Universidad ComplutenseFACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA II

GUIAGUIA DE PRACTICAS DEDE PRACTICAS DEMICROBIOLOGIAMICROBIOLOGIA

Tercer Curso2010/2011

INDICE

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO..............................................................................1

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.............................................................................................3

1. ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO..........................................................5

2. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL......................................................................7

3. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.....................................................................................11

4. OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS.....................................................................................15

5. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.......................................................................................23

6. SIEMBRA Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS...........................................................................27

7. CONTROL MICROBIOLÓGICO AMBIENTAL...................................................................................31

8. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS A PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO BACTERIANO.. 33

9. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA ..........................................43

10. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR.................................................................................45

11. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE UN AGUA PROBLEMA......................................................... 49

ANEXO: MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS.......................................................57

BIBLIOGRAFÍA.....................................................................................................................................64

CALENDARIO.......................................................................................................................................65

- El acceso al laboratorio de prácticas sólo se per-mite a los alumnos que estén realizando las prác-ticas. No se admiten visitas por razones de seguri-dad.

- Los laboratorios de investigación son de accesorestringido al personal del Departamento.

- Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempreque se esté trabajando en el laboratorio. Duranteel periodo de prácticas, la bata no debe utilizarsefuera del laboratorio.

- Debe respetarse la prohibición de beber, comer,masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debeevitar llevarse a la boca ningún objeto (bolígra-fos...) o tocarse los ojos y nariz.

- En la superficie de trabajo no deben depositarseen ningún momento ropa u objetos personales.

- Cada alumno es responsable de la limpieza desu lugar de trabajo y del material asignado, asícomo de los microscopios que haya usado.

- Se deben usar los mecheros Bunsen con pre-caución, no dejando material inflamable cerca yevitando el posible contacto con pelo y ropas. Secomprobará que se ha apagado el gas al finalizarel experimento y al abandonar el laboratorio.

- Está prohibido pipetear con la boca.

- Ante un vertido accidental de material micro-biológico debe informarse inmediatamente al pro-fesor encargado del grupo.

- No se debe forzar un tubo de vidrio o la aperturade un frasco sin tener protegidas las manos.

- No se manejarán los autoclaves o el materialrecién esterilizado si no se dispone de guantesapropiados.

- La eliminación de residuos, material desechabley material reciclable se realizará siguiendo laspautas de la práctica 1, utilizando los contenedo-res dispuestos a tal efecto.

- Se deben lavar las manos con jabón antisépticoante cualquier sospecha de contaminación y siem-pre antes de marcharse del laboratorio.

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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

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Introducción

Para trabajar en un laboratorio de Microbiología serequieren unas técnicas específicas y diferentesde las que se utilizan en otras disciplinas. Esimprescindible trabajar en condiciones asépticas:El material e instrumental que se va a utilizar, asícomo los medios de cultivo, deben ser sometidosa algún procedimiento de esterilización, eliminán-dose de ellos cualquier posible microorganismo.Para mantener las condiciones de esterilidad,debemos trabajar en campana de flujo laminar oen la proximidad de la llama de un mecheroBunsen. En el laboratorio, el trabajo con microorganismossuele realizarse utilizando cultivos axénicos opuros, es decir, que contienen organismos de unasola especie microbiana. La posibilidad de conta-minación está siempre presente porque los micro-organismos se encuentran en todos los ambien-tes: En el aire, en el agua, en nuestra piel y, engeneral, en todo lo que tocamos. Para evitar lascontaminaciones hemos de observar las siguien-tes normas:

- El medio de cultivo y el recipiente que lo contie-ne deben estar estériles.

- Los tubos o matraces deben ser tapados conalgodón hidrófobo estéril o cubiertos con uncapuchón metálico, para impedir la entrada demicroorganismos. Si se usan placas de Petrideben mantenerse tapadas mientras no se esténmanipulando.

- Los instrumentos que van a entrar en contactocon el medio de cultivo, con los distintos recipien-tes o con los microorganismos en estudio (asa desiembra, pipetas, etc) deben ser previamente esteri-lizados.

Materiales empleados y forma de uso

- Asa e hilo de siembra: Antes de su utilización,se esterilizan sometiéndolos a la acción de lallama de un mechero hasta que el filamento quedeincandescente. Luego se flameará la parte inferiordel filamento. Una vez utilizados, deben flamearsede nuevo con el objeto de eliminar los microorga-nismos que quedan en ellos.

- Pipetas Pasteur: Son generalmente de vidrio yse utilizan para la transferencia de cultivos líqui-dos, diluciones de suero, etc con ayuda de un chu-pete de goma u otro sistema de aspiración mecá-nica. Pueden utilizarse, con el extremo inferiorcerrado, en sustitución del hilo de siembra, cuan-do se realizan siembras en el interior del agar (enprofundidad). Para ello se sella previamente elextremo de la misma con la llama del mechero.

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Figura I. I n s t r u m e n t o spara siembra demicroorganismos

A: Asa de siembra

B: Hilo de siembra

C: Pipeta Pasteur

D: Cayado

Figura II. Pipetas

A: Pipeta automática de 0,2-1 ml

B: Pipeta automática de 0,02-0,2 ml

C: Pipeta de vidrio de 10 ml

D: Pipeta de vidrio de 1 ml

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

- Varillas de vidrio macizo acodadas (cayados):Sirven para distribuir los microorganismos de lamuestra sobre la superficie del medio de cultivocontenido en una placa de Petri. Se utilizarán pre-viamente esterilizadas, impregnándolas en alcoholy pasándolas posteriormente por la llama delmechero. También, pueden hacerse usando unapipeta Pasteur, sellando el extremo de la misma yacodándola con la llama del mechero.

- Pipetas graduadas de vidrio o plástico: Se sumi-nistran ya estériles a los alumnos, dentro de estu-ches metálicos o bien empaquetadas de formaindividual (envueltas en papel satinado o plásticopara mantener su esterilidad), en cualquier casodeben abrirse cerca de la llama del mechero. Lapipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada,debe flamearse ligeramente antes de ser usada.Las pipetas llevan un algodón en la boquilla, queactúa como filtro, para evitar la contaminación ypara impedir la llegada de líquido al sistema desucción. Dicho algodón debe permanecer en laboquilla durante el uso. Bajo ningún concepto sedebe pipetear con la boca una muestra micro-biológica. Para pipetear suspensiones de microor-ganismos se utilizan chupetes o pipeteadores máso menos sofisticados, como son las peras degoma provistas de válvulas que permiten controlarla succión y el dispensado de los líquidos o los dis-positivos semejantes a jeringas en los que se colo-

ca la pipeta y que operan por medio de un émbo-lo o con ayuda de bombas eléctricas.

- Tubos de ensayo con cultivos problema y pla-cas Petri: Se destapan cerca de la llama delmechero utilizando para ello sólo los dedos quequedan libres en la mano que sostiene el asa desiembra. Se flamea la boca del tubo, se toma unapequeña muestra del cultivo con asa de siembraestéril, previamente atemperada, y tras flamear denuevo la boca del tubo colocamos el tapón. Todoel proceso se realiza cerca de la llama. Si el medioes líquido, se debe agitar el tubo antes de tomar lamuestra, porque los microorganismos tienden asedimentar. En el caso de que el medio sea sólido(tubos de agar inclinado y placas Petri), la mues-tra se obtendrá rozando ligeramente con el asa lazona en la que se aprecia masa microbiana. Lostubos y las placas deben permanecer abiertos elmenor tiempo posible con el fin de evitar contami-naciones.

- Medios de cultivo: Pueden ser líquidos, sólidosy semisólidos. Se distribuyen en matraces, tubosde ensayo y placas de Petri. Estas últimas sólo lle-van medio sólido. Su preparación y esterilizaciónse describe mas adelante. La composición de los medios, colorantes y reac-tivos utilizados en prácticas se describe en elanexo del final de la guía.

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El asa de siembra semaneja cogiéndola delmango como si fuera unlápiz

El tapón se manejacon el dedo meñiquede la mano derecha.

Toda la operación serealiza cerca delmechero Bunsen

La boca del tubo seflamea después de abriry antes de cerrar

Figura III. Manejo del asa de siembra durante una inoculación.

En Microbiología es importante recordar la necesi-dad de una pulcra y esmerada limpieza del mate-rial. Asimismo, es muy importante la recuperacióndel material reciclable y la eliminación del materialdesechable.

Todos los objetos sucios o contaminados debenrecogerse en recipientes adecuados, provistos detapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipe-tas, se separa del resto del material recogiéndoseen un contenedor vertical u horizontal lleno de unasolución desinfectante, como por ejemplo unasolución diluida de lejía, en la que permaneceráantes de su lavado durante 24 horas.

Como los objetos contaminados contienen, confrecuencia, cantidades importantes de materiaorgánica (procedente de los medios de cultivo)que protegen a los microorganismos de los agen-tes físicos o químicos utilizados en la descontami-nación de los mismos, no puede asegurarse latotal destrucción de las formas vegetativas ymucho menos de las esporas. Por ello, se reco-mienda utilizar mayores concentraciones dedesinfectante y tiempos más largos de tratamientoque para la desinfección o la esterilización dematerial limpio.

Generalmente se utiliza el autoclave para la des-contaminación de instrumentos, equipos y mate-rial que sean estables al calor, así como de mate-rial desechable. A tal objeto se coloca este mate-rial en recipientes adecuados y se introducen en elautoclave sometiéndolos a la acción del vapor deagua a una atmósfera de sobrepresión (121º C) enciclos más prolongados de lo habitual (1 hora enlugar de 30 minutos).

Una vez efectuado este tratamiento, se procede asu lavado para eliminar toda materia extraña,sumergiendo el material en agua caliente jabono-sa o utilizando detergentes, mezcla crómica ocualquier otro procedimiento enérgico, tantomecánico como químico. Se aclara bien con abun-dante agua y se deja escurrir y secar a tempera-tura ambiente. En el caso de las pipetas, y antesde ser lavadas, debe extraerse con ayuda de unalambre o pinzas especiales, el trozo de algodónque tienen en la boquilla.Algunos de los objetos sucios y contaminados(portaobjetos, pipetas, etc), después de lavados,

se sumergen en una mezcla sulfocrómica dondese dejan 24 horas al cabo de las cuales se lavancon agua y se dejan escurrir. Los portas se secancon un paño de hilo limpio, procurando que noqueden hilazas sobre la superficie.

El material que contiene colorantes se trata, segúnlas condiciones del material, durante un tiempovariable con una solución que puede ser de ácidoclorhídrico, nítrico o mezcla sulfocrómica.

El resto del material (tubos de plástico, jeringas,etc) se trata con distintas soluciones desinfectan-tes como hipoclorito sódico, formol, etc, pero deberecordarse que se utilizan a concentracionessuperiores a las utilizadas con otros fines.

PRÁCTICA 1

ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO

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Introducción

En Microbiología se define esterilización como ladestrucción o eliminación total de todos los micro-organismos vivos en un objeto o material, inclui-das las endosporas bacterianas. La esterilidad esun estado absoluto, no hay grados de esterilidad.El material que se va a esterilizar debe prepararsede tal manera que se conserve sin contaminar unavez esterilizado:

- El material de vidrio, como tubos, matraces,frascos, etc, se cierran con algodón graso o tapo-nes metálicos para evitar la entrada o salida de losmicroorganismos. Además, cuando se usaalgodón, ha de cubrirse éste con un papel imper-meabilizado. En el caso de las pipetas, se lescoloca en la boquilla un trocito de algodón queactuará como filtro, evitando la contaminación deloperario con los microorganismos de la muestra yque éste a su vez contamine la muestra. Una vezpreparadas, se introducen en estuches o cajasmetálicas, o bien se envuelven individualmente enpapel satinado para ser posteriormente esteriliza-das. Todo el material de vidrio se esteriliza concalor seco, generalmente en un horno Pasteur.

- El material de plástico desechable ya se sumi-nistra estéril y listo para su uso. Por ejemplo, lasplacas de Petri se introducen en bolsas de plásti-co selladas y se esterilizan con óxido de etileno oradiaciones.

- Las soluciones y medios de cultivo líquidos seenvasan en matraces o tubos y se esterilizan, ge-neralmente, en autoclave.

Existen varios métodos para llevar a cabo el pro-ceso de esterilización y la elección de uno deter-minado viene condicionado por el tipo de materialque se quiere esterilizar.

Objetivos

Conocer la importancia de la esterilización y fami-liarizarse con el manejo de los procedimientosmás frecuentemente utilizados para llevarla acabo.

Material

Mechero Bunsen, horno Pasteur o estufa de airecaliente, autoclaves, equipos de filtración y mate-riales a tratar.

Técnicas

El método más comúnmente empleado para des-truir los microorganismos es el calor, entre otrasrazones porque es el más económico y el másfácil de controlar. El calor utilizado con este finpuede aplicarse en forma de calor seco o de calorhúmedo. El calor seco destruye los microorganis-mos por efectos de oxidación y se requieren tem-peraturas muy elevadas. El calor húmedo eliminalos microorganismos a temperaturas menores, yaque la presencia de agua acelera la rotura de lospuentes de hidrógeno responsables de la estruc-tura terciaria de las proteínas, haciendo que éstasse desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.

La esterilización por calor seco puede hacersepor flameado o mediante estufas de aire caliente.

I) Flameado: Se emplea para esterilizar asas ehilos de siembra, pinzas, espátulas, etc. Consisteen someter directamente a la acción de la llamade un mechero Bunsen los utensilios que sevayan a esterilizar. Este método es rápido y su efi-cacia es altísima, sin embargo no se puede aplicara objetos termolábiles.

II) Esterilización por aire caliente: Se lleva acabo en estufas de aire caliente y consiste encolocar los objetos que se van a esterilizar, debi-damente protegidos para que no se contaminenuna vez esterilizados, en el interior de una estufa.Este procedimiento se utiliza para esterilizar mate-rial de vidrio: Pipetas, matraces, tubos, etc. u otrosmateriales termorresistentes. Las temperaturas alas que se someten estos materiales son muy ele-vadas (160-180ºC durante cerca de 2 horas).Estas temperaturas no pueden utilizarse paraesterilizar líquidos (como medios de cultivo), yaque al llegar a los 100ºC comenzarían a hervir ycontinuarían hirviendo sin elevar su temperaturapor encima del punto de ebullición del agua a pre-sión atmosférica y a esta temperatura las endos-poras bacterianas pueden sobrevivir durante

PRÁCTICA 2

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL

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horas. Pero incluso en muestras en las que supié-semos que no existen endosporas, esta metodo-logía puede implicar cambios en la concentraciónde los componentes del medio, a causa de la fuer-te evaporación sufrida.

El calor húmedo también se utiliza para la des-trucción de los microorganismos siendo, como yase ha comentado, a igual temperatura, muchomás eficaz que el calor seco; con este tratamientolas enzimas se desnaturalizan rápidamente, aligual que las membranas celulares. Además, elvapor de agua, especialmente si se genera asobrepresión, es un eficaz transmisor de calor alinterior de la célula microbiana. Se puede aplicarutilizando varios métodos: Ebullición, vapor fluen-te y vapor saturado a presión:

I) Ebullición: El agua hirviendo (100ºC) tieneacción limitada, ya que aplicada durante 10 minu-tos va a destruir las formas vegetativas de losmicroorganismos, pero las endosporas bacteria-nas pueden sobrevivir incluso a tratamientos pro-longados. Se podría utilizar el baño María o bañode agua hirviente (sólo con fines de desinfecciónen el laboratorio), cuando no se necesita alcanzarla esterilidad o cuando no se dispone de otrosmétodos mejores, tanto para material (pinzas, tije-ras, escalpelos, etc) como para medios de cultivoque no puedan esterilizarse en autoclave.

II) Vapor fluente: Esta técnica se emplea con fre-cuencia para esterilizar medios de cultivo que nose puedan someter a una temperatura superior a100ºC sin que pierdan alguna de sus propiedades,como leche, azúcares, suero, etc. Se utiliza unautoclave a presión atmosférica, con la espitaabierta, donde nunca se superan los 100ºC, y serealiza el proceso durante tres días consecutivos,dejándose a temperatura ambiente en los interva-los entre dos tratamientos. La muestra se sometea calentamiento (100ºC) durante 30-45 minutosdestruyéndose en este proceso las formas vege-tativas pero no las endosporas termorresistentes.Si éstas se encuentran presentes en la muestragerminan después del calentamiento y estas for-mas vegetativas serán destruidas en los siguien-tes ciclos.Este método de esterilización se denomina tam-bién esterilización fraccionada o tindalización.

III) Vapor saturado a presión: La esterilizaciónpor esta técnica utiliza vapor de agua saturadoque se somete a una atmósfera extra de presiónsobre la presión atmosférica normal, elevándosecon ello el punto de ebullición del agua de 100ºCa 121ºC y consiguiéndose la destrucción de todoslos microorganismos (salvo los termófilos extre-

mos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta tem-peratura es también necesaria para la destrucciónde las endosporas bacterianas, que presentanuna alta resistencia térmica y que pueden sobrevi-vir, como ya se ha indicado, a 100ºC durantehoras. El vapor de agua difunde por ósmosis através de las membranas de las esporas, coagu-lando su protoplasma, fenómeno que se acentúasi el vapor es saturado y a sobrepresión. Esta téc-nica de esterilización requiere el uso del autoclave.

El autoclave permite elevar la presión una o dosatmósferas sobre la presión atmosférica, eleván-dose con ello la temperatura de ebullición delagua que se encuentra en su interior.Consta de un recipiente metálico, generalmentede acero inoxidable, similar a una gran olla, encuyo interior se introduce el material a esterilizarque se coloca sobre una rejilla o placa agujerea-da. Después de cerrar cuidadosamente la tapa, seconecta la fuente de calor y comienza a elevarsela temperatura en su interior. La salida continuadel chorro de vapor a través de la válvula nos indi-ca que el aire contenido en el interior del autocla-ve ha sido eliminado. La eliminación de este airees importante ya que la difusión del calor entre elvapor de agua y el aire es pobre, por lo que no sealcanzará la temperatura esperada a la presiónelegida y no se conseguirá la esterilización. Laválvula se cierra cuando sólo sale vapor de aguay, a partir de ese momento, comienza a elevarsela presión hasta una atmósfera sobre la presiónnormal, elevándose como consecuencia la tempe-ratura hasta 121ºC. Transcurridos 15-20 minutos,en estas condiciones, el material se ha esteriliza-do. Es el incremento de temperatura por encimade los 100ºC y no la presión la que destruye losmicroorganismos.Si se esterilizan volúmenes grandes de líquidos,es necesario mantener el material en el autoclavedurante períodos de tiempo más prolongados,pues se tarda más en alcanzar los 121ºC en el

Figura 2.1: Autoclave de cuba horizontal

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centro de un gran volumen.Una vez transcurrido el tiempo necesario, seapaga el autoclave y se deja descender la tempe-ratura hasta que el indicador marque menos de80ºC, que será cuando la presión haya descendi-do hasta presión atmosférica. Se abre ligeramen-te la espita para comprobar que no queda vapor apresión en el interior y ya se puede proceder a reti-rar todo el material esterilizado, dejándolo enfriara temperatura ambiente.El autoclave se utiliza para esterilizar medios decultivo, instrumentos, ropas, soluciones, jeringas,etc que puedan soportar altas temperaturas y unaatmósfera de sobrepresión.Para la esterilización de materiales líquidos sensi-bles al calor, como algunos medios de cultivo,soluciones de antibióticos, enzimas, vacunas, etc.o también para gases, se utiliza la filtración. En laesterilización por calor se destruyen losmicroorganismos del medio, mientras que la filtra-ción los retira de una forma mecánica, en lugar dedestruirlos.La filtración es el paso de un líquido o gas a travésde un material filtrante, con poros lo suficiente-mente pequeños como para retener células micro-bianas. Los filtros que se utilizan en la actualidadson, generalmente, los denominados filtros demembrana y están integrados por pequeñas pie-zas de material sintético, generalmente acetato decelulosa o policarbonato, que pueden tener poroscon tamaños de 0,22 y 0,45 μm, diseñados pararetener bacterias. La acción combinada de losporos, la trama del filtro y la naturaleza químicadel material utilizado retiene los microorganismos,pero no el fluido. Los fluidos que se van a filtrarpasan a través de la membrana con la ayuda delvacío generado, por ejemplo, con una bomba devacío.Tanto los filtros de membrana como los equiposde filtración con los que éstos se usan deben seresterilizados por otros métodos, generalmentevapor saturado a presión en el autoclave.Los virus y algunas bacterias de tamaño muypequeño como, por ejemplo, los micoplasmas, noson retenidos por los filtros habituales.

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Introducción

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes,factores de crecimiento y otros componentes, pre-parados en el laboratorio, que suministran loscompuestos necesarios para el desarrollo de losmicroorganismos.Algunas bacterias pueden crecer satisfactoria-mente en casi cualquier medio de cultivo, otrasbacterias necesitan medios especiales y existenalgunas que no pueden crecer en ninguno de losmedios desarrollados hasta ahora. Los distintostipos de medios de cultivo varían según las nece-sidades de los microorganismos objeto de estudio,pero todos han de cumplir los siguientes requisi-tos:- Han de contener las sustancias necesarias parael crecimiento del microorganismo que se siem-bra.- Han de mantenerse estériles hasta el momentode la siembra.Los requerimientos para el crecimiento microbianose pueden agrupar en dos categorías: Físicos yquímicos. Entre los primeros se incluyen la tempe-ratura, el pH y la presión osmótica; entre losrequerimientos químicos se encuentran el agua,las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustanciasminerales, el oxígeno y determinados factoresorgánicos de crecimiento.Finalmente, una vez sembrados, deben ser incu-bados a la temperatura y condiciones adecuadas.

Objetivos

Aprender a preparar, esterilizar y almacenar dis-tintos tipos de medios de cultivo.

Tipos de medios de cultivo

Existe una gran variedad de medios para el culti-vo de los microorganismos en el laboratorio, lamayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados,necesitando algunos sólo la adición de agua o laesterilización.Los medios de cultivo pueden clasificarse:

A) Por el estado físico en que se encuentran

1.-Medios líquidos o caldos: Son aquellos quecontienen, disueltos en agua, los nutrientes nece-sarios para el crecimiento de los microorganis-mos.2.-Medios sólidos: Contienen nutrientes disuel-tos en agua pero se les añade un agente solidifi-cante.El agar es un polisacárido complejo que se obtie-ne de algas rodofíceas de origen marino cuyaspropiedades son de gran utilidad en la preparaciónde medios de cultivo sólidos: No es degradadoenzimáticamente por los microorganismos (aexcepción de algunos microorganismos deambientes marinos), funde aproximadamente a100ºC y permanece en estado líquido mientras latemperatura no descienda por debajo de 45-50ºC.Además, una vez solidificado se puede incubar atemperaturas elevadas sin que se licúe.Generalmente el agar se añade, para solidificar unmedio líquido, en una concentración del 1,5%. Losmedios con agar se envasan en tubo o en placade Petri.3.-Medios semisólidos: Son similares a losmedios sólidos, pero la concentración del agentesolidificante es menor, generalmente del 0,4% conlo que, una vez solidificados mantienen una con-sistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, paradeterminar la movilidad de los microorganismos.4.-Medios fluidos: Son medios líquidos a los quese añade una baja proporción de agar (por ejem-plo, 0,075%), lo que les confiere un mayor visco-sidad. Su uso es común en la determinación deltipo respiratorio de los microorganismos.

B) Por su composición

1.-Medios complejos: Contienen todos losnutrientes necesarios para el crecimiento demuchos tipos de microorganismos, pero no seconocen todos los componentes que forman partede ellos, ni las concentraciones exactas de cadauno de ellos. Muchos de sus componentes proce-den de la degradación parcial de tejidos o produc-tos animales, de plantas o de microorganismosque son fuente de aminoácidos, azúcares, lípidos,vitaminas y minerales.Ejemplos de dichos componentes son las pepto-nas o triptonas (proteínas animales digeridasenzimáticamente), el extracto de carne y el extrac-to de levadura. Como ya se ha mencionado, enestos medios suelen encontrarse azúcares pero

PRÁCTICA 3

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

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en muchos casos los medios complejos son suple-mentados con glucosa.Un ejemplo de medio nutritivo complejo es elcaldo nutritivo, que contiene peptona y extracto decarne.2.-Medios definidos: Son aquellos que contienenlos distintos nutrientes en forma de productos quí-micos puros (pero no extrapuros) y en concentra-ciones conocidas. Así, un medio definido que per-mita el desarrollo de un microorganismo heterótro-fo y "poco exigente", como E. coli, debería conte-ner sales inorgánicas y fuentes de carbono y nitró-geno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa yNH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro,manganeso y cobre, se encuentran generalmentepresentes como contaminantes de los productosquímicos antes citados, en cantidades suficientespara el crecimiento.

C) Por su utilización:

Muchos medios de cultivo utilizados en el labora-torio son medios generales en los que se puedendesarrollar una gran variedad de microorganismoscon distintos requerimientos nutricionales. Sinembargo, en algunas ocasiones, es necesario ais-lar a partir de una muestra un microorganismo quese encuentre en un bajo número y que pueda serenmascarado por otros microorganismos presen-tes en un número más elevado. En esos casos esrecomendable utilizar medios de cultivo que ayu-den a separar y diferenciar dichos microorganis-mos o que, de forma selectiva, favorezcan el cre-cimiento de alguno de ellos.

Estos medios pueden ser:

1.-Medios selectivos: Son aquellos que permitenel crecimiento de un tipo determinado demicroorganismos, inhibiendo el desarrollo de losdemás.Algunos de estos medios contienen un agenteselectivo como antibióticos, productos químicos,colorantes, etc. Entre los agentes selectivos pode-mos citar el cloruro sódico, que en concentraciónelevada inhibe la mayoría de los microorganismosexcepto los microorganismos halotolerantes,como son los estafilococos, o la azida de sodio,que inhibe el crecimiento de bacterias Gram nega-tivas al fijarse al hierro de la porfirina del sistemacitocromo, permitiendo seleccionar los estreptoco-cos, que carecen de este sistema, así como otrosGram positivos. De la misma manera, la bilis ysales biliares convierten los medios de cultivo alos que se añaden en selectivos para enterobac-terias ya que, además de inhibir a muchos micro-organismos Gram positivos, en concentraciones

elevadas inhiben también a otras bacterias Gramnegativas.Los colorantes, como el verde brillante, inhibenselectivamente las bacterias Gram positivas, sien-do también inhibidor para la mayoría de las bacte-rias intestinales excepto para Salmonella. Estecolorante es la base del medio Agar VerdeBrillante, utilizado para el aislamiento deSalmonella a partir de muestras fecales.Los medios selectivos pueden serlo también porsu pH, así el agar glucosado de Sabouraud ajus-tado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hon-gos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias.

2.-Medios diferenciales: Son aquellos diseñadospara distinguir unos microorganismos de otros, apartir de una población mixta, por la aparienciadistinta que toman sus colonias. Estos medios decultivo ponen de manifiesto propiedades que undeterminado tipo de microorganismo posee.Por ejemplo, el agar sangre es un medio nutritivoenriquecido y es a la vez un medio diferencial, yaque permite reconocer aquellos microorganismoscapaces de producir hemólisis. Otros medios dife-renciales llevan incluido un indicador de pH, quepone de manifiesto la degradación de un nutrienteespecífico (generalmente un azúcar) por el cam-bio de color que se origina cuando éste es meta-bolizado, como en el caso del medio CLED.Los medios diferenciales pueden ser ademásselectivos, si se añaden agentes que inhiben elcrecimiento de determinados microorganismos.En este caso va a ser posible distinguir diferentestipos microbianos dentro del limitado grupo demicroorganismos que pueden crecer. Así, el medioLevine es selectivo para las bacterias Gram nega-tivas por contener dos colorantes, eosina y azul demetileno, que inhiben el crecimiento de bacteriasGram positivas. Es también un medio diferencial,porque distingue las bacterias que fermentan lalactosa (con producción de ácido) de las no fer-mentadoras. La formación de ácidos a partir delactosa hace que ambos colorantes precipiten enla superficie de las colonias, que aparecen decolor morado. En ciertas ocasiones, como ocurreen el caso de E. coli, las colonias presentanademás un brillo metálico. El agar MacConkey esotro ejemplo de medio selectivo y diferencial. Lapresencia de sales biliares y cristal violeta inhibenel crecimiento de bacterias no entéricas; la fer-mentación de lactosa con liberación de productosácidos hace virar un indicador de pH incorporadoen el medio.

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AGAR INCLINADO

MEDIOS LÍQUIDOS (CALDOS)

Baño a 55ºC

Figura 3.1: Preparación de medios de cultivo

Figura original del "Manual Práctico de Microbiología" (Díaz y cols.)

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Preparación de los medios de cultivo

La preparación de medios de cultivo se ha simpli-ficado en gran medida por la comercialización demedios deshidratados, en los que los diferentesnutrientes se encuentran ya mezclados en lasdebidas proporciones, siendo sólo necesario laadición de la cantidad correcta de agua destiladapara disolver sus componentes.Cuando se prepara un medio líquido se debe di-solver totalmente todos sus componentes en aguadestilada. A continuación el caldo se envasa en losrecipientes adecuados (matraces o tubos), tapan-do los mismos y esterilizándolos.La preparación de un medio sólido puede hacersede dos maneras: Preparar el caldo y añadir agar al1,5% o bien utilizar un medio sólido comercial.Independientemente de la forma elegida parahacerlo, la preparación de los medios de cultivosólidos requiere procedimientos especiales, yaque el agar es insoluble en agua. Por ello, una vezañadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta100ºC, para permitir que el agar se funda y quedeincorporado al resto de los nutrientes disueltos.El medio fundido se dispensa en tubos o matra-ces, que se tapan y se esterilizan. Los medios sóli-dos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar enposición vertical, si van a ser inoculados en pro-fundidad, o bien pueden inclinarse para que alsolidificarse en esa posición adopte la forma incli-nada que proporciona una mayor superficie desiembra.Si se desean preparar placas de Petri, se utilizaráel medio de cultivo que ha sido esterilizado en unmatraz y, una vez atemperado, se verterá en pla-cas vacías en un ambiente aséptico, como el queproporciona la proximidad de la llama de unmechero o una campana de flujo laminar. En algu-nas ocasiones, el medio de cultivo destinado aplacas puede conservarse estéril en tubos, que sefundirán al baño María cuando se vayan a prepa-rar las placas.Si se han de incorporar al medio compuestos ter-molábiles, como vitaminas o antibióticos, se este-rilizarán éstos por filtración y se añadirán al mediode cultivo previamente esterilizado en autoclave yuna vez que este se haya atemperado. En todoslos casos se han de seguir las instrucciones delfabricante.La conservación de los medios ya preparadospuede hacerse a temperatura ambiente, pero espreferible conservarlos a 4ºC para retrasar su des-hidratación.

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Introducción

La morfología de los microorganismos puede exa-minarse de dos formas: Observando microorga-nismos vivos sin colorear (en fresco) y observan-do células muertas teñidas con colorantes.El examen en fresco de los microorganismos per-mite conocer algunas de sus características (mor-fología, tamaño, movimiento, etc). Sin embargo,las microorganismos vivos son casi incoloros y nose pueden visualizar fácilmente al microscopioóptico normal cuando se encuentran suspendidosen agua, de ahí que se utilicen colorantes paraincrementar su contraste con el entorno que losrodea y de esta forma hacerlos visibles.Los colorantes son compuestos aromáticos solu-bles en agua (generalmente en forma de sales),que contienen un ión orgánico coloreado y otro ióninorgánico.Pueden dividirse en dos grupos: Ácidos y básicos.El colorante es ácido si la porción coloreada tienecarga negativa, es decir, si tiene un anión colore-ado, siendo en este caso repelido por estructurasde la célula que presenten la misma carga, comoes el caso de la superficie bacteriana. El coloran-te se denomina básico si la porción coloreada esel catión, cargado positivamente y con afinidad porestructuras de la célula con carga negativa, comoes la superficie celular.Las bacterias toman mejor los colorantes básicos,como son el cristal violeta, el azul de metileno y lasafranina. La eosina es un colorante de tipo ácido,así como la nigrosina.

EXAMEN EN FRESCO

Objetivo

Observar microorganismos vivos en el microsco-pio de campo claro. Estudiar su morfología y agru-pación, apreciar las diferencias de tamaño entreorganismos procarióticos y eucarióticos y apren-der a diferenciar el movimiento browniano de lamovilidad de los microorganismos.

Material

Asa de siembra, portaobjetos y cubreobjetos (oportaobjetos excavados), cultivos de microorga-nismos (Proteus mirabilis y Saccharomyces spp.)y microscopio.

Técnica

Para la observación de microorganismos sin teñirse pueden utilizar dos tipos de preparaciones:Montaje húmedo y montaje en gota pendiente.- En el primer caso, depositar una gota de lamuestra tomada con asa de siembra previamenteflameada, en un portaobjetos y colocar sobre lamisma un cubreobjetos presionando suavemente.- En el segundo caso, depositar una gota de lamuestra en el centro de un cubreobjetos limpio ycolocarlo invertido sobre el pocillo de un portaob-jetos excavado, de manera que la gota no se

PRÁCTICA 4

OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

Figura 4. 1. Montaje húmedo entre portaobjetos y cubreobjetos

Figura 4. 2. Montaje en gota pendiente.

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mueva ni tome contacto con los lados o el fondode la depresión.

Utilizar el microscopio con el objetivo de 40aumentos, disminuyendo la cantidad de luz inci-dente sobre la muestra con ayuda del diafragma obajando el condensador. Un exceso de luz dificul-tará la observación de los microorganismos, yaque poseen el mismo índice de refracción que elmedio circundante (el vidrio del portaobjetos y ellíquido en el que se encuentran suspendidos).Si se utiliza el objetivo de inmersión se debe colo-car una gota de aceite de inmersión sobre elcubreobjetos.

Para reducir la evaporación de la muestra con elcalor desprendido por el foco luminoso y que losmicroorganismos pierdan su movilidad, debe reali-zarse la operación rápidamente o bien sellar losbordes del cubreobjetos con parafina.Observar la forma y el tamaño de los microorga-nismos, comparando las levaduras (células euca-rióticas) con las bacterias (células procarióticas).Describir su movilidad, diferenciando el movimien-to browniano, debido a la colisión de los microor-ganismos con las moléculas del líquido que losrodea, de la verdadera movilidad. La movilidad semanifiesta por el desplazamiento de los microor-ganismos a grandes distancias y en una direccióndeterminada, aunque a veces pueden apreciarserotaciones o giros. Los desplazamientos cortos ysin sentido se deben al movimiento browniano.

TINCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS

Existen distintos tipos de tinción:

1.-Tinción simple: Aquella en la que sólo se utili-za un colorante, que generalmente tiñe a losmicroorganismos. Este tipo de tinción se denomi-na directa.Si el colorante proporciona una coloración alfondo, sin alterar el aspecto de las células, quepermanecen sin teñir, la tinción se denominanegativa.La tinción simple permite observar morfologíacelular, tamaño y agrupación de los microorganis-mos.

2.-Tinción diferencial: Es aquella que empleasecuencialmente dos colorantes que permiten dis-tinguir tipos de microorganismos en función dediferencias en su estructura y composición quími-ca. La tinción de Gram y la ácido-alcohol-resisten-te, basadas en las propiedades de la pared celularbacteriana, son las más utilizadas.

3.-Tinción estructural: Se utiliza para identificar yestudiar determinadas estructuras que puedenestar presentes en los microorganismos. En lastinciones estructurales se colorea únicamente unaparte de la célula.Se utilizan este tipo de tinciones para poner enevidencia la presencia de cápsulas, endosporas,flagelos o inclusiones (almidón, polifosfato, etc.).

Técnica general

En la mayoría de los casos, los pasos a seguir sonlos que se indican a continuación:

1- Realizar una extensión con el asa de siembraesterilizada, para ello se toma una pequeña gotade cada uno de los cultivos y se extiende en unportaobjetos limpio. Si el cultivo procede de unmedio sólido, se coloca una gota de agua en elportaobjetos y se mezcla con una pequeña por-ción de la muestra hasta formar una suspensiónhomogénea, extendiéndola con el fin de obteneruna fina película. Posteriormente, se deja secar alaire o en la parte alta de la llama del mechero,pero no se debe eliminar el líquido calentando elportaobjetos a la llama porque pueden distorsio-narse las células.2- Fijar la muestra. La fijación tiene como finalidadcoagular el protoplasma de las células y hacer quese adhieran al portaobjetos, siendo el calor elmétodo más utilizado para la fijación, aunque pue-den utilizarse otros agentes, como el alcohol(metanol) u otros compuestos químicos. La fija-ción con calor se recomienda cuando se trabajacon muestras de un cultivo sólido; en muestrasobtenidas de un cultivo líquido es mejor hacer lafijación con metanol ya que se retienen en el por-taobjetos un mayor número de células. Es nece-sario que la extensión se haya secado antes deproceder a la fijación, por ello se debe esperarhasta que el líquido de la misma se evapore. Lafijación por calor se lleva a cabo pasando variasveces la preparación seca a través de la llama deun mechero, con la extensión hacia arriba. El calordesnaturaliza las proteínas y suele matar al micro-organismo. Es importante no excederse en esteproceso, para evitar que las bacterias se deformeno se rompan, siendo suficiente que el portaobjetosse note caliente sobre el dorso de la mano, perono demasiado.3- Realizar la tinción. Para ello es necesario cubrirla preparación con abundante colorante y dejarloactuar durante algún tiempo. 4- Pasado ese tiempo, lavar con agua las prepa-raciones teñidas para eliminar el exceso de colo-rante, dejando caer con suavidad el agua sobre unextremo del portaobjetos, que se mantendrá incli-nado durante este proceso. No se debe dirigir el

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agua con demasiada fuerza sobre la preparaciónpara no arrastrar la muestra.5- Eliminar el exceso de agua del portaobjetos gol-peándolo ligeramente con cuidado por el canto.Permitir que se seque la preparación, bien utili-zando un papel secante, sin frotar o bien dejándo-la secar al aire, aunque lleva más tiempo.6- Examinar la preparación al microscopio, con elobjetivo de inmersión (100x), colocando, previa-mente, una gota de aceite de inmersión sobre lapreparación.

TINCIÓN SIMPLE

Objetivo

Estudiar las características de los microorganis-mos en cultivo, es decir, tamaño, forma y agrupa-ción de las células.

Material

Asa de siembra, portabojetos, cultivos bacterianosde microorganismos (Escherichia coli yStaphylococcus aureus), colorantes, microscopioy aceite de inmersión.

Técnica

1- Preparar extensiones de los distintosmicroorganismos, dejar secar al aire y proceder asu fijación.2- Realizar la tinción cubriendo la preparación conabundante colorante y dejarlo actuar durantealgún tiempo. Para la fuchsina fenicada bastan de15 a 30 segundos, para el cristal violeta es sufi-ciente de 30 a 45 segundos y para el azul de meti-leno de 3 a 5 minutos.3- Lavar con agua las preparaciones teñidas ycontinuar con la técnica tal y como se indica pre-viamente.4- Examinar la preparación al microscopio con elobjetivo de inmersión. Observar la forma y dispo-

Figura 4.4. Procedimiento general para realizar una tinción.

Figura 4.3. Técnica de extensión de una muestra sobre portaobjetos.

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sición de los microorganismos teñidos con el co-lorante.

TINCIÓN NEGATIVA

Objetivo

Conocer el tamaño y la morfología de los microor-ganismos, realizando una coloración del fondo, sinque se coloreen las bacterias o las estructurasque se tratan de observar.

Material

Asa de siembra, portaobjetos, cultivo bacterianode microorganismos (Escherichia coli yStaphylococcus aureus), nigrosina al 10%, microscopioy aceite de inmersión.

Técnica

1- Depositar una gota de solución de nigrosina al10% sobre un portaobjetos.2- Homogeneizar sobre dicha gota la muestramicrobiológica con el asa de siembra previamenteesterilizada.3- Dejar secar al aire.4- Examinar la preparación con el objetivo deinmersión. Los microorganismos aparecerán sinteñir, en contraste con el fondo oscuro, pudiéndo-se apreciar su tamaño, forma y agrupación carac-terísticas

Alternativamente, esta tinción se puede realizar conuna cierta cantidad de sarro dentario, extraídorecientemente con un palillo estéril,

TINCIÓN DIFERENCIAL

La tinción diferencial colorea selectivamente cier-tos tipos de células, ya que los colorantes que seutilizan reaccionan de modo diferente con los dis-tintos microorganismos, generalmente debido adiferencias en la estructura y/o composición quí-mica de la pared celular de éstos.Estas técnicas son de gran interés en la identifica-ción y la clasificación de las bacterias, y la más uti-lizada es la tinción de Gram.

Tinción de Gram

Es uno de los procedimientos de tinción más útilesen la identificación de microorganismos, ya quedivide a éstos en dos grandes grupos: Gram posi-tivos y Gram negativos. En esta técnica es nece-sario utilizar varias soluciones:

1.- Un primer colorante básico, generalmente cris-tal violeta, que se aplica sobre la muestra y quereacciona con las células (cargadas negativamen-te), coloreándolas.2.- Un mordiente, que incrementa la afinidad entreel primer colorante y las células. Parece ser que elmordiente (solución diluida de yodo) se combinacon el colorante, para formar un compuesto inso-luble coloreado en el interior de la célula.3.- Un agente decolorante, como el etanol de 95%o una solución de alcohol:acetona (3:1), que sondisolventes orgánicos capaces de eliminar el pri-mer colorante de algunas bacterias, decolorándo-las.4.- Un colorante de contraste, igualmente decarácter básico pero de distinto color que el primercolorante. Generalmente se suele utilizar la safra-nina, de color rosa, que contrasta con el color vio-leta del primer colorante, y que teñirá sólo a lasbacterias decoloradas en el paso anterior.

Los organismos que resisten la decoloración yretienen el complejo cristal violeta-yodo apare-cerán de color violeta oscuro al microscopio y sedenominan Gram positivos. Aquellos que pierdenel color inicial del cristal violeta tras la decolora-ción, se clasifican como Gram negativos y tomanel color rosa debido al segundo colorante, la safranina.Las diferencias químicas en sus paredes celula-res, son las que permiten o no la salida del com-plejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram posi-tivas tienen una pared celular gruesa, compuestaprincipalmente por peptidoglucano, mientras queen Gram negativas, aunque la pared está tambiénconstituida por péptidoglucano, es más delgada ypresenta además una membrana externa con lipo-polisacáridos. Las paredes de las bacterias Grampositivas tratadas con alcohol sufren una deshi-dratación y sus poros se contraen, dificultando lasalida del complejo cristal violeta-yodo. En lasGram negativas, el alcohol desorganiza la capalipídica más externa y lava el colorante de la del-gada capa de peptidoglucano.

La tinción de Gram es más reproducible cuandose aplica a cultivos jóvenes de bacterias, ya quelas bacterias Gram positivas, en la fase estaciona-ria de crecimiento, pueden aparecer como Gramnegativas.

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Objetivo

Aprender una técnica de coloración diferencial einterpretar los resultados obtenidos en la misma,distinguiendo bacterias Gram positivas y Gramnegativas.

Material

Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianosde microorganismos (Escherichia coli, Staphy-lococcus aureus, Bacillus subtilis y Neisseria spp.),colorantes, solución de lugol, etanol de 95% osolución de alcohol:acetona (3:1), microscopio yaceite de inmersión.

Técnica

Preparar extensiones de los distintos microorga-nismos, que deberán encontrarse en fase expo-nencial de crecimiento. Dejar secar al aire y pro-ceder posteriormente a la fijación, siguiendo latécnica ya descrita.Para la coloración se seguirá el siguiente protoco-lo (modificación de Hucker):1- Teñir durante un minuto con la solución cristalvioleta.2- Lavar el exceso de colorante con agua.3- Cubrir la extensión con una solución diluida deyodo (lugol), que actuará como mordiente, duran-te un minuto.4- Lavar con agua el exceso de lugol.5- Decolorar con etanol de 95%, cubriendo la pre-paración y dejando actuar durante 30 segundos.Alternativamente, se puede utilizar una soluciónde alcohol:acetona (3:1), dejándola resbalar unossegundos sobre la muestra.6- Lavar con agua abundante para eliminar elresto del disolvente.7- Colorear con safranina durante un minuto (colo-ración de contraste).8- Lavar con agua y dejar que la preparación seseque.9- Examinar las preparaciones al microscopio, conaceite y usando el objetivo de inmersión. Las bac-terias Gram positivas aparecerán coloreadas devioleta, mientras que las Gram negativas seobservan de color rosa.

Tinción de ácido-alcohol-resistentes

Es otra importante tinción diferencial que permitedistinguir aquellas bacterias que una vez teñidasresisten a la decoloración por ácidos y alcoholes.Estas bacterias pertenecen a los génerosMycobacterium y Nocardia y se caracterizan

porque sus paredes celulares contienen un eleva-do porcentaje de lípidos (en su mayoría ácidosmicólicos). Siendo, por ello, impermeables a loscolorantes y a otros compuestos químicos en solu-ción acuosa. Esta característica hace que estosmicroorganismos no se coloreen bien con losreactivos de la tinción de Gram.

Debido a esta gruesa capa de compuestos lipídi-cos en su pared, se deben utilizar métodos espe-ciales para forzar la entrada del primer coloranteutilizado (fucsina fenicada). De ahí, que secaliente la preparación cubierta con este colorantedurante un tiempo establecido (el fenol tambiénfacilita la entrada de la fucsina). Una vez que elcolorante ha penetrado en la pared celular, ladecoloración con ácido y con alcohol resulta tandifícil que dichos microorganismos permanecencoloreados de rosa, mientras que el resto de lasbacterias tomarán el colorante de contraste, azulde metileno.

Esta tinción tiene una gran aplicación en clínica,ya que permite diferenciar microorganismos pató-genos como Mycobacterium tuberculosis, enmuestras patológicas como esputos y secrecionesbronquiales.

Objetivo

Aprender una técnica de coloración diferencial,estudiar la morfología y las propiedades de losmicroorganismos ácido-alcohol-resistentes y dife-renciar estos microorganismos de otros que no loson.

Material

Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianosde microorganismos (Mycobacterium smegmatis yStaphylococcus aureus), colorantes, soluciónácido-alcohólica (3% HCl en etanol 95 %) o bienácido nítrico al 33% y etanol de 95%, microscopio yaceite de inmersión.

Técnica

A. Método de Ziehl-Neelsen

1- Preparar una extensión que contenga una mez-cla de Staphylococcus aureus y Mycobacteriumsmegmatis, secar y fijar como ya se ha descrito. 2- Cubrir la preparación completamente con fucsi-na fenicada y calentar cuidadosamente a la llamade un mechero hasta emisión de vapores, evitan-do la ebullición. Se realiza invirtiendo el mecheroy pasando la llama bajo la preparación periódica-

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mente. Esta operación se repite durante 5 minu-tos, añadiendo colorante conforme éste se evapo-ra. La preparación no debe quedar seca en ningúnmomento.3- Lavar con abundante agua el exceso de colo-rante. 4- Decolorar mediante la adición de 8 ó 10 gotasde ácido nítrico al 33% y dejar actuar a tempera-tura ambiente de 30 a 40 segundos. Lavar conagua y decolorar con etanol de 95% hasta que lamuestra tome un ligero color rosa (unos 30 segun-dos). Alternativamente se puede decolorar consolución ácido-alcohólica durante 20 segundos.5- Lavar nuevamente con agua y hacer la colora-ción de contraste aplicando solución acuosa deazul de metileno o bien azul de metileno deLoeffler durante un minuto.6- Lavar con agua el exceso de colorante y secarla preparación como ya se ha indicado.7- Examinar la muestra teñida al microscopio conel objetivo de inmersión. Los bacilos ácido-alco-hol-resistentes son largos y finos y aparecerán engrupos, teñidos de color fucsia, mientras que lascélulas que no son ácido-alcohol-resistentes apa-recerán de color azul, tras la tinción del contraste.

B. Método en frío o de Kinyoun

Se trata de una modificación del método anterioren la cual el proceso de tinción se realiza de lamanera siguiente: 1- Preparar una extensión de la muestra, secar yfijar como se ha descrito.2- Cubrir la preparación con fucsina fenicada deKinyoun y dejar actuar durante 5-15 min a tempe-ratura ambiente.3- Lavar con abundante agua el exceso de colo-rante.4- Decolorar la preparación con solución ácido-alcohólica durante 20 segundos.5- Lavar nuevamente con agua y hacer la colora-ción de contraste aplicando solución acuosa deazul de metileno o bien azul de metileno deLoeffler durante un minuto.6- Lavar con agua el exceso de colorante y dejarsecar la preparación.7- Examinar la muestra teñida al microscopio conel objetivo de inmersión. Los microorganismosácido-alcohol-resistentes aparecerán teñidos decolor fucsia, mientras que las células no ácido-alcohol-resistentes aparecerán de color azul.

TINCIÓN ESTRUCTURAL

Las tinciones estructurales se utilizan para ponerde manifiesto partes específicas de los microorga-

nismos que carecen del contraste necesario parapoderse observar con el microscopio óptico. Losprocedimientos y colorantes utilizados permitenteñir selectivamente una porción de la célula,como pueden ser endosporas, flagelos, cápsulas,etc.

Tinción de esporas (endosporas)

Las endosporas son estructuras que se forman enel interior de ciertos tipos de bacterias, entre losque destacan las pertenecientes a los génerosClostridium y Bacillus. A diferencia de la célulavegetativa de la que procede, la endospora esresistente a factores ambientales adversos: Altastemperaturas, compuestos químicos tóxicos ytambién a los colorantes. Sin embargo, existencolorantes como el verde malaquita que, conayuda del calor, pueden penetrar en ella. Una vezteñidas, no perderán el colorante en el lavado conagua y sí lo harán las formas vegetativas, quequedarán teñidas con el colorante de contraste.La posición y morfología de las esporas en el inte-rior de la bacteria tiene interés taxonómico, ya quees de utilidad para diferenciar especies dentro deun mismo género.

Objetivo

Aprender una técnica de tinción estructural e inter-pretar los resultados obtenidos, reconocer lasesporas teñidas y observar su forma y su localiza-ción en las bacterias.

Material

Asa de siembra, portaobjetos, cultivos bacterianosde microorganismos (Bacillus subtilis, Bacilluscereus y Bacillus sphaericus), colorantes, micros-copio y aceite de inmersión.

Técnica (método de Wirtz)

Los cultivos bacterianos deberán encontrarse enfase estacionaria, para que se favorezca la espo-rulación. Con ellos se preparan extensiones enportaobjetos y tras secar al aire se fija con calorsegún ya ha sido indicado. 1- Se cubre la preparación con solución de verdemalaquita, calentando con el mechero hasta laemisión de vapores. Se realiza invirtiendo elmechero y pasando la llama bajo la preparaciónperiódicamente. Esta operación se repite durante5 minutos, evitando que la muestra hierva y quese evapore completamente el colorante, añadien-do más colorante en caso necesario. 2- Lavar con agua el exceso de colorante.

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3- Aplicar la solución de safranina, como coloran-te de contraste, durante 30 segundos. 4- Lavar con agua y secar la preparación 5- Examinar con objetivo de inmersión, anotandola morfología y disposición de las endosporas enlas dos especies de Bacillus. Las esporas de B.subtilis son ovaladas y aparecen en posición sub-terminal no deformante, coloreadas de verde, enel interior de las formas vegetativas, con formabacilar y que están teñidas de rosa. Las esporasde B. sphaericus son esféricas, aparecen en posi-ción terminal, estando la célula deformada por eltamaño de la espora.

Tinción de corpúsculos metacromáticos

Los corpúsculos metacromáticos, también deno-minados gránulos de volutina, son inclusionescitoplasmáticas que aparecen en algunas bacte-rias y que, aunque su función no es conocida endetalle, podrían considerarse una reserva deenergía. Están constituidos principalmente porpolifosfatos y presentan una gran afinidad porcolorantes básicos, de manera que cuando éstosse utilizan para teñir las bacterias, los corpúsculosmetacromáticos se tiñen más intensamente que elresto de los componentes celulares.Aunque estas inclusiones aparecen en muchostipos de bacterias, su presencia resulta de espe-cial interés en microorganismos patógenos comoes Corynebacterium diphtheriae, siendo una prue-ba más para su identificación.

Objetivo

Demostrar la presencia de corpúsculos meta-cromáticos en algunas bacterias.

Material

Asa de siembra, portaobjetos, muestra de yogur,colorantes, solución de lugol, microscopio y aceitede inmersión. Lactobacillus delbrueckii sub. bulga-ricus y Streptococcus thermophilus forman partede la biota característica del yogur, presentando laprimera especie corpúsculos metacromáticos.

Técnica

Hacer las preparaciones usuales con las bacte-rias, evitando un exceso de calor en la fijación y enel secado.Se pueden seguir dos procedimientos:

A. Método de Löeffler1- Aplicar sobre la muestra, seca y fijada suave-mente a la llama del mechero, la solución de azul

de metileno alcalina de Loëffler. Se deja actuar de3 a 5 minutos.2- Eliminar el colorante con agua y secar al aire ocon ayuda de un papel secante.3- Examinar la preparación al microscopio con elobjetivo de inmersión, observando los gránulosmetacromáticos coloreados de azul intenso, mien-tras que el citoplasma celular aparece de colorazul más claro.

B. Método de Albert1- Aplicar sobre la muestra seca y fijada suave-mente al calor, el colorante de Albert y teñir duran-te 5 minutos. Lavar con agua el exceso de colo-rante y aplicar una solución de lugol dejandoactuar durante 5 minutos.2- Lavar con agua y dejar secar.3- Examinar la preparación al microscopio con elobjetivo de inmersión. En este caso los corpúscu-los metacromáticos se observan como puntosverde oscuro o negros dentro de una célula decolor verde pálido.

Tinción de cápsulas

Las cápsulas son estructuras producidas por algu-nas bacterias bajo determinadas condicionesambientales que juegan un papel importante en lapatogenicidad del microorganismo, interfiriendocon la acción fagocítica de los leucocitos.Por su composición química no se tiñen normal-mente con colorantes básicos, como cristal violetao safranina, de ahí que, aunque existen variosmétodos para su observación, el más simple con-siste en hacer una tinción negativa con tinta chinao nigrosina. Las cápsulas, al estar constituidas porpolímeros coloidales muy hidratados, se distorsio-nan con facilidad y se contraen en los pasos dedesecación y fijación, por lo que es convenientehacer lun examen en fresco de las mismas utili-zando la técnica del montaje húmedo.

Objetivo

Poner de manifiesto la presencia de cápsulas bac-terianas y observar su morfología.

Material

Asa de siembra, portaobjetos y cubreobjetos, cul-tivo bacteriano de microorganismos (Klebsiellapneumoniae), nigrosina al 10% o tinta china, papelde filtro, microscopio y aceite de inmersión.

Técnica

1- Colocar un asa de solución de nigrosina o de

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tinta china en un portaobjetos y mezclar con unasa de cultivo bacteriano.2- Colocar suavemente un cubreobjetos sobre lamuestra evitando que se formen burbujas ypresionar el mismo con un papel de filtro hastaobtener una capa fina del material que se va aobservar, absorbiendo el papel secante el excesode la muestra. Tirar el papel en un contenedorpara material contaminado y lavarse las manoscon jabón desinfectante.

3- La observación de la muestra se hace con obje-tivo de 40 aumentos o con objetivo de inmersión,utilizando en este caso, una gota de aceite deinmersión. Conviene cerrar el diafragma del con-densador para incrementar el contraste de lascélulas. Para retrasar la evaporación de la mues-tra deben sellarse los bordes del cubreobjetos conaceite de parafina. Las cápsulas aparecerán comozonas claras, transparentes, alrededor del micro-organismo, que aparecerá refráctil sobre un fondooscuro.

Figura 4.3. Ejemplos de morfología bacteriana al microscopio óptico.A.Staphylococcus en tinción Gram (objetivo 100x)B. Escherichia en tinción simple (objetivo 100x)C. Bacillus en tinción Gram (objetivo 100x)D. Pseudomonas en tinción negativa (objetivo 100x)E. Bacterias de morfología filamentosa (actinomiceto) en fresco (objetivo 40x)F. Observación en fresco de células de la levadura Candida (objetivo 40x).

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A

C

B

D

E F

Introducción

En la naturaleza, la mayoría de los microorganis-mos no se encuentran aislados, sino integradosen poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estu-dio de estos microorganismos y de sus propieda-des, es necesario separar unos de otros y trabajarcon especies aisladas, obteniendo cultivos axéni-cos o puros.Un cultivo axénico o puro es aquel que contieneun sólo tipo de microorganismo y que procedegeneralmente de una sola célula; el crecimientode ésta origina, en medio sólido, una masa decélulas fácilmente visible que recibe el nombre decolonia.Para obtener cultivos axénicos o puros a partir deuna población microbiana mixta, se utilizan lasdenominadas técnicas de aislamiento, que fuerondesarrolladas durante el siglo XIX. En un principio,Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquidocon esta finalidad, pero la presencia de contami-nación, es decir, de microorganismos no desea-dos, dificultó el aislamiento. La escuela de RobertKoch introdujo los medios sólidos, complementa-dos con agar, y las placas de Petri enBacteriología, permitiendo así la separación físicade las colonias sobre la superficie del medio decultivo o en el interior del mismo.El aspecto de las colonias sirve para diferenciardistintas especies microbianas.

Objetivos

- Familiarizarse con el manejo de microorganis-mos y con las técnicas de aislamiento en placa de Petri.

- Obtener colonias separadas, utilizando uno omás métodos.- Estudiar la morfología de cada colonia.

Material

Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, jarra deanaerobiosis, placas de Petri con medio de cultivosólido y suspensiones de microorganismos.

Técnicas

Existen distintas técnicas que pueden utilizarse:

a) Extensión en superficie con cayadoDepositar sobre la superficie de una placa conagar nutritivo una gota ó 0,1 ml de una determina-da dilución del cultivo de microorganismos proble-ma y extenderlo con ayuda del cayado, previa-

Cayado

Serie de diluciones

conocidas de la muestra

Figura 5.1. Siembra por extensión en superficie.

Figura 5.2. Siembra por estría en superficie.

PRÁCTICA 5

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

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mente esterilizado, en todas las direcciones hastaque esté completamente seco. Incubar la placa,en posición invertida, a la temperatura deseada(durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de micro-organismo. La posición invertida evitará que elagua de condensación se deposite sobre la super-ficie del medio, dificultando la obtención de colo-nias aisladas.Es una técnica usada para el aislamiento de colo-nias, que permite igualmente el recuento de bac-terias viables (unidades formadoras de colonia oUFC) en la muestra, si conocemos exactamente elvolumen de muestra sembrado.

b) Estría múltiple en superficieCon un asa de siembra, previamente esterilizada,se toma una muestra del cultivo de microorganis-mos y se extiende sobre un área pequeña de lasuperficie de la placa con agar nutritivo, en formade estrías muy juntas, pero sin hacer presión parano dañar el agar.Se flamea el asa, se enfría y después de rozar lasiembra realizada previamente, se extiende denuevo por otra zona de la placa haciendo nuevasestrías. Este proceso se repite sucesivamente, fla-meando y enfriando el asa al comienzo de lassucesivas siembras en estría. Se lleva la placa aincubar, a la temperatura adecuada, siempre enposición invertida.Mediante esta técnica se obtienen colonias aisla-das a partir de una muestra que contenga un ele-vado número de bacterias.

c) Dilución en masaEn una placa de Petri vacía se deposita unpequeño volumen conocido de muestra y a conti-nuación se añade el medio de cultivo (agar nutriti-vo) fundido y atemperado aproximadamente a45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de laplaca. De esta forma los microorganismos se dis-tribuirán de forma homogénea en el medio de cul-tivo, permitiendo el desarrollo de colonias separa-das por todo el agar.Otra variación de esta técnica consiste en inocularel medio de cultivo, fundido y atemperado, conte-nido en un tubo, con un determinado volumen dela muestra. La homogeneización de la muestra yel medio de cultivo se realiza por rotación del tuboentre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, trás homogeneización, se dejanenfriar las placas hasta que se solidifique el medioy posteriormente se incuban a la temperatura ade-cuada (siempre en posición invertida).Aunque con esta técnica se obtienen colonias ais-ladas, generalmente sólo se utiliza para determi-nar el número de microorganismos viables (unida-des formadoras de colonia o UFC) en una mues-tra, cuando éstos son anaerobios facultativos o

microaerófilos.

Condiciones de incubación

Estas siembras pueden realizarse tanto conmicroorganismos aeróbicos como anaeróbicos.En el caso de los anaerobios, las placas no se lle-van a incubar directamen-te a la estufa, sino que seintroducen previamente enuna jarra especial en laque exista un ambientelibre de oxígeno, denomi-nada jarra de anaerobiosis(Fig. 5.4).Para crear un ambiente deanaerobiosis en el interiorde estas jarras, se utilizauna preparación comercialque elimina el O2 y des-prende CO2. La atmósfe-ra va reduciéndose y, paraverificar que el ambiente es anaeróbico, se colocadentro de la jarra una tira de papel impregnada enun indicador que vira de color en presencia deCO2. El indicador suele ser azul de metileno, quees de color azul cuando se expone al aire y sevuelve incoloro cuando está totalmente reducido.

Incubar las placas en estufa durante 24-48 horasa la temperatura más adecuada.

Resultados

a) Extensión en superficie: Tras el período deincubación se examinarán las placas. Las coloniasaparecen sobre la superficie, distribuidas unifor-memente si la siembra se ha realizado de formacorrecta. Podrán diferenciarse las colonias deacuerdo a su tamaño, forma, color, textura, etc.Esta técnica de siembra, además de permitir que

Inóculo calibrado

Medio fundido atempera

HomogeneizHomogeneizar

Medio fundidoatemperado

Inóculocalibrado

Figura 5.3. Siembra por dilución en masao inclusión en agar.

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Figura 5.4. Jarrade anaerobiosis.

se distingan las colonias por su morfología, permi-te el recuento de microorganismos viables. Laexpresión de este recuento se hace en "unidadesformadoras de colonias" (UFC) ya que cada unaprocede de un sólo microorganismo (o de ungrupo de microorganismos, pues en algunoscasos éstos tienden a formar agregados). A partirde las colonias aisladas, los microorganismospueden transferirse a otros medios de cultivo parasu estudio.

b) Por estría múltiple en superficie: Tras la incuba-ción, se observarán las colonias aisladas en algu-na región de la placa inoculada. Con esta técnicase logra la separación de los microorganismosque se encuentran en un cultivo mixto, o bien queproceden de muestras homogéneas, pero en lasque existe un elevado número.En las zonas donde existen colonias aisladas sepuede estudiar la morfología colonial.

c) Dilución en masa: Aparecen las colonias distri-buidas por toda la masa del agar. Aquellas queestán en la superficie tendrán distintas caracterís-ticas, dependiendo del tipo microbiano, mientrasque las colonias que se desarrollan en el interior,bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular,aunque los microorganismos que formen las dis-tintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, lascolonias que aparecen en la profundidad del agarson siempre biconvexas y no se diferencian unasde otras por su morfología.Como ya se ha comentado, esta técnica general-mente se utiliza para el recuento de microorganis-mos viables (unidades formadoras de colonia oUFC) en una muestra, cuando éstos son anaero-bios facultativos o microaerófilos.

Figura 5.5. Aislamientopor estría en superficie.

Figura 5.6. Aislamiento yrecuento por dilución enmasa.

Puntiforme

Forma

Circular

Rizoide

Irregular

Filamentosa

Entero

Borde

Ondulado Lobulado

Filamentoso

Elevación

Superficie

Plana

Elevad

Convex

Crateriform

Acumina

Lisa o

Mate o

Seca o

Invasiva o

Figura 5.7. Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre mediosólido.

Puntiforme

Circular

Rizoide

Irregular

Filamentosa

Entero

Ondulado

Lobulado

Filamentoso

Plana

Elevada

Convexa

Crateriforme

Acuminada

Lisa o rugosa

Mate o brillante

Seca o cremosa

Invasiva o superficial

25

26

Objetivos

- Aprender a inocular distintos medios de cultivocontenidos en tubo: caldo, agar inclinado y mediosemisólido sembrado en profundidad.- Observar el crecimiento bacteriano en los distin-tos medios de cultivo.- Comprobar la movilidad de determinados micro-organismos.- Comprobar el crecimiento de microorganismostanto aerobios como anaerobios utilizando las téc-nicas apropiadas.

Material

Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteuro pipetas graduadas, parafina estéril, suspensiónde microorganismos y medios de cultivo líquidos,fluidos, semisólidos y sólidos.

Técnica

a) En medio líquido con asa: Transferir aséptica-mente, con el asa de siembra, una pequeña mues-tra de los microorganismos, desde el tubo quecontiene el material problema al tubo con mediode cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido yagitar para desprender y diluir la muestra. Incubarel tubo recién sembrado en estufa, durante 24-48horas a la temperatura óptima de crecimiento.

b) En medio líquido con pipeta: Introducir asép-ticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduadaen el medio líquido que contiene los microorganis-mos y, aspirando de forma adecuada, sacar unacantidad establecida de material que se transfiereal tubo con medio de cultivo estéril. Incubar enestufa durante 24-48 horas a la temperatura másadecuada.

Figura 6.1. Inoculación de un caldo de cultivo.

Figura 6.2. Siembra en un tubo con agar inclinado.

PRÁCTICA 6

SIEMBRA Y CULTIVO DE MICRORGANISMOS

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c) En medio semisólido: La siembra en este tipode medio, que contiene una proporción menor deagar que los medios sólidos y que se envasa entubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra este-rilizado, con el cual se toma la muestra. El medioqueda inoculado al introducir el hilo en profundi-dad hasta el fondodel tubo, retirándoloposteriormente porla misma trayectoriautilizada al realizarla picadura. Unasiembra con asa ocon un cierto movi-miento de vaivénpodría originar unpatrón de crecimien-to que se interpre-taría erróneamentecomo movilidad bac-teriana.Incubar durante 24-48 horas a la tempe-ratura óptima de cre-cimiento.

d) En medio sólido(agar inclinado):Con el asa de siem-bra estéril tomar losmicroorganismos dela muestra e inocularel tubo realizando unmovimiento de zig-zag en la superficie. El procesose inicia en el fondo y se va avanzando hacia arri-ba por el área inclinada.Incubar en estufa durante 28-48 horas a la tempe-ratura más adecuada.

e) Siembra en profundidadEn tubo con medio semisólido vertical o fluido: Seutilizan los medios V.L. (Viande et levures,

Buttiaux et al.) o medio fluido de tioglicolato, quedeben ser hervidos en un baño María durante 15ó 20 minutos, antes de ser inoculados, para elimi-nar el oxígeno disuelto. Sembrar los medios, unavez atemperados a 45-50ºC. Con el asa de siem-bra o con una pipeta Pasteur estéril, con el extre-mo cerrado, se realiza un movimiento en espiralde arriba a abajo y de abajo a arriba, para distri-buir la muestra homogéneamente, sin agitar eltubo durante la siembra para evitar la entrada deaire. Con la misma finalidad, solidificar rápidamen-te el medio de cultivo sumergiendo el tubo en aguafría.Los medios VL y tioglicolato pueden utilizarse tam-bién para determinar el tipo respiratorio, como sedescribe en los resultados (Fig. 6.6). También esposible realizar esta prueba en caldo o en placa:Si el medio utilizado es líquido, agregar una capade parafina estéril para impedir la difusión del O2al medio. Incubar en estufa durante 24-48 horas ala temperatura más adecuada.En placa: Transferir 1 ml del inóculo a una placade Petri estéril vacía y añadir el medio de cultivofundido y atemperado a 45-50ºC, homogeneizan-do mediante giros repetidos de la placa, hasta queel inóculo se haya distribuido uniformemente. Unavez solidificado el agar, añadir una segunda capade medio de cultivo.

Resultados

a y b) En los cultivos líquidos no tiene lugar la for-mación de colonias, por lo tanto se examinará laexistencia de enturbiamiento más o menos inten-so, la formación de una película o velo sobre lasuperficie, la aparición de sedimento en el fondodel tubo, etc. La utilización de medios de cultivolíquidos permite la obtención de una poblaciónmicrobiana grande, con un elevado número demicroorganismos, para ser utilizados posterior-mente.

Figura 6.4.Aspecto de cultivosen agar inclinado (A)y semisólido (B) trasla incubación.

B

28

Figura 6.3. Inoculación de un medio semisólido por picadura con hilo de siembra.

A

c) En medio semisólido se podrá comprobar si elmicroorganismo es o no móvil, ya que en el primercaso se observará que el crecimiento difunde alre-dedor de la zona donde se hizo la picadura,detectándose turbidez. Por eso es tan importanteque, cuando se inocula el medio de cultivo, no sedistorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo porel mismo sitio de inoculación. Los microorganis-mos inmóviles crecerán únicamente a lo largo dela picadura (ver Fig. 6.5).Este tipo de siembra en picadura sirve, también,como método de conservación de microorganis-mos anaerobios facultativos.

d) En medio sólido (agar inclinado) se observaráel aspecto general del medio y la aparición de cre-cimiento sobre su superficie. Este tipo de siembrapermite el cultivo de microorganismos aeróbicos oanaeróbicos facultativos. Además, se utiliza paraalmacenar cultivos durante cortos períodos detiempo, a temperaturas de 4ºC.

e) En medio semisólido vertical (V.L.) o fluido (tio-glicolato) los microorganismos pueden crecer enla parte superior del medio si son aerobios estric-tos, en la zona inferior del medio si son anaerobiosestrictos y a lo largo de todo el medio, en el casode anaerobios aerotolerantes. Los anaerobiosfacultativos crecerán también por todo el tubo,aunque preferentemente en superficie. Por último,si se trata de microorganismos microaerófilos,aparecerá crecimiento en una pequeña zona inter-media, próxima a la superficie (ver Fig. 6.6).Observar también el aspecto del crecimiento y eldesprendimiento de gas.En la siembra en placa en profundidad, se debeanotar si ha habido crecimiento de colonias entoda la masa del agar.

Figura 6.5.Prueba de movilidad en agar semisólido.1. Microorganismo móvil. 2. Microorganismo inmóvil. 3. Tubo control sin inocular.

1 32

1 2 3 4 5

Figura 6.6. Comportamiento de losmicroorganismos en tubos con medioVL.

1. Aerobios estrictos2. Anaerobios estrictos3. Anaerobios facultativos4. Anaerobios aerotolerantes5. Microaerófilos

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30

Introducción

El control microbiológico ambiental es necesariopara la evaluación de la calidad microbiológica dezonas estériles en la industria farmacéutica yquirófanos, así como en estudios de la microbiotaen ambientes naturales. El aire contiene en sus-pensión diferentes tipos de microorganismos,especialmente bacterias y hongos. La presenciade uno u otro tipo depende del origen, de la direc-ción e intensidad de las corrientes de aire y de lapermanencia y supervivencia de los microorganis-mos. Algunos se encuentran en forma de célulasvegetativas, pero lo mas frecuente son las formasesporuladas debido a que sobreviven mejor enatmósferas secas. En el aire se aislan bacteriasesporuladas, típicamente del género Bacillus, asícomo actinomicetos. Además son frecuentes loscocos Gram positivos como Micrococcus yKocuria y los bacilos pleomórficos Gram positivosde los géneros Arthrobacter, Corynebacterium yotros. Los bacilos y cocos Gram negativos seencuentran en escasa proporción debido a que nosobreviven a la desecación. Respecto a los hon-gos, los que más frecuentemente se aíslan sonhongos filamentosos como Cladosporium,Aspergillus, Penicillium, Alternaria o Mucor ylevaduras como Rhodotorula o CandidaLa técnica que se emplea rutinariamente en análi-sis microbiológico ambiental es la sedimentaciónpor gravedad. Este método permite determinar lacarga microbiana de un ambiente problema. Losmicroorganismos suspendidos en el polvo oaerosoles sedimentan sobre la superficie de unmedio rico, no selectivo o bien en medios selec-tivos contenidos en placas de Petri. Una vez toma-da la muestra mediante la apertura de las placasen el ambiente deseado, éstas se incubarán enlas condiciones que favorezcan el crecimiento deltipo de microorganismos que deseemos estudiar,normalmente a temperatura ambiente y en aero-biosis.

Objetivo

Observar y caracterizar someramente, medianteobservación macroscópica y microscópica, ladiversidad microbiana de un ambiente elegido porel alumno.

Material

Asa de siembra, una placa de Petri con agar trip-tona soja, una placa de Petri con agar Sabouraud-cloranfenicol, portaobjetos, colorantes para tinciónsimple y de Gram, solución de azul de lactofenol,cinta adhesiva transparente, microscopio y aceitede inmersión.

Técnica

Llevar las placas cerradas, con cuidado de que nose abran durante el transporte, al ambiente cuyacarga microbiológica se desee evaluar. Retirar latapa y dejar las placas abiertas, durante 30 minu-tos, en un lugar representativo de dicho ambiente.Pasado este tiempo, cerrar las placas e incubar-las. La placa de agar triptona soja se incubadurante 2-días a 30-37 ºC, con el fin de estudiar laaparición de colonias bacterianas. La placa deSabouraud-cloranfenicol, medio selectivo parahongos, se incuba de 3 a 5 días a 22-24 ºC.

Resultados

Se observará la aparición paulatina de diversostipos de colonias. Aparecerán en primer lugar

PRÁCTICA 7

CONTROL MICROBIOLÓGICO AMBIENTAL

Figura. 7.1.Control microbiológico ambiental. Aspecto típico de una placa de gravedadmostrando la diversidad microbiana de un ambiente.

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colonias bacterianas y al cabo del segundo o ter-cer día de incubación se observarán las coloniasde levaduras, que se asemejan a las bacterianas,así como las características colonias algodonosasde los hongos filamentosos. Se anotarán lascaracterísticas más importantes de las colonias,según la descripción que aparece en la figura 5.7y se realizará un estudio microscópico de cadauna de ellas. Tras la tinción de Gram de las distin-tas colonias bacterianas que aparezcan en laplaca, se observará todo tipo de microorganismos,con predominio de cocos y bacilos esporuladosGram positivos, frecuentemente dispuestos res-pectivamente en sarcinas y en cadenas. Los baci-los irregulares que se observaran, tienen pared deGram positivos, pero se decoloran fácilmente y en

las preparaciones aparecerán como Gram negati-vos o teñidos de forma irregular, en bandas o enlos extremos. Estos bacilos son muy pleomórficos:unos tienen forma de maza, se agrupan en empa-lizada o recordando letras chinas; otros poseen unciclo de crecimiento de bacilo a coco y algunos ori-ginan filamentos. La observación microscópica dehongos filamentosos se realizará mediante tincióncon azul de lactofenol. Para ello, se pone una tirade cinta adhesiva transparente sobre el micelio,con el fin de que las hifas y esporas queden adhe-ridas. Se añade una gota de azul de lactofenol enel centro del portaobjetos y se adhiere la cintaadhesiva al mismo. El color azul facilita la visuali-zación del micelio en fresco, utilizando el objetivode 40 aumentos.

Figura 7.3. Morfología de hongos al microscopio óptico.A. Levaduras en tinción con cristal violeta (obj. 100x). B. Penicillium. Tinción con azul de lactofenol(obj. 40x). C. Cladosporium. Tinción con azul de lactofenol (obj. 40x). D. Mucor. Tinción con azul delactofenol (obj. 40x). E. Aspergillus. Tinción con azul de lactofenol (obj. 40x). F. Alternaria. Tincióncon azul de lactofenol (obj. 40x).

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A B C

D E F

Figura 7.2. Morfología de algunas bacterias comunes en el aire al microscopio óptico.A. Micrococcus. Tinción de Gram (obj. 100x). B. Bacilos regulares (Bacillus) en tinción Gram (obj.100x). C y D. Bacilos irregulares: Corineformes (C) y Arthrobacter (D). Tinción de Gram (obj. 100x). E.Actinomiceto. Tinción de azul de lactofenol (obj. 40x).

A B C D E

Introducción

El aislamiento de los distintos microorganismoscontenidos en una muestra problema se lleva acabo sobre la superficie de un medio de cultivosólido contenido en una placa de Petri, siguiendola técnica de la siembra por estría múltiple ensuperficie.Los medios de cultivo que se van a utilizar depen-den del tipo de muestra y de los microorganismospresentes en ella, pero deben ser medios sólidosen placa. Así, se usarán: Medios nutritivos gene-rales, medios selectivos, medios diferenciales obien medios enriquecidos, si los microorganismosque se van a aislar son nutricionalmente exigen-tes.Uno de los medios de cultivo que se podrían utili-zar con este fin es el agar CLED, un medio dife-rencial que contiene lactosa y un indicador de pH(azul de bromotimol) que permite apreciar la fer-mentación ácida del azúcar por el viraje del indi-cador de pH, de color verde a amarillo. Su defi-ciencia en electrolitos impide la invasión de laplaca por microorganismos móviles, como son lasespecies del género Proteus, facilitando así suaislamiento y posterior identificación; la presenciade cistina permite el crecimiento de los coliformesdependientes de ella.La identificación de los distintos microorganismosaislados se lleva a cabo realizando una serie depruebas bioquímicas, por las que se van a ponerde manifiesto la producción de ciertas enzimas.En algunas ocasiones es necesario emplear otrosmedios no bioquímicos, basados en técnicasserológicas.

Objetivo

Aplicar la técnica de la siembra por estría múltipleen superficie, para la obtención de cultivos axéni-cos o puros para, posteriormente, proceder a laidentificación de cada uno de los distintos micro-organismos aislados.

Material

Asa de siembra, cultivo mixto de bacterias, placasde agar CLED y agar nutritivo. Además, depen-diendo del microorganismo a identificar, se nece-

sitarán otros medios de cultivo y diferentes reacti-vos, que se indican en cada caso concreto.

Técnica

Para el aislamiento de bacterias, se realiza lasiembra de una muestra del cultivo mixto, median-te la técnica de estria múltiple en la superficie delmedio CLED. Incubar las placas en posición inver-tida a 37 ºC durante 24-48 horas.Tras la incubación, se observarán los distintostipos de colonias desarrolladas en la superficie delmedio. Se deberán anotar las características másimportantes que puedan ser útiles en una identifi-cación preliminar.Para estudiar la pureza de los cultivos se llevará acabo una tinción de Gram de los distintos tipos decolonias aisladas. Posteriormente, se efectuará unnuevo aislamiento en placas de agar nutritivo concada una de las diferentes colonias crecidas enlas placas de CLED.Después de incubar 24 horas a 37º C, se proce-derá a la identificación de cada uno de los distin-tos cultivos puros que se hayan obtenido.

Identificación

Con cada uno de los cultivos puros se realiza unatinción de Gram.

IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAMPOSITIVOS

Con los cultivos Gram positivos que presentanmorfología de cocos se realizan distintas pruebascomo son:

Prueba de la catalasa

La catalasa es una enzima que cataliza la des-composición del peróxido de hidrógeno en agua yoxígeno. Se encuentra presente en la mayoría delos microorganismos aeróbicos y anaeróbicosfacultativos, excluyendo los estreptococos.

PRÁCTICA 8

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIASA PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO BACTERIANO

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Material

Agua oxigenada de 30 volúmenes, cultivo bacte-riano y portaobjetos.

Técnica

En un portaobjetos se depositan una o dos gotasde agua oxigenada de 30 volúmenes y se pone encontacto con ella una colonia de los microorganis-mos a estudiar con ayuda del asa de siembra.

Interpretación

La prueba se considera positiva cuando se produ-ce una efervescencia rápida con desprendimientode burbujas: la enzima catalasa convierte el peró-xido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular.Esta prueba se emplea para diferenciar los géne-ros Micrococcus y Staphylococcus (catalasa posi-tivo) del género Streptococcus (catalasa negativo).

En el caso de cocos Gram positivos, catalasa

negativa, se trata del género Streptococcus uotros relacionados y estudiaríamos la hemólisis enagar sangre:- α-hemólisis (hemólisis incompleta, color verdoso)- ß-hemólisis (hemólisis completa, incoloro)

En el caso de cocos Gram positivos catalasa posi-tiva se comprueba la utilización de la glucosa.

Utilización de la glucosa (O/F)

Es una prueba útil para distinguir aquellos micro-organismos que son incapaces de utilizar la gluco-sa anaeróbicamente de aquellos que lo puedenhacer.

Material

Cultivo bacteriano, dos tubos con medio Hugh-Leifson, pipeta Pasteur y un tubo con vaselinaestéril.

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Técnica

Se utilizan dos tubos de medio de cultivo, que sehierven brevemente antes de utilizarlos para elimi-nar el oxígeno disuelto. Una vez atemperados, seinoculan con ayuda de una pipeta Pasteur, llegan-do al fondo y ascendiendo hacia la superficie.Dejar solidificar ambos tubos y recubrir uno deellos con vaselina estéril. Incubar a 37 ºC durante48 horas.

Interpretación

Las bacterias fermentadoras producen ácido de laglucosa independientemente de la presencia deoxígeno (vía “fermentativa”). Por tanto, los dostubos viran a amarillo (+/+). En este caso, se tra-taría de un microorganismo del géneroStaphylococcus. Las bacterias que requieren O2(respiración aeróbica; vía “oxidativa”) sólo utilizanla glucosa en el tubo descubierto. Dado que elmedio es capaz de detectar la acidificación produ-cida por el CO2 disuelto sólo virará a amarillo eltubo sin cubrir de vaselina (+/-). En este caso, setrataría de Micrococcus. Si no vira ninguno (-/-) labacteria no utiliza la glucosa como fuente de car-bono o bien lleva a cabo una fermentación noácida. Para la posterior identificación de las espe-cies del género Staphylococcus recurriríamos aotras pruebas bioquímicas, como son DNAsa ycoagulasa.

IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAMPOSITIVOS

Con los cultivos Gram positivos con morfología debacilos se realiza una tinción de esporas por elmétodo de Wirtz, como se describe en el apartadocorrespondiente de la Práctica 4 de esta guía.

- En el caso de que no sean formadores deesporas, se observará la morfología. Si se tratade bacilos largos de forma regular, cabe sospe-char de géneros como Lactobacillus, entre otros.Si, por el contrario, se observan formas irregula-res, como de bastón, engrosadas en un polo,podría tratarse de bacterias corineformes, comolas pertenecientes al género Corynebacterium.Otro género característico es Arthrobacter, queaparece pleomórfico, mezclando formas cocoidesy bacilares.

- En el caso de bacilos Gram positivos conendosporas, la observación de la posición de la

espora (terminal, subterminal o central), su forma(ovales o esféricas) y si deforman o no a la célula,proporciona información útil para la posterior iden-tificación de la especie. A continuación cabe reali-zar una prueba de tipo respiratorio (siembra enprofundidad en medio semisólido vertical VL o enmedio fluido de tioglicolato, como se describe enla práctica 6). Esto permitiría distinguir entre losdos principales géneros: Clostridium (anaerobio) yBacillus (aerobio o anaerobio facultativo).

Algunos aspectos de la identificación de especiesdel género Clostridium se tratan en la Práctica 12de esta guía.Para distinguir las especies del género Bacillus,resulta útil la realización de las siguientes prue-bas:

Tipo de crecimiento en caldo. Esta prueba serealiza inoculando el microorganismo en un tubode caldo nutritivo e incubando a 30-37 ºC durante24-72 horas estáticamente. Es característica laaparición de crecimiento en la superficie del caldoformando un velo en algunas especies del géneroBacillus (como B. subtilis). Otras originan en estemedio turbidez (como B. cereus), sedimento y pro-ducción de pigmentos.

Tipo respiratorio. Esta prueba (ver práctica 6)también permite distinguir entre diferentes espe-cies dentro del género Bacillus. Por ejemplo, laespecie B. cereus es anaerobio facultativo mien-tras que B. subtilis es aerobio.

Fermentación de manitol y producción delecitinasa (medio de Mossel)Se siembra una placa de medio de Mossel me-diante aislamiento por estría en superficie a partirde una colonia de Bacillus. Incubar a 30-37ºCdurante 24 horas, en posición invertida. Estemedio es selectivo para Gram positivos, pues con-tiene polimixina B, que inhibe el crecimiento de lamayoría de las bacterias Gram negativas.Además, se trata de un medio diferencial que nospermitirá detectar las especies fermentadoras demanitol por el viraje a amarillo del indicador enpresencia de ácidos. Este medio también permitedetectar las bacterias productoras de lecitinasa,que hidroliza la lecitina de la yema de huevo con-tenida en el medio formando un precipitado blan-co opaco alrededor de la colonia. B. cereus dalugar a unas colonias incoloras-rosadas (manitolnegativas) con halo opaco debido a la producciónde lecitinasa. Otras especies como, por ejemplo,B. subtilis dan lugar a colonias amarillas debido ala fermentación del manitol y carentes de haloopaco.

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IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAMNEGATIVOS

Con los cultivos de cocos Gram negativos se rea-lizan las pruebas de la catalasa (ya descrita) y oxi-dasa; ambas son positivas en el caso de Neisseriay Moraxella. La identificación se completaríamediante pruebas bioquímicas, principalmente defermentación de azúcares.

Prueba de la oxidasa (citocromo c oxidasa)

Los citocromos son enzimas que forman parte dela cadena de transporte de electrones en la respi-ración aeróbica, transfiriendo electrones al oxíge-no, con la formación final de agua.

Material

Tiras de papel con reactivo de oxidasa, pipetaPasteur y cultivo microbiano.

Técnica

Con una pipeta Pasteur, cerrada y cargada debacterias, se trazan rayas sobre una tira de papelimpregnada en solución acuosa al 1% de clorurode tetrametil para-fenilen-diamina.

Interpretación

En caso positivo el papel cambia de color pasan-do a púrpura y negro en 10-20 segundos, comoconsecuencia de que el reactivo se oxida en pre-sencia de citocromo c oxidasa formándose azul deWuster. En caso negativo la tira de papel no cam-bia de color.

IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAMNEGATIVOS

- La identificación de los bacilos Gram negativospuede iniciarse con la prueba de la oxidasa (yadescrita). Cualquier organismo que dé positivo enesta prueba queda excluido de la familiaEnterobacteriaceae, cuyos miembros no poseenla enzima citocromo c oxidasa.

Los microorganismos oxidasa positiva puedenclasificarse en fermentadores de glucosa y no fer-mentadores; por ello, estos dos grupos de micro-organismos se identifican mediante la prueba de

utilización de la glucosa (oxidativa o fermentativa)(ya descrita).Pseudomonas utiliza la glucosa por vía oxidativa yVibrio lo hace, además, por vía fermentativa. Laincapacidad de utilizar glucosa por las dos víasmencionadas es una característica importante deAlcaligenes.La identificación de especies de Pseudomonas sehace por la producción de pigmentos en agar F yagar P.

Producción de pigmentos

Es una prueba útil para poner de manifiesto la for-mación de compuestos pigmentados por microor-ganismos no fermentadores.

Material

Placas de agar F (medio King B) y agar P (medioKing A) y cultivo bacteriano.

Técnica

Inocular cada una de las placas de agar F y agarP con los microorganismos, trazando con el asaestrías paralelas. Incubar a 37ºC durante 24horas, en posición invertida.

Interpretación

La presencia de Pseudomonas aeruginosa sobrela placa de agar F se manifiesta por la apariciónde un pigmento amarillo fluorescente (fluoresceí-na o pioverdina) y un pigmento azul (piocianina)sobre la placa de agar P. La composición de salesde cada uno de estos dos medios potencia la pro-ducción de uno de los pigmentos e inhibe la delotro. Sim embargo, P. fluorescens sólo producefluoresceína.

Los microorganismos oxidasa negativa, se vana identificar mediante una serie de pruebas bio-químicas que comienzan con la siembra en medioKligler. Según los resultados obtenidos, se conti-nuará con otras pruebas de identificación:Producción de indol, movilidad, crecimiento encitrato, producción de ureasa, rojo de metilo,Voges-Proskauer y desaminación de la fenilalanina.

Siembra en medio Kligler

Esta prueba se suele usar en la identificación ini-

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cial de bacilos Gram negativos y especialmente deenterobacterias.En este estudio se observa la fermentación de lac-tosa y/o glucosa con producción de ácido y/o gasy la producción de SH2.

MaterialAsa e hilo de siembra, tubos con medio Kligler ycultivo bacteriano.

Técnica

Los tubos de medio Kligler se inoculan con el hilode siembra, tomando microorganismos de la colo-nia que se va a identificar y haciendo una picadu-ra hasta el fondo del tubo, continuando la siembracon asa por estría en la superficie. Incubar a 37ºCdurante 24 horas y observar los resultados.

Interpretación

Como ya se ha comentado, este tipo de siembrase realiza, en general, para la identificación deenterobacterias. La interpretación de los resulta-dos se hará dela forma siguien-te:

- Fermentaciónde glucosaSe aprecia en elviraje a amarillodel indicador depH (rojo defenol) únicamen-te en la parteinferior del tubo.Esto es debido ala pequeña pro-porción de glu-cosa que existeen el medio(0,1%), que alser fermentadaen el fondo deltubo, dondeexisten condicio-nes de anaero-biosis, producesuficiente ácidopara que vire elindicador, perono a medida quenos aproxime-mos a la superfi-cie, donde lascondiciones son

más aeróbicas, allí la bacteria respira y la produc-ción de ácido es menor, permaneciendo esa zonade color rojo. Si el microorganismo sembrado no fermenta laglucosa con producción de ácidos, todo el tubotoma una coloración roja. Incluso, una vez que laglucosa ha sido degradada la bacteria comienza autilizar los aminoácidos, liberándose aminas, queelevan el pH, por lo que el color rojo puede sermás intenso.

- Fermentación de lactosaSe pone de manifiesto por el viraje a amarillo delindicador, tanto en el fondo del tubo como en lasuperficie. La concentración de lactosa es diezveces mayor que la de glucosa, con lo que la pro-ducción de ácido formado es tan elevada quehace virar el indicador en todo el tubo.El hecho de que la fermentación de lactosaenmascare la de la glucosa no tiene importancia,ya que para que una bacteria fermente lactosadebe ser capaz de fermentar glucosa.Si la bacteria no es capaz de fermentar la lactosa,una vez que la glucosa ha sido degradada, comoya se ha comentado, la bacteria comienza a utili-zar los aminoácidos, liberándose aminas, queneutralizan la pequeña cantidad de ácidos presen-tes en la porción inclinada del medio y elevan elpH. Por lo tanto, la zona inclinada del tubo apare-cerá de color rojo intenso y el fondo de color ama-rillo debido a la fermentación previa de la glucosa.

- Producción de gasLa producción de gas en la fermentación se mani-fiesta por la aparición de burbujas, rotura o eleva-ción del agar del fondo del tubo.

- Producción de SH2Para detectar la producción de SH2 a partir de tio-sulfato sódico debe incorporarse al medio de culti-vo un indicador, dado que el SH2 es incoloro. Paratal fin se suele utilizar alguna sal de hierro quereacciona con el SH2, para producir un precipita-do negro de sulfuro de hierro. La producción deSH2 tiene lugar en ambiente ácido, de ahí que elprecipitado negro se concentre en el fondo deltubo, donde se generan ácidos a partir de la glu-cosa. Así, un fondo negro indica que existe acidezen el fondo del tubo, aunque el color amarillo sehaya enmascarado con el precipitado negro.

Reducción de nitratos

La reducción de nitratos a nitritos es una carac-terística propia de varios microorganismos que uti-

Figura 8.1. Distintos resul-tados de la prueba Kligler:A: Glucosa +, Lactosa -B: Glucosa +, Lactosa -, SH2 +C: Lactosa +, Gas +D: Lactosa +, SH2 +

A B C D

Negro

AmarilloRojo

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lizan nitrato como aceptor final de electrones en larespiración anaeróbica. Esta prueba es útil en laidentificación de microorganismos pertenecientesa las enterobacterias aunque también sirve paraidentificar otros microorganismos.

Material

Un tubo con caldo nitratado, cultivo bacteriano,solución de ácido sulfanílico al 8 por mil y soluciónde α-naftilamina al 5 por mil (ambos en ácido acé-tico 5N) y polvo de zinc.

Técnica

Inocular el medio líquido e incubar a 37ºC durante24-48 horas. Pasado ese tiempo, añadir al cultivounas gotas de solución de α-naftilamina y unasgotas de solución de ácido sulfanílico.

InterpretaciónEl desarrollo de una coloración roja en el medio decultivo, tras la adición de los reactivos, pone demanifiesto la presencia de nitritos y por tanto laprueba de reducción de nitratos se considera posi-tiva. Este color se debe a la formación de un com-puesto coloreado, denominado p-sulfobenceno-azo-α-naftilamina.Si no se desarrolla color, la prueba puede conside-rarse negativa (no se han reducido los nitratos) obien se han reducido originando otros compuestos(amoníaco, nitrógeno molecular, óxido nítrico uóxido nitroso) por lo que la lectura se correspondecon un falso negativo. En este caso se puede aña-dir al medio de cultivo una pequeña cantidad depolvo de zinc, que reduce los nitratos del medio anitritos. El desarrollo de un color rojo, indica laexistencia de nitratos en el medio y confirma quela reacción es negativa.

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Producción de indol

El indol es uno de los productos de degradacióndel metabolismo del aminoácido triptófano. La pre-sencia de la enzima triptofanasa en la bacteriaprovoca la hidrólisis del triptófano y su desamina-ción, produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco.

Material

Medio de cultivo con peptona, cultivo bacteriano yreactivo de Ehrlich, o bien reactivo de Kovacs.

Técnica

Inocular el medio con el microorganismo e incubara 37ºC durante 24-48 horas. Transcurrido esetiempo, añadir al cultivo 1 ml de reactivo de Ehrlicho de Kovacs (para-dimetilaminobenzaldehido ensolución), resbalando por la pared del tubo sin agi-tar.

Interpretación

La aparición, transcurridos unos segundos, de unanillo de color rojo en la interfase entre el reactivoy el cultivo indica la presencia de indol y, por tanto,la prueba se considera positiva. El indol es capazde reaccionar con el grupo aldehído del reactivooriginando un complejo de color rojo.

Movilidad

Es otra característica útil en la identificación de losmicroorganismos. Se puede llevar a cabo obser-vando el crecimiento en un medio semisólido.

Material

Hilo de siembra, medio semisólido (agar movili-dad), y cultivo bacteriano.

Técnica

Sembrar, por picadura, con hilo de siembra enmedio semisólido, incubando a 37ºC durante 48horas.

Interpretación

La baja concentración de agar de este medio per-mite que las bacterias se desplacen si son móvi-les. Por ello, observando si el crecimiento está

sólo en la picadura o se extiende a los lados deella, se puede determinar si el microorganismo esinmóvil o móvil.

Crecimiento en citrato

Algunos microorganismos utilizan el citrato pre-sente en el medio de cultivo como única fuente decarbono, esta característica es importante en laidentificación de microorganismos pertenecientesa las enterobacterias.

Material

Un tubo con medio citratado de Simmons y cultivobacteriano.

Técnica

Sembrar en la superficie inclinada del medio eincubar a 37ºC durante 24-48 horas.

Interpretación

En caso positivo, el medio de cultivo vira de colorverde a azul. Si el microorganismo utiliza el citratocomo fuente de carbono, también utiliza las salesinorgánicas de amonio como fuente de nitrógeno,lo que da lugar a una alcalinización del medio.Esto se pone de manifiesto por un viraje del indi-cador de pH azul de bromotimol, de verde a azulintenso, a la vez que se observa crecimiento en lasuperficie.

Producción de ureasa

La ureasa es una enzima presente en numerososmicroorganismos. Esta enzima cataliza la hidróli-sis de la urea, con producción de dióxido de car-bono y amoníaco, lo que causa una alcalinizacióndel medio.

Material

Un tubo con agar urea de Christensen y cultivobacteriano.

Técnica

Inocular el medio de cultivo mediante estría ensuperficie e incubar a 37ºC durante 24 horas.

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Interpretación

Los microorganismos que hidrolizan la urea hacenque el medio de cultivo tome color fucsia, debidoa la alcalinización del mismo por producción deamonio a partir de la urea, que se pone de mani-fiesto por un viraje del indicador de pH (rojo defenol).

Prueba del rojo de metilo

Esta prueba consiste en comprobar si el microor-ganismo en estudio fermenta la glucosa con pro-ducción de ácidos (succínico, láctico, acético, etc.)o vía ácido mixta.

Material

Un tubo de medio Voges-Proskauer, cultivo bacte-riano y reactivo rojo de metilo.

Técnica

Inocular el medio líquido e incubar a 37ºC durante24-48 horas. Transcurrido ese tiempo añadir, a 2 mldel cultivo, 5 gotas de la solución de rojo de meti-lo y agitar ligeramente.

Interpretación

En caso positivo aparece un color rojo estable, loque indica una producción de ácidos elevada quedisminuye el pH del medio. Un color anaranjadono indica que la prueba sea positiva, ya que otrosmicroorganismos pueden producir pequeñas can-tidades de ácidos.

Prueba de Voges-Proskauer

Consiste en comprobar si el microorganismo estu-diado fermenta la glucosa siguiendo la vía butilénglicólica, detectando un producto intermedio en lareacción que es el acetil-metil-carbinol o acetoína.

Material

Un tubo de medio Voges-Proskauer, cultivo bacte-riano, solución de α-naftol y solución de sosa.

Técnica

Inocular el medio líquido e incubar a 37 ºC duran-te 24-48 horas. Después de la incubación, seañade a 1 ml del cultivo 0,5 ml de α-naftol y 1 mlde solución de sosa, agitando vigorosamente enpresencia de oxígeno atmosférico y se deja repo-sar durante 10 minutos.

Interpretación

El desarrollo de un color rosa en el tubo, transcu-rridos 10 minutos desde la adición de los reacti-vos, indica que la prueba es positiva, es decir, quela acetoína se ha oxidado pasando a diacetilo.

Desaminación de la fenilalanina (APP)

La fenilalanina es un aminoácido cuya desamina-ción por medio de una desaminasa, da lugar a laformación de amoniaco y de ácido fenilpirúvico, elcual puede detectarse por la adición de un reactivo.

Material

Un tubo de medio agar fenilalanina, cultivo bacte-riano y solución de cloruro férrico al 10%.

Técnica

Sembrar el microorganismo en la superficie delmedio agar fenilalanina e incubar a 37ºC durante24 horas. Transcurrido este tiempo añadir 4 ó 5gotas de la solución de cloruro férrico sobre lasuperficie del agar.

Interpretación

La prueba se considera positiva cuando apareceuna coloración verde intensa. Esto se debe a quelas bacterias que poseen fenilalanina desaminasa,transforman el aminoácido en ácido fenilpirúvico,que da reacción coloreada con el cloruro férrico.

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Interpretación global de las pruebas de identificación de bacilos Gram negativos fermentadores de glucosaUna vez realizadas todas las pruebas determinar el género con ayuda de la siguiente tabla:

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Introducción

La técnica de dilución en caldo permite determinarla actividad de un agente antimicrobiano sobre unmicroorganismo, en forma de concentración míni-ma inhibitoria (CMI): La menor concentración deantimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento. Apartir de este dato puede determinarse si es posi-ble tratar una infección causada por ese microor-ganismo con ese antimicrobiano. Si la CMI esmenor que la concentración de antimicrobiano quese alcanza en los tejidos de cuerpo humano, el tra-tamiento puede tener éxito y el microorganismo seconsidera sensible; en caso contrario fracasará yel microorganismo se considera resistente. Unantibiograma es un estudio de la sensibilidad deun microorganismo dado a distintos antimicrobia-nos. Las distintas especies y estirpes microbianaspresentan distintos grados de sensibilidad a losdiversos agentes, de ahí que sea necesario haceruna evaluación para poder seleccionar el com-puesto más apropiado para el tratamiento de unainfección bacteriana.

Objetivo

Determinar la sensibilidad o resistencia a un anti-biótico de una bacteria aislada, utilizando el méto-do de dilución en caldo.

Material

Cultivo bacteriano en medio líquido de Escherichiacoli, 7 tubos con 1 ml de caldo Müeller-Hinton,solución de ampicilina (16 μg/ml) en caldo Müeller-Hinton (2 ml), pipetas de 1 ml y pipetas Pasteur.

Técnica

1.- Preparación del inóculoEsta técnica sólo es aplicable a especies bacte-rianas en cultivo puro. Por ello, previamente seprocederá, si es preciso, a hacer un aislamientoen placa. La preparación del inóculo se realiza sembrandouna colonia aislada del microorganismo en estudioen un tubo de caldo Mueller-Hinton e incubando a37 ºC durante 18-20 h.

2.- Preparación de las diluciones de antibióticoa) Rotular los tubos de caldo Müeller-Hinton: 8, 4,2, 1, 0.5, 0.25 y 0 μg/ml. b) Pipetear 1 ml del tubo que contiene la soluciónde ampicilina (16 μg/ml) al marcado con 8. c) Mezclar bien pipeteando y transvasar 1 ml altubo siguiente (4 μg/ml).d) Repetir el paso anterior hasta llegar al tubomarcado con 0.25 μg/ml, del que se desecha 1 ml. No añadir antibiótico al tubo marcado 0.

3.- Siembra: Tomar una muestra del cultivo de E.coli con una pipeta Pasteur e inocular una gota encada tubo de la serie de diluciones (incluidas lasde 16 y 0 μg/ml). Finalmente, incubar los tubos a37 ºC durante 20 h.

Interpretación

Al día siguiente, observar si hay turbidez en lostubos. De los que no presenten crecimiento, el quecontenga la concentración más baja de antibióticocorresponderá a la CMI. El tubo que no contieneantibiótico debe estar turbio (control positivo).

Figura 9.1. Determinación de la CMI.

μ

PRÁCTICA 9

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMAINHIBITORIA DE UN ANTIBIÓTICO

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Objetivo

Se pretende evaluar la sensibilidad o resistencia adiversos antibióticos de una bacteria de creci-miento rápido aislada en prácticas anteriores. Elmétodo utilizado es el de difusión en agar o deKirby-Bauer.

1. Preparación del inóculo

La técnica de antibiograma sólo es aplicable aespecies bacterianas en cultivo puro. Por ello, pre-viamente se procederá, si es preciso, a hacer unaislamiento en placa.

Material

Tubo con 10 ml de solución salina y cultivo de labacteria problema.

Técnica

Cultivar la bacteria aislada en un tubo de mediolíquido apropiado (caldo nutritivo, infusión cere-bro-corazón) o preparar una suspensión directa apartir del cultivo en placa usando el siguientemétodo:Tomar de una colonia aislada con el asa y resus-pender en el tubo de solución salina frotando en lapared del tubo (Figura 10.1).Homogeneizar bien y ajustar la densidad óptica

con un patrón de turbidez n° 0.5 de McFarland(0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M y 99,5 ml deácido sulfúrico 0,36 M). Esto equivale aproxima-damente a una densidad de 108 células/ml. Diluirsi es necesario la suspensión o añadir más inócu-lo.

2. Siembra y colocación de los discos

Material

Placas con medio de cultivo Müeller-Hinton, hiso-po, pinzas y discos de 6 mm de diámetro impreg-nados con antibiótico.

Técnica

Impregnar una torunda con la suspensión del inó-culo; escurrirla contra la pared del tubo y sembrarcon ella toda la superficie de la placa, medianteestrías cruzadas en varias direcciones. Antes de15 minutos deben colocarse los discos de antibió-ticos.Con pinzas flameadas y frías (o con un aplicadorautomático) se disponen los discos sobre las pla-cas, de forma que disten unos 15 mm del borde dela placa y unos 30 mm entre sí. En una placa de 9cm caben 6 discos. Adherir cada disco al agarpresionando ligeramente con las pinzas. A los 15 minutos se llevan a incubar, invertidas, a 37ºC.3. Lectura

Se realiza a las 16-20 horas. Medir el diámetro delos halos con calibrador o regla graduada, consi-derando la zona que esta libre de crecimiento. Encaso de bacteriostáticos es aceptable un ligerovelo dentro del halo. La presencia de colonias enel interior del halo indica contaminación, cultivomixto o aparición de resistencia.Consultar el siguiente cuadro para interpretar elantibiograma. Teniendo en cuenta la especie bac-teriana y el antibiótico, decidir si la bacteria essensible (S), resistente (R) o su sensibilidad nopuede definirse con claridad (intermedio o indeter-minado: I).

Figura 10.1. Preparación de una suspensión

PRÁCTICA 10

ANTIBIOGRAMA POR DIFUSION EN AGAR

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Tabla 10.1. Criterios de interpretación de antibiogramas a

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Figura. 10.2. Antibiograma por difusión en agar:

Respuesta de Staphylococcus aureusfrente a cuatro diferentes antibióticos.Las líneas indican el diámetro del halo deinhibición.

Introducción

Para conocer la calidad sanitaria de un agua des-tinada al consumo humano, es necesario realizaranálisis periódicos. Los microorganismos que seencuentran en el agua pueden ser autóctonos(propios del agua) y alóctonos (procedentes delsuelo, aire, hombre o animales). Los microorga-nismos propios del agua tienen una temperaturade crecimiento de 22ºC, mientras que los proce-dentes del intestino del hombre y otros animalescrecen mejor a temperaturas de 37ºC a 44ºC.

Los métodos oficiales de análisis microbiológicosy los criterios sanitarios de la calidad de aguaspotables de consumo humano aparecen especifi-cados en el BOE de 21 de febrero de 2003, RealDecreto 140/2003.

1.- Toma de muestras

Las muestras que se tomarán para el análisisdeben ser representativas del agua a estudiar,para determinar a partir de ellas su calidad micro-biológica y, de acuerdo con ella, poder calificardicho agua como "apta o no apta para el consumohumano". Por consiguiente, las muestras debenreflejar la composición microbiana del agua aanalizar.Hay normas para la toma de muestras de aguassegún sus distintas procedencias (grifos, pozos,depósitos, lagos, ríos, manantiales, etc.). En cual-quier caso, siempre para su recogida deben utili-zarse frascos estériles y deben recolectarse canti-dades comprendidas entre 500 y 1000 ml. Cuandose estime probable que el agua a analizar conten-ga trazas de cloro, cloramina u ozono, será nece-sario neutralizar su efecto bactericida en elmomento del muestreo (Real Decreto 1138/1990del 14 de septiembre). Para ello se añadirá unacantidad suficiente de tiosulfato sódico. Para unvolumen de 250 ml son suficientes 0,2 ml de unasolución acuosa al 3% de Na2S2O3·5H2O.

Para la preparación de la muestra, la filtración y lasiembra sobre los medios de aislamiento, debeseguirse los métodos descritos en las NormasISO. Es preferible iniciar el examen de las mues-tras inmediatamente después de su toma. Si las

muestras se conservan a temperatura ambiente(en la oscuridad, sin sobrepasar los 25ºC), su aná-lisis debe comenzar antes de que hayan transcu-rrido 6 h desde el momento de la toma de mues-tras. En circunstancias excepcionales, las mues-tras pueden conservarse a una temperatura de4ºC durante un periodo máximo de 24 h antes desu análisis.

2.- Recuento de microorganismos cul-tivables (Norma UNE-EN ISO 6222:1999)

Se consideran como microorganismos cultivablestodas las bacterias aerobias o anaerobias faculta-tivas, levaduras o mohos capaces de formar colo-nias en el medio y en las condiciones de ensayodescritos posteriormente.

Este recuento de colonias es útil para evaluar elestado de los recursos de agua en su origen y laeficacia del proceso de tratamiento de las aguasdestinadas al consumo humano e indica la limpie-za y el estado de los sistemas de distribución. Deigual modo, permite detectar cambios anómalosen el número de microorganismos en la red de dis-tribución. Así, todo aumento repentino del númeroobtenido puede advertir de la existencia de unfoco de contaminación y requeriría su inmediatainvestigación.

Para hacer este recuento se emplean placas conmedio agar extracto de levadura en las que sesiembra un volumen conocido de agua. La incu-bación se llevará a cabo a 22ºC durante 72 horas.

Material

- Muestra de agua.- 4 placas de Petri estériles.- 1 pipeta de 1 ml estéril.- 4 tubos con medio agar extracto de levadura.- Estufa regulada a 22ºC.

Técnica

- Marcar cada placa con el número de la muestra,la dilución y la fecha, preparando placas duplica-das para cada volumen de muestra examinada.- Homogeneizar la muestra, agitando el frasco

PRÁCTICA 11

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE UN AGUA PROBLEMA

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varias veces.- Depositar, con pipeta estéril, en dos placas 1 mly en las otras dos 0,1 ml del agua problema.- Añadir el medio de cultivo (15-20 ml), fundido yatemperado a 45ºC, sobre las placas.- Mezclar por rotación suave de las placas sobrela mesa.- Cuando el medio esté completamente solidifica-do, invertir las placas y llevar a incubar a la tem-peratura de 22ºC.

Resultados

Efectuar el recuento de colonias eligiendo las pla-cas cuyo número esté comprendido entre 30 y300. El recuento no se efectuará en placas quecontengan menos de 30 colonias, excepto en elcaso de aquellas siembras con agua sin diluir. Sino hay colonias en las placas sembradas conmuestra sin diluir, los resultados se expresancomo "no detectado en un mililitro". Si todas lasplacas tienen más de 300 colonias, el resultadoobtenido se dará como "> 300" o como "valoresaproximados".El resultado, correspondiente a la media delrecuento de ambas placas, se expresará comonúmero de unidades formadoras de colonias pre-sentes en 1 ml de la muestra (UFC/ml) en 72 h decrecimiento a 22ºC.

3.- Detección y recuento de bacteriasindicadoras de contaminación fecal

La investigación en el agua de bacterias indicado-ras de contaminación fecal (Escherichia coli yotros coliformes, enterococos y Clostridium per-fringens) es de gran interés ya que su presenciaindica que ese agua puede estar contaminada porotras bacterias patógenas que viven en el intesti-no del hombre y de los animales de sangre caliente.

3.1.- Detección y recuento de Escherichiacoli y de bacterias coliformes (NormaUNE-EN ISO 9308-1: 2000)

La presencia y el nivel de contaminación fecalconstituye un factor importante en la evaluaciónde la calidad de un agua y del riesgo de infecciónque representa para la salud humana. El análisisde muestras de agua para detectar la presenciade E. coli, que normalmente habita en el tractointestinal del hombre y otros animales de sangrecaliente, proporciona una indicación de este tipode contaminación. Los resultados del análisis debacterias coliformes pueden resultar difíciles de

interpretar dado que algunas bacterias coliformesviven en el suelo y en aguas dulces superficialesy, por tanto, no tienen siempre un origen intestinal.La presencia de bacterias coliformes en el aguade abastecimiento, aunque no pruebe de formaconcluyente una contaminación de origen fecal, sípuede indicar fallos en el tratamiento de depura-ción o en la red de distribución del agua. La iden-tificación de las cepas aisladas puede permitir enocasiones obtener información acerca de su ori-gen.Los coliformes agrupan ciertas especies bacteria-nas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae,de morfología bacilar, Gram negativas, anaerobiasfacultativas, oxidasa-negativa, no esporuladas yque fermentan la lactosa con producción de ácidoa 37ºC en 24-48 horas.

MÉTODO DE FILTRACIÓN

Se utiliza para la determinación del número decoliformes y E. coli, mediante filtración de volúme-nes determinados del agua a analizar a través defiltros de membrana e incubación de los mismossobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.

Material

- Membranas filtrantes estériles de ésteres decelulosa, de 0'45 μm de poro.- Pinzas de extremos planos.- Equipo de filtración por vacío.- Placas de Petri con agar lactosa-trifeniltetrazolio-tergitol 7 (Agar de lactosa TTC con heptadecilsul-fato de sodio o tergitol 7). - Estufas a 37ºC y 44ºC.

Figura 11.1. Equipo de filtración a vacío

A. Filtro de celulosa de 0’45 μm de diámetro deporo.B. Depósito para la muestra o medio.C. Depósito para la muestra o medio filtrados.D. Sistema de vacío.

A B

C

D

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Técnica

- Colocar un filtro de membrana estéril sobre elsistema de filtración, utilizando pinzas estériles.Adaptar el embudo y filtrar 100 ml de la muestrade agua previamente homogeneizada.- Retirar el embudo y, con unas pinzas esteriliza-das, transferir la membrana sobre el medio de cul-tivo agar de lactosa TTC de modo que la superfi-cie de filtración quede hacia arriba. Es importanteque la membrana quede homogéneamente apo-yada sobre el medio de cultivo.- Invertir la placa e incubar durante 24-48 horas a37ºC.- El empleo de un filtro de membrana adicionalpara la incubación a 44ºC puede evitar los proble-mas causados por el crecimiento de otras bacte-rias cuya procedencia no sea fecal.

Resultados, confirmación y recuento

Se examinan las membranas y se cuentan comobacterias lactosa-positivas todas las colonias, sintomar en consideración el tamaño, que originen unviraje de color a amarillo del indicador del mediopor debajo de la membrana, consecuencia de laacidificación tras la fermentación de la lactosa.

NOTA: Aunque no está incluido en la normativa serealizará una tinción de Gram sobre una de lascolonias lactosa-positivas que confirme la presen-cia de bacilos Gram negativos.

Para realizar el recuento de coliformes se cuentanlas colonias lactosa-positivas que hayan apareci-do sobre la superficie del filtro, después de la incu-bación a 37ºC, y se expresan como número deUFC presentes en 100 ml de agua.

A continuación, es necesario llevar a cabo losensayos confirmativos siguientes:

- Prueba de la oxidasa (citocromo c oxidasa)Los citocromos son enzimas que forman parte dela cadena de transporte de electrones en la respi-ración aeróbica, transfiriendo electrones al oxíge-no, con la formación final de agua.

- Producción de indolEl indol es uno de los productos de degradacióndel metabolismo del aminoácido triptófano. La pre-sencia de la enzima triptofanasa en la bacteriaprovoca la desaminación reductiva del triptófanoproduciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco.

Para realizar estos ensayos confirmativos, seresiembran preferiblemente todas las colonias lac-tosa-positivas obtenidas en la placa incubada a

37ºC, o un número representativo de ellas (diezcomo mínimo), sobre una placa de agar triptonasoja (TSA). Además, todas y cada una de estascolonias se resiembran en otros tantos tubos concaldo de cultivo con triptófano. A continuación:- Se incuba la placa de agar TSA a 37ºC durante24 horas y se lleva a cabo la prueba de la oxida-sa, tal y como se indica en la práctica 9.- Se incuban los tubos con caldo de cultivo contriptófano a 44 ºC durante 24 h; tras dicha incuba-ción, se comprueba la producción de indol aña-diendo de 0,2 ml a 0,3 ml de reactivo de Kovacs oEhrlich. La aparición de una coloración roja en lasuperficie del caldo confirma la producción deindol.

Se realiza un recuento de todas las colonias lac-tosa-positiva que dan una reacción oxidasa nega-tiva y se consideran como bacterias coliformes.Se realiza un recuento de todas las colonias lac-tosa-positiva que presentan reacción oxidasanegativa y dan reacción indol positiva y se consi-deran como Escherichia coli.

Expresión de los resultados

A partir del recuento del número de coloniascaracterísticas presentes en la membrana yteniendo en cuenta los resultados de los ensayosde confirmación efectuados, se calcula el númerode UFC de coliformes y de E. coli presentes en 100ml de muestra.

3.2.- Detección y recuento de enterococos(Norma UNE-EN ISO 7899-2: 2001)

Los enterococos pueden considerarse como indi-cadores de contaminación fecal. Sin embargo, esconveniente recordar que algunos enterococosque se encuentran en las aguas pueden procederocasionalmente de otros hábitats. Mediante losmétodos descritos a continuación pueden detec-tarse y cuantificarse las especies: Enterococcusfaecalis, E. faecium, E. durans y E. hirae. Además,pueden determinarse ocasionalmente otras espe-cies de Enterococcus y algunas especies deStreptococcus (en particular S. bovis y S. equinus).Estas especies de Streptococcus no tiene unasupervivencia larga en en agua y probablementeno puedan determinarse cuantitativamente.Como enterococos intestinales se consideranaquellos microorganismos capaces de reducir elcloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) y de hidro-lizar la esculina en las condiciones y sobre losmedios especificados más abajo.

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MÉTODO DE FILTRACIÓN

Se utiliza para la determinación del número deenterococos intestinales mediante filtración de unvolumen determinado del agua a analizar a travésde filtros de membrana e incubación de los mis-mos sobre medios de cultivo a temperaturas ade-cuadas.

Material y técnica

- Siguiendo el método de filtración descrito para elrecuento de coliformes, se filtran 100 ml del aguaa analizar previamente homogeneizada.- Se coloca el filtro de membrana sobre el mediode Slanetz y Bartley y se incuban las placas a37ºC durante 48 h.

Resultados, confirmación y recuento

Tras la incubación, se consideran como coloniastípicas de enterococos todas las que muestren uncolor rojo, marrón o rosado, en el centro o en todala colonia, consecuencia de la reducción del TTC(incoloro) a trifenilformazán (rojo).

NOTA: Aunque no está incluido en la normativa serealizará una tinción de Gram sobre una de lascolonias positivas que confirme la presencia decocos Gram positivos en cadenas.

Si hay colonias típicas se realizará un ensayoconfirmativo. Para ello, con ayuda de unas pin-zas estériles, se transfiere el filtro de membranacon las colonias, sin invertirla, sobre una placacon agar bilis-esculina-azida, precalentada a44ºC. Se incuba a 44ºC durante 2 h y se lee laplaca inmediatamente. En este medio, los entero-cocos hidrolizan la esculina dando origen a escu-letina (6,7-dihidrocumarina) que se combina conlos iones Fe3+ formando un compuesto de colormarrón a negro. Por tanto, se considera que todaslas colonias típicas que muestren un color demarrón a negro, en el medio circundante, danreacción positiva y se cuentan como enterococos.

Expresión de los resultados

A partir del recuento del número de coloniascaracterísticas presentes en la membrana sobre elmedio de Slanetz y Bartley y teniendo en cuenta elresultado del ensayo de confirmación efectuado,se calcula el número de UFC de enterococosintestinales presentes en 100 ml de muestra.

3.3.- Detección y recuento de Clostridiumperfringens (incluidas las esporas)

Los bacterias incluidas en el género Clostridiumtienen morfología bacilar, son Gram positivas,anaerobias estrictas y capaces de formar esporas.La especie C. perfringens está normalmente pre-sente en heces. Sus esporas son resistentes alcalor, a los procesos de desinfección y a los trata-mientos de depuración habituales de las aguas(cloración), por lo que su supervivencia en aguaes mayor que la de las formas vegetativas, inclui-dos E. coli y los enterococos. La diferenciación de C. perfringens de otras espe-cies de Clostridium, se basa en su capacidad defermentar la sacarosa con producción de ácido, ensu incapacidad de fermentar la celobiosa (debidoa la ausencia de β-D-glucosidasa) y en la produc-ción de fosfatasa ácida.

MÉTODO DE FILTRACIÓN

Se utiliza para la determinación del número deC. perfringens mediante filtración de un volumendeterminado del agua a analizar a través de filtrosde membrana e incubación de los mismos sobremedios de cultivo a temperaturas adecuadas.

Material y técnica- Siguiendo el método de filtración descrito para elrecuento de coliformes, se filtran 100 ml del aguaa analizar, previamente homogeneizado.- Se coloca el filtro de membrana sobre el mediode m-CP y se incuban las placas a 44ºC durante24 h en condiciones de anaerobiosis.

Resultados, confirmación y recuento

Tras la incubación, se consideran como coloniastípicas de C. perfringens todas las que muestrenun color amarillo opaco, consecuencia de la acidi-ficación del medio tras la fermentación de la saca-rosa. En general, el resto de las especies deClostridium aparecen de color azul-verdoso si,además de fermentar la sacarosa, son β-D-gluco-sidasa positivas (hidrolizan el indoxil-β-D-glucósi-do) o de color púrpura si no fermentan la sacaro-sa.

NOTA: Aunque no está incluido en la normativa serealizará una tinción de Gram sobre una de lascolonias positivas que confirme la presencia debacilos Gram positivos.

Si hay colonias típicas de C. perfringens se reali-zará un ensayo confirmativo exponiendo dichascolonias a vapores de hidróxido amónico.

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Se considera que todas las colonias que cambiena color rosa o rojo al cabo de 20 a 30 segundosdan reacción positiva (la producción de fosfatasaácida provoca la hidrólisis de la fenolftaleína difos-fato) y se cuentan como C. perfringens.

Expresión de los resultados

A partir del recuento del número de coloniascaracterísticas presentes en la membrana sobre elmedio m-CP y teniendo en cuenta los resultadosdel ensayo de confirmación efectuado, se calculael número de UFC de C. perfringens presentes en100 ml de muestra.

OTROS MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DEClostridium perfringens

Aunque la normativa vigente propone realizar elanálisis ya descrito para la detección de C. per-fringens, también señala la posibilidad de utilizarotros métodos alternativos siempre que estén va-lidados o acreditados por los laboratorios de análi-sis de aguas.

Filtración e incubación en medio agar TSC

El agua problema se filtra como se ha descrito enla técnica anterior y el filtro se incuba sobre medioagar TSC (Triptosa-Sulfito-Cicloserina). Estemedio, muy utilizado en el análisis microbiológicode productos cárnicos, proporciona un sustratoóptimo para el crecimiento de clostridios. Por supropiedad metabólica de utilizar sulfitos comoaceptores de electrones produciendo sulfuros,C. perfringens forma parte del grupo bacteriano delos sulfito-reductores. La reducción del bisulfito asulfhídrico se detecta por precipitación de sulfuroferroso con las sales de hierro incluidas en la for-mulación del medio. Por tanto, esta especie pro-duce colonias negras características. La cicloseri-na y otros antibióticos que suelen añadirse (poli-mixina B o kanamicina) actúan como agenteselectivo inhibiendo el desarrollo de otros microor-ganismos. La incubación se realiza durante 18-24h a 44°C en condiciones de estricta anaerobiosis.Después de la incubación se realizará el recuentode las colonias negras y expresar el resultadocomo UFC/100 ml de muestra.

Recuento de esporas de Clostridium sulfi-to-reductores en tubos con agar de hierroy sulfito

Como se ha indicado, C. perfringens forma partedel grupo de los sulfito-reductores. Una técnicaclásica para el recuento de las formas de resisten-cia de clostridios sulfito-reductores implica suincubación en tubos de medio de cultivo sólidoglucosado, que contiene sulfito sódico y una sal dehierro (agar de hierro y sulfito). Este recuentoexige necesariamente un calentamiento de lamuestra de agua para destruir las formas vegeta-tivas de las bacterias.

Material:

- Tubos con 10 ml del agua problema.- Tubos con 10 ml de medio agar de hierro y sulfi-to a doble concentración.- Tubos con agar agua.- 1 pipeta de 10 ml estéril.

Técnica:

- Colocar 10 tubos del medio de cultivo en bañomaría hasta fusión total del agar.- Calentar la muestra de agua en baño a 80ºC,durante cinco minutos, con objeto de destruir lasformas vegetativas. A continuación, atemperarhasta 60ºC aproximadamente.- Sembrar cada tubo de medio, atemperado a 45-50 ºC, con 10 ml del agua a 60 ºC.- Mezclar y enfriar rápidamente, sumergiéndolosen agua fría. Recubrir con agar-agua en un espe-sor de 2-3 cm.- Incubar a 37 ºC durante 48-72 horas para ladeterminación de esporas de clostridios sulfito-reductores, o bien a 45 ºC durante 24-48 horaspara el recuento de esporas de C. perfringens.

Resultados:

Las colonias de Clostridium sulfito-reductoresaparecerán de color negro, debido a la reduccióndel sulfito a sulfhídrico y posterior formación desulfuro ferroso por reacción de éste con la sal dehierro.Transcurridas 48 horas, contar el número de colo-nias negras desarrolladas en la totalidad del agar.El resultado se expresará como número de espo-ras de clostridios sulfito-reductores en el volumende agua sembrado (100 ml).

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OTRAS DETERMINACIONES

Rara vez se hacen otras determinaciones micro-biológicas en las aguas de abastecimiento apartede las consignadas. Así, cuando la determinaciónde C. perfringens sea positiva y exista una turbi-dez mayor a 5 UNF (Unidad Nefelométrica deFormacina) se determinarán, en la salida de ETAP

(Estación de Tratamiento de Agua Potable) odepósito, si la autoridad sanitaria lo consideraoportuno, Cryptosporidium u otros microorganis-mos o parásitos. De igual modo, sólo en el casode un brote epidémico se lleva a efecto la investi-gación de microorganismos transmitidos a travésdel agua como Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae,etc.

NORMAS LEGALES VIGENTES Real Decreto 140/2003 de 7 de febrero de 2003. BOE 21 de febrero de 2003

Artículo 17. Control de calidad del agua de consumo humano

"... (Tras el análisis de una muestra de agua de consumo humano), el agua se podrá cali-ficar como "apta para el consumo" cuando no contenga ningún tipo de microorganismo,parásito o sustancia, en una cantidad o concentración que pueda suponer un peligro parala salud humana; y cumpla con los valores paramétricos ..."

(1) Parámetros de obligado cumplimiento.(2) En el caso de incumplimiento de estos parámetros, la autoridad sanitaria valorará la calificación delagua como "apta o no apta para el consumo humano" en función del riesgo para la salud.

Parámetros microbiológicos (1) Valor paramétrico

Parámetros indicadores (2) Valor paramétrico

Escherichia coliEnterococosClostridium perfringens (incluidas las esporas)

0 UFC/100 ml0 UFC/100 ml0 UFC/100 ml

Recuento de colonias a 22ºC Coliformes

100 UFC/ml0 UFC/100 ml

Características microbiológicas

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MEDIOS DE CULTIVO

Agar agua:

Agar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Añadir el agar al agua y calentar hasta la fusióndel mismo, mezclando bien. Dispensar en tubosen volúmenes de unos 3 ml y esterilizar en auto-clave a 121ºC durante 15 minutos.

Agar bilis-esculina-azida

Triptona 17,0 gPeptona 3,0 gExtracto de levadura 5,0 gBilis de buey, deshidratada 10,0 gCloruro sódico 5,0 gEsculina 1,0 gCitrato férrico amónico 0,5 gAzida sódica 0,15 gAgar 15 g Agua destilada c.s.p. 1000 ml

Disolver los componentes en el agua por calenta-miento suave, a excepción del agar. Ajustar el pHa 7,1. Añadir el agar y esterilizar en autoclavedurante 15 min a 121ºC. Atemperar a 50-60ºC,repartir en placas de Petri para obtener un espe-sor de 3-5 mm y dejar solidificar. Las placas asípreparadas pueden conservarse en la oscuridadhasta 2 semanas a 4ºC.

Agar citrato de Simmons

Sulfato de magnesio 0,2 gFosfato dihidrógeno amónico 1 gFosfato bipotásico 1 gCitrato sódico 2 gCloruro sódico 5 gAzul de bromotimol 0,08 gAgar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver los componentes en el agua, a excepcióndel agar, y ajustar el pH a 6,8. Añadir el agar y lle-var a ebullición envasando el medio en tubos, a

razón de 9-10 ml por tubo. Esterilizar en autoclavea 121ºC durante 15 minutos y dejar solidificar enposición inclinada.

Agar C.L.E.D

Peptona de gelatina 4 gExtracto de carne 3 gTriptona 4 gLactosa 10 gL-cistina 0,128 gAzul de bromotimol 0,02 gAgar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver los componentes en agua, a excepcióndel agar, y ajustar el pH a 7,3. Añadir el agar y lle-var a ebullición hasta disolver por completo.Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu-tos. El medio estéril y atemperado a 50ºC se dis-pensa en placas de Petri para obtener un espesorde 3-5 mm y se deja solidificar.

Agar de extracto de levadura

Triptona 6,0 gExtracto de levadura 3,0 gAgar 15 gAgua destilada c.s.p. 1000 ml

Disolver los componentes en el agua, a excepcióndel agar, calentando suavemente. Ajustar el pH a7,2. Añadir el agar y llevar a ebullición para disol-ver por completo. Distribuir en tubos a razón de15-20 ml. Esterilizar en autoclave a 121ºC duran-te 15 min. Para su empleo, fundir el medio y man-tener a 45ºC en baño de agua. Es recomendableno mantener el medio durante más de 4 h a 45ºC.Transcurrido este tiempo el medio debe desecharse.

Agar de hierro y sulfito:

Triptona 10 gSulfito sódico 0,5 gCitrato férrico 0,5 gAgar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

ANEXO

MEDIOS DE CULTIVO, COLORANTES Y REACTIVOS

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Disolver todos los componentes por calentamien-to, a excepción del agar y ajustar el pH a 7,1.Añadir el agar y llevar hasta ebullición para la diso-lución total del mismo. Repartir a razón de 20 mlpor tubo y esterilizar en autoclave a 121 ºC duran-te 15 minutos.

Agar F (medio King B)

Peptona 20 gFosfato bipotásico 1,5 gSulfato magnésico 1,5 gAgar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver los componentes en el agua, a excepcióndel agar, y ajustar el pH a 7,0. Añadir el agar y 10g de glicerol, calentando el medio hasta ebulliciónpara que se disuelva por completo. Esterilizar enautoclave a 121ºC durante 15 minutos. Dejarenfriar y dispensar el medio estéril en placas dePetri para obtener un espesor de 3-5 mm y se dejasolidificar.

Agar fenilalanina

Extracto de levadura 3 gFosfato bipotásico 1 gCloruro sódico 5 gDL-fenilalanina 2 gAgar 12 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, aexcepción del agar, calentando suavemente yajustar el pH a 7,3. Añadir el agar calentando denuevo hasta ebullición y distribuir en tubos a razónde 9-10 ml por tubo. Esterilizar a 121ºC durante 15minutos y dejar solidificar en posición inclinada.

Agar lactosa-TTC con heptadecilsulfatosódico

Extracto de carne 5 gPeptona 10 gLactosa 20 gExtracto de levadura 6 gAzul de bromotimol

(solución al 1%) 5 mlAgar 20 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver los componentes en el agua caliente,excepto el agar, y ajustar el pH a 7,2. Añadir el

agar y llevar hasta ebullición para disolver elmedio por completo. Repartir en matraces a razónde 100 ml y esterilizar en autoclave a 121ºCdurante 15 minutos. En el momento de su empleo,fundir al baño María y añadir a cada matraz:- 5 ml de solución acuosa de cloruro o bromuro de2,3,5 trifenil-tetrazolio (TTC) al 0,05%, esterilizadapor filtración (diámetro de poro 0,22 μm). Estasolución debe mantenerse en la oscuridad.- 5 ml de solución acuosa de heptadecilsulfatosódico (tergitol 7) al 0,2% esterilizada en autocla-ve a 121ºC durante 15 min.Mezclar bien y repartir en placas de Petri, dejandosolidificar. El espesor del medio en las placasdebe ser como mínimo de 5 mm.

Agar m-CP

Triptosa 30 gExtracto de levadura 20gSacarosa 5 gL-cisteína monoclorhidrato 1gSulfato magnésico

heptahidratado 0,1 mgPúrpura de bromocresol 40 mgAgar 15 gAgua destilada c.s.p. 1000 ml

Disolver los componentes en el agua, a excepcióndel agar, y ajustar el pH a 7,6. Añadir el agar yesterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min.Atemperar a 50-60ºC y añadir asépticamente: - 400 mg de D-cicloserina.- 25 mg de sulfato de polimixina B. - 60 mg de indoxil-b-D-glucósido (disueltos previa-mente en 8 ml de agua destilada estéril). - 20 ml de solución de fenolftaleína difosfato al0,5% esterilizada por filtración (diámetro de poro0,22 μm).- 2 ml de solución de cloruro férrico hexahidratadoal 4,5% esterilizada por filtración (diámetro deporo 0,22 μm).

Agar de Mossel (MYP: manitol-yema dehuevo-polimixina)

Peptona 10 gExtracto de carne 1 gD-manitol 10 gCloruro sódico 10 gFosfato amónico 1 gRojo fenol 0,025 gAgar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver por calentamiento hasta ebullición, enfriar

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a 50 ºC y ajustar el pH a 7,5. Esterilizar a 121 ºCdurante 15 minutos. Atemperar el medio a 45 ºC yañadirle 10 ml de emulsión de yema de huevo al20% y 1 ml de solución de sulfato de polimixina B(1 mg/ml) previamente esterilizada por filtraciónpor cada 110 ml de medio. Para preparar la emulsión de yema de huevo,remojar una docena de huevos de gallina en unasolución 1:100 de cloruro mercúrico saturado enagua durante 1 min, romper las cáscaras, separarla yema de la clara de once de los huevos ymezclarla con el otro huevo completo. Tomar 20ml de la mezcla, añadirlos a 80 ml de una soluciónde cloruro sódico al 0,9% y mezclar. Esterilizar porfiltración y atemperar a 45-50 ºC.

Agar movilidad

Extracto de carne 3 gPeptona 10 gCloruro sódico 5 gAgar 4 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, aexcepción del agar, calentando suavemente yajustar el pH a 7,3. Añadir el agar calentando denuevo hasta ebullición y distribuir en tubos a razónde unos 5 ml por tubo. Esterilizar a 121ºC durante15 minutos y dejar solidificar en posición vertical.

Agar Müeller-Hinton

Infusión de carne 300 gPeptona de caseína 17,5 gAlmidón soluble 1,5 gAgar 17 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, aexcepción del agar, y ajustar a pH 7,3. Añadir elagar y calentar hasta ebullición para que se disuel-va por completo. Esterilizar a 121 ºC durante 15minutos y una vez atemperado a 50 ºC, dispensaren placas de Petri estériles a razón de unos 20 mlpor placa, con el fin de obtener un espesor de 4 mm.

Agar nutritivo

Peptona 5 gExtracto de carne 1 gExtracto de levadura 2 gCloruro sódico 5 gAgar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver los componentes en el agua por calenta-miento, excepto el agar, y ajustar el pH a 7,1.Añadir el agar y llevar hasta ebullición, repartien-do el medio en tubos de ensayo a razón de 15 a20 ml por tubo. Esterilizar a 121 ºC durante 15minutos y dejar solidificar en posición inclinada.

Agar P (medio King A)

Peptona 20 gSulfato potásico 10 gCloruro magnésico 1,4 gAgar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver los componentes en el agua, a excepcióndel agar, y ajustar el pH a 7,0. Añadir el agar y 10g de glicerol, calentando el medio hasta ebulliciónpara que se disuelva por completo. Esterilizar enautoclave a 121ºC durante 15 minutos. Dejarenfriar hasta 50 ºC y dispensar el medio estéril enplacas de Petri hasta un espesor de 3-5 mm.

Agar Sabouraud-cloranfenicol

Peptona 10 gGlucosa 40 gAgar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua,excepto el agar, y ajustar el pH a 5,6. Añadir elagar y calentar hasta la ebullición, mezclándolosuavemente para que se disuelva por completo.Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minu-tos. Dejar enfriar hasta 50 ºC y añadir cloranfeni-col a partir de una solución madre filtrada hastauna concentración final de 50 mg/L. Dispensar elmedio estéril en placas de Petri hasta un espesor de3-5 mm.

Agar sangre

Utilizar una base de agar nutritivo o de otro mediomás rico, como el agar triptona soja, al que seañadirá en condiciones asépticas, una vez esteri-lizado en autoclave a 121ºC durante 15 minutos yatemperado a 45-50ºC, un 5% de sangre de caba-llo desfibrinada estéril. Mezclar suavemente paraevitar la formación de burbujas y dispensar en pla-cas de Petri hasta un espesor de 3-5 mm.

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Agar triptona soja

Triptona 15 gPeptona de soja 5 gCloruro sódico 5 gAgar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua,excepto el agar, y ajustar el pH a 7,2. Añadir elagar y calentar hasta la ebullición, mezclándolosuavemente para que se disuelva por completo.Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minu-tos. Dejar enfriar hasta 50 ºC y dispensar el medioestéril en placas de Petri hasta un espesorde 3-5 mm.

Agar TSC (triptosa-sulfito-cicloserina)

Triptona 15 gPeptona de soja 5 gExtracto de levadura 5 gBisulfito sódico 1 gCitrato de hierro amoniacal 1 gAgar 15 gAgua destilada c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua,excepto el agar, y ajustar el pH a 7,4. Añadir elagar y calentar hasta la ebullición, mezclándolosuavemente para que se disuelva por completo.Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu-tos. Dejar enfriar hasta 50 ºC, añadir cicloserina apartir de una solución madre filtrada hasta unaconcentración final de 0,4 μg/ml. Dispensar elmedio estéril en placas de Petri hasta un espesor de3-5 mm.

Agar urea de Christensen

Peptona 1 gGlucosa 1 gCloruro sódico 5 gFosfato monopotásico 2 gRojo de fenol 0,012 gAgar 15 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, aexcepción del agar, y ajustar el pH a 6,8. Añadir elagar y calentar hasta ebullición. Esterilizar enautoclave a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a50ºC y añadir asépticamente 100 ml de una solu-ción acuosa de urea al 20% esterilizada por filtra-ción. Mezclar bien y distribuir en tubos estériles arazón de 9-10 ml por tubo, dejando solidificar en

posición inclinada con poca superficie y muchofondo.

Agua de peptona

Peptona 10 gCloruro sódico 5 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua calen-tando suavemente y ajustar el pH a 7,2. Dispensaren tubos y esterilizar en autoclave a 121ºC duran-te 15 minutos.

Caldo de cultivo con triptófano

Triptona 10 gL-Triptófano 1 gCloruro sódico 5 gAgua destilada c.s.p. 1000 ml

Disolver los componentes en el agua por calenta-miento suave. Ajustar el pH a 7,5. Repartir entubos a razón de 3 ml por tubo. Esterilizar en auto-clave a 121ºC durante 15 min.

Caldo nitratado

Extracto de carne 3 g.Peptona 5 g.Nitrato potásico 1 g.Agua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver en el agua todos los componentes porcalentamiento suave y ajustar el pH a 6,9.Dispensar en tubos a razón de 10 ml por tubo yesterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min.

Medio fluido de tioglicolato

L-cistina 0,5 gCloruro sódico 2,5 gGlucosa monohidrato 5,5 gExtracto de levadura 5 gDigerido pancreático

de caseína (triptona) 15 gTioglicolato sódico 0,5 gSolución de resazurina

sódica al 0,1% 1 mlAgar 0,75 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Añadir el tioglicolato sódico o el ácido tioglicólico a

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la solución formada por el resto de los componen-tes, excepto la solución de resazurina sódica y elagar que se añaden después de ajustar el pH a7,1±0,2. Calentar hasta disolución total y distribuiren tubos de 9 x 180 mm a razón de 5 ml por tuboy esterilizar a 121ºC durante 20 minutos.Mantener los tubos en posición vertical.

Medio de Hugh-Leifson

Fórmula para la diferenciación de bacterias Gramnegativas:

Triptona 2 gCloruro sódico 5 gFosfato bipotásico 0,3 gAgar 3 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua, aexcepción del agar y ajustar el pH a 7,1. Añadir 15ml de azul de bromotimol al 0,2% y el agar, calen-tando hasta ebullición para que se disuelva porcompleto. Distribuir en cantidades de 100 ml yesterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu-tos. Atemperar a 45-50ºC y añadir asépticamentea 100 ml de medio estéril, 10 ml de una soluciónde glucosa al 10% esterilizada por filtración, mez-clando a fondo. Dispensar asépticamente cantida-des de 5 ml en tubos de cultivo estériles de 9 x180 mm. Mantener los tubos en posición vertical.

Fórmula para estafilococos y micrococos (modifi-cación de Baird-Parker):

Triptona 10 gExtracto de levadura 1 gGlucosa 10 gAgar 2 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua,excepto el agar, y ajustar el pH a 7,2. Añadir 20 mlde púrpura de bromocresol al 0,2% y el agar,calentando hasta la disolución total del medio.Dispensar en tubos de 9 x 180 mm a razón deunos 5 ml por tubo y esterilizar a 121ºC durante 15minutos. Mantener los tubos en posición vertical.

Medio Kligler

Extracto de carne 3 gExtracto de levadura 3 gPeptona 20 gLactosa 10 g

Glucosa 1 gCitrato férrico 0,3 gTiosulfato sódico 0,3 gCloruro sódico 5 gRojo de fenol 0,05 gAgar 12 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver en el agua los componentes, excepto elagar y el rojo de fenol, y ajustar el pH a 7,4. Añadirel agar y el rojo de fenol, calentando hasta ebulli-ción para disolver el medio por completo.Dispensar en tubos a razón de 12-15 ml por tuboy esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15minutos. Dejar solidificar los tubos en posicióninclinada de manera que se obtenga una buenabase.

Medio de Slanetz y Bartley

Triptosa 20,0 gExtracto de levadura 5,0 gGlucosa 2, 0 gFosfato dipotásico 4,0 gAzida sódica 0,4 gAgar 15 g Agua destilada c.s.p. 1000 ml

Disolver en el agua los distintos componentes porcalentamiento, a excepción del agar. Ajustar el pHa 7,2. Añadir el agar. Esterilizar en autoclave a121ºC durante 15 min. Atemperar a 50-60ºC yañadir, asépticamente a 1000ml de medio estéril,10 ml de una solución acuosa al 1% de cloruro de2, 3, 5-trifeniltetrazolio (TTC) esterilizada por filtra-ción (0,2 μm). (se debe proteger la solución deTTC de la acción de la luz y descartarse cuandoaparezca una coloración rosada). Mezclar bien,repartir en placas de Petri para obtener un espe-sor de 3-5 mm y dejar solidificar. Las placas asípreparadas pueden conservarse en la oscuridadhasta 2 semanas a 4ºC.

Medio de Voges-Proskauer

Peptona 7 gGlucosa 5 gFosfato bipotásico 5 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver en el agua todos los componentes porcalentamiento suave y ajustar el pH a 6,9.Dispensar en tubos a razón de 10 ml por tubo yesterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min.

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Medio V.L. (para cultivo en profundidad)

Peptona 10 gCloruro sódico 5 gExtracto de carne 2 gExtracto de levadura 5 gClorhidrato de L-cisteína 0,3 gGlucosa 2 gAgar 6 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver todos los componentes en el agua,excepto el agar, y ajustar el pH a 7,4-7,5. Calentarhasta la total disolución del medio y envasar entubos de 9 x 180 mm, a razón de 5 ml por tubo.Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minu-tos. Mantener en posición vertical.

COLORANTES Y REACTIVOS

Ácido nítrico

Solución al 33% en agua destilada.

Ácido sulfanílico

Ácido sulfanílico 8 gÁcido acético 5N 1000 ml

Disolver por calentamiento suave en una campa-na de gases.

Agua oxigenada

Solución al 3% en agua destilada.

αα-Naftilamina

α-Naftilamina 5 gÁcido acético 5N 1000 ml

Disolver por calentamiento suave en una campa-na de gases.

αα-Naftol

α-Naftol 6 gEtanol de 96º 100 ml

Disolver el compuesto en el etanol y almacenar enun frasco oscuro y en refrigeración durante untiempo no superior a una semana, ya que es sen-sible a la luz y a la temperatura. Por ser un reacti-vo inestable, conviene que sea preparado justoantes de usarse.

Azul de lactofenol

Ácido láctico 20 mlFenol 20 gAzul de anilina 0,05 gGlicerol 40 mlAgua destilada, c.s.p. 20 ml

Disolver el fenol en ácido láctico, glicerol y agua,calentando suavemente. Luego agregar el azul deanilina (azul algodón, azul de Poirrier)

Azul de metileno

Solución al 0,3% en agua destilada.

Azul de metileno de Loeffler

Azul de metileno 0,3 gEtanol de 95% 30 mlSolución acuosa de hidróxidopotásico al 0,01% (p/v) 100 ml

Preparar una solución saturada de azul de metile-no añadiendo el colorante en el etanol. Añadirentonces, 30 ml del sobrenadante a la solución dehidróxido potásico.

Cloruro férrico

Solución al 10% en agua destilada.

Colorante de Albert

Azul de toluidina 0,15 gVerde malaquita 0,20 gÁcido acético glacial 1 gEtanol 2 mlAgua destilada, c.s.p. 100 ml

Mezclar todos los componentes y filtrar despuésde 24 horas.

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Cristal violeta oxalatado (modificación deHucker)

Solución A:Cristal violeta 10 gEtanol de 95% 100 ml

Solución B:Oxalato amónico 1 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Mezclar 20 ml de la solución A y 80 ml de la solu-ción B. Guardar durante 24 horas y filtrar a travésde papel de filtro.

Etanol de 95% (vol/vol)

Fuchsina fenicada

Fuchsina básica 0,3 gFenol 5 mlEtanol de 95% 10 mlAgua destilada, c.s.p. 100 ml

Disolver la fuchsina en el etanol y disolver el fenol,una vez fundido, en el agua. Mezclar y dejar repo-sar varios días. Filtrar a través de papel antes desu uso.

Fuchsina fenicada de Kinyoun

Fuchsina básica 4 gFenol 8 gEtanol de 95% 20 mlAgua destilada 100 ml

Disolver la fuchsina en el etanol y disolver el fenol,una vez fundido, en el agua. Mezclar y dejar repo-sar varios días. Filtrar a través de papel antes desu uso.

Hidróxido sódico

Solución de hidróxido sódico al 40% en agua destilada.

Lugol (solución yodo-yodurada)

Yoduro potásico 2 gYodo 1 gAgua destilada, c.s.p. 300 ml

Disolver el yoduro potásico en un poco de agua y

agregar el yodo. Una vez disuelto, se agrega elagua restante. Guardar en frascos de color ámbar.

Nigrosina de Dorner

Nigrosina 10 gAgua destilada, c.s.p. 100 ml

Añadir la nigrosina al agua y mezclar en unmatraz. Calentar en un baño de agua hirviendodurante 20-30 minutos. Ajustar el volumen final a100 ml con agua. Como la nigrosina puede conta-minarse con microorganismos, añadir 0,5 ml deformol como conservador. Filtrar dos veces a tra-vés de un papel de filtro doble.

Reactivo de Ehrlich

p-Dimetilaminobenzaldehído 4 gEtanol de 95% 380 mlÁcido clorhídrico concentrado 80 ml

Disolver lentamente el reactivo en el alcohol, conayuda de un agitador magnético y a temperaturaambiente, y añadir entonces el ácido. Guardar enfrigorífico y protegido de la luz.

Reactivo de Kovacs

p-Dimetilaminobenzaldehído 5 gAlcohol amílico o butílico (exento de bases orgánicas) 75 mlÁcido clorhídrico

(ρ = 1´18 g/ml) 25 ml

Disolver el aldehído en el alcohol y añadir el ácidocuidadosamente. Proteger la solución de la luz yconservar a 4ºC. Es conveniente que la coloracióndel reactivo se encuentre entre el amarillo claro yel marrón claro (algunas muestras de alcohol amí-lico no dan resultados adecuados y toman un coloroscuro al mezclarse con el aldehído.

Rojo de metilo

Rojo de metilo 0,2 gEtanol de 95% 600 mlAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver el rojo de metilo en el etanol, con ayudade un agitador magnético y a temperatura ambien-te. Añadir entonces el agua destilada.

63

Safranina

Safranina O 0,25 gEtanol de 95% 10 mlAgua destilada, c.s.p. 100 ml

Disolver la safranina en el etanol y añadir enton-ces el agua destilada.

Solución decolorante ácido-alcohólica

Ácido clorhídrico concentrado 3 mlEtanol 95% 97ml

Solución salina

Cloruro sódico 9 gAgua destilada, c.s.p. 1000 ml

Disolver el cloruro sódico en el agua por calenta-miento suave y ajustar el pH a 6,6. Dispensar entubos y esterilizar en autoclave a 121ºC durante15 minutos.

Verde malaquita

Solución al 5% en agua destilada.

64

BIBLIOGRAFÍA

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Case, C.L. y T.R. Johnson. "Laboratory experi-ments in Microbiology". 5ª Ed. TheBenjamin/Cummings Publishing Company, Inc.1997.

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Collins, C.H. y P.M. Lyne. "Microbiological meth-ods". 8ª Ed. Hodder Arnond Publications. 2004.

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Forbes, B.A., D.F. Sahm y A.S. Weissfeld."Bailey y Scott Diagnóstico Microbiológico". 12ªEd. Médica Panamericana, 2009.

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Koneman, E., Allen, S., Janda, W., Winn, W.,Procop, G., Schrenckenberger, P. y Woods, G."Diagnóstico microbiológico. Texto y atlas encolor". 6ª Ed. Panamericana, 2008.

Seeley, H.W., P.J. Vandemark y J.L. Lee."Microbes in action. A laboratory manual ofMicrobiology". 4ª Ed. W.H. Freeman, New York,1991.

PRIMERA SEMANA

LUNES Preparación de

medios de cultivo líquidos y sólidos

Esterilización de medios de

cultivo

Observación de microorganismos

en fresco y por tinción simple

MARTES

Siembras Microorganismos

aeróbicos y anaeróbicos.

Tipo respiratorio

Control ambiental

Tinción de Gram

MIÉR-COLES

Lectura e interpretación de las siembras y del tipo respiratorio

Análisis microbiológico

de aguas de consumo humano

Tinción negativa

JUEVES

Informe Lectura y ensayos confirmativos de

coliformes y C. perfringens

Aislamiento de la mezcla problema

VIERNES

Tinción de Gram de las

colonias bacterianas

Lectura y ensayo confirmativo de

enterococos y de coliformes

Lectura del aislamiento.

Tinción de Gram y reaislamiento en

CLED

Tinción de esporas

SEGUNDA SEMANA Identificación de las bacterias de la mezcla problema

LUNES

Tinción de las colonias

bacterianas. Observación de hongos

Recuento de colonias a 22ºC

Informe

MARTES

Informe

Lectura de las pruebas de

identificación. Pruebas

complementarias

Tinción de corpúsculos

metacromáticos

MIÉR-COLES

Antibiogramas Métodos de difusión y dilución

Lectura y siembra de pruebas

complementarias

Tinción AAR

JUEVES

Lectura de los antibiogramas

Informe

Lectura de pruebas

complementarias

Examen Siembra en agar CLED

Informe

VIERNES

E X A M E N

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