Guia Practicos 2009 Micro

UNIVERSIDAD IBEROAMERICANA DE CIENCIAS Y TECNOLOGAFacultad de Medicina Veterinaria, Ciencias Agrarias y Forestales Dr. Ivn Palaviccino Hernndez

GUIA LABORATORIO MICROBIOLOGA

Profesores: Dra. Alejandra Viera lvarez Mdico Veterinario Magster en Cs. Veterinarias Dra. Maria Eliana Vega Licenciada en Tecnologa Mdica

2009

Universidad Iberoamericana de Ciencias y Tecnologa Laboratorio de Microbiologa

PRCTICO N1: SEGURIDAD EN EL LABORATORIO Los laboratorios dedicados al trabajo en Microbiologa deben cumplir con una serie de caractersticas que aseguren las condiciones de trabajo y la seguridad de las personas. La seguridad en el laboratorio debe ser tanto para las personas que estn directo contacto con el manejo de microorganismos, como para las personas y animales del entorno. El objetivo de la seguridad biolgica es el de disminuir y prevenir la salida y/o exposicin a agentes que puedan ser peligrosos para las personas que trabajan tanto dentro como fuera de este tipo de laboratorios. La seguridad biolgica se puede resumir en tres elementos indispensables que son: Las Tcnicas de Laboratorio El equipo de seguridad Diseo de la Instalacin

Las tcnicas y prcticas de laboratorio es el elemento ms importante de la seguridad, ya que es de vital importancia el correcto cumplimiento de las normas de trabajo dentro del laboratorio. Las personas que estn en contacto directo con agentes infecciosos o materiales infectados deben estar concientes de los peligros potenciales que esto significa y deben recibir la informacin adecuada para el manejo del respectivo material. El equipo de seguridad deben ser adecuado para el manejo de este tipo de agentes, al igual que el diseo de su instalacin.

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MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 1. Usar delantal blanco, debe usarse abrochado para prevenir la contaminacin de la ropa de calle. 2. Mantener el cabello recogido o protegido con un gorro o red limpio. 3. Evitar entradas y salidas en el laboratorio con frecuencias innecesarias. 4. Evitar movimientos bruscos y rpidos. Es necesario aprender a moverse en el laboratorio. 5. No est permitido fumar, comer, beber o el uso de cosmticos. 6. No colocar objetos personales sobre la mesa de trabajo. 7. No usar los refrigeradores, estufas o microondas para calentar alimentos. 8. Lavarse las manos al entrar y salir del laboratorio, desinfectar y secarse con toallas desechables. 9. No hacer uso de pauelos o del delantal para limpiar superficies y/o instrumentos del laboratorio. 10. Comunicar inmediatamente cualquier sospecha de riesgo qumico, microbiolgico o qumico. 11. Est prohibido pipetear con la boca. 12. Cuando se estn realizando experimentos las puertas deben estar cerradas. 13. El laboratorio no permite la presencia de animales o plantas no relacionadas con el trabajo que se est realizando. REGLAS GENERALES PARA EVITAR RIESGOS I Riesgos Fsicos

1. Asegurarse de que todos los equipos tengan lnea de coneccin a tierra. 2. No mantener equipos o realizar conexiones con las manos hmedas. 3. Mantener un elevado nivel d seguridad o irradiaciones por luz ultravioleta.

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II

Riesgos Qumicos una habitacin aislada del edificio. El lugar debe ser fo y bien ventilado. Estos materiales deben mantenerse en sus envases originales.

1. Mantener los materiales voltiles, inflamables y txicos en un gabinete metlico o en

2. No transferir grandes volmenes de lquidos peligrosos. 3. Transferir los materiales inflamables en habitaciones bien ventiladas. 4. Evitar almacenar juntos reactivos incompatibles. 5. Etiquetar todos los reactivos indicando con dibujo de una calavera el caso que sean productos txicos. 6. Tener disponible neutralizantes para cualquier emergencia. 7. Tener disponibles extintores de incendios. III Riesgos Microbianos 1. Debe darse estricto cumplimiento de las normativas, con el fin de minimizar los riesgos de contaminacin, enfermedades y asegurar la confiabilidad de los anlisis efectuados.

BIOSEGURIDAD Es un conjunto de normas preventivas destinadas a proteger la salud de los funcionarios frente a riesgos por agentes fsicos, biolgicos o qumicos en el laboratorio.

Niveles de Bioseguridad Grupo I: Bajo riesgo individual Bajo riesgo comunitario Grupo III: Alto riesgo individual Bajo riesgo comunitario Grupo II: Moderado riesgo individual Limitado riesgo comunitario Grupo IV: Alto riesgo individual Alto riesgo individual

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CLASIFICACIN DE LABORATORIOS NIVEL I Grupo de riesgo: I Laboratorio de entrenamiento bsico Microorganismos: Eschericha coli, Bacillus subtilis, etc. Tcnicas corrientes No hay equipos de seguridad especficos NIVEL II Grupo de riesgo: II Laboratorio de entrenamiento bsico Laboratorio de diagnstico de hospitales clnicos. Microorganismos: Salmonella, Hepatitis, Vibrio cholerae, Brucilla Tcnicas corrientes y acceso limitado Puertas cerradas, personal adiestrado. Gabinete de Bioseguridad NIVEL IV Grupo de riesgo: IV Clasificacin del laboratorio en contencin mxima Laboratorio de diagnstico de patgenos exticos: virus bola Tcnicas corrientes y sistemas de ingreso especiales. Equipo de seguridad especfico y gabinete de bioseguridad III (hermtico).

NIVEL III Grupo de riesgo III Clasificacin de laboratorio en contencin. Laboratorio especializado Microorganimos: Virus encefalitis, meningococo, SIDA. Tcnicas corrientes y acceso restringido Puertas se abre slo por dentro, ventilacin especial. Equipo de seguridad especficos y diseados.

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PRCTICO N2: ESTERILIZACIN La esterilizacin se define como la destruccin completa o eliminacin total de los microorganismos patgenos y saprfitos que se encuentran en el interior o en la superficie de objetos y sustancias. Criterio: ausencia de crecimiento microbiano en un medio adecuado. La eliminacin de microorganismos se puede realizar mediante procesos fsicos, qumicos o mecnicos. Los mtodos fsicos y mecnicos se realizan a travs de esterilizacin y los qumicos a travs de desinfeccin. El mtodo de esterilizacin depende de la naturaleza y estabilidad del producto frente al calor. Por ejemplo si requerimos agregar suero equino a un medio de cultivo lquido, no podemos aplicar calor para esterilizarlo, ya que se producira la coagulacin de las protenas del suero alterando su composicin. Situacin que sucede con toda sustancia termolbil, para lo cual se utilizan mtodos que no alteren su estabilidad cono por ejemplo irradiaciones. CLASIFICACIN DE LOS MTODOS DE ESTERILIZACIN 1. Mtodos Fsicos: se basa en la aplicacin de mtodos fsicos naturales tales como: calor, luz ultravioleta, radiaciones ionizantes, etc.. Estos mtodos conducen a lo que se designa con el nombre de asepsia, es decir ausencia total de microorganismos patgenos y saprfitos. 2. Mtodos Qumicos: a travs de sustancias qumicas como xido de etileno, fenol, alcohol, halgenos, se impide o retrasa el metabolismo bacteriano. Estos conducen a la antisepsia (impedimento o retraso del desarrollo de patgenos) y/o desinfeccin (destruccin de microorganismos patgenos y saprfitos sobre objetos o superficies).

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3. Mtodos Mecnicos: las sustancias que no se pueden esterilizar a travs de calor o a travs del uso de alcohol, se someten a filtracin. Esto se basa en procesos fsicoqumicos observados entre los cuerpos microbianos o elementos en suspensin y una sustancia semiporosa. As se consigue separar y retener los microorganismos de los lquidos que los contienen. Los lquidos filtrados deben pasar con presin o vaco canalculos a nivel de cuyas paredes los microorganismos son retenidos por absorcin. En el mecanismo de absorcin influyen factores como la viscosidad, pH, cargas elctricas, tiempo y temperatura. Los filtros pueden ser de asbesto, vidrio, porcelana, celulosa y tiene un dimetro de poro inferior al de las bacterias (0,22 m) METODOS FSICOS a) Calor Seco: permite aumentar las reacciones de oxidacin de los microorganismos. Llama:

La destruccin de los microorganismos mediante llama es eficaz cuando el material a esterilizar es indestructible o se va a inutilizar. Se usa para esterilizar el asa de platino que se calienta al rojo blanco (1300C), esptulas, pinzas, pipetas, bocas de tubo de matraces), empleando la llama del mechero Bunsen por un tiempo de exposicin de 10 segundos (tambin se denomina flameado). Cuando a dems de matar las bacterias, se destruye mediante el fuego el material que las contiene, se habla de incineracin. Este procedimiento se utiliza para destruir animales muertos de enfermedades contagiosas, ropa, vendas y objetos altamente contaminados. Por aire caliente:

El aire caliente confinado a temperatura de 160 a 180C mantenido durante 1 hora, destruye con seguridad todas las bacterias y sus esporas. Para su aplicacin se recurre al horno de aire caliente, siendo el ms usado el horno Pasteur, utilizado para esterilizar material de vidrio (tubos, placas Petri, matraces), porcelana y acero entre otros.

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Manejo del horno Pasteur - El material debe estar limpio y seco y se envuelve con papel craff. - Los tubos de vidrio y matraces se tapan con algodn hidrfobo y papel aluminio. - Evitar el contacto directo del material con las paredes. - Temperatura ptima 180C por 1 hora, dejar enfriar y retirar. b) Calor Hmedo: permite mecanismo produce la coagulacin de las protenas del protoplasma bacteriano y de los cidos nucleicos, destruyendo las membranas celulares. Se considera ms efectivo que el calor seco por su mayor poder de penetracin. Por agua en ebullicin:

El agua a 100C es suficiente para matar formas vegetativas de bacterias, pero no sus esporas. Se utiliza para esterilizar jeringa, agujas, pinzas, las cuales se sumergen en bao con agua en ebullicin de 10 a 20 minutos.. Por vapor fluente:

Se utiliza para la esterilizacin de instrumentos de ciruga, equipos de lechera, equipos de industria de alimentos. Puede alcanzar una temperatura de 100C sin presin y a nivel del mar durante 10 minutos (no destruye esporas). Vapor de agua a presin:

El vapor de agua a 100C permite eliminar las formas vegetativas bacterianas, sin embargo a veces pueden sobrevivir sus esporas, para lo cual se eleva la temperatura hasta 121C a 1 atmsfera de presin o 15 libras /pulgada 2 durante 15 minutos. Este sistema es utilizado para esterilizar medios de cultivo, artculos de plstico y soluciones. Estos equipos son denominados Autoclaves, donde existen diversos modelos d ecarga vertical u horizontal, pero en general todos constan de una fuente calrica (gas, electricidad o red de vapor), manmetro (escala lb/in 2 o Kg/cm 2 o atmsferas), termmetro, llave de escape de vapor, vlvula de seguridad, llave de carga de agua, llave de entrada de agua. El manejo del autoclave implica cargar agua destilada en el fondo, colocar el material bien tapado (gasa, papel craff o algodn hidrfobo) en un cesto metlico, cerrar hermticamente8

la tapa, encender el sistema calrico y abrir la llave de escape de aire mientras se llena de vapor, luego cerrar para evitar el escape del mismo, hasta que alcance la presin y temperatura deseadas, controlando el manmetro para mantener los valores constantes durante 15 minutos (los elctricos tienen termorreguladores automticos). Luego abrir la llave de vapor hasta que la presin marque cero y abrir el autoclave. Como precaucin el autoclave debe ser cargado con el material en forma homognea, evitando la formacin de bolsas de vaco y permitir la circulacin homognea de vapor. c) Radiaciones: Esta fuente de energa es absorbida por el ADN de los microorganismos produciendo mutaciones letales o modificaciones qumicas del ADN de manera de interferir en su multiplicacin. Tambin inducen a la formacin de sustancias qumicas como oxhidrilos y tomos de hidrgeno, altamente reactivos con los procesos celulares vitales. La radiacin ultravioleta acta directamente sobre el ADN, por produccin de perxidos orgnicos en los lquidos que contienen oxgeno y compuestos orgnicos. Luz solar:

Tiene una propiedad bactericida muy eficaz, en especial entre longitudes de onda de 2.100 a 3.000 angstroms. Las bacterias esporgenas son ms resistentes que las asporgenas. Lo mismo sucede con las bacterias fluorescentes que convierten las ondas cortas (germicidas) en ondas largas de menor actividad. No es de mucha utilidad su accin esterilizante en el laboratorio. Radiaciones ultravioleta:

Los rayos UV tienen un escaso poder de penetracin, lo que hacen que ejerzan su accin sobre las superficies del material expuesto a la irradiacin, lo que explica su utilidad en el laboratorio. Generalmente se utilizan lmparas que emiten luz con longitud de onda entre 2.650 y 2750 angstroms para la esterilizacin del aire, ambiente y superficies de trabajo, campo quirrgico, etc.. Debe mantenerse un registro de las horas de esterilizacin de cada tubo, pues tienen una vida til limitada. .

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Radiaciones ionizantes:

Las ms utilizadas son las radiaciones gama, que son de lata energa emitida por un istopo radiactivo de Cobalto 60 o Cesio 137. Tienen un alto poder de penetracin y no generan calor por lo que son utilizadas para la esterilizacin de material termosensible como el plstico (tubos, placas, jeringas y bolsas sesechables), suturas, etc. METODOS MECNICOS a) Filtracin: los de uso frecuente en el laboratorio son:. Filtros Seitz: discos de asbesto de diferentes dimetros y diferente porosidad que se montan en un aparato metlico donde se coloca un lquido a filtrar. Los discos se desechan despus de un solo uso. Filtros de vidrio poroso: se fabrican a base de vidrio pulverizado comprimido. Filtros de membrana: de steres de celulosa (acetato o triacetato) con 12 porosidades distintas, de 0.22 m de dimetro esterilizantes (para las bacterias). METODOS QUMICOS Los antispticos y desinfectantes son sustancias qumicas ampliamente utilizadas y de acuerdo a su accin se pueden clasificar en bactericidas (destruyen bacterias) o bacteriostticos (que inhiben el desarrollo bacteriano, pero que se reanuda cuando se retira el agente, es decir es reversible). La actividad germicida de los distintos desinfectantes depende de las condiciones de uso, concentracin, tiempo, temperatura, pH, cantidad y calidad de la materia orgnica presente, caracterstica de la superficie, tipo y concentracin de microorganismos, entre otros. Los ms frecuentemente usados en el laboratorio son: 1. Alcoholes: alcohol etlico no txico, incoloro e inodoro, es til contra las formas vegetativas pero ineficaz contra las esporas, que acta desnaturalizando las protenas. La concentracin ptima es al 70%. Alcohol isopropilo es ms bactericida que el etanol.10

2. Cloro: El hipoclorito de sodio comercial viene en una concentracin del 10%, el cual 0para su uso en el laboratorio debe estar diluido al 1%. Su accin bactericida es por accin de los grupos sulfidrlos libres. 3. Yodo: El tiene una accin bactericida sobre las formas vegetativas y esporas, hongos y algunos virus. Acta sobre el proceso de yoduracin y oxidacin , interfiriendo en los procesos de xido reduccin y fosforilacin bacterianos. Se utiliza como tintura (solucin alcohlica al 2-3%), Lugol (solucin acuosa al 5%), o para aumentar la accin bactericida del alcohol etlico (alcohol yodado al 2%). 4. Yodoforos: Es una asociacin de yodo con polmeros (polivinil pirrrolidina) generalmente al 10% que permite una liberacin lenta de yodo (1%). Tiene accin bactericida y se utiliza como antisptico y desinfectante. 5. Fenol: Al 0.2% tiene una accin bacteriosttica, al 1% es letal para la mayora de las bacterias y al 1.5% es fungicida. Se usa en soluciones acuosas, es de bajo costo y tiene un gran poder de penetracin an en la piel intacta. 6. Iones de metales pesados: Sales de mercurio (mercurio cromo), plata (nitrato de plata), Zinc (sulfato de zinc) y cobre (sulfato de cobre) en concentraciones altas desnaturalizan las protenas. Actan combinndose a los grupos sulfidrilos. Se inactivan fcilmente en presencia de materia orgnica y no actan sobre las esporas. 7. Agentes alquilantes: sustituyen tomos lbiles de hidrgeno con radicales alquilo. Un ejemplo es el xido de etileno que se usa para esterilizar materiales plsticos. Tiene una gran penetracin, muy activo contra esporas y virus. Es extremadamente txico y forma mezclas ex0plosivas con el aire. 8 Detergentes: son sustancias tensioactivas que disminuyen la tensin superficial, modificando la barrera osmtica y permeabilidad de la membrana celular, de manera que la clula no puede mantener su segurida. Pueden ser sustancias no inicas (sin efecto antimicrobiano), aninicas (bactericidas) y catinicas (amonios cuaternarios).11

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Formaldehido: Puede utilizarse en solucin (formalina), o al estado gaseoso como gas formol para desinfectar ambientes de trabajo. Al mezclar permanganato de potasio con formalina, se libera gas formol que es altamente bactericida y viricida.

Esterilizacin de virus La velocidad de inactivacin de los virus se relaciona con la concentracin del agente y la duracin de la exposicin. - Son agentes inactivantes el formaldehdo, luz ultravioleta, hidrocilamina y elementos radioactivos. - Son agentes activos el calor, enzimas proteoliticas, cidos dbiles, luz ultravioleta, compuestos sulfidrilos y detergentes. - Son agentes lipotrficos solventes como el cloroformo.

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PRCTICO N3: MEDIOS DE CULTIVO Los microorganismos pueden vivir y multiplicarse sobre substratos nutritivos preparados en el laboratorio, que son denominados medios de cultivo. Los medios de cultivo son preparados estriles y contienen algunas sustancias necesarias para el desarrollo de los microorganismos, tales como: agua, carbono, nitrgeno, hidrgeno, calcio, fsforo y hierro, mientras que los ms exigentes requieren aminocidos, vitaminas, purinas y otras sustancias que no pueden sintetizar. CONDICIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1. Contener sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos tales como aminocidos, carbohidratos, polialcoholes, vitaminas, minerales. 2. Tener un pH que permita el desarrollo ptimo, por lo general las bacterias patgenas necesitan un pH neutro o ligeramente alcalino (7.0-7.4), en cambio lsa levaduras y hongos requieren un pH cido (5.0). 3. Estar previamente esterilizados o preparados en condiciones aspticas. 4. Estar protegidos de la contaminacin ambiental por tapones de algodn card, tapones de goma, tapas metlicas o roscas. UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1 2 3 4 5 Aislamiento de bacterias desde una muestra o material patgeno (secrecin purulenta, Estudio morfolgico de las colonias. Conservacin de cepas identificadas (coleccin de cepas identificadas (cepario). Clasificacin y tipificacin de bacterias por estudio de sus propiedades bioqumicas en Obtencin de toxinas o investigacin de sus caractersticas.13

orina, rganos, fecas) o de un alimento (leche, carne).

medios diferenciales.

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Cultivo y cosecha de bacterias para la elaboracin de productos biolgicos (vacunas,

antgenos, bacterinas, toxoides). CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1. Segn el estado fsico a) Medios Lquidos: Se utilizan para favorecer el desarrollo bacteriano de clulas estresadas. En determinadas ocasiones no se pueden sustituir por los medios slidos, por ejemplo en la sntesis de exotoxinas, pigmentos, enzimas. Ej. Agua peptonada, Caldo comn, Caldo Cerebro corazn, Caldo Saboreaud. b) Medios Slidos: Se utilizan para obtener bacterias aisladas por la formacin de colonias sobre la superficie del medio de cultivo y para el estudio de la morfologa de las colonia, lo que no permiten los medios de cultivo lquidos. Se diferencian porque tienen una sustancia de sostn que puede ser agar-agar o gelatina. Ej. Agar comn, Agar SS, Agar Cerebro corazn, Agar Saboreaud. c) Medios semislidos: Utilizados para estudiar la motilidad de las bacterias. Tienen un menor porcentaje de agar, de modo que no siendo completamente slidos, no solidifican totalmente a la temperatura ambiente. Ej. Agar MIO, SIM. Los medios slidos tienen generalmente agar-agar como agente solidificante, espesante o gelificante. El agar-agar es una sustancia hidrofilita de carcter coloidal procedente de diversas especies de lagas marinas, especialmente del tipo gelidium, que tiene la propiedad de formar gel. Qumicamente el agar-agar es un polisacrido de cadena larga, dependiendo del tamao del poder gelificante. El agar-agar se expende en forma granulada o en polvo, es insoluble en agua fra, se disuelve solamente a temperatura de ebullicin, se mantiene en forma viscosa a 60-80C y se solidifica en forma de un gel estable a 40-45C. Resiste las temperaturas de esterilizacin a 121C y por su capacidad de retener agua no se deshidrata fcilmente, se puede almacenar a 5C por un largo perodo de tiempo.14

La gelatina no puede reemplazar al agar en la preparacin de los medios slidos, ya que es atacada y descompuesta por muchos tipos de bacterias. Se aade a los medios de cultivo para estudiar si las bacterias son capaces de atacarla (presencia de enzimas gelatinazas). 2. Segn su utilidad prctica a) Medios corrientes, comunes o bsicos: son aquellos apropiados para el cultivo y mantencin de la mayora de las bacterias. Sirven de base para la preparacin de medios especiales. Ej. Caldo comn, Agua peptonada, Agar Nutritivo. b) Medios especiales: Medios mejorados, Selectivos de diagnstico, Diferenciales o Indicadores. Son aquellos medios de cultivo que por su riqueza nutritiva, sirven para el cultivo de bacterias muy exigentes. Contienen en su formulacin sustancias inhibidoras para ciertas bacterias, que permiten el aislamiento y diagnstico precoz de aquellas bacterias que nos interesan por ser agentes etiolgicos de las enfermedades infecciosas. Tambin pertenecen a este grupo aquellos medios que por adiccin de sustancias qumicas determinadas, facilitan el diagnstico por caractersticas bioqumicas de algunas especies microbianas. Medios Mejorados: Se obtienen aadiendo a los medios corrientes sustancias de mayor valor nutritivo, que tienen el efecto de proporcionar condiciones favorables para el cultivo de bacterias exigentes (Estreptococos, Corynebacterium). Las sustancias aadidas pueden ser sangre desfibrinada (conejo, caballo o cordero), suero sanguneo, suero fetal bovino, huevo, cerebro, corazn, trozos o extracto de hgado, carne o levadura, etc. La mayora de estas sustancias por ser proteicas coagulan con el calor, lo cual impide que sean esterilizadas en autoclave. Deben por lo tanto ser esterilizadas por filtracin o ser agregadas a los medios previamente esterilizados, en condiciones de rigurosa asepsia. Ej. Agar sangre, Agar cerebro corazn.

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Medios Selectivos: Generalmente el microorganismo patgeno causante del cuadro infeccioso que se desea aislar a partir de la muestra, no se encuentra puro sino que convive con otras especies sin inters diagnstico. As por ejemplo es frecuente que las fecas, orina, exudados, alimentos, agua, etc. Estn altamente contaminadas con bacterias saprfitas que por su desarrollo exuberante en los medios de cultivo corrientes, inhiben el crecimiento o enmarcan la presencia del agente patgeno buscado. Estos medios se caracterizan por estimular el desarrollo de ciertas especies bacterianas y a la vez de inhibir el desarrollo de ciertas especies bacterianas y a la vez de inhibir el desarrollo de otras especies, lo que permite l aislamiento y diagnstico de las bacterias con facilidad y rapidez. Esto se logra con la adicin de sustancias colorantes como anilinas, sales biliares , antibiticos, etc.. Ej. Agar Brucilla, Agar PPLO, Caldo Selenito Cistina,etc.. Medios Indicadores o diferenciales: Son medios comunes o mejorados que con la adicin de ciertas sustancias ponen de manifiesto propiedades bioqumicas, inherentes a algunas especies bacterianas, como por ejemplo produccin de gas, H2S, de cidos, sustancias alcalinas, accin proteoltica, accin lipoltica, etc.. Estas sustancias indicadoras permiten diferenciar rpidamente una especie microbiana de otra. Ej. Agar Baird Parker, Agar Rambach. Ej. Agar Mac Conkey se utiliza para aislar e identificar E. Coli. Este contiene Cristal violeta y sales biliares que inhiben el desarrollo de Gram positivas. Las cepas de E. coli se distinguen por el color rojo de las colonias, que al fermentar lactosa generan cido haciendo virar el indicador rojo neutro hacia un rojo mas fuerte. Las sales biliares precipitan produciendo un halo caracterstico alrededor de las colonias. Proteus vulgaris no fermenta lactosa y produce colonias transparentes. Ej. Caldo Tripticasa Soya como medio corriente permite el desarrollo de una amplia variedad de bacteria y puede hacerse selectivo para el desarrollo de S. aureus al agregarle un 10% de NaCl, que inhibe el desarrollo de otras bacterias.16

3 . Segn su Origen - Origen animal: caldo cerebro corazn - Origen vegetal: Caldo papa, Caldo Levadura - Sintticos: medios deshidratados. La mayora de los medios comerciales son productos deshidratados, estriles y estandarizados. Las empresas productora son; Disco Laboratorios (USA), BBL, Gibco, Oxoid, Merk entre otras. COMPOSICIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Segn la finalidad los medios de cultivo pueden tener en su composicin de los siguientes ingredientes: a) aminocidos (hidrolizado de protenas) b) Extractos c) Productos biliados d) Carbohidratos e) Productos bioqumicos f) Colorantes e indicadores 1) Peptonas: stas se preparan por hidrlisis enzimtica (pepsina, tripsina, enzimas pancreticas) de protenas naturales (animal, sangre, gelatina, poroto de soya). El producto de la hidrlisis son peptonas, protenas secundarias, polipptidos, dipptidos y aminocidos libres dejndolos disponibles para el uso de bacterias para su crecimiento. Las peptonas se denominan de acuerdo a la protena de origen y a la enzima utilizada: Triptona o tripticasa, correspondiente a la digestin pancretica de la casena, peptona de carne a la digestin tripsnica de carne vacuno. 2. Extractos: son concentrados de tipo acuoso obtenidos bajo calentamiento y luego son deshidratados. Debido a su riqueza en protenas y factores de crecimiento constituyen una base valiosa para la preparacin de medios de cultivo. Se emplean extractos de carne y levadura.17

3. Productos biliados: se obtiene de la bilis fresca de vacuno, que se somete a un proceso de precipitacin, concentracin y deshidratacin. La bilis se utiliza como agente inhibidor selectivo en algunos medios de cultivo para propagar bacterias intestinales. 4. Carbohidratos: Son ingredientes muy importantes en los medios de cultivo, pues la mayora de las bacterias tienen un metabolismo fermentativo. Se utilizan en los medios de cultivo diferenciales para identificar bacterias segn su capacidad de metabolizar algn azcar en particular. 5. Productos bioqumicos: Estimulan el desarrollo bacteriano o son agentes selectivos, como es el caso de los antibiticos. Pueden tener la finalidad de ser agentes diferenciales como el Telurito de potasio que se le agrega al agar Baird Parker para diferenciar colonias de S. aureus, que es capaz de reducirlo a Telurito metlico dando a las colonias un color negro caracterstico. 6. Colorantes e indicadores: Se utilizan en los medios selectivos y diferenciales. Los colorantes actan como agentes bacteriostticos o como inhibidores del crecimiento. Entre estos podemos mencionar la Fucsina bsica, Verde brillante, Verde malaquita, Cristal violeta, Eosina, Azul de metileno, Tionina, etc.. Los indicadores son sustancias qumicas que varan de color segn el pH del medio. Se utilizan en los medios diferenciales y permiten visualizar por cambios de color del medio de cultivo o de las colonias la ocurrencia de reacciones bioqumicas.

INDICADOR Rojo fenol Rojo neutro Rojo metilo Azl bromotimol Prpura BC Fenolftaleina

CIDO Amarillo (6.8) Amarillo (6.8) Rojo Fuerte (4.4) Amarillo (6.0) Amarillo (5.2) Incoloro (8.3)

NEUTRO Rojo Rojo Rojo Verde Azul Rosado

ALCALINO Fucsia Amarillo Amarillo Azul Prpura Fucsia

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PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1. Se utiliza material de vidrio 2. Si utiliza medios de cultivo deshidratados comerciales debe pesar la cantidad indicada en una balanza con sensibilidad de 0.1g. 3. Colocar la cantidad indicada en un matraz Erlenmeyer o vaso precipitado de vidrio, limpio y seco, recipiente con un volumen un 50% ms del que se preparar. 4. Agregar agua destilada y disolver con bagueta de vidrio y calentar a bao Maria hasta la disolucin de componentes (sin grumos). Los caldos se disuelven rpidamente. 5. Medir el pH del medio y verificar si es el requerido por la frmula. Ajustar con NaOH 0.1N (para alcalinizarlo) o HCl 0.1N (para acidificarlo) lentamente para obtener el pH de preparacin adecuado. 6. Para esterilizar los agares en matraces o caldos en tubos se tapan con tapa rosca o algodn card y gasa y tapar con papel craft. 7. Colocarlos en canastillos y llevar al autoclave a 121C por 15 minutos. 8. Los agares se enfran a 45 o 50C antes de vertirlos en placas Petri, mientras que los caldos a temperatura ambiente.

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Universidad Iberoamericana de Ciencias y Tecnologa Laboratorio de Microbiologa PRCTICO N4: EXAMEN MICROSCPICO Y MACROSCOPICO DE LAS BACTERIAS El examen microscpico de las bacterias se pude realizar de 2 maneras: en FRESCO y PREPARACIONES FIJADAS Y TEIDAS. En Fresco: se emplean para el estudio de algunas caractersticas de los microorganismos, como por ejemplo motilidad, aglutinacin, yemacin, y para observar microorganismos vivos. Por ejemplo al observar sangre, lquido cefaloraquideo, orina, pus, etc. y tambin para hacer estudios citolgicos como leucocitos y la presencia o no de ellos, glbulos de pues, parsitos, etc. Tcnica: Si la muestra es lquida colocar una gota de material patolgico en un portaobjetos. Si es slida hacer una suspensin con suero fisiolgico. Si desea hacer una observacin en fresco desde una colonia aislada, hacer una suspensin con suero fisiolgico. Luego cubrir con un portaobjetos. Una vez lista la preparacin observar al microscopio con el condensador abajo y utilizar el objetivo seco de mayor aumento. En preparaciones fijadas y teidas: Las bacterias vivas son casi incoloras y no tienen suficiente contraste con el medio que la rodea, lo cual hace su observacin dificultosa. Al teirlas se les otorga un contraste de color respecto al medio que la rodea, ya que el colorante reacciona con la clula pero no con el medio externo, con lo cual se hacen ms visibles. Las ventajas de la tincin son: - Proporciona un contraste que permite una mejor visualizacin de las bacterias. - Permite el estudio en detalle de la morfologa de las bacterias. - Permite el estudio de las estructuras internas y externas de las bacterias (flagelos, esporas, ncleo, cpsula, pared celular, etc). - Permite lograr una ampliacin mayor (lente de inmersin)20

Extensin Los portaobjetos deben estar limpios y desgrasados, para lo cual pueden mantenerse en una mezcla de alcohol y acetona. Una vez secos, colocar una gota del material a examinar en el centro, diluir con suero fisiolgico haciendo una suspensin y extender en una capa delgada y uniforme. Fijacin: Tiene por objetivo matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la clula y adherir las bacterias la vidrio del portaobjeto, evitando que se desprenda en los lavados posteriores. Esto se realiza pasando la preparacin sobre una llama suave de 2 a 3 veces. Coloracin: Los colorantes son sintticos. Se dividen en grupos cidos y bsicos. Los bsicos estn formados por un catin coloreado y un anin incoloro, mientras que en los colorantes cidos es todo lo contrario. Como las clulas bacterianas son ricas en cidos nucleicos que tienen cargas negativas en forma de fosfatos, estas cargas se combinan con los colorantes bsicos cargados positivamente, por lo cual la bacteria se tie uniformemente, ya que existen cidos nucleicos tanto en el ncleo como citoplasma (ARN). Los colorantes cidos tienen mayor afinidad a combinarse con el citoplasma de las clulas de los organismos superiores. En bacteriologa se usan casi exclusivamente colorantes bsicos (Cristal violeta, Fucsina, Safranina, Azul de metileno). Existen 2 mtodos de coloracin principales: 1. Coloracin Simple: Consiste en hacer actuar sobre la preparacin fijada un solo colorante (azul de metileno, safranina, fucsina al 10%). Tcnica: - Cubrir la preparacin con el colorante. - Dejar actuar por 1-2 minutos - Lavar con agua corriente. - Secar con papel absorbente y luego a la llama suave (sin quemar) - Observar con el condensador arriba y con objetivo de inmersin.21

2. Coloracin Doble: Consiste en hacer actuar 2 colorantes diferentes, con una decoloracin intermedia, sobre una preparacin fijada. La coloracin doble consta en general de 4 pasos: Coloracin primaria Adicin de un mordiente, que en una sustancia que aumenta la afinidad o atraccin clula-colorante. La bacteria se tie ms intensamente bajo la accin del mordiente, siendo mucho m difcil lavar el colorante posteriormente. Ejemplos de mordientes son algunos cidos, bases, sales metlicas y solucin yodo-yodurado. Decoloracin Tincin con colorante de contraste. Tincin Gram: es la coloracin ms empleada en bacteriologa por su gran utilidad en la clasificacin de las bacterias. Permite una clasificacin taxonmica de las bacterias, en Gram positivas y negativas, asociandolas a propiedades morfolgicas. La diferenciacin en la pared celular explica que las Gram positivas con mayor porcentaje de peptidoglicanos en su pared retengan mayor colorante luego de la accin del decolorante alcohol-acetona. Tcnica: Teir la preparacin ya fijada con Cristal Violeta durante 2 minutos. Eliminar el exceso de colorante y cubrir con lugol por un minuto (mordiente). Decolorar con alcohol acetona (30 segundos). Lavar con agua corriente Teir con fucsina fenicada por un minuto. Lavar con agua corriente Secar con papel absorbente y luego llama suave Observar con el condensador arriba y con objetivo de inmersin. Las bacterias Gram positivas se tien de color violeta y las Gram negativas de color Rojo.

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Tincin de Zielh Neelsen: se emplea para diferenciar bacterias cido-alcohol resistentes (Micobacterium tuberculosis).Estas bacterias tienen en la pared celular gran cantidad de cido miclico que se une covalentemente a un fosfolpido, formando un complejo estable con la fucsina de carcter hidrofbico que impide la accin del decolorante. Tcnica: Teir la preparacin ya fijada con fucsina concentrada de Zielh Neelsen de 3 a 5 minutos, calentando la preparacin suavemente con la llama del mechero hasta la emisin de vapores (la preparacin no se debe secar y no debe hervir el colorante). Decolorar con cido-alcohol hasta que se desprenda el colorante (aqu las bacterias cido-alcohol resistentes estn teidas de color rojo y las no resistentes estn decoloradas). Lavar con agua corriente. Teir con azul de metileno durante 2 minutos. Lavar con agua corriente. Secar con papel absorbente y luego a la llama suave (sin quemar). Observar con el condensador arriba y con objetivo de inmersin. Las bacterias cido-alcohol resistentes se tien de color rojo y las no resistentes de color azul. Tincin de Olt:: tincin especfica para la tincin de Bacillus anthracis, el bacilo que produce el Carbunclo bacteridiano. a) b) c) d) e) f) Preparar una extensin y fijarla por calor. Teir con el colorante de Olt. Calentar durante 2 minutos, hasta la emisin de vapores, sin que el colorante se Lavar con agua corriente. Secar y observar con objetivo de inmersin. Las bacterias se tien de color rojo y la cpsula de color anaranjado.

seque.

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TINCIONES ESPECIALES Tinciones para Brucellas Mtodo de Stamp (Zielh Neelsen modificado) a) Secar la preparacin al aire b) Fijar por calor c) Teir con Fucsina de Zielh Neelsen diluida 1/10 por 10 minutos. d) Decolorar con cido actico 0,5% por 30 segundos. e) Lavar con agua corriente. f) Teir con azul de metileno 1% por 30 segundos. g) Lavar, secar y observar con lente de inmersin. h) Las brucellas se tien de color rojo sobre un fondo azul. Mtodo de Kster a) Preparar una extensin en la forma habitual. b) Teir con 2 gotas de safranina y 5 gotas de KOH de 1 a 2 minutos. c) Lavar con agua corriente. d) Decolorar con cido sulfrico 0.1% de 10 a 20 segundos. e) Lavar con agua corriente. f) Teir con azul de metileno 1% en etanol de 2 3 minutos. g) Las brucellas se tien de color rojo anaranjado sobre un fondo de color azul negruzco. MORFOLOGA BACTERIANA Una vez teidas las preparaciones se observan al microscopio utilizando un objetivo de inmersin (100X). De esta forma las bacterias se pueden clasificar segn su tincin (Gram positivas o negativas), alcohol- acido resistentes o no, etc. y adems permite el estudio de su morfologa. Se distinguen las siguientes formas y agrupaciones bacterianas: a) Cocaceas: bacterias de forma esfrica, que pueden presentarse aisladas o reunidas de diferentes maneras de acuerdo a su multiplicacin que se efecta por divisin directa. Segn su tincin pueden ser Gram positivos y negativos.24

Segn su agrupacin se distinguen: Diplococos: permanecen unidos de a 2 posterior a su divisin. Estreptococos: cocaceas unidas en cadena. Estafilococos: Cocaceas agrupadas en racimo. Tetracococ: cocaceas dispuestas de a 4. Sarcinas: cocaceas formando grupos en forma de cubos.

b) Bacilos: son bacterias alargadas en las cuales predomina en dimetro longitudinal sobre el transversal. Segn su forma pueden ser: largos y delgados cortos y gruesos con brotes paralelos y extremos en ngulo recto con bordes convexos y extremos de bordes que se juntan en los extremos con un extremo ms grueso que el opuesto (forma de clava o maza).

Segn su agrupacin se distinguen: diplobacilos unidos de a 2 estreptobacilos: unidos en cadena Segn su tincin pueden ser Gram positivos y negativos, Zielh Neelsen positivos o negativos. c) Cocobacilos: Son formas intermedias entre grupos pueden ser gram positivos o negativos. d) Espirilos: Son bacterias delgadas que presentan incurvaciones en varios planos (tienen forma helicoidal). Tambin existen espirilos con una sola incurvacin , llamados Vibrios. e) Esporas: tiene una forma endocelular presente en algunas especies de bacilos. Pueden ser esfricas u Ovaladas y segn su tamao Bacteridia (dimetro menos que el del cuerpo de la bacteria) o Clostridio (el dimetro de la espora es mayor que el dimetro transversal de la bacteria, alterando su forma) y segn su posicin pueden ser central, subterminal y terminal.25

f) Flagelos: son apndices cilndricos, flexibles y frgiles de longitud variable. La poseen determinadas especies bacterianas y su presencia slo se evidencia mediante tinciones especiales. Pueden ser Montricas (1 slo flagelo), Lottricas (poseen un haz de flagelos en un polo), Anttricas (tienen flagelos en ambos polos), Pertricas (bacterias rodeadas de flagelos). g) Pili o Fimbria: son apndices ms finos y ms numerosos que los flagelos. Se encuentran en algunas especies y slo pueden observarse por microscopia electrnica. h) Cpsula: es una estructura que rodea la pared celular y la presentan slo algunas especies bacterianas. Se puede observar al microscopio de luz corriente mediante tinciones especiales. EXMEN MACROSCPICO En microbiologa debido a que las bacterias no se pueden ver a simple vista, no se puede trabajar con ellas en forma individual, sino que con poblaciones bacterianas observadas microscpicamente, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario proporcionarles los requerimientos de materia orgnica, iones factores de crecimiento a travs de un medio de cultivo. Cada colonia corresponde en su origen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo slido, hasta formar una colonia visible. Por lo tanto una colonia est formad por millones de bacterias. Una bacteria nica que origin una colonia se denomina Unidad formadora de colonia. Cuando se realiza un recuento bacteriano por mL o gramo de muestra, este expresa como unidades formadoras de colonias, lo que en teora equivale al nmero de bacterias presentes en la muestra, al momento de realzar la siembra. El crecimiento de las bacterias en medios lquidos, no da origen a la formacin de colonias. El desarrollo se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras caractersticas.26

Forma de crecimiento en medio slido: Forma de la colonia completa: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa Borde: regular, Ondulado, lobulado, Rizado. Elevacin: plana, elevada, convexa Umbilicada, huevo frito Superficie: lisa, erisada, rugosa, pulvurenta. Consistencia: seca, mucoide, granular, acuosa Olor: presente o ausente. Opacidad: transparente, Opaca Cromognesis: color del pigmento, soluble (exopigmento), no soluble (endopigmento) Tamao: pequeas, medianas, grandes. Desarrollo: nulo, escaso, moderado, abundante. Hemlisis: completa (tipo beta), caliente fra, incompleta (tipo alfa o viridans) Forma de crecimiento en medio lquido: Cantidad: nulo, escaso, moderado, abundante. Tipo de crecimiento: turbio, opaco formacin de velo (pelcula de bacterias que flotan en la superficie del cultivo aerbicas), formacin de anillo, ausencia. Turbidez: uniforme, floculante, ligera, densa, mediana, ausente. Sedimento: granular, floculante, pulvurento, viscoso.

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Universidad Iberoamericana de Ciencias y Tecnologa Laboratorio de Microbiologa PRCTICO N5: PROPIEDADES BIOQUMICAS Y ENZIMTICAS DE LAS BACTERIAS La fisiologa bacteriana comprende procesos tan complejos como la obtencin de energa (quimiosntesis, fotosntesis), la nutricin, los ciclos de transformacin de elementos cromognesis, etc.. Las bacterias se caracteriza por tener una amplia versatilidad metablica capaces de degradar una amplia variedad de compuesto orgnico para obtener carbono, nitrgeno y energa. La diferencia en cuando a la obtencin de carbono o nitrgeno se debe a diferencias bioqumicas, rutas biosintticas, productos metablicos. En microbiologa la diferenciacin bioqumica y enzimtica requiere del siguiente estudio de las vas metablicas: Reconocimiento de metabolitos intermedios que se acumulan durante la fermentacin de azucares. Demostracin de actividades enzimticas caractersticas. Utilizacin de fuentes de carbono. Demostracin de reacciones individuales. de primordial importancia en el equilibrio vital, tales como nitrgeno, azufre y carbono, la

La informacin d estos estudios permite reconocer y clasificar las bacterias (fisiotaxonoma bacteriana) y de esta forma diagnosticarlas. Desde el punto de vista prctico, la fisiologa bacteriana estudia el comportamiento bioqumico y enzimtico de las bacterias de acuerdo a las reacciones que se producen n los medios diferenciales. Las bacterias tiene enzimas que hidrolizan los hidratos de carbono en forma parcial o total, por el proceso denominado fermentacin. Los carbohidratos como polisacridos, hexosas o pentosas, son demasiado grandes y complejos para ser asimilados por las bacterias, por lo cual son desdoblados mediante enzimas, en varias etapas reduciendo su tamao hasta ser sencillos para difundir al interior de la bacteria.28

Fermentacin de azucares: Esta se estudia en medios lquidos y slidos, que contiene un azcar determinado (lactosa, glucosa, sacarosa, manitol, sorbitol) y un indicador cido base conocido. La interpretacin se basa en el viraje del indicador hacia el color cido (por la produccin de cidos orgnicos como ac lctico, pirvico, succnico, como el producto final de fermentacin) cuando la bacteria ha actuado con sus enzimas sobre el azcar que tiene el medio. Tambin se produce gas, que en los medios slidos se visualiza por la ruptura del agar y e los medios lquidos por la acumulacin de gas en la campana Dirham. Se utilizan como indicadores Rojo fenol (vira de color, rojo a amarillo) o azul de bromo Timol (vira de verde a azul) Sistema Durham: En un tubo de ensayo corriente una campana de vidrio invertida en el fondo. Se usa como medio de cultivo un caldo al cual se le agrega un azcar en proporcin de 0.5 a 1% y un indicador de pH. Cuando se produce la fermentacin incompleta (solo produce cido), el indicador de pH vira su color. Cuando la fermentacin es completa (con produccin de gas, es decir produce CO2 y H2O) se observa gas atrapado n la campana. Agar Mac Conkey: Este medio agar tiene lactosa y como indicador rojo neutro. La fermentacin del azcar hace virar el indicador desde el rojo al fucsia. Tenemos colonias transparentes: Lactosa (-) y color fucsia. Lactosa +. Agar TSI: Triple Sugar Iron es un agar semi tendido que se siembra en superficie y profundidad. Contiene lactosa, sacarosa y glucosa y como indicador de pH rojo fenol. Despus de 24 horas d incubacin a 37 C, si permanece rojo y la profundidad vira a amarillo (K/A) la glucosa a fermentando (etapa anaerbica de gluclisis), mientras que si tanto la superficie y profundidad viran a amarillo (A/A) han fermentado los tres azcares. La presencia de gas se reconoce por la ruptura de agar. Tubo K/A: lactosa y sacarosa (-), glucosa (+) Tubo A/A: lactosa, sacarosa y glucosa, (+) Tubo K/K: no hay fermentacin Nota K: alcalino A: cido29

Prueba de Voges Proskauer: Algunas bacterias como E. coli, Salmonella, Shigella, et. Fermentan glucosa con formacin de grandes cantidades de cido orgnicos. Otras bacterias fermentan glucosa y producen productos neutros como 2-3 butanediol que es rpidamente oxidado a acetilmetilcarbinol (acetona) y di-acetilmetilcarbinol, sustancias que no bajan el pH del cultivo. Para su deteccin se utiliza la prueba de Voges Proskauer (VP) donde se incuba caldo glucosado a 37 C de 24 a 48 horas. Luego se agrega reactivo VP y la reaccin e lee a las 4 horas a temperatura ambiente, mediante la aparicin de un color rosado. El reactivo contiene KOH que acelera la reaccin de oxidacin atmosfrica del 2-3 butanediol a acetil y di-acetilmetilcarbinol. El diacetil reacciona con el grupo guanidina del naftol del reactivo y forma un compuesto coloreado rosado. Color rosado VP +: acetoina + Sin formacin de color: acetoina (-) Prueba del Rojo Metilo Algunas bacterias como E. coli fermentan la glucosa con gran produccin de cido pirvico, bajando el pH alrededor de 4.2 o menos. Se utliza un caldo glucoado incubado a 37 C por 48 horas. Se agrega unas gotas de Indicador Rojo metilo. La aparicin de color rojo brillante indica positividad y naranja positividad dbil, mientras que amarillo indica negativo (pH mayor a 5.5). Citrato: Algunas bacterias como Enterobacter son capaces de crecer en medios de cultivo que tiene solamente Citrato como fuente nica de carbono. Se utiliza el Citrato de Simona que contiene citrato de sodio y azul de bromotimol como indicador de pH. Una vez inoculado en superficie el medio (agar tendido) e incubado a 37 C por 24 horas se lee la reaccin. Si la bacteria utiliza el citrato se alcaliniza el medio y vira a color azul intenso. LIA (Lisina Iron Agar): Las bacterias para utilizar las protenas deben degradarlas a compuestos ms sencillos. Esto lo realizan en 2 fases: a travs de enzimas proteinasas que degradan las protenas hasta polipptidos y a travs de polipetidasas que convierten los poliptidos hasta aminocidos30

que pueden penetrar en las clulas bacterianas y participar en el metabolismo bacteriano. Pueden se utilizados: Como piezas fundamentales para sintetizar sus propias protenas. A degradacin ms avanzada ya sea por mecanismos de desaminacin (separacin del grupo NK2) o descarboxilacin (separacin del grupo COOH). Degradacin an ms completa como ocurre con el trptofano degradado por algunas bacterias (E. coli) hasta Indol, ac.pirvico y amoniaco. Por otro lado para la determinacin de la desaminacin de lisina, se utiliza el medio LIA, agra semi tendido que se siembra en la superficie y en profundidad. Las bacterias del gnero Proteus y Providencia desaminan la lisina, producindose un cetocarboxilo que al reaccionar con sales de fierro y en presencia de oxigeno (ocurre en la superficie tendida del medio) se produce un compuesto de color caf (R/A). En la descarboxilacin de aminocidos se separa el grupo COOH, libera el CO2 y la amina correspondiente. La causa principal de olores ptridos productos de la degradacin de las protenas es a menudo por la liberacin de aminas voltiles como ejemplo Histidina producida por histidina, cadaverina liberada a partir de la lisina, putresina a partir de la Ornitina, etc. En la descarboxilacin de la lisina si la bacteria no acta sobre la lisina, se produce la fermentacin de la glucosa que contiene el medio, virando el indicador prpura de bromocresol al color amarillo en el fondo del tubo y el tendido se mantiene del mismo color (K/A). Si la bacteria descarboxila la lisina (reaccin que se produce en medio cido, posterior a la fermentacin de glucosa), se libera cadaverina que al ser un compuesto alcalino neutraliza al acidez y hace que el indicador vire a un color prpura intenso (K/K). -color prpura intenso tendido y profundidad (K/K): reaccin (-). -color amarillo en profundidad y prpura en tendido (K/A): reaccin +

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Descarboxilacin de Ornitina: Se utiliza agar MIO (movilidad Indol y Ornitina).La reaccin se produce en medio cido (por la fermentacin de glucosa), liberndose putresina, que al ser un compuesto alcalino produce que el indicador prpura de bromocresol vire a color prpura intenso. -color prpura intenso (K/K): reaccin + -color amarillo en profundidad y prpura arriba (K/A): reaccin (-) Gelatinasas: Accin sobre gelatina (licuacin), protenas incompletas que carecen de triptofano, Cistina y Cistena. El medio de cultivo contiene sustancias nutritivas como peptona, estracto de levadura y sales, adicionando gelatina nutritiva. Se siembra la bacteria en estudio y se incuba a 37 C de 2 a 7 das. En la estufa el medio est lquido por la accin de temperatura, de modo que para saber si la bacteria licu la gelatina, se debe colocar el medio en refrigeracin de 20 a 30 minutos. Produccin de cido sulfdrico (H2S): La produccin de color negro en la siembra en profundidad en el medio TSI o LIA demuestra la presencia de enzimas proteolticas: el color negro se debe a la presencia de H2S que se produce producto de la degradacin del tiosulfato de sodio que contiene el medio. 1Al combinarse el sulfuro de hidrgeno con el indicador citrato frrico amoniacal (LIA) o Sulfato Ferroso (TSI) que contiene el medio, se forma en ausencia de oxigeno sulfuro de hierro de color negro. Produccin de Indol: El Indol es un compuesto nitrogenado que se forma por la degradacin del triptofano. Su formacin es un proceso aerbico en el cual la enzima triptofanasa oxida una molcula de indol, con liberacin de amonio y cido pirvico. Esta reaccin ocurre a pH neutro o levemente alcalino, lo que explica que no ocurra en medios que contienen hidratos de carbono fermentables. Se utiliza agua peptonada o preferentemente caldo tristona( que tiene un mayor contenido de triptofano).Una vez inoculada la bacteria se incuba a 37 C de 24 a 48 horas. Al agregar 5 gotas del reactivo de Kovacs que contiene p-dimetil-aminobenzaldehido, la simple unin de estos 2 anillos aromticos, forma un complejo coloreado.32

- Un anillo color rosa-fucsia: indol + - Un anillo amarillo : Indol (-) Ureasa: La mayora de los medios utilizados para la deteccin de la actividad de una ureasa incorporan al medio Urea y un indicador de pH. La enzima hidroliza la urea liberando Amonio y CO2 lo que produce una alcalinizacin del medio con viraje del indicador Rojo fenol. Aparicin amarillo: ureasa (-) Aparicin rojo fucsia: ureasa + Catalasa: La mayora de las bacterias tienen un metabolismo aerobio y producen catalasa a objeto de desdoblar el perxido de hidrgeno (agua oxigenada) que ellas mismas generan durante los procesos metablicos en presencia de oxigeno libre. Esta enzima tiene como coenzima una proto porfirina frrica (hemina). Se pone en contacto un cultivo en agar con agua oxigenada de 10 volumenes al 3%, la catalasa se revela por la formacin de burbujas (desprendimiento de oxigeno). Oxidasa: La citocromo oxidasa es capaz de oxidar el citocromo-C reducido, en presencia de oxgeno. Los electrones son removidos por la citocromo oxidasa a partir de compuestos orgnicos como el N,N-dimetil-1.4 (para) fenilenodiamina cloruro de naftol, con formacin de indofenol de color azul. Se coloca 1 gota del reactivo y se hace reaccionar 1 gota de cultivo en caldo o con una colonia, si se produce un color azul intenso la reaccin es positiva. Coagulasa: Las enzimas coagulantes son aquellas que cambian de estado desde una solucin coloidal de algunas protenas (ej. de la elche, del suero) al de cogulo. - Caseinogenasa: produce la coagulacin de la protena de la leche en medio neutro o ligeramente alcalino, res decir en este caso no se produce fermentacin de lactosa. Se encuentran en varias33

especies bacterianas: Proteus, Clostridium, Bacillus. Tambien se encuentra en el cuajar de los rumiantes y en el estmago de algunas aves. - Coagulasa sangunea: Es una enzima que produce la coagulacin del plasma. Tiene un gran valor para diferenciar las cepas de Staphylococcus (coagulasa positivas) de las cepas saprfitas que no lo coagulan. Para las bacterias esta enzima constituye un factor de patogenicidad, ya que contribuye a formar paredes de fibrina alrededor de las lesiones impidiendo la penetracin de macrfagos y de los antibiticos. Se utiliza plasma de conejo oxalatado con EDTA. No se recomienda el uso de citrato de sodio, pues algunas bacterias lo utilizan como fuente de carbono y pueden coagular el plasma. La bacteria se cultiva en caldo cerebro corazn para favorecer la produccin de la enzima por 24 horas a 37 C. luego se mezcla en un tubo de 0.2 mL de cultivo con 0.3 mL de plasma de conejo diluido 1:2 en suero fisiolgico. Al cabo de un perodo de incubacin de 4 a 24 horas se produce la coagulacin total del contenido del tubo. -formacin de cogulo : reaccin + -no formacin de cogulo: reaccin (-) Hemolisinas: Muchas bacterias poseen enzimas capaces de lisar los eritrocitos de los animales superiores, lo que se manifiesta por cambios visibles en la zona que rodea la colonia en un cultivo sobre agar sangre. Si alrededor de la colonia hay un halo de color vede, el fenmeno se denomina hemlisis alfa, incompleta o viridans. Si la zona que rodea a la colonia es clara o incolora, se habla de hemlisis beta o completa. Si la hemlisis beta se intensifica al sacar el cultivo de la estufa, formndose un doble halo se denomina hemlisis caliente-fra. La hemlisis alfa se debe a la formacin de metahemoglobina a diferencia de la tipo beta que se debera a una migracin y reduccin de la hemoglobina liberada. Es importante considerar que una hemolisina es capaz de lisar glbulos rojos de todas o de slo algunas34

especies de las cuales su sangre se utiliza en el laboratorio (cordero, caballo, pollo, conejo, bovino). Leucosidina: Es producida por diferentes especies bacterianas, especialmente estafilococos y otras bacterias pigena. Determina la destruccin de los leucocitos que han fagocitado grandes cantidades de bacterias, transformndolos en glbulos de pus por desintegracin del protoplasma. Tiene un rol patgeno ya que permite que las bacterias se multipliquen fcilmente en los tejidos.

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Universidad Iberoamericana de Ciencias y Tecnologa Laboratorio de Microbiologa PRCTICO N6: OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS SIEMBRA Y AISLAMIENTO Siembra o cultivo es la operacin que consiste en depositar aspticamente microorganismos en un medio de cultivo. Principios generales: 1. Practicar la siembra en medios de cultivo previamente esterilizados y adecuados para la bacteria que se desea asilar. 2. Emplear instrumentos estriles. 3. No contaminar ni destruir los microorganismos. 4. Depositar los microorganismos aspticamente en los medios de cultivo. 5. Esterilizar los instrumentos empleados inmediatamente despus de cada operacin. Los instrumentos empleados corrientemente en la siembra son: 1.- Asa de siembra: se utiliza alambre de platino, o de aleacin niquel-cromo (nicrom), con dimetros de 0.3 a 1 nm y est sujeto a un mango o porta asa metlico o de vidrio. El alambre puede ser totalmente recto con punta de aguja, o punta tipo esptula. Puesto a la llama del mechero alcanza el rojo blanco (1300 C) y se enfra. 2.- Pipeta Pasteur: es un tubo de vidrio con una extremidad afilada o cerrada. La otra extremidad que se encuentra est protegida por una mota de algodn card o hidrofobo. La tcnica de siembra depender del estado fsico del material a sembrar, es decir del estado slido o lquido del medio de cultivo (es decir si es agar o caldo) y del ambiente en el cual crece el microorganismo es decir si es en aerobiosis, microaerofilia o anaerobiosis.

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SIEMBRA EN SUPERFICIE a) Tomar las mismas precauciones sealadas en el punto anterior. b) Colocar la placa petri cerca del mechero y destaparla. c) Depositar una gota del inculo sobre el agar (usando una pipeta Pasteur o el asa de cultivo) evitando romper el agar. d) Extender la gota con ayuda del asa de la forma indicada en las tcnicas de estriacin sobre agar. e) Cerrar la placa. f) Colocar e incubar en forma invertida.

SIEMBRA EN PROFUNDIDAD a) Fundir un tubo de agar a bao Maria y enfriar a 45 C. b) Depositar una alcuota de 0,5 o 1mL de la muestra en una placa Petri estril vaca. c) Verter el agar fundido en la placa. d) Homogeneizar la muestra por movimientos de rotacin suaves. e) Dejar solicitar e incubar en forma invertida.

SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS Los medios de cultivo para las bacterias anaerobias poseen en general las mismas sustancias nutritivas que para las bacterias aerobias, pero es necesario privarlos de O2 libre o en disolucin mediante distintos mtodos.

a) Mtodos fsicos: Expulsin de aire por ebullicin: antes de efectuar la siembra, los medios lquidos o slidos se llevan a ebullicin en bao Maria de 20 a 30 minutos con el fin de eliminar el aire. Este proceso se denomina regeneracin de los medios con el fin de evitar el reoxigenamiento de los medios lquidos, stos se pueden cubrir con una capa de vaselina o glicerina estril.37

Reemplazo del aire por gases inertes: este mtodo consiste en la eliminacin del aire mediante bomba de vaco, del recipiente que contiene los medios sembrados y su reemplazo por hidrgeno, nitrgenos, CO2, etc.. Generalmente se utiliza hidrgenos pues es un gas indiferente para las bacterias, a diferencia de los dems que pueden tener un efecto nocivo sobre el crecimiento bacteriano. Una variante es la utilizacin de la jarra anaerobica, que es un recipiente de polipropileno en cuyo interior se colocan los medios sembrados y se cierra hermticamente. En su interior se coloca un reactivo generador de anaerobiosis, el cual libera hidrgeno, que al combinarse con el oxgeno forma H2O. Como catalizador de la reaccin se utiliza paladio, el que se activa con la temperatura estufa. b) Mtodos Qumicos: Sustancias reductoras txicas: para las bacterias, por cuyo motivo no se adicionan a los medios de cultivo, sino que en un lugar adecuado del recipiente que contiene los tubos sembrados. Se utiliza principalmente c. piroglico o hidrxido de potasio. Sustancias reductoras no txicas: que se agregan directamente a los medios de cultivo, por ejemplo Glucosa 1-2%, tioglicolato de sodio 0.1-0.2%, cistina al 0.05 % entre otros. c) Mtodos Biolgicos: Tejidos animales que se adicionan a los medios de cultivo, como por ejemplo carne picada, cerebro, hgado, etc.. Siembra de anaerobiosis en medio slido a) El medio slido (en tubo) se regenera se enfra a 45 C y se siembra en profundidad con pipeta Pasteur. Si el agar est dispensado en placas Petri, no se regenera. b) Los tubos sembrados se introducen rpidamente en agua fra para que el agar se solidifique lo ms pronto posible y as mantener la anaerobiosis. c) Si la bacteria es anaerbica estricta, es decir no tolera ni siquiera pequeas tensiones de O2 se deben colocar los tubos en jarra anaerbica.38

Siembra de anaerobiosis en medio lquido a) Los medios se regeneran previamente y se enfran a 37 C. b) Se siembran en profundidad con pipeta Pasteur, cuidando de no eliminar todo el contenido de la pipeta para evitar la formacin de burbuja de aire. c) Colocar sobre el caldo, 2-5 mL de parafina slida, estril, fundida y enfriada a 50C. d) Si la bacteria es anaerbica estricta, es decir no tolera ni siquiera pequeas tensiones de O2, se deben colocar los tubos en jarra anaerbica. AISLAMIENTO Y TRANSPLANTE (TRASPASO) Cuando se realiza una siembra en medios slidos es deseable obtener las bacterias en forma aisladas. Sin embargo, generalmente las muestras tienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprfitas (flora normal) o contaminantes del proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patgeno. Para realizar diagnsticos microbiolgicos el organismos debe ser primero aislado y mantenido puro en condiciones de laboratorio. Si en la placa ha crecido ms de un tipo de bacterias se debe realizar el aislamiento de una colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos con fines diagnsticos. En el caso de los medios lquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe realizar el aislamiento de una gota o una asada del cultivo a un medio slido para obtener colonias aisladas y puras. Si fuese necesario las colonias se sometern a uno o a ms re-aislamientos, hasta obtener cultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfologa y microscpicamente correspondan a un solo tipo de bacteria. Slo en este momento se puede proceder a la identificacin de la especie bacteriana mediante el traspaso de una sola colonia a una batera de medios diferenciales. Aislar una cepa bacteriana significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de pureza, condicin indispensable para poder estudiar sus caractersticas morfolgicas y bioqumicas y lograr as su identificacin correcta.39

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Aislamiento por diseminacin o agotamiento: consiste en efectuar estras sobre la superficie del agar, utilizando un asa de cultivo, sin pasar 2 ves por el mismo lugar.

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Aislamiento por accin Trmica: Se puede emplear el calor cuando se trata de separar bacterias esporuladas de otras que no posee esta forma de resistencia. Las esporas en general, resisten hasta 80 C por 10 minutos, mientras que las formas vegetativas mueren al ser sometidas a temperaturas de 60-70 C. Este mtodo se emplea corrientemente para el aislamiento de bacterias del gnero Clostridium (esporulados).

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Aislamiento por cultivos en medios especiales: se emplean medios selectivos o indicadores que tienen sustancias bacteriostticas para cierto grupo de bacterias.

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Aislamiento por inoculacin experimental: se aprovecha virulencia especfica que presenta una especie bacteriana a un animal de laboratorio determinado. La mayora de las bacterias son destruidas rpidamente en el sitio de inoculacin y solo la bacteria ms virulenta vence al sistema inmune del animal provocando la muerte del animal, hacindose la siembra en los rganos del animal moribundo, proporcionado cultivos puros de la bacteria. Por ejemplo del cobayo se obtiene cultivos de Bacillus anthracis y Mycobacterium avium, mientras que de los hamster se obtienen aislados de Leptospira.

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Aislado por cultivo de tejidos: tiene especial aplicacin en el diagnstico de bacterias intracelulares como Chlamydia y Rickettsia.

TIPOS DE SIEMBRA

A

B

C

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PRCTICO N7 INFLUENCIAS AMBIENTALES SOBRE LOS MICROORGANISMOS Los microorganismos responden de diferentes formas frente a las condiciones del ambiente que los rodea. Cada especie bacteriana tiene sus condiciones ambientales ptimas para su metabolismo y desarrollo, que las hace diferente una de las otras, sin embargo los lmites de tolerancia son ms amplios que los de forma de vida evolucionada. Por ejemplo la temperatura promedio del cuerpo humano y de los animales de sangre caliente es de 37C. Como las bacterias no regulan su temperatura interna deben adquirir la temperatura promedio del medio ambiente que las rodea, lo cual implica que muchas actividades enzimticas puedan detenerse en condiciones extremas, sin necesariamente con muerte celular. Existen bacterias adaptadas a cambios de temperatura, acidez, potencial redox, osmolaridad. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO Existe una temperatura mxima por sobre el cual las bacterias no pueden crecer y una temperatura mnima, bajo la cual tampoco se desarrollan. El mejor crecimiento tiene lugar a la temperatura ptima.

La influencia de la temperatura dice relacin con la actividad enzimtica de las bacterias. Al descender o subir la temperatura implica una menor o mayor actividad enzimtica, pero temperaturas muy extremas implican un aumento del catabolismo celular con la destruccinenzimtica y de protenas, producindose la muerte celular.

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DE ACUERDO A LA TEMPERATURA DE CRECIMIENTO LAS BACTERIAS SE CLASIFICAN EN:

CLASIFICACIN Psicrfilas Psicotrofas Mesfilas Termtrofas Termfilas

T MNIMA -15 -5 5-10 10 35-45

T OPTIMA 1-15 25-30 30-37 42-46 50-80

T MXIMA 22 35-40 45 50 60-90

La mayora de las bacterias patgenas son mesfilas.

RESISTENCIA AL CALOR DE LAS ESPORAS Algunas bacterias son capaces de formar esporas cuando las condiciones son adversas (por ejemplo falta de nutrientes, temperaturas elevadas, etc.) como forma de proteccin o resistencia, sin embrago las levaduras y los hongos forman esporas en funcin eminentemente reproductiva. Las endosporas bacterianas son muy resistentes al calor a diferencia de las levaduras y hongos. La mayora de las clulas vegetativas son destruidas l exponerlas a 80-100 C por algunos segundos, a diferencia de las esporas que pueden resistir temperaturas y/o tiempos de exposicin mayores. Esta resistencia depende de: La especie bacteriana. Concentracin de bacterias presentes al momento de la esporulacin Edad de los cultivos (mientras ms jvenes son ms resistentes). pH del ambiente (la mxima resistencia es a pH neutro).

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EFECTO DE LA PRESIN OSMTICA SOBRE EL CRECIMIENTO Un microorganismo presenta un mejor crecimiento en un medio cuya concentracin osmtica sea ligeramente inferior al de la propia clula, condicin esencial para que los nutrientes difundan y para que mantenga una presin hacia el medio externo.(turgencia). Si la concentracin del medio es mucho menor que el de la bacteria (hipotnico), el agua difundir rpidamente hacia el interior de la clula, provocando un aumento de la turgencia, producindose crenacin o plasmlisis. Si la concentracin plasmtica se separa de la pared rgida, originndose el fenmeno de plasmlisis. Existen algunos microorganismos capaces de crecer en condiciones osmticas elevadas, denominadas osmfilas o halfilas, como por ejemplo bacterias que viven en lagos salados naturales. De acuerdo a las condiciones de osmolaridad las bacterias se clasifican en: Halfilas, Obligadas que requieren mas de un 2% de sal y Facultativas que crecen a valores menores de 2% pero de preferencia mayor al 2% de sal. No halfilas, que son sensibles a la sal y crecen solo con valores menor al 2% de sal. Tolerantes que crecen mejor con valores menores al 2% de sal.

EFECTO DEL pH SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO Por lo general las bacterias crecen al pH de su hbitat natural. Por ejemplo el Pneumococo crece mejor a valores de pH cercanos a los del torrente sanguneo humano (pH 7.4). Muchas veces como consecuencia de su propio metabolismo de su propio metabolismo, al bacteria modifica el pH del ambiente que lo circunda. Los hongos, levaduras y bacterias que producen cido crecen mejor a valores de pH moderadamente cido. Por otra parte, las bacterias de la putrefaccin descomponen la protena produciendo ms aminas bsicas y amonaco (sustancias alcalinas), creciendo por lo tanto mejor a valores de pH moderadamente alcalinos.

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Dado que el pH limita las clases y tipos de bacteria capaces de crecer bajo condiciones determinadas, su control tiene una importancia prctica considerable. De acuerdo al pH ptimo de desarrollo las bacterias se clasifican de la siguiente forma:

CLASIFICACIN Bacterias Acidfilas Bacterias Neutrfilas Bacterias Alcalfilas

VALORES DE PH 3.0-4.0 6.0-8.0 8.5-10

EFECTO DEL POTENCIAL REDOX El Potencial redox permite expresar el grado de oxidacin o reduccin de un compuesto o de un ambiente. Un compuesto que tiene una elevada proporcin de hidrgeno en relacin al oxgeno est altamente reducido y tiene un potencial redox negativo, por otro lado una sustancia oxidada tendr un potencial redox positivo. Las bacterias anaerbicas y las facultativas pueden cultivarse en un ambiente con potencial redox negativo. Esto se logra eliminando el oxigeno libre del ambiente o estableciendo un potencial redox bajo mediante la adicin de compuesto reductores a los medios de cultivo. La eliminacin del oxigeno para lograr condiciones anaerbicas se puede realizar de diferentes maneras: a) Hirviendo el medio de cultivo para expulsar el oxgeno gaseoso e impidiendo que vuelva a disolverse en el medio mediante la adiccin de una barrera relativamente compacta como por ejemplo una capa de aceite mineral. b) Utilizando un agente reductor como el tioglicolato de sodio, el que reacciona con el oxgeno y mantiene las enzimas celulares reducidas. Se utiliza en medios lquidos y en agar. c) Desplazando el oxgeno del interior de una vasija de anaerobiosis introduciendo hidrgeno gaseoso, nitrgeno, CO2 o utilizando sobre comerciales que liberan hidrgeno y anihdrido carbnico al reaccionar con agua.44

d) Encendiendo una vela en un recipiente cerrado que contenga las placa o los tubos sembrados. La llama arder hasta que el nivel de oxigeno descienda. Cuando la llama se extinga en el ambiente habr alrededor de un 7% de CO2. De acuerdo al potencial redox que requieren las bacterias para su desarrollo, estas de clasifican: Bacterias aerbicas estrictas Bacterias anaerbicas estrictas, tolerantes, facultativas. ACCIN ANTISPTICA Y DESINFECTANTE Para obtener una medida realmente segura de los efectos de los agentes desinfectantes y antispticos, deben considerarse algunos factores tales como: concentracin de bacterias, concentracin del agente, temperatura, pH, solubilidad de los agentes, etc.. Para evaluar la eficacia de un desinfectante, el patrn clsico es el fenol y la eficacia relativa de un producto se compara con las del fenol en condiciones estndar. La relacin entre la toxicidad del agente ensayado y la del fenol sobre Salmonella tiphi y Staphylococcus aureus, se llama coeficiente fenlico del desinfectante ensayado y es una expresin de su eficacia.

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PRCTICO N8 ANTIBITICOS Y ANTIOBIOGRAMAS

Los antibiticos son agentes quimioterapeticos que se utilizan para el tratamiento de las enfermedades infecciosas producidas por bacterias y hongos. Al igual que los desinfectantes desinfectantes y antispticos interfieren con el desarrollo de los microorganismos, pero se diferencian porque actan dentro del husped sin producir efectos nocivos sobre ste. La efectividad de los antimicrobianos se define por su espectro de actividad. Por ejemplo la penicilina acta sobre las bacterias Gram (+). Los llamados frmacos de amplio espectro actan tanto sobre Gram (+) como Gram (-). En la prctica se llama antibiticos a todos los antimicrobianos, pero desde el punto de vista farmacolgico se distinguen 4 tipos distintos: 1. Antibiticos 2. Antibiticos semisintticos 3. Antimicrobianos 4. Antifngicos Antibiticos: son todas aquellas sustancias qumicas producidas por organismos vivos (bacterias, hongos o vegetales) que tiene el poder de inhibir el desarrollo o destruir bacterias y otros microorganismos en soluciones dbiles. Antibiticos semisintticos: algunos antibiticos han sido sintetizados artificialmente una vez conocida su forma estructural, denominndose sintticos o semisintticos. El primer antibitico obtenido de esta forma fue el cloramfenicol. Las penicilinas semisintticas derivan la penicilina G (benzil penicilina).Las ms importantes son: Meticilina, Oxacilina, Cloxacilina, Ampicilina, entre otros.46

Antimicrobianos: Son aquellos productos completamente sintticos, tales como las sulfonamidas, amoxicilina, cefalosporinas de 2 y 3 generacin (Cefalotina, Cefradina, Cefazolina, Cefoxitina, etc.). Antifngicos: Son drogas que presentan actividad biolgica contra hongos, tanto tipo micelar como levaduras. MECANISMOS DE ACCIN DE LOS ANTIOBITICOS El agente antimicrobiano ideal debera tener una toxicidad selectiva, es decir a

determinadas concentraciones tolerables por el husped deberan actuar sobre procesos metablicos o de sntesis que slo existen en las bacterias. En la actualidad el concepto de toxicidad selectiva slo la comparten la penicilina y las cefalosporinas, que actan solamente contra las bacterias. A nivel celular la mayora de los antimicrobianos actan en alguna de estas formas: 1- Inhibicin de la sntesis de la pared celular: produce la inhibicin d ela sntesis novo del pptidoglicano, la pared celular bacteriana se debilita y la clula se lisa (penicilina, Cefalosporinas, Bacitracina, Vancomicina y Cicloserina). 2.- Aleteracin de la permeabilidad de la membrana celular: se produce cambios en la permeabilidad celular producindose la prdida de metabolitos (Anfotericina B, Pilimixinas, Nistatina, Colistina ). 3.- Inhibicin de la sntesis de protenas: interfieren en la sntesis de aminocidos, protenas y enzimas a nivel ribosoma, por lo tanto se inhibe la actividad enzimtica bacteriana. Las bacterias tienen ribosomas de 70S en tanto que las clulas mamferas tienen ribositas de 80S, razn por la cual no alteran de forma importante la sntesis de protenas del husped (Cloramfenicol, Eritromicina, Lincomicina, Tetraciclinas, Aminoglicsidos, Amiacian, Neomicina, Estreptomicina, Gentamicina, Kanamicina).

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4.- Inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos: se inhibe la sntesis de ADN o ARN, ya sea por inhibicin de las pilimerasas o por unin al ADN molde Novobiocina, sulfonamidas, Trimetropim, Rinfampicina). De acuerdo a la actividad sobre las poblaciones bacterianas o fngicas los antimicrobianos pueden ser: a) Bactericidas o antifngicos: son capaces de producir la muerte de los microorganismos en forma rpida. b) Bacteriostticos o fungistticos: solamente impiden el crecimiento de los microorganismos. Los microorganismos frente a los antibiticos pueden comportarse de la siguiente manera: 1.- Ser susceptibles, es decir presentar receptores especficos para el antibitico, pudiendo ste ejercer su accin sobre ellos. 2.- Ser resistentes, ya sea en forma natural o adquirida, pudiendo la bacteria crecer y multiplicarse en presencia del antibitico. ANTIBIOGRAMA La tendencia cada vez mayor de muchas bacterias a hacerse resistentes a los antibiticos, parece indicar que el uso inadecuado de los antimicrobianos puede conducir a graves consecuencias, de ah la importancia de elegir el antibitico adecuado para una determinada bacteria, con la ayuda de pruebas de susceptibilidad in Vitro o antibiograma. Sin embargo la elccin del antibitico ms apropiado tambin depender de las concentraciones efectivas que pueda alcanzar el antibitico in vivo, que depende de la biodisponibilidad de la droga. Para comprender la importancia del antibiograma, se requiere saber lo que es el espectro antimicrobiano y la resistencia de las bacterias frente a un antibitico. (Ac. nalidixico,

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Espectro antimicrobiano: es ola capacidad que tiene un antibitico de actuar sobre un determinado nmero o clase de especies bacterianas. Resistencia: es la capacidad que poseen ciertas bacterias de crecer y multiplicarse en presencia de un antibitico.

De estas 2 definiciones se deduce que antes de hacer un tratamiento con un antibitico, es necesario hacer un estudio in Vitro de la sesnsibilidad o susceptibilidad del microorganismos causantes de la enfermedad frente a diversos antibiticos que podran utilizarse. Existen varios mtodos para realizar antibiogramas, los que pueden clasificarse en 2 grupos: - Mtodo de dilucin en serie: Es un mtodo cualitativo que se realiza en medios lquidos. El antibitico en estudio se distribuye en concentraciones progresivamente decrecientes en una serie de tubos con un medio apropiados, sembrndose despus en este medio cantidades idnticas del cultivo de 18 horas de incubacin de la bacteria cuya sensibilidad se quiera estudiar. Se incuban los tubos a 37 C por 24 horas y se busca el ltimo tubo en que hay ausencia de desarrollo. La concentracin del antibitico de este tubo nos indica el ttulo de sensibilidad o concentracin mnima inhibitoria del antibitico (CMI), siendo expresada en g/mL. La CMI es la concentracin ms baja del agente antimicrobiano a la cual el microorganismo no es capaz de desarrollarse, pero que al ser inoculado en un caldo libre del agente se desarrolla normalmente. Esta determinacin permite establecer con exactitud una relacin con los niveles alcanzados por la droga en al sangre y as elegir el antibitico adecuado. Por ejemplo si una bacteria presenta una CMI de 100 g/mL y el antibitico no es capaz de alcanzar estos niveles sanguneos, no tendr efecto sobre la bacteria. Tambin se puede calcular la concentracin mnima bactericida (CMB) que es la concentracin ms baja del agente antimicrobiano a la cual el microorganismo no es capaz de desarrollarse y que al ser inoculado en un caldo libre del agente tampoco se desarrolla.49

Este es un mtodo caro, lento y engorroso pero con un mayor rango de seguridad que el mtodo del disco. - Mtodo de difusin en Agar (mtodo del disco): Es un mtodo ms empleado por ser rpido, sencillo y muy reproducible. Se utiliza desde la dcada de los 40 y fue estandarizado por Kirby Bauer. Hoy se utiliza una modificacin de la tcnica de Kirby Bauer la cual ha sido estandarizada por el NCCLS (Nacional Committe for Clinical Laboratory Standard). Esta prueba mide la capacidad de un antibitico (discos de papel impregnados con cantidades conocidas de antibiticos en UI o g) de difundir a travs de un agar, para inhibir el crecimiento de las bacterias. La magnitud d ela zona de inhibicin no es una funcin de la actividad in vivo del medicamento. Las magnitudes de los halos no son comparables entre diferentes antibiticos. La prueba del disco es un test cualitativo, es decir, mide solamente la inhibicin del crecimiento y por lo tanto no indica necesariamente actividad bactericida. Sin embargo, existe una correlacin directa entre los dimetros de inhibicin y los CMI obtenidas por la prueba de dilucin en tubo. Medios de cultivos recomendados: a) Se recomienda el uso de agar Mueller Hinton pH 7.2-7.4 b) En caso de realizar la prueba con bacterias de difcil desarrollo, se utiliza agar sangre o Agar Mueller Hinton adicionado de 5% de sangre de cordero desfibrinada. c) Las placas preparadas (con una altura de agar de 4mm y completamente nivelado) se dejan a temperatura ambiente,el tiempo suficiente para que se evapore la humedad de la superficie. Tambin se pueden colocar en la estufa a 37 C por 30 minutos.

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Preparacin del Inculo a) Empleando un asa de cultivo recoger 4 a 5 colonias desde un cultivo completamente puro y aislado de la cepa a investigar. b) Transferir Las colonias a 5 mL de caldo Mueller Hinton, caldo Nutritivo o Caldo Tripticasa de Soya y realizar una emulsin. c) Comparar la turbidez de la emulsin con el estndar de turbidez (Mc Farland 0.5 que equivale a una concentracin de 108 bacterias/mL). d) Si la emulsin queda ms turbio que es estndar, se debe diluir con el mismo caldo utilizado. e) Si la emulsin tiene menor turbidez se debe agregar mayor cantidad de colonias. Inoculacin de las placas a) Introducir una trula de algodn estril en el caldo ajustado. b) Elevar la trula sobre la superficie del caldo y presionarla contra las paredes del tubo para eliminar el exceso de inculo. c) Frotar la superficie del agar con la trula en forma densa en tres direcciones y cubriendo toda la superficie del agar. d) Dejar secar la placa por 5-10 minutos. e) Elegir los antibiticos a utilizar de acuerdo a la identificacin de la cepa. f) Colocar los discos de sensibilidad con pinza esterilizada a la llama y previamente enfriada. g) Presionar suavemente los discos para segurar su implantacin a la supeficie del agar. h) Colocar los discos suficientemente separados, no ms de 6 a 8 por placa. i) Una vez colocado el disco nunca se debe mover ya que el antibitico comienza a difundir casi instantneamente. j) Incubar la placa a 37 C por 18 a 24 horas. Medicin de los halos a) las zonas de inhibicin (dimetro) se miden con una regla y se expresa en milmetros. b) La lectura se realiza contra un fondo oscuro con luz reflejada.51

c) Las zonas se miden por la parte posterior de la placa sin abrirla. d) Si se emplea agar sangre debe abrirse la placa y medir desde arriba. e) El punto lmite para medir el halo es la inhibicin completa de desarrollo observado a ojo desnudo, excepto para sulfonamidas y si se trata de especies Proteus. f) Con las sulfonamidas, puede observarse un desarrollo tenue (80% de inhibicin) dentro del halo, debido a que las bacterias alcanzan a multiplicarse algunas generaciones antes de que el antibitico acte sobre ellas. g) Las cepas de Proteus presentan un pequeo velo de desarrollo dentro de la zona de inhibicin que no debe ser considerado. h) El dimetro de los halos se compara con una tabla estandarizada que fija los lmites entre la sensibilidad, sensibilidad intermedia y resistencia. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ANTIMICROBINANA IN VITRO a) pH del medio de cultivo: algunos antibiticos son ms activos a pH cido (nitrofurantoina) y otros a pH alcalino (aminoglicsidos y sulfonamidas). b) Componentes del medio: presencia de detergentes anionicos inhiben a los aminoglicsidos. Presencia de PABA (acido para amino benzoico) en extractos titulares antagonizan las sulfonamidas. c) Estabilidad de los antibiticos: principalmente referido a la prdida de actividad de los discos de antibiticos. d) Concentracin del inculo: en general mientras mayor se la concentracin del inculo bacteriano, ms baja ser la sensibilidad aparente ya que la inhibicin bacteriana es ms lenta. e) Actividad metablica: las bacterias en fase logartmica de la curva de crecimiento son ms sensibles a la accin de los antibiticos, por este motivo es esencial que el inculo sea joven y que el medio contenga los nutrientes adecuados para un rpido crecimiento. f) Espesor del medio: es necesario que el espesor del agar sea de 4 mm de toda la placa, para permitir la difusin del antibitico.

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La ventaja del mtodo de Kirby-Bauer es que todos estos factores han sido considerados y estn estandarizados. El medio de Mueller Hinton contiene solo trazas de PABA que no inactivan las sulfonamidas. TABLA DE INTERPRETACION DE LAS MEDIDAS DE LOS HALOS DE INHIBICIN

ANTIBITICO

POTENCIA DEL DISCO

RESISTENTE (MENOR DE) mm

INTERMEDIO mm

SENSIBLE (MAYOR O IGUAL A ) mm

c. Nalidixico Amikacina Ampicilina -S. aureus -Otras bacterias Bacitracina Carbenicilina -Pseudomonas - Otras bacterias Cefalotina Clindamicina Cloranfenicol Cloxacilina Colistn Enrofloxacina Eritromicina Estreptomicina Gentamicina Kanamicina Lincomicina Neomicina

30 g 10 g 10 g 10 g 10 UI 50 g 100 g 100 g 30 g 2 g 30 g 10 g 10 g Menor 5 g 15 g 10 g 10 g 30 g 2 g 30 g

13 11 20 19 8 13 17 14 14 12 9 8 17 13 11 12 13 9 12

14-18 12-15 21-28 9-12 14-16 18-22 15-17 15-16 13-17 10-13 9-10 18-21 14-17 12-14 13-16 14-17 10-14 13-16

19 16 29 20 13 17 23 18 17 18 14 11 22 18 15 17 18 15 1753

Nitrofurantoina Novobiocina Penicilina G - S. aureus - Otras bacterias Polimixina B Sulfametoxazol + trimetropim Sulfonamidas Tetraciclina vancomicina

300 g 30 g 10 UI 10 UI 300 g 23.75 g 1.25 g 300 g 30 g 30 g

14 17 20 11 8 10 12 14 9

15-16 18-21 21-28 12-21 9-11 11-15 13-16 15-18 10-11

17 22 29 22 12 16 17 19 12

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PRCTICO N9

MICOLOGALos hongos pertenecen a los Porristas superiores junto con las algas y protozoos. Por sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y ecolgicas forman un reino llamado FUNGI, caracterizado por poseer una estructura celular eucariota, carecen de clorofila, nutricin heterfila y de reproduccin sexuada y/o asexuada. Existen 2 grandes grupos de hongos: 1. Hongos Levaduriformes: Son hongos unicelulares globosos, ovales o alargados de 2-6 m que presentan resporduccin asexuada a travs de hiemacin (Torulopsis, Candida), fisin binaria (Schizosaccaromyces) o procesos intermedios (Saccharomyces). Algunas presentan reproduccin sexuada por ascosporas o teliosporas. Algunas levaduras forman Pseudomicelios, que son brotes que continan unidos a la clula madre formando cadenas con contricciones completas sin unidad citoplasmtica. Las levaduras se desarrollan a temperaturas de 37 C y forman colonias lisas, de textura hmeda, cremosas o membranosas (sin hifas areas) semejantes a las bacterias. A la observacin en fresco, aparecen de mayor tamao que las bacterias y se observan clulas en hiemacin o fisin. Presentan una tincin Gram +. Las levaduras presentan metabolismo fermentativo, por lo cual su identificacin se realiza por el estudio de la fermentacin de los azcares.

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2.- Hongos Filamentosos o Mohos: Son h9ongos formados por una serie de ramas tubulares llamadas hifas, cuyo conjunto forman el micelio. Se reproducen por la formacin de esporas, las cuales pueden ser pigmentadas y le dan el color al hongo. Al centro de la colonia se ubican las hifas frtiles que dan origen a las esporas, razn por la cual los hongos son ms coloreados en esa zona. Se caracterizan por presentar crecimiento rpido, tener reservorios naturales en el suelo, plantas, animales y vegetales muertos, que crecen a temperaturas entre los 25 a 30 C y sus esporas o conidios son transportados por el aire, son normalmente inhalados y presentan gran resistencia en el medio ambiente. La mayora de los hongos filamentosos de inters clnico, aunque tienen una fase de reproduccin sexuada (telomorfa), es su forma asexual (anamorfa) la que casi siempre produce enfermedades y es observada de las muestras clnicas. CLASIFICACIN TAXONMICA 1. Zygomycetes: hongos filamentosos no tabicados. La mayora corresponde a hongos saprfitos aunque pueden colonizar animales, vegetales y hombre. Ej. Mucor, Rhyzopus, Absidia. 2. Ascomycetes: hongos filamentosos tabicados. Ej. Aspergillus, Penicillum, levaduras como candida y dermatofitos como Microsporum y Trichophyton. 3. Basidiomycetes: hongos tabicados y su extremo es forma de escudo (basidios). Ej. Cryptococcus y Trichosporum. 4. Deuteromycetes y hongos imperfectos: son hongos tabicados y levaduriformes. A este grupo pertenecen la mayora de los hongos patgenos.

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MORFOLOGA DE LOS HONGOS FILAMENTOSOS HIFAS: Los hongos filamentosos estn constituidos por una serie de ramas tubulares habitualmente aisladas y conservando su individualidad pero ue permancen unidas por un tronco central que se denomina hifa.Estas hifas pueden ser: Aseptadas : Mucor, Absidia, Rhyzopus. Septadas: Hialinas comoen los gneros Aspergillus, penicillum, paecilomyces, Scopulatiopsis, Fusarium, dermatofitos, etc. Septadas dematiceas: con pigmento de color negro a caf oscuro derivado de la melanina. Ej. Alternaria, Cladosporium, Botrytis, etc.. COLONIA, TALO O MICELIO: es el conjunto de desarrollo de un hongo (conjunto d elas hifas) pudiendo ser visible macroscpicamente como una masa cremosa, algodonosa, vellosa, etc.. El micelio puede ser areo: es aquel destinado a dar sostn, proteccin y nutricin al hongo. Es l primero que se desarrolla cuando se inicia la germinacin de una espora. Las hifas vegetativas pueden ser tabicadas o continuas (no tabicadas), en tal caso se observa un filamento continuo y multicelular. El micelio puede se reproductivo: es el conjunto de hifas frtiles que nacen del micelio vegetativo pero que se diferencian biolgica y morfolgicamente para las funciones de reproduccin. Estas hifas frtiles son las que finalmente dan origen a las esporas que se encargarn de reproducir totalmente al hongo. ESPORAS O CONIDIOS: son clulas uni o plurinucleadas de aspecto hialino y pigmentado. (azul, verde, amarillo, rojo, negro) y son ellas las que dan el color a las colonias o micelios. Cuando se originan de forma sexuada (por fusin de clulas diferenciadas sexualmente o gametos) se denominan esporas y su origen es de tipo asexuado (esporulacin o fragmentacin) se llaman conidios.

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Cualquiera sea el origen de las esporas, ellas son las encargadas de la reproduccin del hongo. Cuando la espora llega a un medio adecuado (medio de cultivo, piel, pelos, rganos) se produce la germinacin de la espora que da origen a un tubo germinativo el que se desarrolla dando origen a un hongo completo. La morfologa de las esporas (o conidios) es variable y caractersticas de cada especie de hongo: las esporas pueden ser: a) Segn forma: ovales, elpticas, estrelladas, fusiformes, helicoidales, piriformes. b) Segn la presentacin de tabiques o septos: Amerospora: ausencia de tabiques: Aspergillus, Penicillum, Mucor. Dimospora. Presencia de 1 slo tabique: Trichosthecium Fragmospora: presencia de varios tabiques transversales: Microsporum, Fusarium Dictiospora: presencia de tabiques longitudinales y transversales (Alternaria).

DIAGNOSTICO MICOLGICO Para efectuar el diagnstico micolgico se realiza siempre u

Guia Practicos 2009 Micro

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