GENERACIÓN DE NANOBODIES COMO HERRAMIENTAS PARA...
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GENERACIÓN DE NANOBODIES
COMO HERRAMIENTAS PARA
BIOLOGÍA ESTRUCTURAL
Vanina Alzogaray
Inmunología y Microbiología Molecular
Fundación Instituto Leloir, IIBBA-CONICET
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Sistema inmunitario: formado por células y moléculas responsables de
la inmunidad.
Inmunidad: protección contra agentes externos ya sea de naturaleza
biológica (bacterias, virus) o físico-química (contaminantes o
radiaciones).
Inmunidad celular: Mediada por Linfocitos T.
Inmunidad humoral: mediada por Anticuerpos.
INTRODUCCIÓN
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Glicoproteínas del tipo gammaglobulina. Inmunoglobulinas (Ig).
Se distribuyen en los líquidos biológicos y mucosas. Ejemplo: sangre y
secreciones.
Producidos por linfocitos B y células plasmáticas en la médula ósea
y órganos linfáticos (bazo).
Se los puede encontrar de manera acoplada a la membrana
plasmática y en forma secretada.
Se unen específicamente y neutralizan agentes externos.
Existen distintos tipos. Todos comparten la misma estructura básica.
ANTICUERPOS
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Cadena pesada
Cadena liviana
PM IgG:150KDa
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Estructura tridimensional de IgG humana. En rojo y azul las cadenas pesadas, y en amarillo y verde las cadenas livianas
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HALLAZGO DE IgG DE CADENA PESADA EN CAMÉLIDOSS
in R
ed
ucto
r C
on
Red
uc
tor
1 y 3: IgG de cadena pesada
2: IgG convencional
Hamers-Casterman, et al, (1993) Naturally occurring
antibodies devoid of light chains. Nature.
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IgG PRESENTES EN CAMÉLIDOS
PM: 150KDa PM: 90KDa PM: 18KDa
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ESTRUCTURA DE LOS Nbs
FR: Framework o armazón
CDR: Región determinantes de la complementariedad
: Cisteínas
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Comparación de los dominios variables de las cadenas pesadas en Camélidos
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Fáciles de obtener de manera recombinante
Solubles
Estables (pH y temperatura)
CARACTERÍSTICAS
Crystal strurcture of camel single-domain in
complex with lysozyme. Desmyter A. et al. 1996.
Nature.
Fáciles de expresar a partir del espacio
periplasmático de E. coli y de purificar
CDR3 de larga longitud convirtiendo a
éstos fragmentos en buenos candidatos
para la inhibición de enzimas
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Characterization of folding-
sensitive nanobodies as tools to
study the expression and quality
of protein particle immunogens.
Alzogaray V, et al . J. Biotechnol.
2019.
Single-domain llama antibodies as
specific intracellular inhibitors of
SpvB, the actin ADP-ribosylating
toxin of Salmonella typhimurium.
Alzogaray V, et al. FASEB J. 2011.
Selection of Nanobodies that Block
the Enzymatic and Cytotoxic
Activities of the Binary Clostridium
Difficile Toxin CDT. Unger M, et al.
SCIENTIFIC REPORTS. 2015.
APLICACIONES
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Brian Kobilka, Robert Lefkowitz
2012 Chemistry Nobel Prize
Structure of a nanobody-stabilized active state of the β2 adrenoceptor. Søren G.
F. Rasmussen, Hee-Jung Choi, Juan Jose Fung, Els Pardon, Paola Casarosa,
Pil Seok Chae, Brian T. DeVree, Daniel M. Rosenbaum, Foon Sun Thian, Tong
Sun Kobilka, Andreas Schnapp, Ingo Konetzki, Roger K. Sunahara, Samuel H.
Gellman, Alexander Pautsch, Jan Steyaert, William I. Weis, and Brian K.
Kobilka. Nature. 2011.
UTILIZAR LOS Nbs COMO CHAPERONAS DE
CRISTALIZACIÓN: reconocen epitopes conformacionales
de las proteínas blanco en su estado nativo, rigidizándolas
y ocluyendo en muchos casos zonas hidrofóbicas
expuestas.
β adrenergic receptor-Nb
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INSTRUCT: Consorcio Europeo de Investigación en Biología Estructural.
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Generación de nanobodies para ser
utilizados como chaperonas de
cristalización para la investigación
estructural de proteínas complejas.
OBJETIVO
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Control de calidad del antígeno. Inmunización de llamas con proteínas en su estado conformacional nativo.
NIS (sodium/iodide symporter): esuna glicoproteína de membranaplasmática y tiene un papel crucial en lafisiología de la glándula tiroidea.
Nav 1.4 (Canal de sodio gatillado por voltaje):una glicoproteína de membrana plasmática y tiene unpapel crucial en enfermedades relacionadas conparálisis congénitas, miotonia, entre otras.
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I. ELISA: respuesta humoral
500
1500
4500
1350
0
4050
0
1215
00
3645
00
1093
500
0
1
2
3
4
NIS t=0
NIS t=35
Nav1.4 t=0
Nav1.4 t=35
1/dilución
Ab
so
rban
cia
(492 n
m)
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II. Construcción de bibliotecas de Nbs
Tamaño de la biblioteca: 2,14x108 clones
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III. Desarrollo de la tecnología de “display” en fagos: rondas de panning
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Crecemos cada clon de Nb
Antigen quality control
Nanobody purification
Biochemical and biophysical characterization of binders
Co-crystalization
Mediante ELISA evaluamos la
especificidad de cada Nb
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Clo
n 1
Clo
n 2
Clo
n 3
Clo
n 4
Clo
n 5
Clo
n 6
Clo
n 7
Clo
n 8
Clo
n 9
Clo
n 1
0
Clo
n 1
1
Clo
n 1
2
Clo
n 1
3
Clo
n 1
4
Clo
n 1
5
Clo
n 1
6
Clo
n 1
7
Clo
n 1
8
Clo
n 1
9
Clo
n 2
0
Clo
n 2
1
Clo
n 2
2
Clo
n 2
3
Clo
n 2
4
Clo
n 2
5
Clo
n 2
6
Clo
n 2
7
Clo
n 2
8
Clo
n 2
9
Clo
n 3
0
Clo
n 3
1
Clo
n 3
2
Clo
n 3
3
Clo
n 3
4
Clo
n 3
5
Clo
n 3
6
Clo
n 3
7
Clo
n 3
8
Clo
n 3
9
Clo
n 4
0
Clo
n 4
1
Clo
n 4
2
Clo
n 4
3
Ab
so
rba
nc
e 4
92
nm
Nav1.4 Control Negativo
Especificidad de cada Nb evaluada mediante ELISA
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FR1 FR2 FR4CDR2 FR3 CDR3CDR1
Secuencias de Nbs. Clasificación en familias
SDS-PAGE Níquel. 1: pico 1 de la corrida. 2: Nb
SDS-PAGE SD75. 1: Nb. M: marcador de peso
molecular. PM Nb: 18KDa
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IV. Ensayos de screening de cristalización
+
Actualmente contamos con 21 Nbs específicos contra los
antígenos en estudio. Todos son utilizados en ensayos de
screening de cristalización. Además, se está evaluando el uso
de los mismos en ensayos en células eucariotas.
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Resumen
Control de calidad exhaustivo de los blancos a estudiar
Respuesta inmunitaria alta contra los antígenos en estudio
Construcción de bibliotecas de elevado tamaño
Número elevado de screening de cristalización del complejo Nb-Ag
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Dres. Mario Amzel, Sandra Gabelli y Nancy Carrasco: Investigadores argentinos radicados
en el exterior, de sólida trayectoria y expertise en targets complejos
Dr. Sebastián Klinke. Plataforma Argentina de Biología Estructural y Metabolómica. PLABEM.
Dra. Soledad Labanda
Dr. Lisandro Otero
Dres. Daniela Albanesi y Diego de Mendoza. IBR, Rosario. Santa Fé
Inmunova S. A
PICT Raíces internacional
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Dr. Fernando Goldbaum. Laboratorio
de Inmunología y Microbiología
Molecular Fundación Instituto Leloir.
Centro de Resideño e Ingeniería de
Proteínas. UNSAM
Laboratorio 304. Fundación Instituto Leloir.
Muchas gracias!!!