Guia de Inmunología Farmacia_2015

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Inmunologa (Ciclo Farmacia)

Gua de Trabajos Prcticos

2015

Prof.: Gentile, Teresa JTP: Cardoso, Alejandro Alvarez, Elida Castro, Marisa S. Malchiodi, Emilio Costantino, Susana N. Fernndez, Marisa M. Gonzlez Maglio, Daniel H. Paz, Mariela L.

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ndice

Contenido Pg.

Prlogo 3

Propsitos Docentes 4

Normas de Bioseguridad 6

Calendario de Tericos 8

Calendario de Trabajos Prcticos 9

Bibliografa 10

Seminario: Introduccin a la respuesta inmune (RI) 12

Seminario: Tcnicas Inmunolgicas 18

Trabajo Prctico N 1: Interaccin Secundaria 33

Trabajo Prctico N 2: Interaccin Primaria 38

Trabajo Prctico N 3: Immunoblotting o Western blotting 40

Seminario: Planes de Inmunizacin y Anticuerpos Monoclonales 41

Seminario: Produccin y Control de Inmunoterpicos 52

Seminario: Inmunidad Celular 59

Trabajo Prctico N 4: Inmunidad Celular 69

Actividades de Repaso 70

Taller de Sueros y Vacunas: Cuadro 74

Cuadro Inmunoterpicos 75

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PRLOGO

La Inmunologa es una ciencia biomdica que ha ido adquiriendo ms y ms

importancia en la formacin del profesional farmacutico, por la creciente cantidad de

productos inmunolgicos empleados en la prevencin y en el tratamiento de las

enfermedades. Las vacunas, en desarrollo an antes de que existiera la Inmunologa

como disciplina, los anticuerpos monoclonales y las protenas recombinantes son un

campo de aplicacin donde el farmacutico juega un papel fundamental. Las tcnicas

inmunoqumicas, para la produccin de inmunoterpicos, y los inmunoensayos, como

mtodos analticos en el control de medicamentos, son herramientas utilizadas en el

control de calidad, purificacin y ensayos de estabilidad de estos productos en la

industria farmacutica. Por otra parte, el Farmacutico de oficina entrega a los

pacientes numerosos productos inmunolgicos, adems de recibir permanentemente

consultas, cuyas respuestas estn estrechamente relacionadas con la Inmunologa.

Durante el dictado de la materia conocern las distintas relaciones que se

establecen entre los individuos y los agentes infecciosos o nocivos del ambiente en que

vivimos, que conducen al desarrollo de diferentes mecanismos de defensa o que

producen procesos patolgicos.

Junto con ello, aprendern diferentes metodologas que son utilizadas en el

diagnstico inmunolgico de las enfermedades (tests inmunodiagnsticos), o el diseo

de estrategias inmunoqumicas para el estudio y/o purificacin de macromolculas de

inters inmunolgico. La materia est fuertemente orientada a la aplicacin de dichas

tcnicas para la produccin y control de los inmunoterpicos; para su mejor

comprensin, es imprescindible que adquieran una serie de conocimientos tericos y

prcticos, que les brindarn las bases sobre las que se asientan.

Finalmente, es importante que sepan que esta disciplina se encuentra en un

constante avance, por lo que, adems de generar la comprensin de los conocimientos

impartidos, esperamos desarrollar en ustedes la curiosidad y la capacidad para buscar y

comprender los nuevos conocimientos, o profundizar en los ya conocidos y puedan

desenvolverse como profesionales en el imprescindible proceso de formacin

permanente.

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PROPSITOS DOCENTES

Los docentes responsables del dictado de la materia Fundamentos de

Inmunologa tenemos como propsitos:

Proporcionar los conocimientos tericos y prcticos sobre los contenidos

seleccionados para el dictado de la asignatura.

Posibilitar la integracin de las diferentes unidades temticas tericas y

prcticas.

Establecer relaciones con las disciplinas afines.

Brindar las herramientas que posibiliten la resolucin de situaciones

problemticas del ejercicio profesional.

Facilitar el desarrollo de una actitud crtica para que los conocimientos

adquiridos se conviertan en el futuro en elementos para un mejor desempeo de

su actividad profesional.

MODALIDAD DE LA CURSADA

La materia ser desarrollada mediante el dictado de clases tericas y clases

prcticas, que incluyen trabajos prcticos, seminarios y talleres.

Tericos: si bien no son obligatorias, les brindarn contenidos imprescindibles que

debern ser incorporados gradualmente para su mejor comprensin. Tendrn una

secuencia que favorecer la interrelacin entre los contenidos de los mismos y aquellos

desarrollados en las clases prcticas.

Seminarios: en ellos se desarrollarn los contenidos de la unidad temtica especificados

en el temario que antecede a cada unidad. Para que los seminarios sean aprovechados

de la mejor manera, los alumnos debern concurrir habiendo ledo el temario, los

conceptos introductorios, y habiendo contestado el cuestionario de orientacin incluido

en cada unidad, haciendo uso de la bibliografa sugerida.

Talleres: en ellos los alumnos realizarn bsquedas bibliogrficas, realizarn

presentaciones y discutirn sobre los temas seleccionados.

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Trabajos Prcticos: se desarrollarn diferentes tcnicas de laboratorio, que les

permitirn iniciarse en el correcto manejo de las mismas y comenzar a formar un criterio

profesional.

REGULARIZACIN DE LA MATERIA

De acuerdo con la reglamentacin vigente, la regularizacin de la materia la

lograrn alcanzando el 75% de asistencia a las actividades obligatorias y con la

aprobacin de 75 % de las evaluaciones regulatorias que se realizarn a lo largo del

cuatrimestre.

En la calificacin de cada unidad temtica se considerar el resultado individual

de las evaluaciones parciales acerca de los fundamentos de los trabajos prcticos, que

se realizarn al comienzo de cada trabajo prctico.

Asimismo, ser requisito para la regularizacin de la materia la asistencia y

aprobacin de los talleres a dictarse durante el cuatrimestre.

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NORMAS DE BIOSEGURIDAD

La prevencin de accidentes se apoya en el conocimiento de las situaciones

potencialmente peligrosas y en las conductas apropiadas para afrontarlas. La

imprudencia, ya sea por ignorancia, por negligencia o por exceso de confianza, es la

causa de la mayora de los accidentes en nuestro mbito laboral.

Remitindonos al trabajo de laboratorio, consideramos tres tipos de riesgos: A)

fsico; B) qumico; C) biolgico. En este breve compendio, consideramos el riesgo de

clase C, por considerar que los alumnos se han familiarizado con las medidas

elementales de precaucin de las otras dos clases de riesgo, en materias previas.

TODO MATERIAL BIOLGICO, CUALQUIERA SEA SU ORIGEN,

DEBE SIEMPRE CONSIDERARSE COMO INFECCIOSO Y MANIPULARSE TOMANDO LOS

RECAUDOS APROPIADOS.

Modos de infeccin ms frecuente:

Infeccin accidental por pinchazos o cortes con agujas, bisturs, lancetas, pipetas,

etc.

Exposicin de la piel o mucosas a sangre, hemoderivados u otros fluidos

biolgicos.

Inhalacin de aerosoles producidos al agitar muestras, destapar tubos, o durante

una incorrecta centrifugacin.

Salpicaduras en ojos, nariz o boca.

Principales normas de bioseguridad:

Utilizar dentro del laboratorio ropa protectora (guardapolvo, chaqueta, etc), que

debe usarse slo dentro del laboratorio.

Utilizar guantes descartables para la manipulacin de materiales. No tocar con

las manos enguantadas otros elementos de uso corriente (elementos de

escritura, telfonos, etc) ni el propio cuerpo. El empleo de guantes por lo general

reduce la agilidad de aquellos operadores no habituados a trabajar con ellos; por

ese motivo es fundamental acostumbrarse a trabajar siempre con guantes.

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Lavarse las manos despus de quitarse los guantes, y cada vez que se retire del

laboratorio.

Utilizar protectores oculares (antiparras) y barbijo especial cuando exista riesgo

de salpicaduras o formacin de aerosoles.

Jams pipetear con la boca fluidos biolgicos ni reactivos. Utilizar siempre

pipetas automticas, propipetas o peras de goma.

Evitar la formacin de aerosoles, los que se producen por el agitado de tubos sin

tapa, incorrecta centrifugacin (sin tapa, tubos con excesivo volumen, o levantar

la tapa de la centrfuga antes de tiempo), etc.

Utilizar material descartable para la toma de cualquier muestra biolgica.

En caso de emplear jeringa y aguja, jams descartar la aguja destapada.

Al finalizar la tarea, realizar siempre una limpieza del lugar de trabajo. Emplear

lavandina diluida al 10%.

No beber, comer ni fumar en el laboratorio.

No guardar comestibles ni bebidas en las heladeras del laboratorio.

CONOCER Y AUTOMATIZAR ESTAS NORMAS CONSTITUYE

LA MXIMA GARANTA DE SU CUMPLIMIENTO.

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CALENDARIO DE CLASES TERICAS Inmunologa de Farmacia 2015 MARTES 13-14:30 hs

10/3 Elementos inespecficos de defensa. La respuesta inmune. Clulas que

participan en la respuesta inmune. rganos linfoides primarios y secundarios.

Dr. Malchiodi

17/3 Respuesta inmune innata. Respuesta inflamatoria. Clulas que participan. Mediadores solubles. Sistema complemento.

Dra. Alvarez

31/3 Antgenos. Inmungenos. Epitopes T y B. Respuesta inmune mediada por linfocitos B. Estructura de los anticuerpos. Sitio de combinacin. Mecanismos biolgicos mediados por anticuerpos. Respuesta primaria y secundaria.

Dra. Gentile

07/4 Origen de la diversidad de los receptores linfocitarios (BCR y TCR). Ontogenia y diferenciacin de B y T. Activacin LT y LB. Marcadores celulares. Seleccin positiva y negativa.

Dra. Gentile

14/4

Molculas del CMH, estructura y funcin. Presentacin y reconocimiento del Antgeno. Respuesta inmune mediada por linfocitos T. Recirculacin linfocitaria. Respuesta inmune asociada a mucosas.

Dr. Malchiodi

21/4 Respuesta inmune mediada por linfocitos T. Activacin y diferenciacin de linfocitos efectores y de memoria. Acciones reguladoras e inductoras de la respuesta inmune. Linfocitos T reguladores.

Dr. Malchiodi

28/4 Diferentes mecanismos efectores de la inmunidad. Citotoxicidad y Citlisis. Regulacin de la respuesta inmune y su relacin con distintos procesos infecciosos.

Dra. Alvarez

05/5 Clase de consulta 14 h

1 PARCIAL PROMOCIONAL: JUEVES 7 de Mayo 14 hs 12/5 Sueros y Vacunas. Adyuvantes. Dr. Malchiodi

19/5 Tolerancia Inmunolgica Autoinmunidad. Terapias. Dra Miranda

26/5 Inmunomoduladores. Supresores y estimuladores. Dra. Miranda

02/6 Hipersensibilidad inmediata. Alergia. Hipersensibilidad de tipo II y III. Hipersensibilidad retardada. Terapias inmunes.

Dra. Gentile

09/6 Inmunidad de transplantes. Rechazo de injertos. Inmunidad Tumoral. Dra. Canellada

16/6 Inmunodeficiencias. Dra. Canellada

23/6 Nuevos desarrollos en vacunas Dr. Malchiodi

30/6 Clase de consulta 14 h

2 PARCIAL PROMOCIONAL: JUEVES 2 de Julio de 14 hs

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CALENDARIO DE TRABAJOS PRCTICOS

Semana 1- (09 al 13 de Marzo) Seminario Introductorio: Antgenos y haptenos. Generalidades. Antigenicidad: factores que la condicionan. Inmungenos. Epitopes B y T. Anticuerpos: estructura y funcin, afinidad y avidez. Respuesta inmune primaria y secundaria.

Semana 2 - (16 al 20 de Marzo)

Seminario Tcnicas Inmunolgicas: Interaccin Ag-Ac. Tcnicas de interaccin secundaria: fundamentos y aplicaciones.

Semana 3 (23 al 27 de marzo). SOLO comisiones das MIE, JUE y VIE

Trabajo Prctico N 1 (Tcnicas de Interaccin secundaria).

Semana 4 - (30 de marzo al 03 de Abril) SOLO comisiones das LUN y MA Trabajo Prctico N 1 (Tcnicas de Interaccin secundaria).

Semana 5 - (06 al 10 de Abril)

Seminario Tcnicas Inmunolgicas: Tcnicas de interaccin primaria: fundamentos y aplicaciones.


Trabajo Prctico N 2 (Tcnica de Interaccin Primaria: ELISA) y Trabajo Prctico N 3 (Tcnica de Interaccin Primaria: Western Blotting o Immunoblotting) + Actividades de repaso.


Evaluacin N 1 y 2

Semana 8 - (27 de Abril al 1 de Mayo) Sin clases. 1 Parcial Promocional: Jueves 7 de Mayo de 14 hs

Semana 9 - (11 al 15 de Mayo)

Seminario Produccin de Sueros y Vacunas. Obtencin de Acs monoclonales. Planes de inmunizacin: generalidades. Ac monoclonales: fundamento de su produccin. Usos en diagnstico y tratamientos. Ac quimricos y humanizados.

Semana 10 - (18 al 22 de Mayo)

Seminario Inmunidad Celular: respuesta inmune celular. Tcnicas de enriquecimiento y de purificacin de clulas. HLA y transplante. Tcnicas de proliferacin celular, de citotoxicidad. Bioensayos. Reaccin de hipersensibilidad retardada.

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Semana 11 - (25 al 29 de Mayo) LUNES feriado, COM01 debe recuperar

Seminario Control y Produccin de Inmunoterpicos: estrategias de produccin de citoquinas, Acs y/o Ags recombinantes. Purificacin. Control de calidad: actividad y pureza. Aplicaciones farmacuticas. Produccin de IL2, GM-CSF, IFN tipo I, anti-TNF, anti-VEGF.

Semana 12 - (01 al 05 de Junio)

Trabajo Prctico N 4 (Inmunidad Celular, Bioensayo).

Semana 13 - (08 al 12 de Junio) Taller sueros y vacunas.

Semana 14 - (15 al 19 de Junio). Actividad integradora.

Semana 15- (22 al 26 de Junio) Evaluacin N 3 y 4

2 Parcial Promocional: Jueves 02 de Julio de 14 hs

BIBLIOGRAFA GENERAL

Abbas-Litchman-Pillai. Inmunologa Celular y Molecular. 6 Edicin 2008.

Elsevier.

Fainboim-Geffner. Introduccin a la Inmunologa Humana. 5 Edicin 2005.

Editorial Mdica Panamericana.

Murphy-Travers-Walport. Janeways immunobiology. 7 Edicin 2007. Garland

Science Publisher (en ingls).

Roitt-Brostoff-Male. Inmunologa. Fundamentos. 11 Edicin 2008. Editorial

Panamericana.

Temas de trabajos prcticos

Roitt-Brostoff-Male. Inmunologa. Fundamentos. 11 Edicin 2008. Editorial

Panamericana.

11

Luttman-Bratke-Kpper. Inmunologa. Manual de tcnicas de investigacin en el

laboratorio. Primera Edicin 2009. Editorial Acribia SA.

Margni. Inmunologa e Inmunoqumica. 5 Edicin 1996. Editorial Panamericana.

- Interaccin Ag-Ac. Precipitacin. Aglutinacin (int sec) Caps 9 y 35

- Int primaria Caps 8, 35, 38 y 42

- Sueros y vacunas Cap 20

- Monoclonales Cap 37

- Celular Cap 36

Gmez Luca-Blanco-Domenech. Manual de Inmunologa Veterinaria. - Valoracin de la respuesta inmune de base humoral Cap 17

- Valoracin de la respuesta inmune de base celular Cap 17

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INTRODUCCIN A LA RESPUESTA INMUNE (RI)

TEMARIO

- Caractersticas de la Respuesta Inmune:

Concepto de lo propio y no propio

Elementos de la Respuesta Inmune

Concepto de Antgeno y Anticuerpo

rganos linfoides

- Respuesta Inmune Innata:

Barreras Naturales

Inflamacin

Sistema de complemento

- Respuesta Inmune Adaptativa:

Concepto general del reconocimiento antignico

Antgenos T dependientes e independientes

Anticuerpos: Estructura e isotipos

Tipos de Respuesta Inmune

-Inmunidad Activa y Pasiva (Conceptos generales)

Para un organismo la vida es una interaccin permanente con el medio que lo rodea.

Como consecuencia de este intercambio, los organismos han desarrollado diferentes

sistemas que les permiten sobrellevar las agresiones del ambiente. Estos sistemas son

sencillos o ms complicados segn el lugar de la escala biolgica en que cada organismo

se encuentre. As, los hongos producen sustancias capaces de inhibir el crecimiento

bacteriano como la penicilina y las bacterias tienen una barrera natural de defensa

produciendo enzimas capaces de inactivar las penicilinas liberadas por los hongos. Uno

de estos sistemas, que se ha desarrollado con el simple y complejo fin de asegurar la

perpetuacin de las especies en el medio ambiente, recibe el nombre de sistema

inmune (SI) y ha alcanzado su mxima expresin en los mamferos.

La ciencia que estudia los mecanismos que rigen al SI es la Inmunologa y sus

orgenes se le atribuyen a Edgard Jenner, quien en 1796 introdujo el concepto de vacuna

al descubrir que la viruela ovina o vaccinia brindaba proteccin contra la viruela que

afectaba al hombre. Jenner desconoca los principios de la vacunacin, pero hoy

sabemos que se fundamentan en una respuesta inmune (RI) especfica que se genera

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contra un patgeno y que persiste en el tiempo. Es por ello que a este tipo de RI se la

llama adquirida o adaptativa. En una infeccin natural hay una etapa que precede a la

respuesta inmune adquirida, se la llama RI innata y presenta una limitada diversidad de

reconocimiento. Ya sea que hablemos de RI innata o adquirida, podremos diferenciar

una etapa de reconocimiento-activacin y otra efectora.

La principal caracterstica del SI es la capacidad de diferenciar lo propio de lo

extrao o no propio, y, excepto en situaciones patolgicas, la RI se desencadenar

contra organismos invasores.

Las clulas involucradas en la RI derivan de un precursor comn o stem cell en

mdula sea que puede ser: un progenitor mieloide, que origina a los granulocitos

(neutrfilos, basfilos y eosinfilos), macrfagos, monocitos y clulas dendrticas (CD); o

un progenitor linfoide, que da origen a los linfocitos T (LT), linfocitos B (LB) y clulas

natural killer (NK). Los rganos en los que se originan y maduran los componentes

del SI se llaman rganos linfoides primarios y en los mamferos son la mdula sea y el

timo. Los rganos linfoides secundarios son los ganglios linfticos, el bazo y el sistema

inmune asociado a mucosas, all se desencadena la RI o hay procesos relacionados con

sta.

La primer barrera de defensa est dada por el SI innato, si bien su especificidad es

limitada, es el primer paso para discriminar entre lo propio y lo extrao. Con el ingreso

de un microorganismo se genera un proceso inflamatorio, que se caracteriza por calor,

dolor, rubor y tumor. La inflamacin es consecuencia de la reaccin a la infeccin que

implica a las clulas residentes (macrfagos y CD), a las clulas endoteliales y a

componentes solubles (sistema complemento entre otros). Al sitio llegan los neutrfilos

en primera instancia que fagocitan al patgeno y luego los monocitos-, y se liberan

citoquinas y quimoquinas. Estas son sustancias capaces de alterar el comportamiento de

otras clulas al interaccionar con receptores especficos. El proceso de inflamacin

aumenta la permeabilidad vascular, permitiendo as mayor extravasacin de sustancias

quimiorreactantes que ayudan a reclutar clulas del SI en el sitio de la injuria.

Si bien esta primera RI tiene un reconocimiento limitado, esto no implica ausencia

de receptores. Estos receptores se caracterizan por interactuar con patrones o motivos

presentes en diferentes grupos de microorganismos (PAMPs), y no con antgenos (Ag)

especficos de cada uno de ellos, siendo esta una diferencia fundamental con la RI

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adquirida. Se denomina Ag a los componentes de los patgenos que tienen la capacidad

de interactuar especficamente con receptores presentes en los LT o LB y se reserva este

trmino para hablar de RI adaptativa.

Como ejemplo de este reconocimiento PAMP-receptor podemos mencionar: 1) los

pptidos N formilados producidos por las bacterias, que son reconocidos por los

receptores fMet-Leu-Phe guiando a los neutrfilos al sitio de la infeccin; 2) ciertos tipos

de azcares presentes en las superficies bacterianas y virus, reconocidos por los

receptores de manosa de los macrfagos; 3) los motivos CpG presentes en el ADN

bacteriano o el ARN doble cadena de los virus, reconocidos por los receptores tipo toll

(TLR) 9 y 3, 4) los cidos lipoteicoico o lipopolisacridos (LPS) presentes en la pared

bacteriana de ciertos microorganismos, reconocidos por los TLR 2 y 4, respectivamente,

etc. Los TLR, llamados as por haberse descubierto inicialmente en la mosca de la fruta

Drosophyla melanogaster, y luego encontrar sus anlogos en otras especies, se

encuentran en la superficie, o en vesculas endosomales, de macrfagos, CD, etc. Estos

receptores al interactuar con sus ligandos, desencadenan una cascada de seales que

llevan a la activacin de las clulas que los poseen, liberando sustancias coestimulatorias

que tambin intervienen en la RI especfica. Es por ello que algunos autores consideran

a los TLR como un nexo entre ambos tipos de respuesta.

La interaccin de los PAMPs con los Rc de la RI innata llevan a una activacin de las

clulas fagocitas: neutrfilos y macrfagos. Si bien los macrfagos son los fagocitos por

excelencia, los neutrfilos son los primeros en llegar al sitio de la injuria. La finalidad de

la fagocitosis es eliminar al microorganismo mediante mecanismos dependientes o

independientes de oxgeno.

Un mecanismo humoral efector muy importante es el sistema de Complemento. El

mismo est constituido por un grupo de protenas, muchas de ellas de sntesis heptica,

que circulan en el plasma como zimgenos. Puede activarse por las denominadas va

alterna, va de las lectinas o la va clsica, esta ltima involucra la participacin de

anticuerpos (Ac).

La RI adquirida o adaptativa se caracteriza por ser altamente especfica y generar

memoria inmunolgica. Ante la presencia de un patgeno se requieren clulas capaces

de procesarlo y mostrar los pptidos antignicos al SI, para que este los reconozca como

no propios y desencadene mecanismos para eliminarlos. Esta es la etapa de

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reconocimiento del patgeno. Estas clulas se llaman clulas presentadoras de

antgenos (CPA) profesionales y son las CD, los LB y los macrfagos. Slo estas clulas

pueden presentar los pptidos asociados a las molculas del complejo mayor de

histocompatibilidad de clase II (CMH-II) o CMH-I a los LT. Todos los otros tipos celulares,

a excepcin de los espermatozoides y de los glbulos rojos, son capaces de presentar

Ags, pero esta vez slo asociados a molculas del CMH-I a linfocitos ya efectores. Este

proceso es necesario para la etapa efectora de la RI.

Las molculas del CMH-II sintetizadas en el lumen del retculo endoplsmico (RE) se

asocian con una protena conocida como cadena invariante li, la que evitar la unin al

CMH-II de pptidos presentes en el RE y lo guiar hacia las vesculas exocticas donde li

es removida y el CMH-II se asocia el pptido antignico siendo llevado hacia la superficie

de la CPA. All, los LT CD4+ con sus receptores para antgenos de los LT (TCRs), reconocen

a los pptidos antignicos presentados en el contexto de las molculas del CMH-II. Los

pptidos que se asocian a las molculas del CMH-II se generan por la accin de

proteasas sobre Ags extracelulares que han sido fagocitados o sobre las protenas

secretadas por patgenos intracelulares, como ciertos parsitos, que son capaces de

vivir en el sistema vesicular y han sido incorporadas a los endosomas. stos se

fusionan con el lisosoma para constituir los fagolisosomas que en una etapa posterior se

asociarn con las vesculas exocticas

Los patgenos intracelulares como los virus, sintetizan sus protenas en el

citoplasma de la clula infectada. Algunas protenas son degradadas en pptidos

menores por un sistema cataltico presente en el citoplasma celular llamado

proteosoma. Estos pptidos pasan al RE empleando un transportador de pptidos y all

se renen con las cadenas del CMH-I que son traslocadas al lumen del RE por las

protenas TAP. La molcula CMH-I asociada al pptido, viaja por el Golgi y por el sistema

de vesculas hasta la superficie de la clula. Este proceso lo pueden hacer tanto las CPA

como otras clulas al ser infectadas. En el 1er caso ser una presentacin antignica y

los LT CD8+ reconocern al pptido en el contexto del CMH-I, a travs de su receptor de

superficie (TCR). En el 2do caso ser una respuesta efectora y, en este caso se produce

porque el LT CD8+ ya fue activado anteriormente.

Que la presentacin del Ag a los LT sea por clase I o II es fundamental, ya que eso

determinar si el mecanismo efector ser predominantemente celular o humoral. En el

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primer caso los mecanismos efectores estarn mediados principalmente por clulas y en

el segundo por Acs secretados por los LB. Los LB reconocen al Ag a travs de una

molcula de inmunoglobulina anclada a su membrana que es lo que se denomina

Receptor del LB o BCR. Cada clon de LB expresa un nico tipo de Ac con una

especificidad dada.

Los Acs son glicoprotenas sricas constituidas en su unidad fundamental de

inmunoglobulina por dos cadenas pesadas y dos livianas. Cada cadena consta de un

nico dominio variable y uno o ms dominios constantes. La combinacin del dominio

variable de la cadena liviana y pesada constituye el sitio de reconocimiento del Ag o

paratope, que es el que le proporciona la interaccin especfica y actividad

inmunolgica. As un paratope se combina con un epitope antignico y se da la

interaccin Ag-Ac. El Ac reconoce al Ag en su forma nativa y no es necesario que las

CPAs los procesen y expresen.

En lneas generales, podemos decir que la combinacin de los dominios constantes

de las dos cadenas pesadas son los que confieren las propiedades biolgicas tambin

efectoras. Un ejemplo es la activacin del complemento.

En los dominios constantes tanto de cadenas pesadas como livianas existen regiones

que determinan el isotipo o clase de la Ig. Se describieron 5 isotipos: , , , y para

las cadenas pesadas y dos para las livianas, y

La RI no es nicamente de tipo humoral o celular, sino que en general estn las dos

presentes con predominio de una forma u otra. La presentacin de Ags tampoco es

estrictamente por una va u otra, sino que existe lo que se denomina presentacin

cruzada.

Un concepto muy importante es comprender que cada vez que ocurre una infeccin

natural, estamos en presencia de numerosos Ags. Estos, a su vez, presentarn en su

estructura molecular zonas restringidas de reconocimiento denominadas epitopes. Cada

epitope interactuar con un paratope de un Ac proveniente de un LB.

Los LT CD4+ activados se diferencian a efectores que pueden ser de tipo 1 2 y se los

llama linfocitos colaboradores o helper (LTh) 1 2. Si el que se activa es un LTh1, se

secretar un patrn de citoquinas que promover una RI efectora predominantemente

de tipo celular junto con la secrecin de cierto isotipo de Acs. Si se activan LTh2,

entonces la RI ser predominantemente de tipo humoral y con un perfil de isotipos de

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Acs diferente al anterior. Los LTh1 tambin contribuirn a activar a los LT CD8+ para

potenciar la fase efectora citotxica.

Una RI puede ser protectiva controlando al patgeno, autolimitndose y evitando

una reinfeccin con el mismo. As la RI adquirida culmina con una fase reguladora. Este

es el aspecto beneficioso y deseado de la RI.

La RI tambin puede ser daina porque puede haber una reaccin contra Ag propios,

y se producir un fenmeno de autoinmunidad; o puede haber una RI a sustancias

inocuas como los alergenos, y tendremos el cuadro clnico conocido como alergia.

CUESTIONARIO (para responder despus del seminario)

1) Qu entiende por inmunidad?

2) Cun efectiva considera a la RI innata?

3) Considera que RI innata y adaptativa son dos hechos no relacionados?

Fundamente.

4) Dnde se generan los componentes humorales y celulares de la RI?

5) Dnde se monta la RI de reconocimiento antignico?

6) Por qu es importante que la RI sea policlonal?

7) Mencionamos la existencia de diferentes isotipos de Acs. Enumrelos y

discuta si es importante o no su existencia.

8) Qu sucedera si el nico isotipo producido fuese IgM?

9) Una mujer embarazada padece rubola en su infancia. Cmo lo confirma el

obstetra? Por qu no corre riesgo de contraerla nuevamente durante el

embarazo?

10) Mediante un esquema, indique como es la RI ante una primo infeccin y una

reinfeccin con el mismo patgeno.

11) De ejemplos de inmunidad activa y pasiva.

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TCNICAS INMUNOLGICAS

TEMARIO

- Interaccin Antgeno-Anticuerpo:

Factores que condicionan la interaccin

Concepto de epitope, paratope, hapteno

Afinidad, avidez

Sueros policlonales, Acs monoclonales

Concepto de Monoespecificidad

- Tcnicas de Interaccin Secundaria:

Precipitacin: zona de equivalencia, medio gelosado (IDR y DID)

Aglutinacin: directa, indirecta, reversa

Sistema ABO, Rh. Prueba de Coombs

- Tcnicas de Interaccin Primaria:

ELISA: no competitivos. Sistemas de amplificacin.

Inmunofluorescencia

SDS-PAGE, Inmunotransferencia (WB)

Se desarrollan a continuacin conceptos introductorios de las tcnicas ms

importantes. Los conceptos sern desarrollados durante el Seminario y deber

consultarse la bibliografa indicada.

INTRODUCCIN

Las interacciones antgeno-anticuerpo (AgAc) son asociaciones bimoleculares

de alta afinidad y especificidad. La interaccin entre un Ac y su Ag correspondiente

involucra a varias uniones no covalentes entre el determinante antignico o epitope

del Ag y la regin variable (VH/VL) o paratope de la molcula de Ac. Dado que estas

interacciones son reversibles, las asociaciones Ag-Ac pueden ser disociadas en

condiciones particulares.

La especificidad de un Ac por un Ag ha llevado al desarrollo de una variedad de

ensayos que pueden ser utilizados para la deteccin de cualquiera de los dos

componentes en una mezcla o fluido biolgico. Estos ensayos pueden tener un papel

fundamental en el diagnstico de enfermedades, el monitoreo del nivel de respuesta

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inmune o la identificacin de molculas de inters mdico o biolgico. Adems,

difieren entre ellos en velocidad y sensibilidad y pueden ser cuali o cuantitativos.

La valencia de los Acs (multi, bi o monovalencia), las caractersticas

fisicoqumicas y nmero de epitopes del Ag, as como el rango de concentraciones (pg,

g o mg) en el que se encuentran ambos reactantes y las condiciones del medio son

factores fundamentales que condicionan la visualizacin o no del complejo inmune

formado. As, un sistema Ag-Ac simplificado podra estar constituido por: una solucin

de un Ag que presenta un nico epitope por molcula y una solucin que contenga

molculas de Ac idnticas y especficas para ese epitope. Tras un perodo de contacto

de ambas soluciones, la velocidad de formacin de complejos Ag-Ac se iguala a la

velocidad de disociacin de los mismos, alcanzando un estado de equilibrio dinmico.

Esta interaccin, que no se visualiza, es conocida como interaccin primaria.

Ag + Ac Ag-Ac Sin embargo, si los Acs son al menos bivalentes y el Ag es multivalente

(repeticin de un mismo epitope o diferentes epitopes por molcula), y ambos

reactantes estn en concentraciones del orden de mg/ml, las reacciones producidas

pueden visualizarse macroscpicamente. Estas reacciones observables a simple vista,

son consecuencia del fenmeno de interaccin secundaria, en el que los complejos

inmunes primarios se asocian entre s dando lugar a complejos secundarios de mayor

tamao. Para que esto ocurra no slo se requiere la interaccin epitope-paratope sino

tambin la formacin de una estructura compleja (red) integrada por varias

molculas de Acs interactuando simultneamente con varias molculas de Ag que

presenten varios epitopes. Esta estructura slo se logra trabajando con relaciones Ag-

Ac apropiadas y en condiciones fisiolgicas; concentraciones salinas elevadas, pH

extremos y temperaturas superiores a 37 C disgregan los complejos impidiendo su

visualizacin. Estas condiciones extremas pueden llevar a una mala interpretacin de la

reaccin, ya que al no visualizarse los complejos secundarios se concluye que no existi

una interaccin Ag-Ac.

En todos los casos es necesario realizar controles adecuados, que permiten

interpretaciones confiables de los resultados obtenidos.

TCNICAS DE INTERACCIN SECUNDARIA

20

PRECIPITACIN

Se denomina precipitacin a la interaccin secundaria in vitro de un Ag

soluble (protena, hidrato de carbono, etc.) con su Ac especfico.

AGLUTINACIN

Se denomina aglutinacin a la interaccin secundaria in vitro de un Ag

particulado con su Ac especfico. Si el Ag (protena, hidrato de carbono, etc.) se

encuentra presente en la superficie de clulas (como glbulos rojos), bacterias u otras

partculas naturales el fenmeno se denomina aglutinacin directa. Utilizacin tpica:

determinacin de grupo sanguneo ABO.

Cuando el Ag con el que interaccionan los Acs especficos no forma parte de la

estructura de la partcula, sino que se incluye artificialmente en su superficie, la

aglutinacin que tiene lugar se denomina genricamente aglutinacin pasiva o

indirecta. Las partculas utilizadas como soportes pueden ser inertes como el ltex o

bien glbulos rojos, en cuyo caso el mtodo recibe el nombre de hemoaglutinacin

pasiva o indirecta. Utilizacin tpica: HAI Chagas.

Las tcnicas de aglutinacin pueden ser cualitativas o semicuantitativas.

A bajas diluciones del suero la aglutinacin puede estar ausente, debido a un

exceso de molculas de Ac, este fenmeno se denomina efecto de prozona, y de

ignorrselo, puede conducir a un resultado falso negativo.

Es importante recordar que el Ac a investigar por aglutinacin debe ser por lo

menos funcionalmente bivalente. Aquellos Acs que poseen un solo paratope til de

alta afinidad se denominan anticuerpos incompletos o asimtricos (funcionalmente

monovalentes). Para poder evidenciarlos utilizando reacciones de interaccin

secundaria es necesario recurrir a otras pruebas como la Reaccin de Coombs.

Utilizacin tpica: deteccin de anticuerpos anti-Rh (anti-Ag D) en el suero de

mujeres embarazadas Rh negativo (siendo el nio Rh positivo). Esta reaccin se basa

en la utilizacin de Acs anti-Ig humana (suero de Coombs) para producir la aglutinacin

luego de la interaccin del Ag con los Acs incompletos.

PRECIPITACIN EN MEDIO GELOSADO

21

Las macromolculas en solucin son capaces de difundir en un gel; dicha

capacidad depende de la concentracin del gel (que determinar un tamao de poro),

del tamao de la macromolcula en cuestin y de su concentracin. Utilizando geles es

posible hacer difundir Ags y/o Acs, generando un gradiente de concentracin y as

producir una reaccin de precipitacin en la zona de equivalencia, zona donde la

relacin de Ag y Ac es ptima. Existen varias tcnicas basadas en la precipitacin en

medios gelosados, algunas de las cuales se describen a continuacin.

- IDR (Inmuno Difusin Radial): En esta tcnica cuantitativa se utiliza un suero

monoespecfico embebido en el gel, soluciones estndar de diferente concentracin

del Ag y la/s muestra/s a valorar en los pocillos respectivos. Luego de difundir se

formar un halo de precipitacin cuyo dimetro (d) ser proporcional a la

concentracin antignica (cc Ag). Se realiza una curva patrn (r2 vs. cc Ag o d vs. Log cc

Ag) utilizando los estndares y en ella se interpola el valor de la muestra a valorar,

obteniendo as la concentracin del Ag en la muestra. Utilizacin tpica: cuantificacin

de isotipos de inmunoglobulinas totales sricas y del componente C3 del sistema

complemento.

- DID (Doble Inmuno Difusin): Esta tcnica cualitativa se basa en la doble difusin en

un gel tanto del Ag como del Ac, colocados en pocillos cercanos. La formacin de

inmunocomplejos insolubles se visualiza como bandas de precipitacin, cuya posicin

puede variar de acuerdo a las concentraciones y a los tamaos de ambos reactantes.

La comparacin de las bandas de precipitacin formadas por diferentes soluciones de

Ags y una solucin de Ac que los reconozca, permiten sacar conclusiones sobre las

similitudes o diferencias antignicas. Utilizacin tpica: comparacin de antgenos,

comparacin de reactividad de anticuerpos.

TCNICAS DE INTERACCIN PRIMARIA

Las tcnicas de interaccin primaria son mucho ms sensibles que las de

interaccin secundaria y permiten la identificacin de Ags o Acs en situaciones donde

las ltimas no son tiles debido a que estn condicionadas por las concentraciones y

22

las caractersticas fisicoqumicas de ambos inmunorreactantes, as como tambin por

las propiedades del medio de reaccin.

Existen varios tipos de tcnicas que se basan en la interaccin primaria; entre

ellas los enzimoinmunoensayos (EIA), los radioinmunoensayos (RIA), las tcnicas de

inmunofluorescencia (IF), y las tcnicas de western-blotting (WB). Las seales

detectadas sern colorimtricas, radioactivas, o fluoromtricas, y se deben a un

reactivo denominado conjugado, que consta de un Ag o un Ac unido a una enzima, a

un radioistopo (en cuyo caso particular lo denominamos trazador o radioligando), o a

un fluorocromo. Utilizacin tpica: Determinacin de Ac como diagnstico de

infeccin y determinacin de Ags.

ENZIMOINMUNOANLISIS

EIA heterogneos: El conjugado puede ser tanto el Ag como el Ac. Las enzimas ms

usadas en este tipo de tcnicas son la peroxidasa de rbano (HRP o horseradish

peroxidase) y la fosfatasa alcalina (FA).

Los EIA heterogneos son denominados tambin ELISA (enzyme-linked

immunosorbent assay), debido a que en estos ensayos se cuenta con una fase slida

en la que se inmoviliza uno de los inmunorreactantes. Esto permite la remocin de

todo aquello que no interaccione con la molcula inmovilizada con un simple lavado.

La inmovilizacin, tambin llamada sensibilizacin, es la unin del Ag o Ac a la fase

slida.

Los pasos bsicos de un ELISA son:

1- Sensibilizacin con uno de los reactivos inmunolgicos, ya sea un Ag o un Ac,

segn el diseo del ELISA. Posteriores lavados para eliminar el innmuno-

reactivo no adherido.

2- Bloqueo de los sitios vacos con una protena inerte al sistema. Lavados.

3- Incubacin con la muestra y con los estndares de ser necesarios. Lavados.

4- Incubacin con el sistema de deteccin. Puede ser tanto un Ag o un Ac

conjugado con una enzima. Lavados.

5- Agregado del sustrato de la enzima y un cromgeno.

6- Frenado de la reaccin.

23

Los ELISA no competitivos, pueden ser cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos y

la seal ser siempre proporcional a la concentracin de la molcula incgnita. Existen

distintos tipos de esquemas que pueden plantearse segn el objetivo:

INMUNOFLUORESCENCIA

Esta tcnica se utiliza casi exclusivamente con Ag particulados. Aqu el

conjugado es un Ac unido covalentemente a un fluorocromo como FITC (isotiocianato

de fluorescena) o rodamina que al ser excitados por luz UV emiten luz de color verde o

rojo, respectivamente. Pueden ser cualitativas o semicuantitativas.

La tcnica consiste en inmovilizar el corte de un tejido, clulas, bacterias u otras

partculas naturales sobre un portaobjeto o similar (se denomina a este preparado

impronta) y evidenciar la presencia tanto de Ag como de Ac.

La tcnica puede ser directa (IFD) o indirecta (IFI).

Esta tcnica presenta dos desventajas muy importantes: la primera es que se

debe disponer de un microscopio de fluorescencia y la segunda es la poca

reproducibilidad dado que depende de la subjetividad del operador.

ELECTROFORESIS EN GELES WESTERN BLOTTING- IMMUNOBLOTTING

Las protenas tienen una determinada carga neta a un valor de pH diferente de su

punto isoelctrico (pI), siendo capaces de migrar en un campo elctrico. Bajo estas

condiciones, la velocidad de migracin ser dependiente de su carga y su masa.

PAGE: La electroforesis en gel de poliacrilamida es un mtodo analtico basado en la

discriminacin de protenas segn su carga y su masa. La poliacrilamida es un polmero

con diferentes grados de polimerizacin, que se obtiene al mezclar acrilamida con bis-

acrilamida en diferentes proporciones. As se genera un gel con diferentes tamaos de

poros que ejerce un "efecto tamiz" sobre las molculas que migran, producindose la

24

separacin diferencial de las molculas en estudio en funcin de la relacin tamao/

carga.

SDS-PAGE: hace uso de gel de poliacrilamida y de un buffer que contiene

dodecilsulfato de sodio (SDS). Por accin del SDS todas las protenas adquieren una

carga homognea negativa al interactuar con el detergente. De este modo, la carga no

influye en la electroforesis y se separarn en funcin de la masa. Esta tcnica puede as

aplicarse para la determinacin de pesos moleculares.

Los geles pueden ser continuos o discontinuos. Los geles discontinuos estn

compuestos por un gel concentrador o stacking y el de corrida o running, esto hace que

las muestras sembradas en el stacking ingresen al mismo tiempo y con menor efecto de

difusin al gel separador.

Una vez finalizada la corrida, las protenas se visualizan mediante una tincin

irreversible que abarca desde el uso de colorantes, como el Coomassie Blue, hasta

marcas radiactivas y el uso de metales tales como el oro y la plata. Para las

glicoprotenas se puede emplear la Tincin de Schiff. Estos mtodos varan en

sensibilidad, es por ello que la no visualizacin de una banda no implica necesariamente

su ausencia.

El Western blotting o Immunoblotting, es una tcnica analtica utilizada para

detectar protenas especficas en una muestra determinada. Mediante una

electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso

molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Luego, las protenas son transferidas a una

membrana adsorbente, tpicamente de nitrocelulosa o de polyvinylidene fluoride

(PVDF), para poner de manifiesto a la protena de inters con anticuerpos especficos

contra ella. Finalmente, se detecta la unin Ag-Ac por actividad enzimtica,

fluorescencia, etc. De esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en la

muestra.

Esta tcnica es actualmente imprescindible en varios campos de la biologa, como

la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa.

25

Pasos del Western Blotting

-Preparacin de la muestra

-Electroforesis en gel: La electroforesis en gel ms frecuente es el SDS-PAGE.

Figura 1: Esquema de SDS-PAGE

-Transferencia Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos,

se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de

PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin de un

campo elctrico (electrotransferencia).

Las membranas que se emplean se caracterizan por su capacidad de unir protenas

de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con idntica afinidad).

Las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las

26

interacciones membrana - protena, se sabe con cierta seguridad que se trata de

interacciones no covalentes de naturaleza hidrfba. En las membranas de PVDF, la

unin est basada en interacciones hidrofbicas y de dipolos entre la membrana y las

protenas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de

exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de

surfactantes.

-Electrotransferencia: Este mtodo se basa en el empleo de una corriente elctrica y

un buffer de transferencia para llevar las protenas desde el gel hacia la membrana. Para

ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o ctodo

al positivo o nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de

transferencia, gel, membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja. Este

montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y

se aplica una corriente elctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados

durante un tiempo dado. Las protenas del gel se desplazan hacia el polo positivo y

quedan atrapadas en la membrana.

Tras la transferencia, la membrana se colorea de forma reversible con Rojo Ponceau.

El uso de marcadores de PM pre teidos permite tambin verificar la transferencia sin

necesidad de tincin extra.

- Bloqueo:

En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin proteca, tpicamente de

albmina de suero bovino (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA), leche en polvo o

casena, con una diminuta fraccin de detergente, como Tween 20 o Tritn X-100. Las

protenas en solucin se unirn a todos aquellos lugares de unin de la membrana que

no estn ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo slo

podr unirse a su antgeno especfico, reduciendo as el ruido de fondo y los falsos

positivos.

- Deteccin: Se emplea un anticuerpo especfico unido a una enzima que al catalizar

el sustrato genere una reaccin colorimtrica. De esta forma, se pone de manifiesto la

unin la protena de inters (antgeno), as como su localizacin. En el caso de emplear

27

como enzima a la peroxidasa, se puede utilizar 4 Cl Naftol junto con el sustrato de la

enzima que es el agua oxigenada o perxido de hidrgeno, generando as un precipitado

de color violceo insoluble.

En algunos casos, no se disponen de dichos anticuerpos conjugados para la protena

de inters y se requiere entonces del empleo de dos anticuerpos. Un primer anticuerpo,

o anticuerpo primario, que es especfico para la protena y luego se realiza otra

incubacin con el anticuerpo secundario conjugado a la enzima. Por ejemplo, un

anticuerpo secundario "anti-ratn" es aquel capaz de reconocer anticuerpos obtenidos

de ratones. Del mismo modo se pueden generar anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo",

etc.

Otro mtodo ms sofisticado y sensible consiste en usar un sustrato que al ser

catalizado por la enzima d una reaccin quimioluminiscente. Las enzimas

anteriormente nombradas pueden ser usadas. En el caso de la peroxidasa, cataliza la

oxidacin del luminol en presencia de perxido de hidrgeno. La fosfatasa alcalina

cataliza la defosforilacin del adamantil-1-2-dioxetano fosfato, reaccin que genera luz.

Si se coloca una pelcula fotogrfica sobre la membrana, la exposicin a la luz que se

desprende en la reaccin permite detectar la actividad enzimtica, y por ende al

antgeno buscado.

El sistema avidina/estreptavidina es otra opcin de revelado. Consiste en emplear

un anticuerpo primario unido covalentemente a molculas de biotina. Despus la

deteccin se llevar a cabo con una protena de unin a la misma, como la

estreptavidina o la avidina, la que se ha conjugado, por ejemplo, con una enzima.

28

CUESTIONARIO DE ORIENTACIN

1) Qu tipo de uniones participan en la interaccin entre Ags y Acs?

2) Defina y ejemplifique los conceptos de especificidad, afinidad y avidez.

3) Un Ac monoclonal, es siempre monoespecfico? Concepto de

monoespecificidad. Cmo se obtienen los sueros monoespecficos?

4) Qu es el fenmeno de prozona y cules pueden ser las causas que lo

expliquen?

5) Qu es la hemoaglutinacin pasiva o indirecta?

6) Qu es la isosensibilizacin por Rh? Cmo puede producirse? Fundamento de la

reaccin de Coombs o anti-gammaglobulina directa e indirecta. Describa los

distintos tipos de reacciones de Coombs que pueden realizarse y cmo se

obtienen experimentalmente los antisueros utilizados en cada una de ellas.

7) Cules son las diferencias y semejanzas entre aglutinacin y precipitacin?

Tienen igual sensibilidad?

8) Cules son las leyes fsicas que rigen la difusin de las macromolculas? Cules

son los factores que influyen en la aparicin de las bandas de precipitacin?

9) Compare reacciones de interaccin secundaria y primaria analizando:

sensibilidad, visualizacin de la reaccin y equipos necesarios. En qu casos

utilizara una tcnica de interaccin primaria?

10) Detalle la metodologa general para un ELISA puntualizando las etapas de la

reaccin y todos los reactivos necesarios.

29

11) Detalle las diferentes estrategias que pueden aplicarse a la tcnica de ELISA. En

qu casos se utilizan cada una de ellas? Qu caractersticas debe tener el Ac

marcado a usar en cada caso? (monoclonales, policlonales y/o monoespecficos).

12) Desarrollo de cada uno de los pasos del WB. Cmo se verifica la correcta

transferencia de las macromolculas? Ventajas y desventajas de usar un Ac

primario monoclonal y otro policlonal en un WB.

13) Enumere los componentes de cada buffer a emplear y discuta el porqu de su

inclusin.

14) Cmo se determinan los pesos moleculares de las protenas por SDS-PAGE?

15) Cul de estas tcnicas se realiza a voltaje constante y cul a amperaje constante?

16) Considera Ud. que la ubicacin de la membrana respecto de los polos de la cuba

es importante? Justifique.

17) Qu se debe tener en cuenta para determinar el tiempo de transferencia?

18) Qu conclusiones puede sacar frente a un resultado negativo para una protena

cuando revela un WB con 4 Cl Naftol, y la visualizacin de esta misma protena

con quimioluminiscencia?

30

PROBLEMAS

1) Un inmungeno (I) da origen a un suero policlonal. Dicho suero policlonal fue

enfrentado con los Ags esquematizados a continuacin

(Considere que los epitopes esquematizados como circular y oval son, aunque no

iguales, muy similares estructuralmente)

1.a.- Indique:

a) Con qu Ags podra dar una reaccin cruzada el suero policlonal?

b) Con cules slo podra obtener una interaccin primaria?

c) Con cules podra obtenerse una interaccin secundaria?

1.b.- Cmo hara para que el suero policlonal obtenido con el Ag I se comporte

como monoespecfico?

2) Siguiendo el plan adecuado se inmuniz una cabra con Salmonella typhi con el

fin de obtener Acs para comercializar. a) Cmo demuestra (in vitro) la presencia

de Acs anti-Salmonella en el suero de la cabra? b) Si el tcnico del laboratorio

realiza el ensayo con el suero sin diluir e informa un resultado negativo, porque

tanto el control negativo como el positivo dieron el resultado esperado, Usted

est de acuerdo con este informe?

3) Se desea comercializar un kit que ser empleado para determinar el nivel de Ac

anti-Toxoplasma gondii en el suero de individuos posiblemente infectados. El kit

diagnstico est constituido por glbulos rojos humanos grupo B factor Rh-

marcados con protenas purificadas del parsito: a) Qu indicaciones deberan

figurar en el prospecto del kit acerca del procesamiento de los sueros de

individuos que fueran del grupo 0 A? b) Esquematice cmo indicara que se

debe realizar la reaccin precisando cules son los controles necesarios.

31

4) Ud es empleado de un laboratorio que est encargado de producir un lote de

placas de IDR para dosar IgG en el suero de los tigres. a) Indique cul sera el

inmungeno que empleara para inmunizar un lote de cabras y porqu. b)

Cmo evaluara que ese suero reconoce slo a la IgG de tigre y no a otras

protenas del suero?

5) En un laboratorio que se dedica a la produccin de vacunas se est cultivando

Clostridium tetani con el fin de obtener la toxina tetnica que posee un PM: 150

kDa. Cmo demuestra la pureza de dicho Ag? Indique los reactivos necesarios

para efectuar su estudio y el esquema del resultado esperado.

6) El empleo de inmunoterpicos puede ocasionar, como efecto adverso, la

produccin de Acs especficos que limitan su eficacia. Considerando que se

administra un inmunoterpico proteico X Por cul de los mtodos que Ud.

conoce determinara si un individuo tratado con X gener Acs especficos?

Podra determinar el isotipo de estos Acs?

7) En su laboratorio Ud. ha obtenido un Ac monoclonal contra la lumazina sintetasa

de Brucella spp. Se sospecha que pertenece a la subclase IgG2a Cmo

comprobara dicha sospecha?

8) Se desea investigar si existi activacin linfocitaria en ratones inmunizados con el

antgeno CSP de Plasmodium falciparum (agente etiolgico de la malaria). Para

ello se decidi investigar el nivel de IL-2 en el suero de los animales. Disee un

EIA para tal fin.

9) Ud. trabaja en un laboratorio donde se produce el AcMo anti CD25 (cadena

del Rc de IL-2). Luego de la obtencin y purificacin, dicho Ac se somete al

control de calidad donde se busca evidenciar si mantiene su capacidad de Ac.

Sabiendo que la tcnica inmunolgica empleada para esto es el ELISA, explique

cmo cree Ud. que se lleva a cabo mencionando los reactivos y controles

necesarios.

32

10) Se ha purificado una protena y al analizar dicho producto por electroforesis en

geles de poliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes y sin reductor se

obtuvieron los siguientes resultados:

Si usted dispone de un antisuero especfico para la protena, cmo identificara a

partir de la separacin por SDS-PAGE cul es el componente de su inters.

11) Se ha desarrollado un Ac monoclonal murino anti dicha protena. El Ac

monoclonal obtenido presenta buena afinidad y buen ttulo por ELISA. Cuando se

lleva a cabo el WB con dicho monoclonal para detectar la presencia de la

protena, la reaccin no se verifica, a qu puede deberse?

12) Los parsitos A y B presentan una alta homologa estructural. Sin embargo, la

glicoprotena de 75 kD de la superficie de un parsito A genera, en el suero de los

pacientes infectados, altos ttulos de Acs que son especficos de la infeccin con

A. Para su empresa es de inters obtener esos Acs para transformarlos en

reactivo comercial, por lo tanto:

a-Cmo investigara la presencia de Acs contra esa gliocprotena en el suero de

pacientes infectados? Indique la preparacin de la muestra y el diagrama de la

reaccin. b-Podra discriminar si los Acs presentes corresponden al isotipo IgG

o IgM?

33

TRABAJO PRCTICO N 1 TCNICAS DE INTERACCIN SECUNDARIA

Objetivo: realizacin de tcnicas de interaccin secundaria cualitativas,

semicuantitativas y cuantitativas.

Tcnicas: Precipitacin en medio gelosado, Aglutinacin directa, Aglutinacin reversa y

Aglutinacin indirecta o pasiva.

1) Aglutinacin indirecta: Control de calidad de un kit de Hemaglutinacin

indirecta en microplaca para deteccin de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi.

Validacin de la estabilidad en el tiempo del mismo kit

Objetivo

Titular semicuantitativamente un control positivo con Acs anti-Trypanosoma

cruzi en kit con y sin tratamiento trmico (15 dias a 37C).

Obs: el criterio de aceptacin ser de un ttulo del control positivo de 32 (+/ 1

dil.) para los kits con o sin tratamiento trmico.

Reactivos y materiales

- GR de carnero sensibilizado con Ags citoplasmticos de Trypanosoma cruzi.

- GR de carnero sin sensibilizar.

- Diluyente.

- Muestra control positivo.

- Muestra control negativo.

- Microplaca de 96 pocillos.

- Pipetas automticas.

Protocolo:

Hay identificados kits con y sin tratamiento trmico.

34

Homogenizar bien cada dilucin antes de pasar los 20 l al pocillo siguiente. Una vez

finalizado cubrir la placa e incubar a 37 C durante 2 horas.

2) Aglutinacin directa: Reaccin de Hemaglutinacin directa en microplaca

Objetivo

Valorar semicuantitativamente los anticuerpos anti-Rh en una formulacin

comercial.


- GR factor Rh (+) humanos.

- Anticuerpos a valorar.

- Diluyente.

- Pipetas automticas

- Microplaca de 96 pocillos.

Protocolo:

Muestras ControlesPocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Suero Referencia 20 ul 20ul

dil 1/4Diluyente 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul

Control 20 ul Positivo Control 20 ul

Negativo GR

Sensibiliz . 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul

GR sin Sensibiliz. 20 ul

Muestras ControlesPocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Suero Referencia 20 ul 20ul

dil 1/4Diluyente 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul

Control 20 ul Positivo Control 20 ul

Negativo GR

Sensibiliz . 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul

GR sin Sensibiliz. 20 ul

Control +

35

Homogenizar bien cada dilucin antes de pasar los 20 l al pocillo siguiente. Una vez

finalizado cubrir la placa e incubar a 37 C durante 2 horas.

3) Aglutinacin directa: Tipificacin de grupo sanguneo.

Objetivo

Tipificar el grupo sanguneo de diversas muestras de sangre humana.


- GR humanos para tipificar

- Anticuerpos anti Rh (anti D), anti A y anti B

- Portaobjetos

- Pipetas automticas.

Protocolo:

1- Limpiar los porta objetos con alcohol 70 % y dejar secar.

2- Colocar una gota de sangre entera.

3- Colocar una gota de anti-suero. (no contaminar la punta del vial)

4- Rotar suavemente el portaobjeto.

5- Observar.

Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo Pocillo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Suero a 20 ul

valorar Diluyente 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul

GR Rh + 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul

Muestra C

Sangre entera+

Suero anti-A

Sangre entera+

Suero anti-B

Sangre entera+

Suero anti-D

36

4) Aglutinacin reversa: Reaccin de aglutinacin indirecta reversa para el

diagnstico de embarazo.

Objetivo

Determinar la presencia de gonadotropina corinica humana (hCG) en orina.

Reactivos y materiales:

-Muestra de orina.

-Partculas de ltex sensibilizadas con anticuerpos monoclonales anti hCG.

-Control positivo y negativo.

-Placa de vidrio.

-Gotero descartable.

Protocolo:

1- Limpiar la placa de vidrio con alcohol 70 % y dejar secar.

2- Colocar en cada sector de la placa una gota de muestra o control.

3- Colocar una gota del reactivo de partculas de ltex sensibilizadas sobre cada

gota de muestra o control (agitar el frasco)

4- Homogenizar la suspensin con un tip por muestra (no contaminar).

5- Rotar suavemente la placa.

6- Observar.

5) Precipitacin en medio gelosado: Tcnica de Inmunodifusin radial (IDR).

Objetivo

Cuantificar antgenos en muestras complejas.

Reactivos y materiales:

- Suero humano.

- Placas para IDR comerciales.

37

Protocolo:

1- Se siembra 5 l de muestra a valorar en el pocillo del agar.

2- Se deja difundir 24 hs a 4 C. Las placas deben quedar invertidas.

3- Se mide el dimetro del halo obtenido y se interpola en el cuadro de

calibracin.

38

TRABAJO PRCTICO N2 TCNICAS DE DE INTERACCIN PRIMARIA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

Objetivo:

Evaluar la presencia de Acs especficos contra toxoide tetnico en sueros humanos.

Determinar el ttulo de los sueros por dilucin a punto final.

Materiales y Reactivos:

PBS: buffer fosfato 0.01 M pH: 7.4 NaCl 0.15 M Diluyente: PBSTL, PBS con el agregado de 0.05% Tween y 3% leche descremada Solucin de lavado: PBST Conjugado: anti-gamaglobulina humana conjugada a peroxidasa Sustrato/cromgeno: H2O2 0.03% / OPD (ortofenilendiamina) 0.5 mg/ml en buffer

fosfato citrato pH:5

H2SO4 4 N Suero 1 y 2 Toxoide tetnico Placas de ELISA previamente sensibilizadas con toxoide tetnico (10 g/ml en PBS) y

bloqueadas con PBS-leche descremada 3%.

Procedimiento

1. Lavar la placa previamente sensibilizada con el toxoide tetnico y bloqueada con

PBST (3 lavados).

2. Colocar las diluciones seriadas de los sueros 1 y 2 en los pocillos

correspondientes:

a. Filas A B, partiendo del pocillo 3, diluciones seriadas del Suero 1 como

lo indique el docente auxiliar

b. Filas C D, partiendo del pocillo 3, diluciones seriadas del Suero 2 como

lo indique el docente auxiliar

c. Pocillos A1-2, B1-2, C1-2 y D1-2 reservados para blancos de reaccin.

39

3. Incubar 45 min a 37C (en estufa), cubrir bien con papel de aluminio. Cumplida la

incubacin, se descarta el contenido de los pocillos volcando enrgicamente la

placa y escurriendo sobre papel absorbente.

4. Lavar las placas con PBST (4 lavados).

5. Agregado del conjugado: Se utilizar una dilucin del conjugado que ha sido

previamente determinada como ptima. Agregar 100 l/pocillo.

6. Incubar 45 min a 37C (en estufa), cubrir bien con papel de aluminio. Cumplida la

incubacin, se descarta el contenido de los pocillos volcando enrgicamente la

placa y escurriendo sobre papel absorbente.

7. Lavar las placas con PBST (4 lavados).

8. Agregado del sustrato/cromgeno: Preparar la solucin en el momento de usar:

2 ml de solucin de OPD (2,5 mg/ml) + 8 ml de buffer citrato fosfato + 10 l de

H2O2 30% (mantenerla en oscuridad!). Agregar 100 l/pocillo lo ms rpido

posible para evitar el desarrollo de color inespecfico.

9. Incubar en oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min.

10. Frenar la reaccin por el agregado de 100 l/pocillo de H2SO4 4 N.

11. Determinar el ttulo de cada suero como la inversa de la dilucin que brinde una

DO igual al 50 % de la seal (DO) mxima.

40

TRABAJO PRCTICO N 3 TCNICAS DE INTERACCIN PRIMARIA

INMUNOBLOTTING O WESTERN BLOTTING

Objetivos:

Evaluar la presencia de Acs especficos contra toxoide tetnico en sueros humanos.

Comparar esta metodologa con la otra tcnica de interaccin primaria desarrollada

en el Trabajo Prctico N 3 (ELISA).

Materiales:

- Toxoide tetnico

- Soluciones de Acrilamida-Poliacrilamida

- TEMED y Persulfato de Amonio

- Coomassie Blue

- Membrana de nitrocelulosa

- Suero humanos a evaluar

- Anti globulinas humana conjugado con peroxidasa.

- 4Cl Naftol

- Buffer de corrida y transferencia

- Equipo para ensamblaje de geles

- Cubas

- Fuente de poder

- H2O2

Procedimiento 1- Partiendo de membranas ya transferidas, bloqueadas, incubar con los sueros 1 y

2, por 45 min.

2- Lavar 3 veces con agitacin suave con TBS-Tween.

3- Incubar con el conjugado diluido en TBS- bloqueante segn lo indique el

ayudante.

4- Lavar 3 veces con agitacin suave con TBS-Tween.

5- Revelar con 4 Cl Naftol/H2O2.

6- Comparar con lo observado en el gel de poliacrilamida provisto por el docente

auxiliar.

41

PLANES DE INMUNIZACIN y ANTICUERPOS MONOCLONALES. SUEROS Y VACUNAS

TEMARIO

- Planes de Inmunizacin

- Sueros y Vacunas: generalidades. Diferentes tipos y clasificaciones. Ejemplos.

- Inmunizacin en animales de experimentacin para obtencin de sueros policlonales

- Anticuerpos monoclonales

Obtencin

Produccin

Aplicaciones

Ac quimricos / humanizados / humanos

PLANES DE INMUNIZACIN

Desde las primeras experiencias realizadas por Edward Jenner, en el ao 1776, sobre

la utilizacin de un virus similar al de la viruela humana como inmungeno para conferir

inmunidad a personas sanas frente a las cepas virulentas, hasta los actuales planes de

vacunacin, se puede pensar que el avance obtenido ha sido lo suficientemente amplio

como para lograr una respuesta inmune especifica y protectiva frente a cualquier

patgeno. Sin embargo esto no es as, e inclusive en el siglo XXI se sigue investigando y

desarrollando planes mejorados para vacunar a la poblacin mundial. Los nuevos

desarrollos comprenden desde los antgenos utilizados, los adyuvantes y efectos

sinrgicos por combinaciones de vacunas. Como ejemplo del desafo que an representa

este campo se puede citar el desarrollo de la vacuna contra la inmunodeficiencia

adquirida (SIDA), o el desarrollo de vacunas efectivas en patologas como la malaria. Por

otro lado, aunque parezca un contrasentido, el desarrollo de nuevas vacunas debe

enfrentar rigurosas fases de desarrollo y cumplimiento de legislacin que hacen su

avance muy restrictivo. Adems, el componente econmico para el desarrollo de

algunas vacunas no despierta el inters de compaas farmacuticas.

La inmunoterapia comprende la inmunizacin activa (vacunacin), que puede ser

profilctica o de tratamiento, y la pasiva (seroterapia).

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Vacunacin

Algunos de los factores a tener en cuenta para el desarrollo de una vacuna son:

1- Inmungeno

En el caso de las toxinas como la tetnica o diftrica encontramos el desafo de

presentar al sistema inmune un Ag que debe ser similar en su conformacin al nativo y a

su vez no presentar ningn grado de toxicidad. As se desarrollaron los toxoides, toxinas

que han sido modificadas de tal forma que sin ser txicas mantienen similitud antignica

tal que permite desarrollar Acs que reconozcan y bloqueen a la toxina nativa. En el caso

de ser microorganismos como bacterias, las mismas pueden estar inactivadas

(microorganismo muerto) o atenuadas, es decir microorganismos que mantienen su

capacidad infectiva, pero que no son capaces de generar enfermedad. En el caso de los

virus, actualmente se usan protenas virales obtenidas por ingeniera gentica (vacuna

hepatitis B) como tambin virus atenuados por tcnicas de pasajes sucesivos en

distintos organismos (Ej. papiloma humano y el virus causante de la poliomielitis).

2- Vas de administracin

Existen diferentes vas de administracin y en parte, stas determinarn la

calidad de la RI generada. Podemos citar la vacuna anti-Polio oral (Sabn) frente a la de

va intramuscular (Salk). En el caso de la Sabn, la administracin oral emula la va

natural de infeccin llevando a la generacin preferencial de Acs del isotipo IgA y muy

buena inmunidad de mucosas. La vacuna Salk, al ser intramuscular genera una muy

buena proteccin para el individuo vacunado a expensas del isotipo IgG, pero no brinda

buena inmunidad de mucosas. Esto hace que la vacuna Sabn sea ms efectiva.

La utilizacin de va intramuscular y subcutnea est muy difundida en vacunas

con agentes muertos o proteicos que son aplicadas cerca de sistemas de ganglios

linfticos.

3- Adyuvantes

Los adyuvantes son sustancias capaces de exaltar y/o modular la RI generada por

el inmungeno que se aplican junto con la formulacin vacunal. En el caso de las

vacunas utilizadas en el humano hasta el momento, la FDA slo aprueba el uso de geles

de hidrxido de aluminio y fosfato de aluminio. En el caso de inmunizacin en animales

de experimentacin se utilizan los adyuvantes de Freund (completo e incompleto), que

originan una gran exacerbacin de la respuesta celular y humoral, pero dado que

43

tambin produce una importante necrosis en el sitio de aplicacin en forma de

granuloma, no es posible su uso en humanos.

4- Edad del individuo

La edad de vacunacin depende de cada vacuna en particular y se relaciona con

la madurez del sistema inmune y su capacidad para responder frente al estmulo.

5- Nmero de aplicaciones

El nmero de aplicaciones puede variar segn el inmungeno y la caracterstica

de la poblacin a la que se va a vacunar. Esto surge de estudios estadsticos donde se

comprueba el grado de proteccin alcanzada. Es de importancia sanitaria y econmica el

poder definir exactamente el nmero de repeticiones que se debe aplicar en cada caso.

Normalmente, se observa que la vacuna no es efectiva en el 100% de la

poblacin vacunada. Existe un fenmeno denominado inmunidad de masas o barrera

sanitaria, que permite la proteccin de los individuos no protegidos dado que la

vacunacin efectiva en el resto de la poblacin, impide la diseminacin del patgeno.

Seroterapia

Se usa este mtodo, tambin denominada inmunizacin pasiva cuando se

necesita neutralizar al patgeno o toxinas liberadas por el mismo inmediatamente. Hay

en el mercado sueros homlogos, es decir provenientes de la misma especie a la cul va

a ser administrado, como el suero antitetnico para humanos que proviene de

hemoderivados, y sueros heterlogos, es decir aplicados en individuos de una especie

diferente a la que le dio origen. Como ejemplo podemos mencionar los sueros anti-

ofdicos, obtenidos en caballos y usados en humanos. El uso de los sueros heterlogos

tiene la complicacin de que ellos mismos se comportan como antgenos que van a

desarrollar en el individuo posibles complicaciones, las mismas pueden ir desde

reacciones leves a reacciones anafilcticas.

Inmunizacin de animales de experimentacin

En general las mismas estrategias usadas en los planes de vacunacin humana

son empleadas en animales de experimentacin, aunque en el caso de los animales los

ttulos buscados sean muy superiores a los buscados en una seroconversin.

44

La edad del animal deber ser tal que su sistema inmune est lo suficientemente

maduro. La eleccin de la especie, dentro de las comnmente utilizadas en bioterios,

deber ser aquella en la cual el inmungeno se presente en una escala gentica ms

diferenciada de la que proviene la sntesis del inmungeno a usar. Adems hay que

tener en cuenta el tipo de antgeno utilizado, dado que si es un polisacrido o una

protena, se esperarn diferentes tipos de respuesta humoral y de memoria

inmunolgica para ese antgeno.

Con respecto a la dosis de inmungeno, sta puede variar e influir en la calidad

de los anticuerpos producidos. En general, en el caso de protenas, depende de la

especie a inmunizar abarcando un amplio rango en el orden de los microgramos a

miligramos por dosis aplicada.

En lo que respecta a los adyuvantes usados, es comn el uso de adyuvante de

Freund completo en la primera dosis, y el adyuvante de Freund incompleto en las

siguientes, para garantizar una mejor respuesta inmune.

Las vas de aplicacin ms usadas son, generalmente, intramusculares y

subcutneas, buscado sitios cercanos a ganglios linfticos como la lnea lateral de la

columna vertebral o los glteos.

El nmero de aplicaciones vara segn el antgeno usado y el animal en

particular, pueden encontrarse grupos de animales endocriados y que presenten una

respuesta inmune diferente. Por lo que sangras exploratrices para el monitoreo del

desarrollo y seguimiento de la respuesta inmune deben ser utilizadas.

En el caso especfico de inmunizacin de ratones para la produccin de

anticuerpos monoclonales, si bien tampoco hay un protocolo nico por todo lo

expuesto, se puede proponer una primera inoculacin con 0.1 mg de antgeno con

adyuvante de Freund completo, un descanso de 4 semanas, luego 2 o 3

reestimulaciones peridicas monitoreando el nivel de anticuerpos especficos y una

ltima estimulacin 3 das antes de la fusin.

En el caso de poseer muy bajas cantidades de inmungeno, se puede recurrir a la

inoculacin intraesplnica con buenos resultados.

ANTICUERPOS MONOCLONALES

45

La respuesta inmune humoral normal frente a un antgeno se establece a partir de

linfocitos B (LB) activados y es policlonal, por lo tanto frente a una inmunizacin se

sintetizarn anticuerpos, provenientes de diferentes clones de LB que van a reconocer

diferentes epitopes del antgeno y la respuesta a cada uno de ellos depender del grado

de antigenicidad de los mismos. Cada clon de LB sintetizar Acs con la misma

especificidad y caractersticas, es decir una poblacin homognea de Acs. Como la

respuesta inmune es la resultante de la activacin de muchos clones, tendremos una

mezcla de muchas poblaciones, resultando as en una poblacin general de Acs

heterognea.

Durante muchos aos se busc obtener una lnea de cultivo celular in vitro permanente

de LB productores de anticuerpos con especificidad y afinidad conocida para un

determinado antgeno, pero dada la baja sobrevida de los LB en medios de cultivo, esto

no se poda lograr. Recin en 1975 los investigadores Kohler (Alemn) y Milstein

(Argentino) trabajando en la Universidad de Cambridge, lograron este objetivo por

medio de una ingeniosa fusin de LB productores de Acs, y una lnea de clulas de

mieloma (cancerosas) que le conferan inmortalidad a los mismos. Sin embargo, este

hallazgo no lleg a ser bien ponderado en todo su potencial y tal fue as, que la tcnica

original no fue patentada en su momento ni por los investigadores ni por la Universidad.

En 1984 este logro signific para estos investigadores el premio Nobel de Medicina. Los

anticuerpos as obtenidos, que derivan de un solo clon celular de LB y que posee

capacidad de replicacin permanente in vitro, fueron denominados anticuerpos

monoclonales (AcMo).

Los AcMo han permitido un avance cualitativo y cuantitativo en diferentes reas tanto

de la ciencia como de la industria y, si bien, las metodologas actuales de obtencin y

produccin de AcMo han sufrido modificaciones de la original, la estrategia bsica en la

produccin de los AcMo se ha mantenido.

Los pasos bsicos para la obtencin de los AcMo se pueden resumir en los siguientes:

1) El primer paso comprende la inmunizacin de un animal con el antgeno deseado. La

utilizacin de diferentes planes de inmunizacin puede variar segn el antgeno. Pero

una vez finalizada la inmunizacin se espera que el animal posea suficientes LB

activados productores de anticuerpos especficos para el antgeno utlizado. Se sacrifica

46

al animal y se extrae el bazo en condiciones de esterilidad, luego se obtienen los

esplenocitos recolectndolos rpidamente en un medio de cultivo nutritivo.

2) La fusin entre los esplenocitos y las clulas de mieloma se realiza generalmente por

el uso de polietilenglicol (PEG), no se conoce bien el mecanismo mediante el cual acta,

pero es sabido que el PEG permite la fusin entre membranas celulares produciendo de

esta manera hbridos por combinacin de diferentes clulas. Este proceso es aleatorio y

produce fusiones entre las distintas clulas presentes en el medio, pero solo la fusin

entre los plasmocitos y las clulas de mieloma pueden formar los hbridos viables para

las condiciones de trabajo, el resto son generalmente lneas abortivas

3) La seleccin post-fusional de los hibridomas se realiza fcilmente dado que las clulas

de mieloma utilizadas son defectivas en la enzima hipoxantil-guanil-fosforribosil-

transferasa (HGPRT) la cual permite la sntesis de nucletidos a travs de la va de

reciclaje o salvataje, la cual utiliza como sustrato hipoxantina y timidina. Esta va se

activa especialmente cuando la va sntesis de novo de nucletidos, a travs de la va de

las xantinas, est bloqueada por antagonistas del cido flico como es la aminopterina.

Por este motivo los hbridos son colocados en un medio selectivo denominado HAT

enriquecido en hipoxantinas y timidina adems del agregado de aminopterina como

bloqueante. Por esto, las clulas mieloides deficitarias en HGPRT mueren. Por otro lado,

los esplenocitos no poseen viabilidad prolongada, pero los hbridos de ambos que

combinaron la viabilidad de las clulas de mieloma in vitro y la capacidad de sobrevida

en ese medio que le confiere la presencia de la HGPRTasa de los linfocitos B, les permite

proliferar.

4) El cultivo de los hibridomas se realiza en medios nutritivos de diverso origen como ser

suero fetal bovino o medios ya utilizados en crecimiento de linfocitos aprovechando

factores estimulatorios secretados por macrfagos y otras clulas. Normalmente luego

de 2 3 das se ha incrementado en 100 veces la concentracin de hbridos en esos

medios de cultivo.

5) Deteccin por medio de tcnicas de interaccin primaria tipo ELISA de la presencia de

AcMo de inters en el sobrenadante de cultivo celular. Se seleccionan los hbridos que

tengan crecimiento y produccin de AcMo especficos para el antgeno.

6) El aislamiento de cada clon individual se puede realizar por tcnicas de dilucin lmite

en medio lquido o por aislamiento en agar blando, tcnica similar a la utilizada para el

47

aislamiento de bacterias. Una vez aislado, para asegurarnos su monoclonalidad se

vuelve a realizar el aislamiento. Se suele llamar a este paso reclonado.

7) Una vez aislados los hibridomas se seleccionan por tcnicas de interaccin primaria,

aquellos que secretan los AcMo de mejor calidad, la cual estar dada bsicamente por

su especificidad para el antgeno original y por una constante de afinidad alta.

8) La produccin en escala de los AcMo se pude realizar por expansin de los hibridomas

en reactores fermentadores (sistema industrial) o utilizando la capacidad tumoral del

hibridoma y su implantacin en animales husped con la produccin de lquido asctico

el cual presenta concentraciones en el orden de mg/ml de AcMo.

9) La purificacin de los AcMo de los medios donde se produjeron pueden variar desde

precipitacin en sulfato de amonio, cromatoenfocado o cromatografa de afinidad,

entre otros, pero la eleccin del mtodo de purificacin depender del grado de pureza

necesario de los AcMo para sus aplicaciones posteriores.

Normalmente en los pasos 5,6 y 7 se congelan en nitrgeno lquido parte de los

hibridomas producidos como banco de reserva.

Ventajas frente a los sueros policlonales

1) Produccin ilimitada de anticuerpos a escala piloto o industrial.

2) Fcil conservacin de los hibridomas en nitrgeno lquido.

3) Buena estabilidad de los AcMo en congeladores.

4) Pureza para su posible conjugacin con otras protenas o frmacos.

5) No es necesario contar con antgeno puro para nuevas obtenciones.

Desventajas

1) Los costos de produccin los hacen caros y restrictivos.

2) El tiempo necesario para su obtencin. Si bien es variable, puede tomar desde 6

meses hasta aos.

3) No son utilizables en terapias prolongadas en humanos debido al origen murino.

Aplicaciones

Son innumerables los campos de aplicacin de los AcMo, tanto en investigacin como

en la aplicacin en biosensores, como catalizadores entre otros. En la clnica, son usados

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como herramienta de diagnstico dada su altsima sensibilidad y especificidad. As, han

llevado los lmites de la deteccin de protenas al orden de fentomoles y an menos. En

el caso de estudios celulares han permitido la identificacin y aislamiento de sub-clases

de clulas, hasta no mucho tiempo atrs, desconocidas.

Con referencia a las aplicaciones teraputicas de los AcMo en enfermedades

autoinmunes, cncer y en trasplantes de rganos apareci una idea revolucionaria que

se denomin bala mgica que consiste en tener un Ac especifico contra una

determinada clula o tejido maligno. El Ac podra transportar un posible frmaco y

llevarlo especficamente al blanco sin afectar al resto de los tejidos sanos. Esta

aplicacin pareci abrir una ventana revolucionaria en la inmuno-farmacologa y si bien

la idea ya ha sido aplicada, han surgido problemas metodolgicos y prcticos que han

llevado a que los AcMo puedan ser aplicados en pocos tratamientos teraputicos.

De algunos desarrollos destacados de este concepto podemos mencionar los siguientes:

1) Utilizacin de las regiones Fab o Fv del AcMo en ausencia de la regin Fc. Por su

menor tamao es de esperar que las reacciones de tipo anafilcticas disminuyan. Por su

inestabilidad estructural se los ha fusionado a otras protenas a fin de estabilizarlos y de

poder tenerlos en forma multivalente. Esto presenta como desventaja que los Fv poseen

un mayor ndice de clearance en tejido blanco y una mayor inestabilidad que los Fab,

pero por otro lado poseen una menor inmunogenicidad. En ambos casos por la falta de

la regin Fc se pierden la capacidad biolgica de activacin de complemento, de

opsonizacin, de mediar reacciones de ADCC, las cuales son importantes en cuanto se

busca eliminar la clula blanco ms que bloquear una funcin. Las aplicaciones van

desde detoxificacin, direccionamiento de toxinas, drogas o radio nucleidos a clulas

tumorales.

2) Acs quimricos: son AcMo que mantienen la regin variable murina fusionada con

regiones constante humana. Se obtienen por ingeniera gentica, poseen una mayor

afinidad que los anteriores, mayor vida media y mantienen la actividad biolgica por la

presencia del Fc. La inmunogenicidad disminuye pero no desaparece. Actualmente la

mayora de los AcMo en uso teraputico son de este tipo.

3) Acs humanizados: Con el fin de aumentar la homologa con los Ac humanos se

sintetizan Acs que solo poseen porciones de la regin variable murina (que le permite

conservar la afinidad por el antgeno) fusionada con cadenas humanas. Se obtienen con

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el uso de ratones transgnicos. Deberan poseer menor inmunogenicidad aunque la

misma se puede dar incluso con las regiones humanas que poseen.

4) Acs humanos: los mismos no poseen ninguna secuencia procedente de otro animal.

Se obtiene de dadores humanos inmunizados y posteriormente transformando los

linfocitos B por medio de RT-PCR, clonage y display en fagos. Tambin por ratones

transgnicos con genes para codificar inmunoglobulinas humanas, o por ratones

inmunodeficientes a los cuales se les trasplanta mdula sea humana. Estos anticuerpos

deberan poseer menor inmunogenicidad terica si se usasen las secuencias ms

conservadas del ADN de los anticuerpos humanos.

Algunos usos y aplicaciones

En la actualidad se encuentran una docena de AcMos en uso con aplicaciones

teraputicas in vivo. Los mecanismo efectores pueden ir desde el bloqueo de receptores

de clulas diana a la accin citotxica por el transporte de drogas, radio nucleidos o

toxinas a las mismas.

1- Tratamiento en cncer. En el caso de tumores mamarios que posean un estado

metastsico avanzado se est utilizando un AcMo llamado Trastuzumab (Herceptin ), el

cual es capaz de bloquear el receptor HER2 de las clulas tumorales, cuyo ligando es el

Factor de Crecimiento Epidrmico (Epidermal Growth Factor, EGF). El inconveniente que

posee es que si bien este receptor es sobre expresado en un 20% por estas clulas

tumorales no se evita el ataque de tejido sano que tambin expresa, en menor medida,

este mismo receptor.

2- Trasplantes. Los AcMo murino Muromonab (OKT3) se utilizan en el tratamiento del

rechazo agudo, tiene especificidad por la cadena psilon de la molcula CD3. El

mecanismo de accin es por el bloqueo de la unin del TCR con el antgeno. Esto

produce la modulacin del complejo TCR/CD3 en la superficie del LT. De esta manera

solo los LT son eliminados por fijacin de complemento y opsonizacin, mantenindolos

por debajo de un 2%, siendo los valores normales de hasta un 60%. Estos AcMo

presentan algunos riesgos a tener en cuenta al momento de su uso, como la posible

aparicin de Acs neutralizantes que los haga intiles frente a un proceso de rechazo

agudo donde sea nuevamente necesaria la inmunosupresin. Tambin puede ocurrir

50

que el proceso de inmunosupresin severa quede de forma permanente y ser muy

riesgosa para el futuro del paciente.

Otro ejemplo es el uso del Ac Basiliximab (Simulect) en el trasplante de rin.

Este AcMo se une y bloquea al receptor de interleuquina 2 (IL-2R) en los LT. Tiene

especificidad por la cadena alfa del receptor (CD25) Esto no modifica la proporcin

normal de LT circulantes pero evita su activacin como sucede en el rechazo agudo.

Normalmente se utiliza junto con ciclosporina (frmaco inmunosupresor de base) el cual

tiene una accin sinrgica al bloquear la sntesis de IL-2.

3- Enfermedades autoinmunes. La perdida de tolerancia por parte del sistema inmune a

Ag propios, lleva a un ataque de clulas del sistema inmune contra estructuras o tejidos

del propio organismo. En el caso de artritis reumatoidea se ha utilizado Infliximab

(Remicade) el cual es un AcMo que tiene especificidad por el Factor de Necrosis

Tumoral (Tumor Necrosis Factor, TNF). Generalmente se administra conjuntamente con

metrotexato (droga de eleccin) y que acta reduciendo la expresin de molculas de

adhesin celular, tales como E-Selectina, molculas de adhesin intercelular (ICAM-1) y

molculas de adhesin vascular (MCP-1) entre otras. De esta ma

Guia de Inmunología Farmacia_2015

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