HEMATOLOGIA 2014 CLASE TEORICO-PRACTICA CLASE TEORICO-PRACTICA PRUEBAS PARA EVALUAR EL MECANISMO...

HEMATOLOGIA2014

CLASE TEORICO-PRACTICA

PRUEBAS PARA EVALUAR EL MECANISMO HEMOSTÁTICO

Mariana Raviola

HEMOSTASIA

Comprende el proceso que previene el sangrado cuando un vaso sanguíneo es dañado y al mismo tiempo mantiene la sangre en estado fluido dentro del árbol vascular

HEMOSTASIA

FASES:-Respuesta vascular: Vasoconstricción

localizada a nivel del área afectada-Hemostasia Primaria: Formación de un

agregado o trombo de plaquetas sobre la superficie de vascular lesionada.

-Coagulación: Formación de fibrina que refuerza el trombo plaquetario.

-Fibrinolisis: Eliminación de los depósitos de fibrina.

INDICACIONES PARA EL PACIENTE

Concurrir al laboratorio con ayuno de 8 horas tratando de realizar el menor esfuerzo físico posible

FICHA DE ANTECEDENTES DEL PACIENTE - Motivo de consulta -Trombosis actual o anterior -Gingivorragia, epistaxis, melena, hematuria, hemartrosis -Sangrado post extraccion dentaria -Hemorragia post parto o post cirugia -Menstruacion abundante -Petequias -Antecedentes familiares de trombosis o sangrado. -Consumo de medicamentos: aspirinas, dicumarinicos,

heparina, etc

HEMOSTASIA PRIMARIA

RECUENTO DE PLAQUETAS

- Anticoagulante: EDTA - Material adecuado: tubos de polipropileno,

vidrio siliconado- Toma de muestra adecuada: evitar ruptura de

tejido

HEMOSTASIA PRIMARIA


Métodos manuales- sangre venosa anticoagulada con EDTADil. 1/20 con oxalato de amonio 1% (vn: 150-400x103/mm3)

Contadores hematológicos.

HEMOSTASIA PRIMARIA


Es conveniente observar un frotis de sangre periférica donde

se controlará el número, forma y tamaño plaquetario.

Prueba global de la hemostasia primaria. Evalúa interacción: Plaquetas-Pared vascular “in vivo”Depende de:cantidad y calidad funcional de las plaquetascantidad y calidad funcional de vWFcalidad del colágeno.Duke VN < 3 min Ivy VN < 4.5 minSimplate VN < 9.5 minCohibir cuando tpo > 2 VN

Tiempo de sangría

HEMOSTASIA PRIMARIA

Tiempo de sangría

TS:

sensibilidad - especificidad - reproducibilidad

Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, “barrido” excesivo

Retracción del Coagulo

Se produce a través de la interacción de la GPIIb-IIIa con la actina del citoesqueleto, requiere ATP como fuente de energía, depende de varios factores, calidad y cantidad de plaquetas, cc de fibrinógeno, hematocrito, es poco sensible, y muy influenciada por la limpieza del material

HEMOSTASIA PRIMARIA

RETRACCION DEL COAGULO

Retracción del CoaguloSe coloca 1 ml de sangre en tubo de hemolisis de vidrio bien limpio, se mantiene a 37C°,a la hora se observa la magnitud de la retracción.El resultado se expresa en cruces. Cuando el coagulo se ha despegado por completo de la pared del tubo se considera retracción total(+++), cuando no hay retracción es aretráctil, y cuando queda un cuello de fibrina y un sedimento de hematíes se llama fibrinocruorico.

HEMOSTASIA PRIMARIA

Prueba del Lazo

Evalúa fragilidad capilar aplicando una presión positiva que aumenta la presión sanguínea por obstrucción del recorrido venoso.Depende de calidad y cantidad de plaquetas, calidad del vaso y los tejidos adyacentes y del gradiente de presión que tiende a generar la extravasación

HEMOSTASIA PRIMARIA

Prueba del Lazo

Se coloca el esfigmomanómetro en el antebrazo y se deja 5 min. a una presión media entre la máxima y la mínima, se quita la presión y se observa la aparición de petequias luego de unos minutos.VN: Hasta 5 petequias en un circulo de 5 cm de diámetro. Se informa la positividad en cruces

HEMOSTASIA PRIMARIA

ADHESIVIDAD

PLAQUETA SUPERFICIE

• In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157)

• In Vitro : Hellem II (superficie de vidrio)

Scand J Haemat 1970, 7: 37

vW

HEMOSTASIA PRIMARIA

ADHESIVIDAD

In Vivo : Borchgrevink

Adhesividad (%)= 100 *( RT0 – RT2 / RT0 )

RT0 : recuento de Pq. de muestra de sangre venosa extraída con EDTA

RT2 : recuento de Pq. Luego de 2 min de TS.

VN: 30-70%

HEMOSTASIA PRIMARIA

columna cp

• Sangre entera

• Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna.

• Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg.

bombasp

EDTA 2%

EDTA 2%

%Adh = 100 SP- CPSP

ADHESIVIDAD: método de Hellen II

VN = 27- 70%

AGREGACIÓN

La agregación plaquetaria es el resultado final de un complejo proceso metabólico. Cuando el endotelio se daña se exponen una serie de agonistas capaces de activar a las plaquetas, estos son el colágeno de la pared vascular, la trombina generada, la adrenalina y el ADP.

La agregacion plaquetaria in vitro se define como la interaccion Pq-Pq medida sobre PRP.

HEMOSTASIA PRIMARIA

Agregación plaquetaria in vitro

IIHEMA-ANM

Método óptico (Born, 1980)

Método potenciométrico (Challen, 1982)

Condiciones del ensayo:

- Sangre obtenida por punción sobre citrato de sodio 3.8% (1:9)

- Tubos de polipropileno- Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP): 10 min a

150-200 rpm- Preparación de plasma pobre en plaquetas (PPP): 15 min a

altas rpm.- Ajustar concentración del PRP con PPP: 250 – 300 109/ m3

- Tapar tubos para evitar cambios de pH- Realizar el ensayo luego de 30 minutos y hasta 4 hs posteriores a la extracción.

AGREGACION

Agonistas panel de rutina:ADR: 10 uM ( adrenérgicos) Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa)AA: 0.5 mM (receptor de Tx)

ADP: 2.5 uM, 5.0 uM (P2Y1, P2Y12)

Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vW tipo II)

Agonistas especialesTRAP6 : PAR1, PAR4U46619: análogo de TXEndoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintazaIonóforos (A23187): movilización de Calcio

AGREGACION

COAGULACIÓN

ME

TC

MI

HMWKXII

PKXI

IX

VIII

VII

X

VIII

TOMA DE MUESTRA

Anticoagulante: Citrato trisodico 3.2 o 3.8 %

No se aconseja utilizar sangre capilar.

La sangre venosa debe ser obtenida por punción rápida

y precisa, evitando la formación de espuma, el éxtasis venoso y la contaminación con tromboplastina tisular,

(torniquete menos de un minuto)

TOMA DE MUESTRA

La sangre arterial debe ser obtenida por punción directa no traumática.

Evitar la extracción por catéter, de ser indispensable, realizar la extracción con doble jeringa y descartar los primeros 5 a 10ml de sangre.

TOMA DE MUESTRA

No se aconseja la extracción con tubos de vacío, aunque estos tubos pueden utilizarse para colocar la sangre una vez abiertos.

Relación ac / sgre, 1+9

TOMA DE MUESTRA

La relación Anticoagulante / Sangre varía cuando el Hto. se

encuentra fuera del rango de 25 – 50%. Para calcular el

citrato a utilizar se usa la siguiente fórmula:

Sangre entera en ml = 9 x citrato de Na en ml x 0,55

1 – Hto en (v/v)

TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

Cualquiera sea la distancia se remitirán las

muestras congeladas, con hielo seco, y en

un recipiente adecuado para su

conservación, acompañadas de controles

normales procesados de igual forma.

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

Descartar los tubos que no mantengan adecuada relación ac/ sgre , y aquellos que muestren hemólisis visible.

Centrifugar las muestras y separar los plasmas con pipetas de plástico lo mas rápido posible.


a-Plasma citratado rico en plaquetas (prp)

centrifugar 5-10 min. a bajas rpm, separar el

plasma y mantener a temperatura ambiente hasta 2 hs

b-Plasma citratado pobre en plaquetas (ppp)

centrifugar 10 min. a 3000 rpm, utilizar dentro de las 4 hs .


c- Preparación de pool de plasmas normales Se extrae sangre a como mínimo 10 sujetos

normales con básico de coagulación normal , y se prepara ppp se fracciona y se conserva

a -80° C hasta 6 meses o solo 1 mes si se guarda a -20 ° C


d-Preparación de plasma adsorbido Es plasma desprovisto de los factores vitamina K

dependientes, factores II ,VII, IX y X, que quedan adsorbidos en sulfato de bario.

A partir de sangre extraída con oxalato de sodio en relación 1+9, se prepara ppp y se mezcla con sulfato de Ba (50 mg por ml de plasma). Se incuba a 37°C 15 min. ,se centrifuga dos veces y se recoge el sobrenadante, que debe tener un TP mayor de 60 seg. El plasma adsorbido posee los factores: I,V,VIII,XI,XII


e-Preparación de suero

Aporta los factores VII, IX, X y un 50% de XI Y XII. Se obtiene dejando coagular la sangre en tubo de vidrio por espacio de 4 hs. Se centrifuga 15 min. a 3000 rpm .Se puede mantener a 4°C por 24 horas o fraccionar y congelar


f-Preparación de plasma envejecido

Deficitario en factor V, se extrae sangre con oxalato de sodio 0.1 M en proporción 9+1, se obtiene ppp, y se lo coloca en un enlenmeyer a 37°c.

Se controla el decaimiento de la actividad del factor V mediante el TP hasta un valor de 60 seg. Alicuotar y guardar a -20°C

PRUEBAS PARA EVALUAR LA COAGULACIÓN

TPR-Tiempo de plasma recalcificado-Se basa en reiniciar la cadena de activación del

sistema de la coagulación al agregar un exceso de iones calcio al plasma citratado y se mide el tiempo que tarda en coagular

-Evalúa numero y función de plaquetasMuestra: prpReactivo: cloruro de calcio 0,025 M


TPRProcedimiento: incubar unos segundos a 37°C 200 ul

de prp y disparar el cronometro al agregar cloruro de calcio 0,025 M, medir en intervalos de 30 seg el tiempo que tarda en coagular

Se realiza por duplicado y se informa el promedioVN: 1-3 min.Prolongado: Déficit de factores de la vía intrínseca y

del numero y función de las plaquetas.


TP-Tiempo de protombina -Mide el tiempo de coagulación de un plasma

citratado en presencia de tromboplastina (FT) e iones calcio

-Evalúa la vía extrínseca-Se usa para monitorear la terapia con ACO-Refleja cambios en los niveles de los factores

II,VII,X,V-En cuanto al fibrinógeno solo una disminución por

debajo de 50 mg lo afectan.


TP

Tromboplastina Apoproteina + Fosfolipidos

Fuentes: plantas, cerebro de conejo, ratón o mono, recombinarte (humana) a la que se le agregan fosfolipidos naturales o artificiales


TPMuestra: plasma citratado pppReactivo: tomboplastina calcicaProcedimiento: incubar 100 ul de ppp 1 min a 37°C,

disparar el cronometro al agregar 200 ul de reactivo a 37°C, medir el tiempo de coagulación

Los resultados se informan:

-En segundos informando entre paréntesis el valor del testigo( 11 recombinante, 12-14 de conejo)


TP -En % de actividad o tasa de trombina: Se preparan diluciones de un pool de plasmas

normales y se determina el TP por duplicado, con los datos se grafica una curva, en papel doble log, de TP vs % de actividad, asignando al pool de normales el 100% de actividad.

Teniendo el TP del paciente se busca en la curva el % o tasa que le corresponde.

VN: 70-100%


TPValores prolongados se observan en:-Deficiencia congénita o adquirida de uno o varios de

los siguientes factores: II,V,VII,X-Hipofibrinogenemia-Enfermedad hepática-Deficiencia de vitamina K-Tratamiento con ACO-Presencia de inhibidores de alguno de los factores

involucrados


APTT-Tiempo de tromboplastina parcial activado -Mide el tiempo que tarda en coagular un plasma

citratado ppp en presencia de tromboplastina parcial, un activador, e iones calcio.

-Evalúa la vía extrínseca -Se utiliza para controlar la terapia de anticoagulación

con heparina


APTTTromboplastina parcial: fosfolipidos de la

tromboplastina que se obtienen de tejido animal o de fuentes vegetales (cefalina)

Activador :- particulado, caolín, celite, sílica micronizada.

-no particulado, ac. Elagico


APTTMuestra: plasma citratado pppReactivos: -cefalina - caolin

-cloruro de calcio 0.025 MProcedimiento: incubar100 ul de ppp con 100 ul de

rvo a 37°C durante 3 min, disparar el cronometro al agregar 100 ul de cloruro de calcio 0,025 M, medir el tiempo que tarda en coagular.

VN: 30- 40 seg.


APTTValores prologados se observan en:

-Déficit congénito o adquirido de factores II, V, VIII, IX, X, XI, y XII

-Tratamiento con heparina

-Presencia de inhibidores

-Tratamiento ACO instaurado


TTEvalúa la etapa de fibrinoformación midiendo el tiempo

que tarda en coagular el plasma citratado en presencia de trombina, independientemente de las alteraciones que podrían afectar el MI o el ME


TTMuestra: ppp

Reactivo: solución de trombina comercial (liofilizada) o preparada a partir de plasmas de dadores, se ajusta la dilución de manera tal que el testigo sea aproximadamente 15 seg

Procedimiento: incubar 100ul de muestra 1 min a 37° C agregar 100 ul de trombina diluida y tomar el tiempo que tarda en coagular.


TTSe considera prolongado cuando el plasma del paciente

difiere en mas de 4 segundos con el normal.Valores prolongados se observan en :-Niveles bajos de Fibrinógeno o Disfibrinogenemia-Tratamiento con heparina no fraccionada-Presencia de inhibidores adquiridos

PRUEBAS ALTERADAS

Déficit de factores

o presencia de inhibidores?

Mezclas con plasma normal (1+1)

corrige

cuantificación de factores

no corrige

detección de inhibidores

PRUEBAS DE CORRECCIÓN

Para orientarnos sobre las causas que provocan la alteración de las pruebas podemos realizar correcciones mezclando partes iguales del plasma en estudio con:

- Plasma adsorbido: aporta los factores I,V,VIII,XI,yXII.

-Suero: aporta los factores VII,IX,X,XI, yXII

-Plasma envejecido: carece de factor V

DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA EXTRINSECA

II, V, VII, X

TP• plasma

» patrón/pool de plasma normal(curva de calibración)

» paciente diluido

• plasma deficiente en el factor a medir

• tromboplastina - calcio% factor

seg

% pac

seg pac

KPTT• plasma » patrón/pool de plasma

normal (curva de calibración)

» paciente diluido

• plasma deficiente en el factor a medir

• cefalina - kaolín

• Cl2Ca

seg

% pac

DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA INTRINSECA

VIII, IX, XI, XII

% factor

seg pac

DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA FINAL : FIBRINOGENO (método gravimétrico)

fibrinógeno fibrina

trombina

-Se recoge el coagulo con varilla de vidrio

-Se lava con agua destilada

-Se deshidrata con alcohol, y se deja secar a 80° C

-Se pesa la fibrina en balanza de precisión, la masa final de fibrina es directamente proporcional a la

concentración de fibrinógeno

método básico = TT• plasma » patrón mg/dl (curva de

calibración)» paciente

• trombina

mg/dl

seg

mg/dl pac

seg pac

DOSAJE DE FACTORES DE LA VIA FINAL :FIBRINOGENO

(método de Claus)

SANGRADO SIN ALTERACION DE LA PRUEBAS GLOBALES

Determinación de factor XIIILa fibrina formada en ausencia de factor XIII se

disuelve en urea 5 MProcedimiento: Se hace coagular 200ul de ppp con

200ul de cloruro de calcio 0.025 M, y 100 ul de trombina, incubar 30 min a 37°C agregar solución de urea 5 M, desprender el coagulo de las paredes y dejar a temperatura ambiente 24 horas. Observar a los 30min, 1,2,4,y 24 horas la disolución del coagulo

Valor normal: no disolución a las 24 horas.

FUNCIONES DEL SISTEMA FIBRINOLITICO

ELIMINACIÓN DE LA FIBRINA QUE QUEDA ADHERIDA A LAS PAREDES DE LOS VASOS DESPUÉS DE LA COAGULACION (intravascular)

INTERVIENE EN LAS REPARACIONES HÍSTICAS

INTERVIENE EN LA ACTIVACION DE LOS MACROFAGOS (extravascular)

SISTEMA FIBRINOLÍTICO

Está compuesto por una enzima clave: plasmina (Plm), cuyo precursor inactivo es el plasminógeno ( Plg ). Esta activación puede producirse por :Activador tisular del plasminógeno: t-PA Activador tipo uroquinasa: u-PA Factor XIIa y calicreína

SISTEMA FIBRINOLÍTICO

La plasmina produce clivaje tanto del fibrinógeno como de la fibrina._____________________________________________________

Degradación del fibrinógeno.(Fibrinogenolisis) fragmentos X, Y, D, E ( PDF)

Fisiológicamente esto no ocurre ya que las pequeñas cantidades de plasmina que se generan son inhibidas por la antiplasmina.

_____________________________________________Degradación de fibrina. (Fibrinolisis)

fragmentos de distinto PM , en su mayoría fragmento D entrecruzado ( D-Dímero)

El hallazgo de Dímero D aumentado implica que hubo formación de fibrina entrecruzada y posterior lisis de la misma.

EVALUACION DEL MECANISMO FIBRINOLÍTICO

PRUEBAS GLOBALES

TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO.

TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO DE SANGRE ENTERA DILUIDA.

TIEMPO DE LISIS DE EUGLOBULINAS


TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO2 ml de sangre.Incubar a 37 ºCTomar el tiempo de lisis.Se informa el tiempo de lisisNormal un tiempo mayor de 24 hs< de 24 hs--- aumento de la act.fibrinolitica< 6hs----asociado a hemorragias.Poco sensible.Sirve en los def. de alfa2-AP


TIEMPO DE LISIS DEL COAGULO DE SANGRE ENTERA DILUIDA

Sangre diluida 1/10 en buffer fosfato y con el agregado de trombina.30 min en heladera

Dejar a 37 ºC.Examinar cada 10 min.Anotar tiempo de lisis.

Resultado variable. < de 2 hs ---Hiperfribrin.> de 20 hs----HipofibrinolísisEvaluar junto a la lisis de euglobulinas


LISIS DE EUGLOBULINAS

La dilución y acidificación del plasma provoca la precipitación de las euglogulinas( fracción proteica que contiene el fibrinógeno, el plasminógeno, los activadores del plasminógeno y la plasmina), luego se resuspende en buffer alcalino, se coagula y se incuba a 37°C, para registrar el tiempo de lisis del coágulo, este procedimiento elimina los inhibidores de la fibrinolisis.


LISIS DE EUGLOBULINAS

El tiempo de lisis del coagulo es inversamente proporcional a la actividad fibrinolítica del plasma


Procedimiento: en tubo de vidrio se agregan 4ml de agua destilada,70ul de acido acético, y 250ul de ppp, se mezcla y deja 30 min a 4° C, se centrifuga 5 min a bajas rpm, en el sobrenadante quedan los inhibidores que se descartan, se deja escurrir y se resuspende con solución de borato de sodio en baño a 37°C hasta disolución y se coagula agregando cloruro de calcio

Se registra el tiempo desde la coagulación hasta la disolución total del coagulo.


VN: el coagulo se lisa entre 1h 30 min y 4 hs.Tiempos de lisis inferiores demuestran un aumento de la

fifrinolisis a expensas del aumento de los activadores del plasminógeno, pudiéndose asociar con hemorragias.

Tiempos de lisis superiores reflejan disminución de la actividad fibrinolítica y pueden asociarse a perdidas embriofetales.

La prueba se ve afectada por los niveles de fibrinógeno y de plasminógeno.

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