GUIA METODOLÓGICA PARA LA DETECCIÓN RÁPIDA DE

ALGUNOS NÚCLEOS SECUNDARIOS

Elizabeth Murillo Perea

Jonh Jairo Mendez Arteaga

Departamento de Química Facultad de Ciencias

Universidad del Tolima Ibagué 2007

JUSTIFICACIÓN Los vegetales producen una diversidad de sustancias, producto del metabolismo secundario (metabolitos secundarios), algunas responsables de la coloración y aromas de flores y frutos, otras vinculadas con interacciones ecológicas. Las investigaciones han demostrado que principalmente la mayoría de estos compuestos participan en el mecanismo de defensa de las plantas, lo que a su vez ha generado una gama de usos y aplicaciones en la agricultura y en la medicina. Adicionalmente, las múltiples funciones que presentan en los vegetales permite la búsqueda de nuevos agroquímicos naturales, como insecticidas, herbicidas, reguladores de crecimiento, etc. Estrictamente hablando, la FITOQUIMICA estudia los metabolitos secundarios extraídos de las plantas. Para ello esta rama de la química enseña cómo aislar e identificar los principios activos de numerosos vegetales con importante actividad biológica, tal es el caso de las plantas medicinales. En un sentido amplio la FITOQUIMICA se interesa por el conocimiento de la historia, el comercio, la distribución y geografía, la botánica, el cultivo, recolección, selección, preparación y preservación, identificación y evaluación por todo tipo de métodos, la composición química y el análisis, la farmacología y el uso tradicional de los productos químicos derivados de los vegetales y sus derivados, con el propósito de mejorar la salud del hombre u otros animales. Todo tipo de drogas vegetales y otros productos naturales que tienen valor comercial por sus usos tecnológicos, incluyendo una variedad de productos de uso comercial, entre ellos: colorantes, aromas, condimentos, insecticidas, herbicidas, antibióticos, extractos alergénicos e inmunizantes biológicos, etc, también pueden ser estudiados dentro de la disciplina. Por supuesto, se necesitan prerrequisitos: botánica, química orgánica, analítica, bioquímica, etc. Un punto importante en el conocimiento de las moléculas implicadas en la actividad de las plantas es la determinación de su estructura y de su comportamiento. Ello permite comprender la naturaleza y las modalidades de los métodos de control, racionalizar los procesos extractivos, a veces prever la actividad farmacológica, frecuentemente pronosticar la farmacocinética y la biodisponibilidad; es preliminar a la síntesis. Estudiar las estructuras moleculares es también comprender su origen. Por el potencial que representan estos metabolitos, las investigaciones no sólo se han dirigido a la elucidación de estructuras químicas y evaluación de su actividad biológica mediante bioensayos, sino hacia la obtención por cultivo in vitro. El propósito de este laboratorio es despertar en el estudiante el interés por el estudio en el área de los productos naturales de origen vegetal, proporcionar los medios adecuados para manejar los procesos de extracción, purificación e identificación de metabolitos primarios y secundarios en plantas, caracterizar física y químicamente los ingredientes activos mediante técnicas usuales en análisis orgánico y bioquímico, ampliar los conocimientos de la Química

orgánica hacia los productos naturales y conocer sus posibles rutas biosintéticas, complementar las técnicas de laboratorio con estudios espectroscópicos característicos del metabolito estudiado, incentivar el estudio químico de las plantas con fines investigativos suministrando las bases teóricas y técnicas necesarias para avances en el conocimiento de los constituyentes activos con interés industrial o bromatológico.

EVALUACIÓN FARMACOGNÓSTICA DEL MATERIAL VEGETAL

1. Toma y preparación de la muestra

• Anotar el sitio, fecha y hora de recolección del material vegetal

• Anotar la parte del vegetal recolectado, empacar en bolsas negras debidamente

rotuladas para su traslado al laboratorio.

En el laboratorio:

• Pesar todo el material recolectado, tal como se trajo del campo (no hacer ningún

tipo de selección)

• Retirar el material en mal estado (viejo, enfermo, muy joven, etc) o cualquier

materia orgánica que no haga parte del vegetal a estudiar. Pesar este material, se

denominará: MATERIA ORGANICA EXTRAÑA

• Separadamente retirar la arena, piedras, y en general cualquier tipo de material

inorgánico que no haga parte de la muestra vegetal. Pesar este material, se

denominará: MATERIA INORGANICA EXTRAÑA

• Separadamente pesar cada parte del vegetal que será sometida al análisis, se

llamará: MUESTRA o DROGA

• Secar la droga en estufa a 45º C (24 -48 h) o a temperatura ambiente en un sitio

protegido de la radiación solar directa, la lluvia, el polvo y animales. Cuidar que

en cualquier caso la temperatura no sobrepase los 50º C.

• Triturar la muestra en mortero o molerla en molino eléctrico. Si fuera necesario

tamizar a través de malla de 2 mm.

• Empacar en frasco oscuro, tapar, rotular y guardar en sitio fresco hasta su

utilización

2. ESTUDIO MORFOLÓGICO DEL MATERIAL VEGETAL 2.1 Estudio macromorfológico

Para las hojas tener en cuenta la forma del limbo, borde, ápice, base, peciolo, venación, consistencia y color.

Para las ramas, ramillas y tallos determinar la consistencia, forma de la pieza,

superficie externa, superficie interna y color de la superficie interna 2.2 Estudio micromorfológico

Realizar cortes transversales y observar los caracteres anatómicos internos, así como también algunos componentes químicos como el súber, lignina y celulosa mediante técnica de tinción con safranina. 2.3 Determinación de índices farmacognósticos en la droga cruda Determinar parámetros de calidad, tales como: % de humedad %de materia orgánica extraña % de materia inorgánica extraña % de cenizas % de cenizas solubles en agua % de cenizas insolubles en HCl al 10% 3. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS VEGETALES Solvente. Pueden utilizarse: agua, metanol, etanol, acetato de etilo, diclorometano, éter o ciclohexano. Su utilización depende del interés que se tenga por un tipo de metabolito, un grupo o el tamizaje completo. En este último caso es recomendable aplicar etanol. Método de extracción. Los metabolitos secundarios pueden ser extraídos aplicando cualquiera de los siguientes métodos: Maceración, lixiviación, digestión, infusión, decocción, soxhlet y reflujo. En este curso se aplicará básicamente el método de MACERACION, cuando el solvente sea orgánico. Proporción: material vegetal: solvente 1: 10 Tiempo de extracción: 24 horas. Para mayor eficiencia debe renovarse el solvente cada 24 horas hasta observar agotamiento total. El método de maceración puede sustituirse por el de PERCOLACION Para extractos acuosos se sugiere aplicar DECOCCIÓN (30 minutos). . El extracto obtenido por maceración o por decocción debe filtrarse, a través de papel filtro, y puede concentrarse a presión reducida si se considera necesario. 4. Estandarización del extracto

• Determinar el color, olor característico, el pH, la densidad, el índice de refracción y los sólidos totales del extracto obtenido.

• Colocar 2 ml del extracto en un tubo de ensayo y observarlo a la luz UV a 366 y 254 nm, colocándolo siempre en posición horizontal a fin de que la capa del extracto sea lo más delgada posible.

• Colocar 0.5 ml del extracto en un tubo de ensayo, ajustar el pH entre 6 y 8. Adicionar 5 gotas del reactivo ninhidrina, calentar 2 minutos en baño maría hirviendo y observar. Coloraciones entre azul y violeta son indicativos de la presencia de aminoácidos. Sin embargo, la prolina y la hidroxiprolina dan coloraciones amarillas.

5. REVISIÓN DE LITERATURA

• Revisar literatura especializada del vegetal en estudio en relación a: • Farmacogeografía (origen geográfico) • Farmacoetimología (significado científico del nombre técnico de la familia,

género, especie, sinónimo, si lo hay, nombres vernáculos del vegetal). • Farmacoetnología: usos industriales y etnomédicos, incluyendo ritos especiales

utilizados en su aplicación. • Farmacoergasia: agrotecnia, fenología, cosecha.

6. GUIA PARA LA DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS

Los carbohidratos son polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas o compuestos que por hidrólisis se convierten en estos. Son las principales sustancias elaboradas en la fotosíntesis y se almacenan en forma de almidón en cantidades elevadas en las plantas y en los animales en forma de glucógeno. Existen dos tipos de carbohidratos: simples y complejos, los primeros son compuestos de una o dos moléculas y saben más dulces ya que por su tamaño pueden empezarse a digerir desde la saliva. de tipo complejo, son cadenas más largas de moléculas, debido a esto su sabor no es dulce ya que se no se digieren desde la boca, estos se encuentran en alimentos como pan, arroz, papa, etc.

6.1 Pruebas genéricas para detectar carbohidratos La solución a estudiar debe tener un pH 6-7. Si la solución es alcalina se le adiciona HCl, está ácida se le añade acetato o hidróxido de plomo y se filtra. La presencia de carbohidratos se determina mediante las pruebas genéricas de: a) Antrona: 1-3 mg ó 0.5 ml de solución se colocan en un tubo de ensayo; si la muestra es sólida se añade unas gotas de agua para disolverla. Después se deja resbalar por las paredes del tubo una solución recientemente preparada del reactivo de antrona (2 mg en 2 ml de H2SO4 concentrado) Se deja reposar 5-15 minutos. La prueba es positiva si en la interfase aparece un anillo verdoso. El color se extiende lentamente por el tubo. b) Molisch: 2-5 mg ó 0.5 ml de la muestra se colocan en un tubo de ensayo, se le añade 0.5 ml de solución de α-naftol (5 mg en 0.5 ml de etanol). Agitar muy bien. Posteriormente se deja resbalar por las paredes 1 ml de H2SO4. Cuando la prueba es positiva aparece un anillo en la interfase. La cimarosa y algunos desoxiazúcares no dan coloración. 6.2 Determinación de carbohidratos reductores Los carbohidratos que reducen los reactivos de Fehling o Benedict (soluciones alcalinas de iones cúpricos, en forma de complejos, con iones tartratos o citratos, respectivamente) o de Tollen (solución amoniacal de una sal de plata) se conocen como azúcares reductores. Todos los monosacáridos (aldosas y cetosas), y la mayoría de los disacáridos, exceptuando la sacarosa, son reductores.

6.2.1 Pruebas de laboratorio 6.2.1.1 Ensayos a la gota A 1.0 ml de la muestra se le adiciona 1.0 ml del reactivo de Benedict y el doble de agua destilada. Calentar la mezcla en baño maría, anotar el tiempo de la reducción. Precipitado rojo-ladrillo se considera positivo. Si el material no reduce Benedict y es soluble en agua, puede ser un oligosacárido no reductor. Para averiguarlo calentar la solución con unas gotas de H2SO4 y repetir la prueba. Si la prueba es positiva, ensayar otra alícuota con 1.0 ml de reactivo de Barfoed. Introducir la mezcla en baño de agua hirviendo. Si en 3-5 minutos no hay formación de precipitado rojo-ladrillo, no hay monosacáridos. Continuar el calentamiento hasta prueba positiva (máximo 60 minutos). Si la reacción fue muy lenta, 2-5 ml de solución concentrada se mezcla con 5 ml de HNO3 y se evaporan hasta 2 ml en una cápsula de porcelana. Se dejan reposar y se ve si hay cristales de ácido múcico, lo cual indicaría lactosa u otro oligosacárido que tenga galactosa. Si la prueba fue positiva, se buscan cetosas con el rectivo de Seliwanoff: en un tubo de ensayo se coloca 1.0 ml del material de prueba, 1.0 ml de reactivo y 1.0 ml de HCl al 25 %. Colocar la mezcla en baño maría. Un color rojo cereza, en 2-10 minutos indica cetosas (por ejemplo fructosa). Si la prueba fue negativa se averigua si el material da positiva la prueba de ácido múcico. Si esta es negativa, se hace la prueba del orcinol: calentar en baño maría 3-5 ml del reactivo y cuando esté hirviendo se añaden unas gotas de la muestra. Si hay pentosas aparece color azul verdoso. Si posteriormente se añade 1-butanol, el color pasa a la fase butanólica. Para confirmar la presencia de pentosas, se pone en un tubo de ensayo 1.0 ml de solución de muestra y se le añade 1.0 ml de HCl concentrado. Calentar la mezcla a ebullición. Sobre la boca del tubo se pone un papel filtro humedecido con acetato de anilina (1 gota de anilina y una gota de ácido acético). En caso positivo el papel toma un intenso color rojo. 6.3 Determinación de la presencia de azúcares no reductores A 1.0 ml del extracto agregar 1.0 ml de resorcinol y 1.0 ml de HCl al 25%. Colocar la mezcla en baño maría. Un color rojo cereza en 2-10 minutos es positivo para carbohidratos no reductores (sacarosa, melicitosa, rafinosa).

7. PRUEBAS FITOQUÍMICAS PRELIMINARES 7.1 Determinación de la presencia de SAPONINAS

Las saponinas tienen acción irritante sobre las células a nivel del parénquima pulmonar se traduce en acción expectorante, sobre las células renales acción diurética y sobre los glóbulos rojos acción hemolítica. Como norma general las acciones de las drogas con saponinas son: expectorante, diurética, depurativa, tónico venoso, disminuye el colesterol. Las saponinas esteroídicas sirven como materia prima en la hemisíntesis de hormonas sexuales y corticales. Aunque se absorben mal en el tracto digestivo, favorecen la absorción de otros compuestos: cardiotónicos. 7.1.1 Reconocimiento en el laboratorio A) Prueba de la espuma Tomar 1 ml de cada una de las fracciones (polar y apolar) en tubos de ensayo separados, añadir 9 ml de agua a cada uno. Utilizar 1 ml de esta solución en un tubo de ensayo pequeño, agitar vigorosamente por 30 segundos y dejar en reposo durante 15 minutos. La espuma sobrenadante indica la presencia de saponinas en la muestra. La proporción de saponinas se mide de acuerdo a la altura de la espuma sobrenadante así: Altura de menos de 5 mm = no se detectan saponinas Altura de 5-9 mm = contenido bajo Altura de 10-14 mm = contenido moderado Altura mayor de 15 mm = contenido alto B) Hemólisis Agregar 1 ml del extracto a probar a 5 ml de solución de solución normalizada de glóbulos rojos. Si hay hemólisis es positivo para saponinas. C) Cromatografía en Capa Delgada (TLC) f. estacionaria: sílica gel G-60 f. móvil: 1. cloroformo-metanol-agua (64:50:10) 2. n-butanol-etanol-amoniaco concentrado (3.5: 1: 2.5) 3. Me2CO-benceno (2.8:0.2) 4. Hexano-AcOEt (1:1) 5. CHCl3 – Me2CO (9:1) 6. BAW (4:1:1)

Revelador: Se pueden aplicar tres diferentes métodos para identificar las manchas de saponinas:

a) aspersión con ácido acético-anisaldehído b) tratamiento con nitrato de plata seguido de hidróxido de sodio c) tratamiento con una suspensión de eritrocitos en buffer isotónico d) ácido sulfúrico en metanol, seguida de calentamiento a 110º C por

30 minutos Identificación.- La presencia de manchas azules o azules violetas y zonas amarillas al visible, son indicativo de la existencia de saponinas. Es preciso combinar los dos ensayos ya que los bisdesmósidos no tienen acción hemolítica y algunas saponinas presentan actividad hemolítica a diluciones mayores que presentan la capacidad de formar espumas. 7.2 Reconocimiento de la presencia de POLIFENOLES en general Los compuestos fenólicos se originan principalmente a través de dos rutas biosintéticas: la ruta del ácido sikímico que conduce, mediante la síntesis de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina), a los ácidos cinámicos y sus derivados (fenoles sencillos, ácidos fenólicos y derivados, cumarinas, lignanos y derivados del fenilpropano), y la ruta de los poliacetatos por la cual se originan quinonas, xantonas, orcinoles, algunos se originan a través de rutas mixtas que combinan la vía del sikimato y del acetato, es el caso por ejemplo de los flavonoides. Un grupo especial de polifenoles lo constituyen los taninos. Los polifenoles son un conjunto heterogéneo de moléculas que comparten la característica de poseer en su estructura varios grupos bencénicos sustituidos por funciones hidroxílicas. Son poderosos antioxidantes que protegen a las LDL del daño oxidativo, y su acción como antioxidante está relacionada no sólo con su estructura química sino que también con su localización en la partícula. Pueden actuar como potentes inhibidores de la oxidación de las LDL por varios mecanismos: actuando como atrapadores de radicales libres, como agentes quelantes de iones de metales de transición, Por sus propiedades de solubilidad pueden localizarse sobre la superficie de la partícula de LDL, disminuyendo el consumo de los antioxidantes propios de las LDL como vitamina E y carotenoides, y en algunos casos regenerando vitamina E oxidada en la partícula de LDL, Por su capacidad de inhibir, activar o proteger enzimas específicas en el organismo. Los polifenoles son importantes para la fisiología de las plantas pues contribuyen a la resistencia de microorganismos e insectos y ayudan a preservar su integridad por su continua exposición a estresantes ambientales, incluyendo radiaciones ultravioletas y relativamente altas temperaturas 7.2.1 Reconocimiento en el laboratorio 7.2.1.1 Ensayos a la gota

A) Ensayo con el reactivo de Folin-Ciocalteu Utilizar dos tubos de ensayo, en uno de ellos colocar 0.5 ml del extracto + 5 gotas del reactivo + 2 gotas de Na2CO3 al 7.5%. En el segundo tubo colocar sólo la mezcla de reactivos y sustituir el volumen de extracto por agua destilada. Una coloración azul es indicativo de polifenoles. Evaluar los resultados así: Coloración amarilla: indica que no se detectaron fenoles Coloración verdosa: se detectaron fenoles en baja cantidad Coloración azul clara: se detectaron fenoles en cantidad moderada Coloración azul intensa: se detectaron fenoles en alta cantidad Si en la prueba anterior se detectaron polifenoles, añadir unos miligramos de carbonato de sodio ó 5 gotas de solución de NaHCO3 al 20 % al tubo de ensayo donde se realizó la prueba, agitar y observar cambio de coloración de rojo a azul. 7.2.1.2 Cromatografía de capa delgada (TLC) f. estacionaria: sílica gel G o sílica gel G F254 f. móvil: BAW 4:1:5 revelador: luz UV 7.3 Determinación de la presencia de TANINOS

Catecol

Los taninos son compuestos polifenólicos muy astringentes debido a su capacidad de union a proteínas, de gusto muy amargo, muy sensibles a la oxidación especialmente en medio ácido. Se emplean como cicatrizantes ya que al unirse a la piel forman una capa

protectora que permite que los tejidos subyacentes se regeneren. Pueden producir trastornos al ser eliminados vía renal. Como uso interno se emplean como antidiarréico, disminuye el peristaltismo, vasoconstrictor a nivel de pequeños vasos (varices, flebitis, hemorroides), antimicrobiano, antivírico y antifúngico, hipoglucemiante. Industrialmente se han utilizado sus propiedades para curtir pieles, al eliminar el agua de las fibras musculares. En el mundo vegetal actúan como protectores de ellas contra las heridas que sufren, protegiéndolas así de los ataques exteriores, bien porque resultan tóxicos para los microorganismos o herbívoros, bien porque no son digeribles para estos últimos. Alos taninos se les suele clasificar como HIDROLIZABLES o Gálicos y taninos CONDENSADOS o catéquicos. 7.3.1 Reconocimiento en el laboratorio 7.3.1.1 Ensayos a la gota A) Prueba del cloruro férrico Depositar 0.5 ml de la fracción hidroalcohólica en 5 tubos de ensayo pequeños; añadir en cada caso dos gotas de agua destilada en todos los tubos con lo que se logra un color amarillo. Dejar el tubo 1 como testigo, y adicionar gotas de cloruro férrico a los siguientes tubos así: una gota al tubo 2, dos en el tercero y así sucesivamente hasta llegar al quinto tubo. La caracterización de taninos se hace de acuerdo a la coloración observada, así: No hay cambio significativo de color = no se detecta presencia de taninos Cambio en el color a azul, negro azulado = taninos pirogálicos (hidrosolubles) Cambio de color a verde, azul verdoso, precipitado negro verdoso = taninos de tipo catecol (condensados). B) La prueba del cloruro férrico también puede realizarse así Pesar 0.7 g de muestra y colocarlo en un matraz, agregar 200 ml de solución de ferricianuro de potasio 0.004 M y agitar fuertemente. Luego se adicionan 15 ml de solución de cloruro férrico 0.008 M en ácido clorhídrico 0.008 M. Observar los cambios de coloración y evaluar los resultados así: Verde claro: baja o nula cantidad de tanino Verde oscuro: contenido medio de tanino Azul: alto contenido de tanino C) Prueba de la gelatina-sal Utilizar dos tubos de ensayo, en cada uno colocar 0.5 ml del extracto y 1 ml de solución de gelatina-sal (solución de gelatina al 1% en NaCl al 10%). El otro tubo servirá de testigo, adicionar en él 0.5 ml del reactivo de gelatina-sal. De esta forma precipitan todos los taninos e incluso los pseudotaninos a altas concentraciones. Si hay formación de precipitado agregar 0.5 ml de úrea 10 M. A la solución resultante adicionar 2-3 gotas de cloruro férrico. Evaluar el resultado asi:

Coloraciones verdes: confirma la prueba para taninos condensados Coloraciones azules: confirma la presencia de taninos hidrolizables Si se detectaron taninos y la prueba de la espuma le dio negativa, indica que los taninos impiden observar la presencia de saponinas, se recomienda entonces realizar la marcha completa: ANALISIS DE TANINOS Y DE SAPONINAS. D. Diferenciación entre taninos condensados e hidrolizables A) 0.5 ml del extracto colocados en un tubo de ensayo, se mezclan con 0.5 ml de etanol, agitar y agregar solución de sulfato de magnesio al 30%. Evaluar los resultados así: Los taninos catéquicos (condensados) son completamente precipitados. Los taninos pirogálicos (hidrolizables) no lo son sino parcialmente, pero el líquido filtrado es bastante decolorado. E) Prueba para taninos hidrolizables 0.5 ml del extracto + 0.5 ml de etanol, disolver y añadir unos miligramos de nitrito de sodio y unas gotas de ácido acético. Al inicio se observa color rosado que posteriormente pasa a café. F) Prueba para taninos condensados Utilizar 2 ml del extracto, añadir 1 ml de butanol, agitar bien y separar la capa orgánica (superior). Añadir a la capa orgánica 0.5 ml de [HCl] , calentar suavemente con mechero de alcohol o simplemente con un encendedor de cigarrillos (∼ 37º C). Una coloración roja es indicativo de taninos condensados o proantocianidinas. Si se agregan unos miligramos de Na2CO3 o unas gotas de NaHCO3 al 20%, se debe observar coloración azul. 7.4 Determinación de la presencia de FLAVONOIDES

Los flavonoides o bioflavonoides son pigmentos vegetales no nitrogenados. Comprenden un grupo de compuestos polifenólicos ampliamente distribuidos en las frutas y en los vegetales, así como en el té negro, el café, el chocolate, la cerveza y el vino rojo. Pueden aparecer desde simples moléculas fenólicas hasta compuestos muy polimerizados con pesos moleculares superiores a los 30. 000 Da. Existen 13 subclases de flavonoides con un total de más de 5 000 compuestos, 10 todos presentando un

esqueleto hidrocarbonado del tipo C6-C3-C6 (difenilpropano) derivado del ácido shiquímico y de 3 restos de acetato.

No son considerados por los nutricionistas como vitaminas, sin embargo los flavonoides actúan protegiendo la salud: limitan la acción de los radicales libres (oxidantes) reduciendo el riesgo de cáncer y enfermedades cardíacas, mejoran los síntomas alérgicos y de artritis, aumentan la actividad de la vit.C, refuerzan los vasos sanguíneos, bloquean la progresión de las cataratas y la degeneración macular, evitan las tufaradas de calor en la menopausia y combaten otros síntomas.

7.4.1 Reconocimiento en el laboratorio 7.4.1.1 Ensayos a la gota A) Prueba de Shinoda 1 ml del extracto + 0.5 g de limaduras o polvo de Mg y gota a gota [ HCl ] hasta que termine el desprendimiento de hidrógeno. Observar durante 10 minutos los cambios de color. Coloraciones rosada, roja, violeta, anaranjada es positiva para sustancias que posean en su estructura el núcleo de la γ- benzopirona, tales como: flavonas, flavonoles, flavanonas, flavanonoles, xantonas. Isoflvonas, chalconas y auronas no dan coloración. El siguiente interpretación podría ser una ayuda en el análisis de los resultados obtenidos en la prueba de Shinoda, sin embargo no debe tomarse como absoluto o definitivo: Flavonas y flavonoles dan coloración amarillo a rojo; flavanonoles rojo a magenta; flavanonas rojo, magenta, violeta, azul. 7.4.1.2 Cromatografía de capa delgada (TLC) A) CP: f. estacionaria: papel para cromatografía f. móvil: BAW (4:1:5, 5:4:1 ó 6:1:2 ó n-butanol-ácido acético 50:7saturado con

agua) ó Forestal (agua-HOAc-HCl conc. 30:10:3) Revelador: UV y vapores de amoniaco B) CCD: muestra: utilizar el extracto metanólico crudo f. estacionaria: sílica gel GF254 f. móvil: 1. n- butanol-ácido acético-agua (6:1:2 ó 4:1:5) 2. acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético-agua (100:11:2:7) Revelador: a) análisis a la luz visible antes y después de exponer el cromatograma a los

vapores de NH3 b) análisis a la luz UV (366 nm) antes y después de exponer el cromatograma a

los vapores de NH3 c) análisis después de asperjar con solución metanólica al 5 % de AlCl3, primero

al visible y después con luz UV (366 nm).

Interpretación: Antocianinas: rojo, azul o púrpura (dependiendo del pH) y de la absorción al UV Flavonoles y flaconas: amarillo o marfil. C) También puede usarse f. estacionaria: sílica gel GF254 f. móvil: acetato de etilo-ácido fórmico-agua (8:1:1) Revelador: Rociar la placa con una mezcla preparada con 15 ml de solución de ácido bórico al 30% en agua y 5 ml de solución de ácido oxálico al 10% en agua destilada. Llevar a la estufa 10 minutos y luego observar al UV Se observan manchas fluorescentes. 7.5 Determinación de la presencia de FENILPROPANOIDES

Los fenilpropanos son sustancias naturales ampliamente distribuidas en los vegetales caracterizadas por un anillo aromático unido a una cadena de 3 carbonos y derivados biosintéticamente del ácido shiquímico, son constituyentes principales de algunos aceites esenciales, tales como el de clavo, canela, anís, algunas albahacas, etc. A su vez los aceites esenciales son fracciones líquidas volátiles, generalmente destilables por arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmética (perfumes y aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéutica (saborizantes); todo lo cual evidencia la importancia de los fenilpropanos. 7.5.1 Reconocimiento en el laboratorio 7.5.1.1 Ensayos a la gota Manejar 3 tubos de ensayo y utilizarlos así: -Colocar en el primero 1 ml del extracto etanólico a ensayar (testigo). -En el segundo adicionar 1 ml del extracto etanólico a ensayar + 2 ml de HCl 0.5 N, añadir 2 ml de solución acuosa de nitrito de sodio al 10% (reactivo de Arnow) y finalmente agregar 2 ml de solución acuosa de NaOH 2N. -En el tercer tubo agregar toda la mezcla de reactivos sin la muestra (testigo) Interpretación: El reactivo de Arnow en presencia de fenilpropanoides, presenta coloración naranja y después de la adición de la soda se genera un rosado púrpura. 7.5.1.2 Cromatografía de capa delgada (TLC)

f. estacionaria: sílica gel f. móvil: n-hexano-cloroformo 3:2 revelador: vainillina al 1% em H2SO4 al 5%, seguido de calor Interpretación: Rf y color de algunos fenilpropanoides:

-Safrol 0.74 0.86 - Gris

-Estragol 0.72 - Rosado

-Anetol 0.69 - Rojo

-Miristicina 0.50 0.71 Pardo

-Apiol 0.39 0.41 Pardo Pardo

-Timol 0.38 - Rojo

-Eugenol 0.20 0.31 Pardo

-Isoeugenol 0.29 0.27 Rojo Amarillo

-Metileugenol - 0.42 - Rojo pardo

-Metilisoeugenol - 0.42 - Púrpura

-Elemicina - 0.27 – Amarillo

7.6 Determinación de la presencia de ANTRAQUINONAS

Este grupo de metabolitos es el más numeroso de las quinonas naturales y son la base y fuente de una importante cantidad de colorantes. Son compuestos aromáticos polihidroxilados más o menos metilados, cuando hay sustituyentes en la posición C-2 o en C-3, el estado de oxidación del átomo de carbono puede variar y ser –CH3, -CH2OH, -CHO, -COOH o formar grupos más complejos.

Por ejemplo, la 9,10 antraquinona es de color amarillo claro y cuando está sustituída por grupos auxocrómicos, en una o más de sus ocho posiciones disponibles, especialmente

4a, 9a- dihidro-antraquinona; 9,10Antracenediona; 9,10-Antraquinona

en las cuatro posiciones alfa, se produce un incremento en la intensidad del color, el cual se desplaza al rojo intenso fuete hasta el negro.

Las antraquinonas naturales se encuentran libres y al estado de combinaciones glicosídicas. Las propiedades tintóreas y laxantes de algunas plantas superiores, están relacionadas con su contenido de antraquinonas alfa-hidroxiladas.

7.6.1 Reconocimiento en el laboratorio 7.6.1.1 Ensayos a la gota A) Reacción de Bornträger Hervir una parte del extracto durante 5 minutos con 10 ml de KOH al 5% y 1 ml de H2O2 al 6%. Filtrar y acidular el filtrado con 10 gotas de ácido acético. Extraer con 10 ml de benceno. La capa bencénica (superior) se pone amarilla, se separa Unos 5 ml de la solución bencénica se agitan con 2.5 ml de NaOH al 10%. Las antraquinonas colorean de rojo la capa alcalina. B) Puede también utilizarse este procedimiento: Colocar en un tubo de ensayo 0.20 g de planta y adicionar 5 ml de cloroformo, agitar, dejar 15 min en reposo. Recoger la fase clorofórmica y dividirla en dos tubos de ensayo. En el 1er. tubo agregar 1 ml de solución de NaOH al 5% en agua (Reacción de Borntraeger). Interpretación: Coloración rojiza en la fase acuosa, indica presencia de antraquinonas En el 2º tubo, adicionar 1 ml de solución de acetato de magnesio al 0.5% en metanol. Coloración roja indica presencia de antraquinonas libres. 7.6.1.2 Cromatografía de capa delgada (TLC) f. estacionaria: sílica gel f. móvil: a) acetato de etilo- n-hexano (8:2) b) acetato de etilo:metanol:agua. (100:17:13). c) n-propanol:acetato de etilo:agua. (40:40:30). Revelador: 1. Sin tratamiento químico: UV-365 nm. Interpretación: Todas las antraquinonas dan fluorescencia amarilla o rojo-marrón. 2.Con tratamiento químico. a) solución de hidróxido de potasio (Reacción de Bornträger). Interpretación: Antraquinonas: rojo en el visible. Antronas y antranoles: amarillo en el visible y fluorescencia amarilla en UV-365 nm.

7.7 Determinación de la presencia de TERPENOS/ESTEROIDES

Los terpenos forman una amplísima y muy diversa familia de sustancias naturales, producidos de manera primaria por una gran variedad de plantas, particularmente las coníferas y algunos insectos. Cuando los terpenos son modificados químicamente ya sea por oxidación o reacomodo del esqueleto carbonado los compuestos resultantes son referidos generalmente como Terpenoides algunos autores usan invariablemente el término terpeno para incluir a todos los terpenoides, unos y otros son los principales constituyentes de los aceites esenciales de muchos tipos de plantas y flores. Tradicionalmente se han considerado derivados del 2-metil-butadieno más conocido como isopreno. Esta llamada «regla del isopreno» ha permitido clasificarlos y estudiarlos, pero realmente los terpenos no derivan del isopreno ya que éste nunca se ha encontrado como producto natural. El verdadero precursor de los terpenos es el ácido mevalónico, el cual proviene del acetil coenzima A. Desde el punto de vista farmacéutico, los grupos de principios activos de naturaleza terpénica más interesantes son: monoterpenos y sesquiterpenos constituyentes de los aceites esenciales, derivados de monoterpenos correspondiente a los iridoides, lactonas sesquiterpénicas que forman parte de los principios amargos, algunos diterpenos que poseen actividades farmacológicas de aplicación a la terapéutica y por último, triterpenos y esteroides entre los que se encuentran las saponinas y los heterósidos cardiotónicos. 7.7.1 Reconocimiento en el laboratorio 7.7.1.1 Ensayos a la gota A) Reacción de Lieberman-Burchard

Colocar 1 ml del extracto en un crisol; evaporar casi hasta sequedad, dejar enfriar y adicionar 3-4 gotas de cloroformo. Repartir la mezcla en dos tubos de ensayo, secar al aire, en uno de los tubos adicionar gotas de anhídrido acético seguido por una gota de ácido sulfúrico concentrado, el otro se deja de testigo. Los cambios de color interpretarlos así: Azul o verde = esteroides Rojo, rosado o violeta = triterpenos Amarillo pálido = esteroides o triterpenos saturados B) Reacción de Salkowski 0.5 ml del extracto se mezcla con 1 ml de cloroformo, dejar deslizar por la paredes del tubo con sumo cuidado 1 ml de ácido sulfúrico del 85%. Interpretación: Formación de colores amarillo o rojo se considera positivo. Si en la interfase se forma color azul, verde o violado característica de los carotenoides, sirve para distinguirlos de otros pigmentos naturales, como las antocianinas C) Prueba de Tortelli-Jaffe 0.5 ml de la muestra se mezcla 0.2 ml de ácido acético y 2 gotas de cloroformo. Sobre esta mezcla se deja caer con cuidado 0.1 ml de una solución al 2% de bromo en cloroformo. Si hay esteroides con un doble enlace terciarios efectivo o potencial, se forma una zona verde en la interfase. 7.7.2 Cromatografía de capa delgada (TLC) A) BIDIMENSIONAL f. estacionaria: sílica gel G-60 f. móvil: solvente 1. hexano-acetona (80:20) solvente 2. hexano-éter etílico-ácido acético 75:25:1 Revelador: -Lieberman Burchard ó -ácido sulfúrico al 5% en etanol seguido de calentamiento en estufa ó -CoCl2 al 2% en ácido sulfúrico al 10% y luego calor, ó -vainillina etanólica al 1% seguida de pulverización con ácido

clorhídrico y calor ó -vainillina al 1% en H2SO4 al 5% seguido de calor Interpretación: manchas de diversidad de colores (verdes, rojos, rosados, azules,

amarillos, etc) son indicativos de la presencia de estos metabolitos.

A) CCD UNIDIRECCIONAL: f. estacionaria: sílica gel G-60 f. móvil: éter de petróleo-AcOEt (9:1, 8:2, 7:3 ó 1:1) Revelador: los mismos de la cromatografía bidimensional Interpretación: manchas de diversidad de colores (verdes, rojos, rosados, azules,

amarillos, etc) son indicativos de la presencia de estos metabolitos

7.8 Determinación de la presencia IRIDOIDES

Bajo la denominación de iridoides se agrupan una serie de monoterpenos bicíclicos (C10) derivados biosintéticamente del monoterpeno geraniol, que presentan como estructura básica común un ciclopentapirano denominado iridano, por haberse detectado la primera vez en unas hormigas pertenecientes al género Iridomirmex. Estos compuestos pueden encontrarse como estructuras abiertas (secoiridoides) o cerradas (iridoides) generalmente en forma heterosídica, mayoritariamente como glucósidos.

La mayoría se presentan como heterósidos; algunos están libres y como compuestos dímeros. Hay muchos seco-iridoides en los que el anillo del pirano está abierto y en algunos de ellos, el oxígeno del anillo piránico está reemplazado por nitrógeno. Son marcadores quimiotaxonómicos del orden Tubiflorae

Existen una serie de plantas que se emplean por sus propiedades farmacológicas precisamente porque algunos de sus principios activos son de naturaleza iridoídica. Entre las mas importantes destacan la valeriana y la genciana de los cuales se utilizan los órganos subterráneos y, las hojas de olivo.

7.8.1 Reconocimiento en el laboratorio

7.8.1.1 Ensayos a la gota Utilizar tres tubos de ensayo de la siguiente forma: - En el primero colocar 0.5 ml del extracto etanólico (testigo) -Colocar en el segundo tubo 0.5 ml del extracto etanólico, mezclar con 3 ml de

vainillina (4% p/v en metanol) y con 1.5 ml de HCl concentrado. La muestra se protege de la luz durante 1-2 horas. -En el tercer tubo se adicionan los reactivos sin la muestra

Interpretación: La presencia de iridoides produce una coloración azul

7.9 Determinación de la presencia de ALCALOIDES

Se incluyen en este grupo a los compuestos nitrogenados, que se comportan como bases frente a los ácidos, formando sales. En su gran mayoría son de origen natural, sobre todo del reino vegetal, aunque se encuentren algunos semisintéticos y otros exclusivamente sintéticos.

A pesar de su distinta estructura, poseen propiedades fisiológicas y toxicológicas que se ejercen fundamentalmente sobre el sistema nervioso central, con predominio en alguno de sus niveles. Por estas razones pueden ser usados como fármacos. El uso prolongado de alguno de estos de estos compuestos produce en el hombre acostumbramiento, que constituyen verdaderas toxicomanías, con dependencia física y psíquica y un aumento de la tolerancia.

La mayor parte de los alcaloides se encuentran en las plantas dicotiledóneas en forma de sales (malatos, tanatos, citratos, etc.). A excepción de algunos como la nicotina, que son líquidos, los restantes son sólidos, poseen sabor amargo y reacción alcalina. Insolubles generalmente en el agua, lo son más en el éter y fácilmente solubles en el alcohol. Con los ácidos forman sales y con ciertos cuerpos dan reacciones, coloreadas o no, pero características. Tienen por lo común, carácter de aminas terciarias, y son en su mayor parte venenos muy violentos; como antídoto se emplea, entre otros, infusiones de té muy cargadas; el tanino de la infusión precipita el alcaloide e impide su asimilación en el tubo digestivo.

7.9.1 Reconocimiento en el laboratorio

7.9.1.1 Ensayos a la gota

A) Llevar a sequedad, 30 ml del extracto etanólico de la planta, adicionar 5 ml de HCl (10%) y calentar por 10 min. Enfriar, filtrar, dividir el filtrado en tres tubos de ensayo y agregar unas gotas de los reactivos de reconocimiento: Dragendorff, Mayer y Wagner. Una leve turbidez o precipitado (rojo a naranja, blanco a crema y marrón) evidencia la posible presencia de los mismos. Para mayor claridad utilice 4 tubos testigos así:

1. para colocar 1 ml del extracto a probar 2. para colocar 1 ml del reactivo de Dragendorff 3. para colocar 1 ml del reactivo de Mayer 4. para colocar 1 ml del reactivo de Wagner

Compare lo obtenido en los dos sets de tubos.

B) Puede también aplicarse la siguiente metodología: Tomar 3 ml de extracto concentrado. Evaporar el solvente, utilizando baño maría, casi hasta sequedad para obtener un mínimo residuo. Extraer con 5-7 ml de HCl al 5%, luego alcalinizar la mezcla con 2 ml de NaOH al 20%. Posteriormente, se extrae primero con 10 ml de CHCl3 y etiquetar la fracción clorofórmica como 1.1. Colocar de nuevo el residuo acuoso-alcalino en el embudo de separación y extraer con CHCl3/EtOH 3:2, separar esta fracción y etiquetarla como 1.2. Concentrar las fracciones 1.1 y 1.2 por separado en baño maría. Extraer por separado cada fracción con HCl al 5% y filtrar. Con el filtrado hacer las pruebas para alcaloides mencionadas en el literal (A). 7.9.1.2 Cromatografía de capa delgada (TLC) Calentar 20 mg del extracto etanólico de la planta con una mezcla de EtOH-CHCl3 (1:1).Utilizar el producto para realizar la CCD f. estacionaria: Sílica gel G f. móvil: a) CHCl3-MeOH. (9:1) b) CHCl3-AcOEt. (8:2) c) AcOEt:MeOH:H2O. (100:13.5:10). Revelador: reactivo de Dragendorff. Interpretación: manchas de color rojo a naranja se toma como positivo 7.10 Determinación de la presencia de CARDIOTÓNICOS

Este grupo de compuestos son derivados del núcleo esteroideo general o núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno al cual pertenecen el colesterol y los ácidos biliares. las hormonas sexuales, las hormonas corticoadrenales y la vitamina D.

Una característica que los diferencia es que los glicósidos cardíacos aparte de tener una o más moléculas de azúcar en el carbono 3 del núcleo esteroideo contienen un anillo lactónico incrustado al cabono 17. Los glicósidos cardiacos son sustancias obtenidas de Digitalis, Strophantus y otras plantas, y que se emplean en la insuficiencia cardíaca congestiva. Aumentan la fuerza de la contracción cardíaca sin acrecentar significativamente otros parámetros, pero son muy tóxicos en altas dosis. Su mecanismo de acción generalmente implica la inhibición de la bomba de sodio y potasio, siendo 7.10.1 Reconocimiento en el laboratorio 7.10.1.1 Ensayos a la gota A 10 ml del extracto etanólico de la planta adicionar 5 ml de solución de acetato de plomo al 10% y 4 ml de agua destilada. Calentar la mezcla a baño María durante 10 min. Filtrar. Agitar el filtrado con 20 ml de CHCl3, separar la capa clorofórmica en 6 tubos de ensayo, llevar a sequedad. Adicionar:

Al primer tubo 1 ml de reactivo de Baljet [mezclar volúmenes iguales de: snl A (solución etanólica de ácido pícrico al 1%) y sln B (NaOH al 10% en agua).

Coloración roja, naranja-rojiza o violeta con cardenólidos. Al segundo 1 ml de reactivo de Kedde (Volúmenes iguales de Sln A: ácido 3,5-

dinitrobenzoico al 2% en metanol y Sln. B: KOH al 5.7% en agua). Coloración rosa o azul-violeta al visible indican cardenólidos, los bufadienólidos no reaccionan. El color se atenúa en pocos minutos.

Al tercero: 1 ml de solución al 1% de m-dinitrobenceno en etanol al 50% y enseguida se añaden 2-3 gotas de solución de NaOH al 20% en agua (reactivo de Raymond-Marthoud) para identificar el anillo lactónico de los cardenólidos

Coloraciones violeta o azul. En el cuarto realizar la reacción de Keller-Kiliani. (5 ml de ácido acético glacial,

1 gota de cloruro férrico al 5% en metanol y 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado) En uno o dos minutos se observan coloraciones intensas.

En el quinto realizar la reacción de Liebermann-Burchard (1 mg de muestra/pocas gotas de HOAc + 3 ml Ac2O/H2SO4 (50:1)). Coloración verde, azul verdoso, vía rojo al azul identifica el núcleo esferoidal

En el sexto realizar la reacción de Salkowaki para identificar el núcleo esferoidal (0.5 ml del extracto se mezcla con 1 ml de cloroformo, dejar deslizar por la paredes del tubo con sumo cuidado 1 ml de ácido sulfúrico del 85%).

Coloración amarilla-rojo sangre se toma como positivo. 7.10.1.2 Cromatografía de capa delgada (TLC) f. estacionaria: Sílica gel 60F254 f. móvil: a) Acetato de etilo:metanol:agua. (100:13.5:10). b) Cloroformo:metanol:agua (65:35:10). fase inferior. Revelador: a) específicas para anillo γ-lactona. (cardenólidos).

- reactivo de Kedde. - reactivo de Baljet (solución alcalina de ácido pícrico). - reactivo de Raymond (soluciones alcalinas de m-dinitrobenceno). b) métodos de detección general. - reactivo tricloruro de antimonio. Se asperjan los cromatofolios con el reactivo. Se calienta a 100º C por 6 minutos, luego se observa inmediatamente al UV-365nm. Interpretación: Se distinguen diferentes colores según la estructura. 7.11 Determinación de la presencia de CUMARINAS

Cumarina Aflatoxina B1 Con el nombre de cumarinas se conoce a un grupo muy amplio de principios activos fenólicos que se encuentran en plantas medicinales y tienen en común una estructura química de 2H-1-benzopiran-2-ona, denominada cumarina. Prácticamente todas las cumarinas, a excepción de la cumarina propiamente dicha, poseen un sustituyente hidroxílico en posición 7 ya sea libre, como sucede en la umbeliferona, o combinado (metilo, azúcares, etc.). Las cumarinas sencillas pueden poseer además hidroxilos adicionales también libres o combinados. Es frecuente, que sobre el anillo cumarínico básico, generalmente hidroxilado en C-7, se sitúen sobre los carbonos 6 u 8 radicales isoprenílicos de 5, 10 o más raramente de 15 átomos de carbono, que por su alta reactividad pueden originar anillos adicionales de tipo furánico o piránico. A este grupo de cumarinas isopreniladas se les conoce en conjunto como cumarinas complejas debido a la gran variabilidad química de sus estructuras. Como grupo, su interés farmacológico no es muy grande, sin embargo se debe mencionar sus efectos sobre el sistema vascular tanto en territorio arterial como venoso y su utilidad en el tratamiento de algunas alteraciones de la piel como por ejemplo la psoriasis debido a sus propiedades fotosensibilizantes. Las cumarinas deprimen la síntesis hepática de los factores esenciales para la coagulación sanguínea dependientes de vitamina K (II (protrombina), VII, IX y X)., razón por la cual se les utiliza como anticoagulantes y rodenticidas. 7.11.1 Reconocimiento en el laboratorio 7.11.1.1 Ensayos a la gota A) En un tubo de ensayo colocar 2 ml del extracto etanólico de la planta, tapar

con papel de filtro impregnado en solución diluida de NaOH y llevar a Baño de agua a 100ºC por algunos minutos. Remover el papel de filtro y examinarlo bajo luz UV, siendo la fluorescencia amarilla indicativa de la presencia de cumarinas. 7.11.1.2 Cromatografía de capa delgada (TLC) f. estacionaria: Sílica gel 60F254. f. móvil: a) Tolueno:éter (1:1, saturado con ácido acético al 10%). Se agitan, por 5 min, en un embudo separador, 50 ml de tolueno, 50 ml de éter y 50 ml de ácido acético al 10%. Se separan las capas y se utiliza la capa orgánica. b) acetato de etilo. Revelador: 1) Sin tratamiento químico: Interpretación: UV-365 nm. Intensa fluorescencia:azul, marrón, o azul-verdosa. 2) Con tratamiento químico: - Reactivo hidróxido de potasio. Interpretación: Las zonas que muestran fluorescencia azul se intensifican asperjando con solución de KOH al 5% en EtOH. 7.12 Determinación de la presencia de LACTONAS TERPENICAS Las lactonas sesquiterpénicas poseen un esqueleto carbonado de 15 átomos de carbono, que teóricamente deriva de la unión de tres fragmentos de isopreno (2-metil-1,3-butadieno), cabeza-cola, y algunos productos de transposición; parte del esqueleto es un anillo de metilbutenólido. Son sustancias amargas, de farmacología poco estudiada pero provenientes de plantas usualmente reportadas como medicinales, por lo que es probable que sean los agentes medicinales. 7.12.1 Reconocimiento en el laboratorio Pesar 3 g del extracto crudo y concentrar en baño maría.

Extraer el extracto concentrado con 10 ml de acetato de plomo al 5%, a 60º C por 15 minutos. Al finalizar este tiempo filtrar y añadir al filtrado 2 gotas de ácido acético concentrado, luego extraer con 15 ml de CHCl3, agitando lentamente para evitar que se formen emulsiones. Concentrar hasta sequedad y agregar 1 ml de EtOH-CH2Cl2 1:1. Realizar CCD con la mezcla anterior realizar varias cromatografías, así: 1. f. estacionaria: sílica gel G f. móvil: CHCl3-acetona (90:10) Revelador: vainillina al 1% en ácido sulfúrico al 5% Interpretación: Manchas de diversos colores (rojo, azules, verdes, etc) son indicativo de la estructura terpénica. 2 . f. estacionaria: sílica gel f. móvil: diclorometano-metanol-agua (87: 12: 1) revelador: Asperjar primero con m-dinitrobenceno al 2% en EtOH, dejar secar Asperjar por segunda vez con NaOH al 5% en EtOH del 50% Llevar a la estufa (110º C) al menos 6 minutos. Interpretación: Si la lactona tiene en su estrutura una γ-lactona α,β-insaturada, se revelan manchas violetas con Rf alto (> 0.5 ).