1 Área de Bioquímica y Biología molecular- Facultad de Ciencias- Universidad de Burgos

BIOQUÍMICA Prácticas de Laboratorio

Electroforesis en geles de poliacrilamida: Separación de proteínas

1. Introducción La poliacrilamida se forma por la copolimerización de la acrilamida y bis-acrilamida ( N,N´

metilen bis-acrilamida) en una reacción iniciada por TEMED (tetrametilenetilendiamina) y persulfato amónico. El radical persulfato activa al TEMED, el cual activa al monómero de acrilamida para que polimerice, entrecruzándose al azar con la bis-acrilamida.

Entre las diversas técnicas electroforéticas, una de las más utilizadas es la denominada SDS-PAGE, en la cual se añade SDS que es un detergente aniónico. Las proteínas se unen al SDS de forma proporcional a su peso formando complejos desnaturalizados cargados negativamente, y así su separación es independiente de la forma y carga que tenía la proteína en su estado inicial y se separa únicamente en función de su peso molecular.

Esta técnica puede ser utilizada para estimar el peso molecular de una proteína con un margen de error de ± 10% al comparar su migración electroforética con la de un patrón proteico de peso molecular conocido. La movilidad electroforética relativa (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo del peso molecular, realizando una curva de calibrado con la migración de los patrones de peso conocido es posible determinar el peso molecular de una muestra problema

La poliacrilamida posee ciertas características que la hacen ser un soporte muy útil a la hora de realizar separaciones electroforéticas:

• Es termoestable • Transparente • Resistente • Químicamente inerte • Se pueden preparar geles con diferente tamaño de poro • Resistente a altos voltajes • Se pueden realizar sobre el soporte diferentes tinciones • Las proteínas pueden ser extraídas

2. Reactivos • Solución acrilamida/bisacrilamida (30%): se pesan 29,2 g de acrilamida y 0,8 g de

bisacrilamida y se enrasa a 100 ml con agua destilada. • Amortiguador del gel separador: 18,15 g de Tris y disolver en agua, ajustar el pH a 8,8

con HCl y enrasar a 100ml. • Amortiguador del gel compactador (superior o stacking): pesar 3 g de Tris y disolver en

agua, ajustar a pH 6,8 con HCl y enrasar a 100ml.

Grado en Química

3º

PRÁCTICAS DE

2 Prácticas de Laboratorio – Bioquímica - 3º - Grado en Química

• Amortiguador de la cámara (10x): 12 g de Tris, 57,6 g de glicina, 4 g de SDS disolver en

agua y ajustar el pH a 8,4 (pero al preparar o reactivos el pH debe quedar en torno a ese valor). Aforar a 400 ml. Este tampón es de almacén y debe diluirse 10 veces poco antes de utilizar.

• Amortiguador de las muestras (2X): 10ml del amortiguador del gel superior, 16 ml de solución de SDS, 50 mg de azul de bromofenol, 12 ml fe glicerol y 4 ml de agua.

• Persulfato de amonio 10%: la solución debe mantenerse en desecador y prepararse al momento. Pesar 0,5 gr y enrasar en 5ml.

• Solución de SDS 10%: 10 gr de SDS y disolver en 100ml. • Solución fijadora: 250 ml de metanol, 35 ml de de ácido acético, 215 ml de agua. Guardar

en recipiente hermético. • Colorante azul de Coomassie R-250: 0,25 gr de colorante azul de Coomassie R-250, 225 ml

de metanol, 46 ml ácido acético, 230 ml de agua. Se disuelve el colorante en metanol, luego agregar el ácido y por último el agua.

• Decolorante: 200ml de metanol, 100 ml de etanol, 50 ml de ácido acético 650 ml de agua.

Muestra de proteínas: pesar 20 mg de cada proteína por separado. Para disolver se usa la disolución amortiguadora de las muestras y solo se preparará la solución en el momento de su uso. Para muestras complejas puede usarse una concentración de proteínas de 10 mg/ml, y cargarse unos 30 µl de muestra por pocillo.

3. Procedimiento

Preparación del gel de poliacrilamida. En este caso el gel de poliacrilamida tiene 2 partes: una superior que en este caso se hará al 4% denominada gel compactador o stacking, y una inferior o gel de separación en este caso al 12%.

Componentes

Gel Separador 12% Gel Compactador 4%

Agua de ionizada 11781 µl 6000 µl Amortiguador gel 8750 µl 2520 µl

SDS 350 µl 132 µl Acrilamida/bisacrilamida 14000 µl 1320 µl

TEMED 21 µl 8 µl Persulfato amónico 105 µl 40 µl

El gel stacking tiene la función de apilar las proteínas, el pH de este gel es de 6,8 y desplaza levemente el equilibrio de la glicina (pI: 6,1) hacia la forma con carga negativa y esta migra más lentamente. Dado que las proteínas pueden migrar más rápidamente que los iones Cl- y sumado al bajo % de acrilamida/bis-acrilamida hace que las proteínas tiendan a apilarse en la zona de baja conductancia.

PRÁCTICAS DE

3 Prácticas de Laboratorio – Bioquímica - 3º - Grado en Química

Una vez que están en el gel separador, la glicina está a pH 8,8 y está cargada negativamente haciendo que el voltaje sea homogéneo en todo el gel, y la separación sea función del peso molecular de la proteína.

1. Primero se prepara la parte inferior del gel (gel separador). En este caso será un gel al 12% del cual prepararemos 35ml (para un gel de 16x18 cm y un espesor de 1,5 mm). Los cristales deben estar bien limpios. Se ensambla el molde del gel teniendo especial cuidado en que los separadores estén bien sujetos (firme pero con cuidado de que no se rompan) a cada lado por las pinzas de sujeción y sin que sobresalgan ni queden cortos. Se coloca el peine y se hace una marca a 1 cm desde el final de este.

2. Una vez preparado el molde se coloca en la parte de la cubeta destinada a la preparación del gel. La parte inferior está formada por una tira rectangular que por una cara es de goma y por la otra es un material mullido, se pondrá la goma hacia arriba y sobre esta el molde, el cual se presionará hacia abajo para introducir las piezas de sujeción y se girará ½ vuelta.

PRÁCTICAS DE

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3. En un vaso de precipitados se prepara la mezcla para la polimerización, para el gel separador se preparan 35 ml de la siguiente forma: 11781 µl de agua desionizada, 8750 µl de amortiguador separador, 350 µl de SDS y 14000 µl de acrilamida/bisacrilamida. Para iniciar la reacción se añaden 21 µl de TEMED y 105 µl de persulfato amónico se mezcla pero sin formar burbujas y se vierte con cuidado en el molde hasta la marca hecha antes. Para evitar que se forme menisco en el gel se añade una delgada capa de agua depositándola con cuidado para que no se mezcle con la solución de polimerización.

4. Después de unos 15 minutos la mezcla está completamente polimerizada, esto se puede ver porque la interfase entre la poliacrilamida y el agua se vuelve visible. Se elimina el exceso de agua y se coloca el peine.

5. Ahora se prepara el gel superior que compactará las muestras, en este caso se preparan 10 ml de la misma forma que para el gel inferior. En un vaso de precipitados se mezclan 6000 µl de agua desionizada, 2520 µl de amortiguador compactador, 132 µl de SDS y 1320 µl acrilamida/bisacrilamida, 8 µl de TEMED y 40 µl de persulfato amónico.

6. Una vez polimerizado se quita el peine con cuidado y se coloca el gel dentro de la cubeta para la migración y se ajusta el reservorio superior del tampón con las piezas de sujeción. De forma similar a como se hizo para el montaje del molde, se aprieta el reservorio y se gira ½ vuelta la pieza de sujeción.

7. Un vez se ha ajustado se rellena con el tampón de la cámara (diluido a 1x) tanto el reservorio superior como el inferior y se cargan las muestras en los pocillos con ayuda de una jeringuilla.

8. Se inserta la carcasa, se fija el voltaje a 200 V y se deja migrar hasta que el azul de bromofenol llegue casi hasta el final del gel.

PRÁCTICAS DE

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9. Una vez que ha terminado de migrar, se saca el gel del molde y se sumerge en la solución de fijación durante 15 minutos en un recipiente cerrado para que lo vapores no salgan al ambiente.

10. Se saca el gel de la solución de tinción y se sumerge en la de coloración con azul de Coomassie durante 1 hora, luego se elimina el exceso de colorante limpiando con la solución de decoloración.

3. Resultados y cuestiones

• Medir las distancia de las diferentes bandas usando como referencia la migración del azul de bromofenol. Calcular el Rf para cada banda.

• Contestar a las siguientes preguntas: 1.- ¿Cuál es el agente entrecruzador (cross-linking), iniciador y catalizador en la reacción de polimerización del gel de poliacrilamida?

2.- ¿Qué clase de electroforesis has realizado en la práctica, a) desnaturalizante o b) nativa? Razona la respuesta.

3.- En la electroforesis aplicada en base a qué se produce la migración de las proteínas. Explicar el papel del SDS.