HEMATOLOGA CLNICA

HEMATOLOGA CLNICATRABAJOS PRCTICOSALUMNO:

GRUPO:.......

AO: 2011NMINA DE TRABAJOS PRCTICOS

TP1: HEMOGRAMA 1 (HTO, HEMOGLOBINMA, VSG, COLORACION MGG)

TP2: HEMOGRAMA 2 (FRMULA NORMAL, RECUENTO DE GB)

TP3: FRMULA PATOLGICA-ALTERACIONES SERIE BLANCA

TP4: ANEMIA ARREGENERATIVAS (MICROSCOPIA)

TP5: ANEMIAS REGENERATIVAS (MICROSCOPIA Y RETICULOCITOS)

TP6: INMUNOHEMATOLOGA (GRUPO Y FACTOR, COOMBS D e I)

TP7: ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA

TP8: CITOQUMICA (MPO-PERLS-KLEIHAUER BETKE) - MEDULOGRAMA

TP9: LMA (MICROSCOPIA)

TP10: LLA-SLPC (MICROSCOPIA)

TP11: LMC-SLPC (MICROSCOPIA)

TP12: HEMOSTASIA PRIMARIA (RECUENTO DE Pq, TIEMPO DE SANGRA, TIEMPO DE COAGULACIN, RETRACCIN DE COGULO)

TP13: HEMOSTASIA SECUNDARIA (TP, KPTT, MTODOS MANUALES Y AUTOMATIZADOS)

MODELO DE INFORME (EL INFORME ES INDIVIDUAL)TP N GRUPO DE LABORATORIO: FECHA

NOMBRE Y APELLIDO

1-ACTIVIDADES REALIZADAS (detallar en forma resumida las actividades realizadas)

2- RESULTADOS HALLADOS

Determinacin

Valor hallado

Mtodo

Valores de referencia

3- ELEMETOS OBSERVADOS

Para los TPs de microscopia especificar cada uno de los elementos observados (coloracin y aumento) as como tambin, en caso de disponer de ellos, datos referentes al cuadro en que fue encontrado (edad, datos de hemograma, patologa, tratamiento, etc).

Ej. Se observ un frotis con anisocitosis moderada (MGG 40x), correspondiente a un cuadro de anemia ferropnica en recuperacin (Nio 8 aos, GB: 7300 cel/mm3 GR: 4,18 x 106 cel/mm3 Hb 11,2 g%, Hto: 37 %, VCM: 87,3 fL, HCM 26,7 pg, CHCM 30,2 g%, RDW 18 %, Pq 323x103 /mm3, Tratamiento: Hierro oral)

Ej. Se observaron numerosos esferocitos (MGG 100x) en un frotis perteneciente a un paciente con AHAI.

4- DISCUSION DE RESULTADOS (variaciones fisiolgicas, patolgicas, posibles causas de error, procedimientos para la validacin del resultado)

TRABAJO PRCTICO N 1

Ojetivos Generales

- Puesta en prctica de normas de bioseguridad bsicas.

- Prctica de los pasos para la obtencin de muestras de sangre venosa para la realizacin de las determinaciones incluidas en el hemograma.

- Aplicacin de los criterios necesarios para la eleccin de anticoagulantes en funcin de las determinaciones a realizar.

- Manejo del material necesario para las prcticas a desarrollar.

- Interpretacin de resultados.

1 -Instructivo para la obtencin de sangre perifrica por puncin venosa

1. Durante la toma de muestra deben guardarse las ms estrictas normas de higiene.

2. El material descartable a usar se abrir slo al momento de su utilizacin y, una vez manipulado, no podr guardarse nuevamente an cuando se lo considere nuevo.

3. Una vez realizada la toma de muestra, descartar inmediatamente los materiales usados en recipientes para ese fin.

4. Al momento de hacer la extraccin colocarse los guantes desechables, los cuales se mantendrn puestos durante todo el procedimiento.

5. Antes de iniciar la toma de muestra, tener TODO el material preparado.

6. Elegir una vena bien visible en el antebrazo, localizndola visualmente y por palpacin. Colocar el lazo y volver a palpar la vena, indicarle al paciente que abra y cierre el puo para facilitar la extraccin.

7. Una vez identificada la vena, limpiar el rea circundante con algodn empapado en alcohol. Dejar secar.

8. En este momento se romper el sello de garanta de la aguja, se la colocar en la jeringa sin tocar con los dedos, controlando el correcto funcionamiento del mbolo.

9. La aguja se insertar en la vena elegida con el bisel hacia arriba, dejando que la sangre fluya en la jeringa aspirando suavemente con el mbolo. La escala de la jeringa debe estar visible (hacia arriba).

10. Despus de la toma, se le indica al paciente que abra la mano, se retira el torniquete y luego la aguja, presionando el lugar de la puncin con un trozo de algodn seco.

11. LA AGUJA SE DESCARTAR EN EL CONTENEDOR DESTINADO PARA ESE FIN.

12. La sangre que est en la jeringa se descargar en los tubos o frascos que contienen los anticoagulantes correspondientes, evitando hacer espuma y homogeneizando inmediatamente por inversin suave.13. Rotular los tubos o frascos con los datos del paciente.

14. En el sitio de la puncin se pondr un apsito despus de controlar que no haya ms sangrado.

15. La persona que hace la extraccin deber quitarse los guantes al finalizar la toma de muestra y desecharlos inmediatamente. NO REUTILIZARLOS.

16. Si hay algn dato que haya interferido con el procedimiento, aclararlo en el registro de muestras.

2 - Descripcin de los anticoagulantes usados en Hematologa

Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las caractersticas morfolgicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las clulas sanguneas a estudiar se encuentren en el estado ms parecido al fisiolgico. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfologa de los leucocitos, el tamao eritrocitario, no producir hemlisis e impedir la agregacin plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el mximo perodo de conservacin de la muestra (generalmente no ms de 24 horas incluso refrigerada a 4 C).

Los anticoagulantes ms utilizados son:

EDTA (C10H16N2O8) o sal disdica, dipotsica o tripotsica del cido etilendiaminotetraactico, actua mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++), impidiendo el proceso de la coagulacin al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realizacin de recuentos celulares, sobretodo en los autoanalizadores y permite adems la realizacin del hematocrito y del frotis sanguneo hasta dos horas despus de la extraccin de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinacin de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja, respecto a las de sodio, de ser ms fcilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto slido, sin embargo , las tres sales afectan el tamao del eritrocito, especialmente despus del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotsica como anticoagulante para recolectar muestras sanguneas destinadas al recuento y caracterizacin del tamao celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibracin de los contadores automticos. El K2EDTA . 2H2O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio inico y el pH para una solucin al 1% es de 4.8 1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/mL. de sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulacin y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares. TENER SIEMPRE PRESENTE QUE 10L DE ANTICOAGULANTE PUEDEN ANTICOAGULAR HASTA 2,5 mL de SANGRE.

HEPARINA SDICA. HEPARINA DE LITIO, es un anticoagulante fisiolgico que acta impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacrido cido. Los frotis realizados con muestras sanguneas anticoaguladas con heparina producen en las tinciones panpticas un color azulado y una pseudovacuolizacin celular por lo tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporcin adecuada es de 15-20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.

CITRATO TRISDICO, C6H5O7Na3, acta impidiendo que el calcio se ionice, evitando as la coagulacin. Se utiliza para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporcin sangre: anticoagulante 9:1 (Por Ej.:2mL sangre con 250L anticoagulante); as como para la velocidad de eritrosedimentacin en una proporcin sangre: anticoagulante 4:1 (Por Ej.: 2 mL sangre con 500 L anticoagulante). ACD se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades de sangre y estudios metablicos eritrocitarios por permitir una buena conservacin de los hemates. Se utiliza en una proporcin de un volumen de ACD por cada cuatro volmenes de sangre. La proporcin de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Ctrico 0.9 g, Citrato disdico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 mL.

3 - Recuento de hematesRECUENTO MANUAL

Consiste en hacer el recuento en una dilucin de sangre entera anticoagulada. Es un mtodo poco usado debido al elevado error que presenta.

Lquido diluyente: solucin fisiolgica o citrato de sodio 3,8%., o Solucin de Hayem (HgCl2 0,25%, Na2SO4 2,5%, NaCl 0,5%)La dilucin empleada es de 1/200, para lo cual se mide exactamente:

Solucin fisiolgica o citratada:3,98 mL

Sangre: 0,02 mL

El recuento se realiza en la cmara de Neubauer (40X) cuyo esquema es el siguiente:

El recuento de hemates se realiza en el cuadrado central, se eligen 5 de los cuadrados que se encuentran subdivididos en 16 cuadrados pequeos, como se muestra a continuacin:

Las lneas reforzadas, o triples, sirven nicamente como lmites de cada cuadrado que contiene los 16 cuadrados pequeos. Se deben contar 5 de estos cuadrados. La superficie de este cuadrado es de 1 mm2 y la cmara tiene una profundidad de 0,1 mm.

Con la dilucin indicada, luego de agitar adecuadamente, se carga la cmara y se cuentan los glbulos rojos de los 80 cuadrados pequeos (zona sombreada). La cmara puede ser cargada con un capilar, evitando que queden burbujas y que la misma quede cargada uniformemente.

Considerando entonces, que el retculo tiene 400 cuadrados pequeos en total, el clculo que se debe hacer es el siguiente:

N x D x FC x ST= n de glbulos rojos/mm3

TC

Donde:

N: nmero de eritrocitos contados.

D: Ttulo de la dilucin realizada (200).

FC: Factor de correccin de la profundidad, para llevar a 1 mm3 (10).

ST: Total de cuadrados pequeos en la superficie de 1 mm2 (400).

TC: Total de cuadrados pequeos contados.

Causas de error en el recuento en cmara de Neubauer

El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse a:

1. Errores de extraccin: dilucin o hemoconcentracin. Coagulacin parcial. Hemlisis.

2. Mala homogeneizacin por agitacin insuficiente de la sangre.

3. Utilizacin de material mal calibrado, sucio o hmedo.4. Falta de suficiente agitacin de la sangre diluida.

5. Cmara de Neubauer mal ajustada, sucia o mojada.

6. Llenado incompleto de la cmara Neubauer.

7. Empleo de cubreobjetos deformable, no rgido.

8. Clulas mal distribuidas en el fondo de la cmara.

9. Errores del operador al realizar el recuento.

10. Errores al efectuar los clculos.VALORES DE REFERENCIA

Edad SexoIntervalo de referencia

Recin nacidosambos4,7x1012/L - 6,3x1012/L

Nios (2-12 aos)ambos4,0x1012/L - 5,3x1012/L

Adultos jvenes (12-18 aos)mujeres4,1x1012/L - 5,1x1012/L

varones4,5x1012/L - 5,3x1012/L

Adultos jvenes (19-60 aos)mujeres4,1x1012/L - 5,2x1012/L

varones4,6x1012/L - 5,9x1012/L

4 - HematocritoDEFINICION

El hematocrito (Hto) es la relacin existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de sangre, expresado como porcentaje. Est directamente relacionado con la concentracin de hemoglobina, por lo que su determinacin constituye el procedimiento ms simple para el diagnstico de anemia. As, un descenso del Hto es indicativo de anemia, mientras que el aumento lo es de poliglobulia.

El mtodo de referencia para la determinacin del Hto es la centrifugacin de sangre total en tubo capilar (micromtodo), es una tcnica sencilla, barata y accesible a laboratorios de baja complejidad.

En la actualidad, todos los autoanalizadores hematolgicos suministran, dentro del contexto del hemograma automatizado, un valor de Hto que resulta de un clculo electrnico a partir del Volumen Corpuscular Medio (obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentracin de eritrocitos. Obviamente este valor obtenido electrnicamente difiere del obtenido por centrifugacin en que no considera el efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes clulas sanguneas, por lo que es siempre algo inferior (0,2-0,3 %).Tanto el Hto. obtenido por microcentrifugacin o por mtodos automatizados, son un buen parmetro del estado de la serie eritroide.

El Hto refleja la concentracin y no la masa total de glbulos rojos. Por Ej., un paciente en estado de shock acompaado de hemoconcentracin, el Hto. puede ser normal o alto, an cuando la masa eritrocitaria total disminuye por la prdida de sangre. Por lo tanto no es confiable como indicador de anemia poco despus de una hemorragia o una transfusin.

METODO MANUAL

Micromtodo (microhematocrito)

Es una tcnica muy utilizada, por necesitar muy poca cantidad de sangre, muy sencilla y poderse realizar en gran nmero de muestras a la vez y en muy poco tiempo.

Se utilizan tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm. de longitud por 1mm. de dimetro interno. Heparinizados o no, dependiendo del tipo de muestra (sangre entera anticoagulada o sangre capilar). Si se utiliza sangre capilar, se desechar la primera gota despus de la puncin.

Se llena el tubo capilar hasta tres cuartas partes de su capacidad con la sangre (aproximadamente 50 (L). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, favoreciendo el proceso inclinando el capilar hacia abajo a medida que se va llenando. Limpiar con papel o gasa el capilar y tapar el extremo limpio con plastilina o sellndolo a la llama del mechero. Una vez cerrados se colocan los capilares en la centrfuga con el extremo del capilar cerrado hacia fuera y de modo que quede perfectamente equilibrada. Se centrifugan durante cinco minutos a 12.000 rpm. Tan pronto se detiene la centrfuga se extraen los capilares y se procede a su lectura. Esta se puede realizar con los lectores de hematocrito (ABACO), que nos darn el resultado directamente, o con una regla milimetrada, aplicando la siguiente regla de tres:

A------- 100 x: hematocrito en tanto por ciento

B------- x A: longitud total

B: longitud de la parte corpuscularLa determinacin del Hto debe realizarse por duplicado y la diferencia entre los dos valores obtenidos no debe ser nunca superior a 0,01%.

Causas de error

Las fugas de muestra al no quedar bien sellado los capilares producen una disminucin en el valor, al perderse mayor proporcin de clulas que de plasma.

El uso de anticoagulantes lquidos provoca un error por dilucin de la muestra

En muestras capilares no descartar la primer gota, produce una mezcla con los lquidos tisulares que provoca hemodilucin.

En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce hemoconcentracin.

La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hemates vaya tomando forma de bisel si el capilar permanece en posicin horizontal.

VALORES DE REFERENCIA ( ( 2 DE)

El valor de Hto vara con la edad y el sexo.

Edad y sexoHematocrito %Fraccin

Recin Nacidos54 ( 100,54 ( 0,1

Nios (hasta 10 aos)38 ( 50,38 ( 0,05

Mujeres (18-50 aos)42 ( 50,42 ( 0,05

Embarazadas39 ( 50,39 ( 0,05

Varones (18-50 aos)45 ( 50,45 ( 0,05

5 - Determinacin de hemoglobina: mtodo de la cianmetahemoglobina

FUNDAMENTO

Este mtodo tiene como fundamento la transformacin previa de la hemoglobina en cianmetahemoglobina (HiCN), que es muy estable y posee un color caracterstico cuya absorbancia a 540 nm puede ser cuantificada comparndola con la de varias soluciones de concentraciones conocidas de hemoglobina preparadas a partir del patrn de referencia (curva de calibracin). Los distintos compuestos de hemoglobina, excepto la sulfohemoglobina que casi nunca es significativa, se transforman en HiCN segn el siguiente proceso:

Hemoglobina + [K3 Fe(CN) 6] ( metahemoglobina

Metahemoglobina + [CNK] ( cianmetahemoglobina

MATERIAL

1. Espectrofotmetro o fotocolormetro: Estos instrumentos deben ser calibrados peridicamente mediante la solucin patrn de HiCN, preparada de acuerdo a las especificaciones del International Committee for Standardization in Haematology (ICSH)

2. Tubos: 12 x 100 mm.

3. Sangre venosa total: anticoagulada con EDTA-Na2 (1,5 mg/ml) o con heparina (10 UI/ml). Puede emplearse sangre capilar.

4. Pipetas volumtricas: de vidrio y de 5 mL.

5. Pipetas automticas: de 20 (L, debidamente calibradas.

6. Reactivo de Cianmetahemoglobina:

Composicin (pH 7-7,4)

Ferricianuro potsico [K3 Fe(CN) 6]200 mg

Cianuro potsico [CNK]50 mg

Fosfato monopotsico [KH2PO4]140 mg

Detergente no inico*1 mL

Agua destilada hasta1000 mL

Detergentes no inicos: Tritn X-100, Nonic 218, Nonidet/40, Quolac Nic 218.

El detergente no inico facilita la solubilizacin de protenas insolubles y acelera la transformacin de la hemoglobina en HiCN, de forma que aquella se completa en 3 min. Este reactivo debe tener un color amarillo plido, ser completamente transparente y tener un pH entre 7 y 7,4. La lectura de absorbancia a 540 nm utilizando agua destilada como blanco debe ser igual a cero. Para su conservacin utilizar botellas de vidrio de borosilicato opacas y mantener a temperatura ambiente (el fro modifica el color del reactivo).

7. Patrn de referencia (solucin comercial): Es una solucin de HiCN cuya absorbancia corresponde a una determinada concentracin de hemoglobina. Todo patrn de HiCN debe cumplir las especificaciones del llamado patrn primario de HiCN.

METODO

Se determinar la concentracin de Hemoglobina de una muestra problema siguiendo los pasos detallados a continuacin:

1. Conectar el espectrofotmetro.

2. Homogeneizar bien la sangre mediante agitacin suave con un sistema automtico (rodillos/disco giratorio) durante un tiempo mnimo de 5 min o manualmente por inversin del tubo 20 veces.

3. Pipetear (CON PROPIPETA) 5 ml de reactivo de Drabkin en un tubo de ensayo limpio.

4. Mediante la micropipeta aadir 20 (l de sangre homogeneizada al tubo que contiene 5 ml de reactivo de Drabkin. Al realizar esta operacin, es fundamental eliminar el exceso de sangre que pueda quedar en las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo y procurar asimismo que no quede sangre adherida a las paredes internas de la pipeta.

5. Agitar el tubo mediante inversin (4 o 5 veces) con el fin de conseguir homogeneizar bien la mezcla sangre-reactivo y esperar un mnimo de 5 min para que se produzca la hemlisis total y se complete la transformacin de toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina.

6. Leer la A de la solucin a 540 nm, utilizando agua destilada como blanco.

7. Para calcular la concentracin de hemoglobina es recomendable disponer de una curva de calibracin.

Curva de calibracin de hemoglobina

Se toma un Kit. de calibracin con estndar de CC. Normal, de una CC. Alta y otro de una CC .baja, y se miden las absorbancia de cada una de ellas o se toma un Standard de CC. conocida y se hacen diluciones mayores y menores que el normal y se miden las absorbancia y se determina un factor que es el promedio de las tres diluciones. Teniendo que A= . b. C y como b=1 cm => A/ = C para facilitar el calculo A . (1/ ) = C donde (1/ )= F y es la inversa de la pendiente de la curva tendremos que C= F . AGrafico:

De esta manera controlo:

La linealidad del equipo

El deterioro que sufre el reactivo

Puedo trabajar con un estndar diario, procesado por cada operador que realiza la determinacin de hemoglobina, como si fuese una muestra ms y determino el factor del estndar: Procesando un estndar todos los das:

CONTROLO EL DETERIORO QUE PUEDE SUFRIR EL REACTIVO DESDE EL DIA QUE SE LO PREPARO Y SE REALIZ LA CURVA.

CONTROLO EL FACTOR HUMANO

CAMBIOS EN LA TENSIN DE LA RED O DESGASTE DE LA LMPARA DEL FOTOCOLORMETRO

Causas de error en la determinacin de la concentracin de hemoglobina

La determinacin de hemoglobina est sometida a posibles errores que deben ser tenidos en cuenta. Algunos de ellos obedecen a caractersticas peculiares del espcimen como la presencia de hiperlipemia o leucitocitosis intensa ((50 x 109/l). No obstante, la mayora de las veces los errores se deben a defectos tcnicos en la manipulacin y el anlisis del espcimen.

Errores en la obtencin del espcimen de sangre:

1. Errores de extraccin

2. Empleo de anticoagulantes no recomendados3. Coagulacin parcial de la sangre

Errores de la dilucin:

1. Empleo de pipetas automticas descalibradas u otras pipetas sucias o hmedas

2. No eliminacin del exceso de sangre adherida a las paredes externas del capilar antes de introducirlo en el reactivo 3. Dilucin incompleta de la sangre en el reactivo

Errores de la transformacin de la hemoglobina en HiCN:

1. Empleo de reactivo de Drabkin mal preparado o vencido

2. Lectura antes del tiempo necesario para la completa transformacin de la Hb en HiCNErrores de la determinacin:

1. Empleo de instrumentos no calibrados

2. Cubetas sucias o deterioradas

3. Soluciones turbias de HiCN

Errores en la conservacin del reactivo:

1. Congelacin del reactivo, lo que produce transformacin de K3 Fe(CN) 6 en K4 Fe(CN) 6 y una oxidacin parcial de la Hb.

Conservacin del reactivo en botellas de polietileno: se pierden grupos CN con formacin exclusiva de metahemoglobina, en vez de HiCN, con lo que los valores de concentracin de Hb obtenidos son inferiores a los reales.6 - Velocidad de sedimentacin globular (VSG) o EritrosedimentacinFUNDAMENTO

El test de velocidad de sedimentacin globular (VSG) mide la sedimentacin de eritrocitos en su plasma nativo.

VSG es un test no especfico que puede ser utilizado para detectar un amplio rango de enfermedades y para monitorear el curso evolutivo de ciertas enfermedades crnicas como los procesos inflamatorios crnicos (artritis reumatoidea, polimialgia reumtica y tuberculosis) o la respuesta a la terapia, por ejemplo con citostticos (enfermedad de Hodgkin, linfomas y mieloma mltiple). Sin embargo en ocasiones cuadros tan graves como neoplasias y la cirrosis pueden presentar una VSG normal. Constituye uno de los tests ms utilizados como screening en el laboratorio clnico. Se trata de un mtodo sencillo para realizar y que requiere equipamiento simple.

MECANISMO

El mecanismo por el cual se produce la eritrosedimentacin no est completamente dilucidado, pero parece obedecer a interacciones electrostticas entre la superficie de los GR y diversas protenas del plasma que favorecen (fibringeno y globulinas) o disminuyen (albmina) la agregabilidad de estas clulas.

Desde el punto de vista fsico, este fenmeno depende de los siguientes factores:

a. Tamao de los GR

b. Diferencia de densidad entre los eritrocitos y el plasma,

c. Viscosidad del plasma.

d. Temperatura.

Estos factores se hallan relacionados entre s a travs de la ley de Stokes si se considera al GR como una esfera suspendida en un medio infinito (relacin entre la resistencia R que encuentra una partcula esfrica de radio r al desplazarse en el seno de un fluido de viscosidad ( a una velocidad v: R = 6(vr

La sedimentacin ocurre en 3 etapas: 1) una etapa en que se produce la aglutinacin de los GR con formacin de agregados en forma de "pilas de monedas", 2) un perodo durante el cual los agregados de GR sedimentan a velocidad constante, y 3) una etapa final donde la velocidad de sedimentacin se hace ms lenta al mismo tiempo que los GR se acumulan en el fondo del recipiente.

La etapa ms importante es la primera o de aglutinacin, ya que de ella depender la velocidad de todo el proceso. As, cuanto ms pequeo sean los agregados, ms lentamente se producir la sedimentacin y viceversa.

Dado que, como se mencion ms arriba, el test tambin est influenciado por la forma y el tamao de los GR, ste resulta poco confiable como un ndice de enfermedad en la anemia falciforme o cuando hay una marcada poiquilocitosis.

La velocidad de sedimentacin se incrementa por las altas concentraciones de fibringeno y otras protenas de fase aguda e inmunoglobulinas. La albmina retarda la VSG. El mecanismo por el cual el fibringeno y las globulinas facilitan la aglutinacin de GR no se conoce fehacientemente aunque se cree que actan disminuyendo la fuerza de repulsin que normalmente existe entre GR debido a su carga superficial o potencial zeta. El potencial zeta es producido por una intensa carga negativa a nivel de la superficie de los GR, lo que explica que estas clulas se mantengan separadas. La intensidad del potencial zeta depende en gran medida de la composicin proteica del plasma y especialmente de la relacin entre las concentraciones de albmina, globulinas y fibringeno. As, mientras la albmina tiende a aumentar el potencial zeta, las globulinas y sobre todo el fibringeno tienden a disminuirlo. Ello obedece a que tanto el fibringeno como las globulinas tienen un mayor peso molecular y una conformacin menos esfrica que la albmina, lo que aumenta la constante dielctrica del plasma y reduce el potencial zeta eritrocitario. La disminucin del potencial zeta de los GR tiene como consecuencia una mayor tendencia de stos a agregarse y formar las llamadas pilas de moneda. De acuerdo con este mecanismo, el valor normal de la VSG resulta del equilibrio entre las principales protenas plasmticas.

METODOLOGIA

Existen dos mtodos comnmente utilizados para medir la VSG: el mtodo de Westergren y el mtodo de Wintrobe. Ambos mtodos poseen limitaciones. El mtodo de Westergren es menos sensible a pequeos aumentos de los factores que causan la sedimentacin de los GR y as puede ser levemente menos confiable como un procedimiento de screening.

El mtodo de Wintrobe, por el otro lado, puede dar lecturas bajas incorrectas cuando la VSG Westergren es marcadamente elevada. Ambos mtodos son altamente sensitivos a la relacin entre el plasma y los GR en la muestra, y un bajo hematocrito causa un aumento no especfico de la VSG probablemente acelerando la agregacin y reduciendo las fuerzas de friccin entre los agregados en sedimentacin. Se trataron de aplicar factores de correccin para anemias, pero no resultaron confiables.

Tradicionalmente, la VSG se ha determinado ms frecuentemente por el mtodo de Westergren que fue propuesto como mtodo de referencia por el International Council for Standardization in Hematology (ICSH).

Durante los ltimos aos, han aparecido sistemas semiautomticos para medir la VSG que emplean soportes especiales y pipetas de material plstico desechable. Estos sistemas, aunque reproducen exactamente el mtodo de Westergren, se diferencian de ste por su carcter cerrado (recogida de los especmenes en tubos al vaco que incorporan una cantidad precisa de anticoagulante) y por el empleo de material complementario (bombas aspirativas) que aumentan la rapidez y precisin del llenado de las pipetas.

MTODO DE WESTERGREN

Es el mtodo de referencia para medir la VSG. Sin embargo, continua siendo un mtodo poco reproducible y sometido a diversas variables difciles de controlar, como es la necesidad de prediluir la sangre.

A. MATERIALES.

A.1 Anticoagulante

Si utiliza citrato trisdico dihidratado (Na3C6H5O7.2H2O) en solucin acuosa 32,08 g/l.

A.2 Tubo de sedimentacin

Se utilizan tubos de vidrio especialmente diseados de una longitud de 300 + 1.5 mm y de un dimetro de 2.55 + 0.15 mm. El dimetro del tubo debe ser uniforme (+ 0.05 mm) todo a lo largo del tubo y ste debe poseer una escala graduada con exactitud en mm numerada de 200 mm en el fondo hasta 0 mm. Los tubos estandarizados que cumplen las especificaciones de ICSH deben aprobados por Comits de Estandarizacin en los diferentes pases.

Los tubos deben ser cuidadosamente limpiados en acetona-agua. No se recomienda el uso de detergentes o dicromatos para la limpieza.

Tubos plsticos descartables: Se fabrican tubos plsticos descartables segn las especificaciones, los cuales son provistos limpios y secos por el fabricante. Algunos plsticos resultan inadecuados pues unen GR siendo as ms susceptibles a los problemas de taponamiento. Otros tubos plsticos se manufacturan recubiertos de agentes que eliminan hongos o contienen componentes que interactuan con la sangre.

A.3 Gradillas

Las gradillas o dispositivos de sostn estn diseados para sostener los tubos en una posicin vertical inmvil. Un dispositivo de burbuja niveladora debe formar parte integral de la gradilla para asegurar que la posicin de los tubos sea vertical dentro de un lmite de 1(. La misma debe estar construida de modo tal que no existan prdidas de sangre cuando el tubo est colocado en ella.

B. TCNICA

A) La sangre se obtiene por puncin venosa, evitando contaminacin con materiales utilizados para la higiene de la piel. La sangre se agrega en proporcin de 4 Vol de sangre a 1 Vol de solucin de citrato de sodio, por ejemplo 2 ml de sangre en 0,5 ml de anticoagulante. El test debe ser realizado dentro de las 2 hs si la sangre es mantenida a temperatura ambiente, o dentro de las 6 hs. si es mantenida a 4(C.

B) Si la sangre citratada se equilibra a temperatura ambiente, se mezcla por inversin repetidas veces, y se sumerge un tubo de Westergren en la muestra dejando que la sangre ascienda por capilaridad. El nivel de la sangre se ajusta a cero.

C) El tubo es colocado en la gradilla en posicin estrictamente vertical a temperatura ambiente (18-25(C), sin exposicin a la luz del sol directa, libre de vibraciones y corrientes de aire, mantenindolo exactamente 60 min.

D) Una vez transcurrido el tiempo, se lee la distancia entre la superficie del menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de sangre situada a nivel de la marca cero de la escala graduada. El valor de esta distancia, expresado en mm, corresponde al de la VSG durante la primera hora (mm/hora).

C. VALORES DE REFERENCIA

EDAD (aos)Valores de referenciaLmite superior de la normalidad

Nios mayores y jvenes0-155 a 1015

Varones adultos17-504 310

51-606 312

61-706 414

Mujeres adultas17-506 312

51-609 519

61-7010 520

Factores tcnicos capaces de modificar la VSG

Causas de aumento

Desviacin de verticalidad de la pipeta

Incremento de la longitud y el dimetro de la pipeta

Elevacin de la temperatura ambiente

Dilucin de la sangre

Causas de disminucin:

Reduccin del dimetro de la pipeta

Utilizacin tarda de la sangre (especimen envejecido)

Cambio de anticoagulante

D. INTERPRETACION DE RESULTADOS

Los valores de referencia de la VSG se expresan exclusivamente en mm/h y varan fundamentalmente con el sexo y en cierto grado tambin con la edad (ver valores de referencia), el ciclo menstrual, y las medicaciones (corticosteroides, contraconceptivos orales, etc.) La VSG no parece estar influenciada por las ingestas o por los ritmos circadianos.

Las determinaciones de la VSG a la segunda hora o a las 24 hs, muy utilizadas anteriormente, han demostrado ser poco fiables y de escasa significacin clnica, por lo que no se recomienda su empleo.

Existen numerosas patologas con alteraciones proteicas del plasma que cursan con modificaciones del valor de VSG. Se observan aumentos de VSG en un amplio espectro de enfermedades principalmente relacionadas a las protenas de fase aguda, y tambin en el embarazo normal y el puerperio.

Un 10% de los nios normales tambin presentan VSG aumentadas.

La VSG es especialmente baja (0-1 mm) en la policitemia, anormalidades de GR (hemoglobinopatas, esferocitosis hereditaria, anemia falciforme, etc.), hipofibrinogenemia, defectos cardacos congestivos, y ocasionalmente sin causa aparente.

Adems de estas condiciones que pueden tender a ocultar una alta VSG, es inusual obtener falsos negativos, por ende, un valor normal de VSG generalmente asegura que no existe enfermedad orgnica.

7-OBTENCIN DEL FROTIS DE SANGRE

Sobre un portaobjetos perfectamente limpio, se coloca en un extremo una gota pequea de sangre (1-2 mm) recin obtenida, ya se trate de puncin digital, o del taln (en pediatra) o de la ltima gota de sangre extrada con la jeringa y que se encuentra en la luz de la aguja. Evitar usar sangre con anticoagulantes porque altera la morfologa de las clulas.

Por medio de otro portaobjetos de borde pulido y al cual se le ha quitado los ngulos (extensor), se realiza la extensin de la gota de sangre: conservando un ngulo menor de 45( respecto al portaobjetos horizontal, el extensor se apoya delante de la gota de sangre y retrocediendo hasta tocarla, una vez que la misma se extiende a lo largo del borde de contacto por capilaridad, se avanza con firmeza y no muy rpidamente. As se obtiene una fina pelcula de sangre que representa integralmente a la gota de sangre que se extiende.

Secar rpidamente el extendido al aire para evitar el deterioro de las clulas.

Un extendido as obtenido poseer tres reas de diferente espesor y con distribucin tambin distinta de leucocitos:

1. Zona excesivamente gruesa: Se encuentra en la regin inmediata al punto de partida de la extensin (cabeza). En ella hay siempre un aumento del nmero de linfocitos.

2. Zona excesivamente fina: Corresponde al final de la extensin (cola) y en sta se observa un exceso de granulocitos y monocitos.

3. Zona ideal: Regin central (cuerpo), en ella hay un reparto equilibrado de las clulas.

Para que un frotis sea valido:

1) No debe ser demasiado grueso (los elementos estarn retenidos y no sern identificados.

2) No debe ser demasiado delgado (ser muy pobre en elementos lo que impedira una lectura conveniente).

3) No debe alcanzar los bordes ni las extremidades del porta (se perderan los elementos mas voluminosos). La gota debe agotarse sobre el porta.

4) No debe presentar agujeros (utilizacin de portas mal desengrasados) ni estras o flecos (provocados por un extensor de bordes no esmerilados, irregulares). Conviene elegir el extensor observando sus bordes en el microscopio para asegurarse de que sean bien lisos.

5) Debe ser regular (si no, el reparto de elementos es heterogneo y por tanto el recuento variara segn los campos examinados).

6) Debe ser secado correctamente (un secado defectuoso produce artefactos: hemates festoneados por ejemplo).

Existen algunas sutilezas que es necesario cuidar:

El tamao de la gota debe ser el adecuado y esto lo enseara la experiencia. Si ha cado un exceso de gota limpiar el porta con gasa o algodn. Repetir el procedimiento las veces que sea necesario hasta que la cantidad de sangre sea la adecuada.

Si tuvieran que elegir entre un extendido largo, y uno corto, es preferible el segundo, pero lo ideal es que ocupe partes de la lamina.

Se prefieren en general los frotis delgados pero el excesivamente fino tiene muchos inconvenientes: los hemates aparecen poligonales con su claridad central desaparecida, las plaquetas se destruyen y los leucocitos resultan rotos o distorsionados.

Nunca debe llevarse la gota de sangre por delante del extensor porque producira erosin de las clulas.

Un buen frotis debe constar de una zona inicial gruesa (cabeza), una zona central mediana (espesor ideal para la lectura) y la cola delgada terminada suavemente en un borde convexo sin estras prolongadas que hablan de un extensor defectuoso. Un buen extendido luce como una pincelada sobre el vidrio. Aun cuando el frotis sea ideal y el reparto homogneo no se puede evitar una cierta segregacin de los elementos. Los linfocitos (mas pequeos) predominan en el centro de la extensin. Los polimorfonucleares y los monocitos son atrados hacia los bordes y cola.

FROTIS ARRASTRADOS: todos los elementos estn en la cola. Deben rechazarse para la formula.Defectos observados en frotis con sangre anticoagulada:

1) Impide agrupacin de plaquetas.

2) Los ncleos de los monocitos aparecen como con lbulos, inclusive pueden estar desintegrados o coloreados ms homogeneamente, ms compactos que con sangre fresca, el citoplasma puede aparecer vacuolado.

Importante:

Lavar y secar bien el extensor entre una y otra extensin

Los portas nuevos deben ser desengrasados con agua jabonosa, enjuagados minuciosamente.

8-COLORACIN DEL FROTIS DE SANGRE

La coloracin se realiza por el mtodo de May Grnwald-Giemsa.

Fundamento

Prcticamente todos los mtodos empleados para teir las clulas de la sangre se basan en el empleo de una mezcla de eosina y azul de metileno.

Estos colorantes son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes estructuras celulares, de modo que las que tienen carcter bsico fijan en mayor medida la eosina (colorante cido), mientras que las que poseen propiedades cidas fijan principalmente el azul de metileno (colorante bsico). Esto explica que ciertas estructuras basfilas presentes en el ncleo (nuclolo) o en el citoplasma (ribosomas) se coloreen de azul, mientras que otros componentes acidfilos como la hemoglobina adquieren color rosado.

De esta manera, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en: neutrfilos, en los que la granulacin especfica posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultneamente, resultando en un color pardo; eosinfilos, en los que la granulacin especfica contiene sustancias de intenso carcter bsico que fijan fundamentalmente los colorantes cidos, dando un color rojo-naranja; y los basfilos, cuya granulacin especfica posee sustancias de carcter cido, que fijan colorantes bsicos dando un color azul oscuro.

Reactivos Solucin May Grnwald : eosinato de azul de metileno en metanol.

Solucin Giemsa: azul de metileno (clorhidrato de tetrametiltionina), su derivado oxidado en medio alcalino: el azur II, y eosina (tetrabromofluorescena).

MtodoCubrir el frotis de sangre seco con solucin May Grnwald. Dejar 3 minutos. A continuacin, agregar buffer fosfato pH 6.8 o una mezcla de agua de canilla con agua destilada en partes iguales, en proporcin igual a la de colorante. Homogeneizar soplando suavemente con una pipeta o moviendo el portaobjetos con un movimiento de vaivn. Dejar 3-5 minutos. Volcar, enjuagar bajo chorro de canilla suave y cubrir el preparado con una solucin de Giemsa, obtenida a razn de dos gotas del colorante por ml de agua (1/10). Dejar 10- 12 minutos. Lavar con agua, limpiar la cara inferior del portaobjeto con un algodn y secar al aire.

TRABAJO PRCTICO N2

Objetivos generales-Familiarizarse con el uso de la cmara de Neubauer

-Adquirir destreza en la preparacin de diluciones y manejo de muestras de sangre entera

-Adquirir destreza en el manejo del microscopio y la cmara de Neubauer para el recuento de glbulos blancos

-Delinear los criterios para la identificacin de glbulos blancos en preparados coloreados con MGG

-Realizar frmulas leucocitarias en muestras de pacientes sanos

-Interpretacin y validacin de resultados1-RECUENTO DE LEUCOCITOS

Mtodo manual

1) Agregar 20 (l de sangre anticoagulada a un tubo de Kahn conteniendo 0,38 ml de solucin de Trk. Esta solucin contiene acido actico al 1 % en agua destilada y el agregado de una punta de esptula de azul de metileno. DILUCION 1/202) Homogeneizar la mezcla.

3) Cargar la cmara de recuento

4) Ubicar el reticulado de la cmara con bajo aumento (10X), constatar la ausencia de burbujas y que la distribucin sea regular.

5) Proceder al recuento de los elementos presentes en los cuadrados angulares grandes (4) de la cmara. Las cuentas de los cuatro cuadrados no deben diferir entre s en ms del 20%. En caso contrario debe cargarse nuevamente la cmara.

Si el valor obtenido (leucocitos/mm3 de sangre) es menor de 2500, se practica nuevamente el recuento empleando una dilucin 1:10. Si por el contrario el nmero resulta notablemente elevado se emplean diluciones 1:100 o 1:200.

6) Clculo:

m x 10 x d= N de leucocitos/ mm3

n

Donde: m=nmero de leucocitos contados en n (4) cuadrados de 1 mm de superficie y d=dilucin utilizada, n= nmero de cuadrantes contados.Valores de referencia

Adultos4.000 - 11.000 / mm3

Recin nacidos10.000 - 25.000 / mm3

Nios de 1 ao6.000 - 18.000 / mm3

Nios de 4 a 7 aos6.000 - 15.000 / mm3

Nios de 8 a 12 aos4.500 - 13.000 / mm3

2-DETERMINACIN DE LA FRMULA LEUCOCITARIA: RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

En todo frotis coloreado con M.G.G. debe colocarse una delgada capa de aceite de inmersin, aun para el pequeo aumento a seco. Si no se cumple este requisito la refringencia de los elementos impide una buena observacin. Para esto es suficiente depositar una gota en un extremo, aplicar de plano sobre ella otro portaobjetos que puede contener otro extendido en cuyo caso se harn coincidir ambas caras que los contengan y desplazarlos suavemente unos contra otros.

La observacin debe hacerse al principio de manera panormica con objetivo de 10X para ver la dispersin de los elementos. Con este aumento se observaran la presencia de clulas grandes como los linfocitos hiperbasofilos de la mononucleosis. Por ello debe evitarse la tendencia a usar e comienzo la inmersin.

Luego se pasa a 40 X aumento que resulta til para evaluar alteraciones de tamao de los glbulos rojos y finalmente se pasa a 100X para el recuento diferencial de los glbulos blancos y para la observacin detallada de los elementos sanguneos.Formas de recorrer el preparado

Contar por lo menos 100 leucocitos anotando la cantidad de cada uno de ellos para establecer los porcentajes. Refiriendo al valor de recuento de glbulos blancos se puede expresar cada tipo de leucocitos en valores absolutos por mm3 de sangre.Siempre que sea posible se deben contar 100 elementos , recordar que se est haciendo una estimacin porcentual de las poblaciones, el recuento de 100 elementos resulta relativamente sencillo en pacientes con valores absolutos de GB dentro de los valores de referencia. Distinto es el caso de pacientes leucopnicos con recuento bajos por ej: 1500 GB / mm3 en estos casos resultar muy tedioso llegar a encontrar 100 elementos para poder expresar en % , por ello es aconsejable expresar literalmente lo que se vi al observar el preparado por ej: se realiza la frmula leucocitaria en un paciente leucopnico y solo se logr contar 80 elementos ( pueden ser 70, 90 dependiendo del tiempo utilizado y del grado de leucopenia del paciente) entonces lo aconsejable es expresar los resultados de la siguiente manera: DE 80 ELEMENTOS CONTADOS x son Neutrfilos, y son eosinfilos, z son linfocitos, etc, etc, es decir se expresa cuantos elementos de cada serie se observ en el total de GB contados Y NO EN PORCENTAJE!FORMULA LEUCOCITARIA EN ADULTOS SANOS

LEUCOCITOS(%)ABSOLUTO (cel / mm3)

CAYADOS0 1%100 - 250

NEUTROFILOS SEGMENTADOS55 70 %3000 - 5000

EOSINOFILOS1 4 %20 - 350

BASOFILOS0 1 %10 - 60

LINFOCITOS20 40 %1500 - 4000

MONOCITOS4 8 %100 - 500

No hay variacin de la frmula segn el sexo, pero s segn la edad.

Nacimiento: 70% de neutrfilos.

Primera semana: 50% de neutrofilos y 50% de linfocitos.

Segunda semana: 65% de linfocitos y 25% de neutrfilos3-4 aos: 50% de linfocitos y 50% de neutrfilos.

10-12 aos: valores de referencia del adulto.

Descripcin de cada uno de los elementos que componen una frmula normal

1. Neutrfilo: Ncleo lobulado (2-5 lbulos). Los lbulos estn unidos entre s por filamentos cromatnicos muy delgados. La cromatina es condensada. Es una clula terminal. Mide aproximadamente 12 (m. El citoplasma es abundante y rosado, cubierto por una granulacin fina especfica de color pardo rojiza.

2. Eosinfilo: Mide aproximadamente 13 (m. El ncleo es segmentado, con predominio del bisegmentado en forma de anteojo aunque pueden aparecer con ms lbulos. El citoplasma es abundante y est cubierto de granulaciones esfricas de mayor tamao que las del neutrfilo y que se colorean de anaranjado.

3. Basfilos: Mide aproximadamente 10 (m. El ncleo est irregularmente lobulado. La cromatina es densa. La masa nuclear es voluminosa con relacin al citoplasma. Las granulaciones son groseras y muy irregulares en forma y tamao pudiendo quedar superpuestas al ncleo, cubrindolo parcialmente.

4. Linfocitos: Es una clula generalmente pequea (7 (m), pero puede llegar hasta 12 (m. La forma ms pequea posee slo un escaso anillo de citoplasma color celeste. Alrededor de un 10% de los linfocitos circulantes son clulas ms grandes y con citoplasma ms abundante. El ncleo por lo general es redondo, pero puede tener una escotadura. La cromatina es densa.

5. Monocito: Es el leucocito normal de mayor tamao (18-24 (m). El ncleo presenta forma irregular y variada, la cromatina se esponjosa. La proporcin ncleo-citoplasma es aproximadamente semejante. El citoplasma se tie de celeste plomizo y no presenta granulaciones.

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