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1Brucelosis bovina
Técnicos responsables: Andrés D. Gil* José M. Piaggio*
Equipo técnico del Proyecto: Andrés D. Gil, José Piaggio, Alejandra Suanes, Álvaro Nuñez,Alfredo Garín, Mariela Silva, Deborah Cesar, Beatriz di Pace,Gabriel Mautone, Ricardo Zaffaroni, Natalia Chans, Stella Maris Huertas
Colaboración de Referentes Internacionales: Mo Salman, Luis Samartino, David Dargatz
Técnicos que aportaron suexperiencia en trabajos de talleres: Francisco Muzio, Nora Negrín, Federico Fernández, Ricardo
Perez-Rama, Marcelo Rodríguez, Edgardo Vitale, LeopoldoAmorín, Oscar Caponi, Luis E. Chans, Nicolás Barg, NormanBenett, Eduardo Barre, Luis García, Luis Eduardo Días y RaúlOyenart
*DV, MS, Ph.D, Dirección General de los Servicios Ganaderos (DGSS-MGAP).** DMTV, MSA , Facultad de Veterinaria, UDELAR.
Proyecto FPTA-245 Evaluación de instrumentos devigilancia epidemiológica y desarrollo de herramientaspara la toma de decisiones en el control y erradicación
de la Brucelosis bovina
BRUCELOSIS BOVINA: EVALUACIÓN DE LAS PRUEBASDIAGNÓSTICAS PARA MUESTRAS COMPUESTAS DE
LECHE Y MODELOS EPIDEMIOLÓGICOS DE DIFUSIÓNDE LA ENFERMEDAD
2 Brucelosis bovina
Título: BRUCELOSIS BOVINA: EVALUACIÓN DE LAS PRUEBAS DIAGNÓSTICAS PARAMUESTRAS COMPUESTAS DE LECHE Y MODELOS EPIDEMIOLÓGICOS DE DIFU-SIÓN DE LA ENFERMEDAD
Técnicos responsables: Andrés D. Gil José M. Piaggio
Equipo técnico del Proyecto: Andrés D. Gil, José Piaggio, Alejandra Suanes, Álvaro Nuñez,Alfredo Garín, Mariela Silva, Deborah Cesar, Beatriz di Pace,Gabriel Mautone, Ricardo Zaffaroni, Natalia Chans, Stella MarisHuertas
Colaboración de Referentes Internacionales: Mo Salman, Luis Samartino, David Dargatz
Técnicos que aportaron suexperiencia en trabajos de talleres: Francisco Muzio, Nora Negrín, Federico Fernández,
Ricardo Perez-Rama, Marcelo Rodríguez, EdgardoVitale, Leopoldo, Amorín, Oscar Caponi, Luis E. Chans,Nicolás Barg, Norman Benett, Eduardo Barre, LuisGarcía, Luis Eduardo Días y Raúl Oyenart
Serie: FPTA N° 36
© 2013, INIA
Editado por la Unidad de Comunicación y Transferencia de Tecnología del INIA
Andes 1365, Piso 12. Montevideo - Uruguayhttp://www.inia.org.uy
Quedan reservados todos los derechos de la presente edición. Esta publicación no se podráreproducir total o parcialmente sin expreso consentimiento del INIA.
3Brucelosis bovina
Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria
Integración de la Junta Directiva
Ing. Agr., MSc., PhD. Álvaro Roel - Presidente
D.M.T.V., PhD. José Luis Repetto - Vicepresidente
Ing. Agr. Joaquín Mangado
Ing. Agr. Pablo Gorriti
D.M.V. Álvaro Bentancur
D.M.V., MSc. Pablo Zerbino
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FONDO DE PROMOCIÓN DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA
El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA) fue instituido por elartículo 18º de la ley 16.065 (ley de creación del INIA), con el destino de financiarproyectos especiales de investigación tecnológica relativos al sector agropecuario delUruguay, no previstos en los planes del Instituto.
El FPTA se integra con la afectación preceptiva del 10% de los recursos del INIAprovenientes del financiamiento básico (adicional del 4o/oo del Impuesto a la Enaje-nación de Bienes Agropecuarios y contrapartida del Estado), con aportes voluntariosque efectúen los productores u otras instituciones, y con los fondos provenientes definanciamiento externo con tal fin.
EL FPTA es un instrumento para financiar la ejecución de proyectos de investiga-ción en forma conjunta entre INIA y otras organizaciones nacionales o internacionales,y una herramienta para coordinar las políticas tecnológicas nacionales para el agro.
Los proyectos a ser financiados por el FPTA pueden surgir de propuestaspresentadas por:
a) los productores agropecuarios, beneficiarios finales de la investigación, o por susinstituciones.
b) por instituciones nacionales o internacionales ejecutoras de la investigación, deacuerdo a temas definidos por sí o en acuerdo con INIA.
c) por consultoras privadas, organizaciones no gubernamentales o cualquier otroorganismo con capacidad para ejecutar la investigación propuesta.
En todos los casos, la Junta Directiva del INIA decide la aplicación de recursos delFPTA para financiar proyectos, de acuerdo a su potencial contribución al desarrollo delsector agropecuario nacional y del acervo científico y tecnológico relativo a lainvestigación agropecuaria.
El INIA a través de su Junta Directiva y de sus técnicos especializados en lasdiferentes áreas de investigación, asesora y facilita la presentación de proyectos a lospotenciales interesados. Las políticas y procedimientos para la presentación deproyectos son fijados periódicamente y hechos públicos a través de una amplia gamade medios de comunicación.
El FPTA es un instrumento para profundizar las vinculaciones tecnológicas coninstituciones públicas y privadas, a los efectos de llevar a cabo proyectos conjuntos.De esta manera, se busca potenciar el uso de capacidades técnicas y de infraestruc-tura instalada, lo que resulta en un mejor aprovechamiento de los recursos nacionalespara resolver problemas tecnológicos del sector agropecuario.
El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria contribuye de esta manera ala consolidación de un sistema integrado de investigación agropecuaria para elUruguay.
A través del Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA), INIA hafinanciado numerosos proyectos de investigación agropecuaria a distintas institucio-nes nacionales e internacionales. Muchos de estos proyectos han producido resulta-dos que se integran a las recomendaciones tecnológicas que realiza la institución porsus medios habituales.
En esta serie de publicaciones, se han seleccionado los proyectos cuyos resulta-dos se considera contribuyen al desarrollo del sector agropecuario nacional. Surelevancia, el potencial impacto de sus conclusiones y recomendaciones, y su aporteal conocimiento científico y tecnológico nacional e internacional, hacen necesaria laamplia difusión de estos resultados, objetivo al cual se pretende contribuir con estapublicación.
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PROYECTO FPTA 245EVALUACIÓN DE INSTRUMENTOS DE VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA YDESARROLLO DE HERRAMIENTAS PARA LA TOMA DE DECISIONES EN ELCONTROL Y ERRADICACIÓN DE LA BRUCELOSIS BOVINA
Autores y Cargos
• Andrés D. Gil (Profesor Bioestadística - Facultad de Veterinaria; CoordinarUnidad de Epidemiología - Dirección General de los Servicios Ganaderos -MGAP),
• José Piaggio Técnico Unidad de Epidemiología - Dirección General de losServicios Ganaderos - MGAP),
• Alejandra Suanes (Asistente Bacteriología - Facultad de Veterinaria; Encarga-da del Laboratorio de Diagnóstico de Leptospirosis - Depto. Bacteriología -DILAVE «M.C. Rubino» Dirección General de los Servicios Ganaderos - MGAP),
• Álvaro Núñez (Profesor Adjunto Depto. Patología y Clínica de Rumiantes ySuinos – Facultad de Veterinaria; Director DILAVE «M.C. Rubino» - DirecciónGeneral de los Servicios Ganaderos - MGAP),
• Alfredo Garín (Jefe Programa Brucelosis – Depto. Programas Sanitarios –División Sanidad Animal - Dirección General de los Servicios Ganaderos -MGAP),
• Mariela Silva (Encargada del Laboratorio de Diagnóstico de Brucelosis – DeptoBacteriología - DILAVE «M.C. Rubino» Dirección General de los ServiciosGanaderos - MGAP),
• Deborah Cesar (Técnico Asesor del Instituto Plan Agropecuario),
• Beatriz di Pace (Asistente de Proyectos de Bioestadística - Facultad deVeterinaria,
• Gabriel Mautone (Asesor Técnico Unidad de Epidemiología - Dirección Gene-ral de los Servicios Ganaderos - MGAP),
• Ricardo Zaffaroni (Veterinario Ejercicio Libre),
• María Natalia Chans (Jefa de Servicio de Establecimientos Comestibles, delDepto. de Establecimientos Industrializadores – División Industrial Animal -Dirección General de los Servicios Ganaderos - MGAP),
• Stella Maris Huertas (Profesor Adjunto Bioestadística - Facultad de Veterina-ria; Directora del Centro Colaborador de OIE en Bienestar Animal).
9Brucelosis bovina
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CONTENIDO
I.BRUCELOSIS BOVINA EN URUGUAYIdentificación del Problema ................................................................................... 13Antecedentes y Justificación ................................................................................ 14IV.1. Generalidades ............................................................................................... 14IV.2. Antecedentes Nacionales ............................................................................ 15IV.3. Justificación .................................................................................................. 15Objetivo General ..................................................................................................... 17
II.SENSIBILIDAD ANALÍTICA DE LAS PRUEBAS DE DIAGNÓSTICOAPLICADAS SOBRE LECHE MEZCLAIntroducción ............................................................................................................ 19Materiales y Métodos ............................................................................................ 19Resultados .............................................................................................................. 20Discusión .............................................................................................................. 23
III.EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LASPRINCIPALES PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO UTILIZADAS PARA LAVIGILANCIA DE REBAÑOS LECHEROSIntroducción ............................................................................................................ 27Materiales y Métodos ............................................................................................ 28Resultados .............................................................................................................. 30Discusión .............................................................................................................. 33
IV.DIFUSIÓN DE LA BRUCELOSIS ENTRE REBAÑOS, CARACTERÍSTICASDEMOGRÁFICAS Y EPIDEMIOLÓGICAS PARA DEFINIRESTRATEGIAS DE VIGILANCIA Y CONTROLIntroducción ............................................................................................................ 35Materiales y Métodos ............................................................................................ 36Modelo Epidemiológico ......................................................................................... 36Modelo de Simulación ........................................................................................... 40Transmisión entre rebaños. .................................................................................. 44
Transmisión por movimiento de portadores ............................................... 44Transmisión por contigüidad (linderos) ....................................................... 47Programas de Vigilancia .............................................................................. 48Supuestos ...................................................................................................... 51Salidas del Modelo ....................................................................................... 51
V.MODELO DE DIFUSIÓN DE LA BRUCELOSIS BOVINA INTRAREBAÑOSTipo de Producción «Lechera» ............................................................................. 53
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Modelo conceptual ................................................................................................. 54Estados .......................................................................................................... 54
Parámetros del Modelo ......................................................................................... 54Susceptibilidad .............................................................................................. 55Mortalidad ...................................................................................................... 55
Modelo con infección ............................................................................................. 55Probabilidad de Aborto .......................................................................................... 56Refugo por otras causas ....................................................................................... 58Transmisión ............................................................................................................ 58
Probabilidad de infección horizontal ........................................................... 58Probabilidad de infección vertical ......................................................................... 61Detección .............................................................................................................. 61Vigilancia .............................................................................................................. 61Anticuerpos ............................................................................................................. 62Intervención ............................................................................................................. 62Salidas «Outputs» del Modelo ............................................................................. 62Salidas (Outputs) de la simulación (5000 iteraciones): .................................... 62
VI. CONCLUSIONES ............................................................................................. 65
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ............................................................. 67
Pág.
13Brucelosis bovina
Proyecto FPTA 245Período de Ejecución: Fe. 2007-Dic. 2009
Andrés D. Gil*, José Piaggio*, Ale-jandra Suanes*, Álvaro Núñez*,Alfredo Garín*, Mariela Silva*,Deborah Cesar**, Beatriz di Pace***,Gabriel Mautone*, RicardoZaffaroni****, María Natalia Chans*,Stella Maris Huertas***
*Dirección General de los ServiciosGanaderos - MGAP**Instituto Plan Agropecuario***Facultad de Veterinaria****Ejercicio Libre
IDENTIFICACIÓN DELPROBLEMA
Uruguay inició un Plan Nacional deErradicación de la Brucelosis Bovina apartir del año 1998. Este plan implicabala suspensión de la vacunación, el refuer-zo de las actividades de vigilancia, laeliminación de los reactores y el sanea-miento de los predios con animales posi-tivos.
Las actividades de vigilancia en losestablecimientos lecheros se realizarona través de la Prueba del Anillo en Leche(PAL) sobre las muestras compuestasde leche extraídas de los tanques. UnPAL positivo lleva a la realización deserología en el establecimiento. Las ac-tividades de vigilancia epidemiológica delos establecimientos que producen ani-males para carne, estuvieron basadas enmuestreos en plantas de faena que seiniciaron a fines del año 2002 y se man-tienen e incrementaron hasta la fecha.
La cabaña nacional se monitoreamediante la exigencia de resultados se-rológicos negativos para el ingreso a lasexposiciones, remates ferias, liquidacio-nes y exportaciones.
La marcha de esta campaña mostrósu primer alerta a partir del año 2002,cuando a partir de dos focos iniciales ymediante muestreos serológicos realiza-dos sobre los linderos a ellos por laDivisión Sanidad Animal, se detectaron104 establecimientos positivos en gana-dería de carne en el departamento deRocha. En este departamento se aplicó
la cuarentena (interdicción) con obligato-riedad de serología negativa previa almovimiento de los ganados susceptiblesen cinco seccionales policiales.
A mediados del 2003 también surgióuna situación de preocupación en el de-partamento de San José, donde existíanun número importante de focos en esta-blecimientos lecheros, lo cual se agravódurante el año 2005 al detectarse comopositivo un campo de recría. Cuando seinicio este estudio (2007) había 102 fo-cos activos en ese departamento, siendoactualmente (octubre 2011) 13 y de ellossolo cinco en establecimientos lecheros.
A esta situación sanitaria, se agregóel incremento del diagnóstico de algu-nos casos de brucelosis en humanos deáreas rurales de zonas del departamentode Rocha, que determinaron, como estáestablecido, la transmisión de informa-ción entre los servicios locales y centra-les del MGAP y el MSP para tomar lasmedidas que correspondían en formacoordinada. Estos casos pusieron sobrela mesa el riesgo que presupone estázoonosis para los individuos que debenestar en contacto con los animales o susproductos.
En el año 2005 la Dirección Generalcreó un Grupo Técnico para delinear unplan de acción y delinear los caminos aseguir para controlar la situación y con-tinuar con la erradicación
El grupo técnico analizó la situación yconcluyo que: De acuerdo a la informa-ción existente el objetivo final era alcan-zar nuevamente los niveles de prevalen-
I. Brucelosis bovinaen Uruguay
14 Brucelosis bovina
cia adecuados para continuar la erradi-cación de la Brucelosis bovina en todo elterritorio nacional.
Dentro de los principales cambiosintroducidos se destaca la vacunacióncon RB51 en el departamento de SanJosé y la obligatoriedad de realizar sero-logía en todos los establecimientos le-cheros para la refrendación anual.
El principal motivo para el cambio enla utilización de la Prueba de Anillo enLeche (PAL) por serología fue que estaprueba fue cuestionada por diversos ac-tores como sistema para la detección deanimales positivos. Con un rebaño leche-ro en el entorno de las 450 mil hembrasy con un costo estimado de 2,7 dólarespor reacción la adopción de la serologíaobligatoria significo un incremento en elentorno de 1 millón de dólares anuales enla estrategia de erradicación.
Esta situación ameritó que el grupotécnico recomendara evaluar las técni-cas de diagnóstico y su utilidad en lacampaña, especialmente en lo referenteal PAL y otras pruebas de posible usosobre la leche tanque.
Si bien resulta claro la necesidad deevaluar instrumentos de vigilancia epide-miológica también resulta necesario con-tar con una herramienta de Apoyo a lasDecisiones que permite combinar las di-versas estrategias de vigilancia y preven-ción de forma de buscar la mayor eficien-cia.
Este estudio buscó evaluar las princi-pales características de las pruebas dis-ponibles para la vigilancia basada en laleche tanque a través de la comparaciónde la sensibilidad analítica del PAL, com-parado con tres diferentes kits de ELISAy la Prueba de Polarización Fluorescente(FPA).
También se trató de dotar al programacon un modelo de simulación estocásti-co que permitiera generar diversos esce-narios que combinen la vigilancia condiversos instrumentos y medidas preven-tivas en busca de una mayor eficienciadel programa.
ANTECEDENTES YJUSTIFICACIÓN
Generalidades
La Brucelosis es una enfermedad in-fecto-contagiosa producida por bacteriasdel género brucella, siendo consideradapor los organismos internacionales comola zoonosis más difundida del mundo. LaBrucella es una bacteria intracelular fa-cultativa con predilección por el sistemaretículo-endotelial y el tracto y órganosreproductivos. El capitán David Bruce fueel primero en aislar el agente de la bruce-losis de las cabras, en 1884 en la isla deMalta y el profesor L. F. Bang un veteri-nario danés describió la Brucella abortusde los bovinos en 1895 (24, 25).
Dentro del género Brucella se distin-guen siete especies y cada una tiene unhuésped natural: Br. abortus - bovinos,Br. melitensis – caprinos, Bruc. suis –cerdos, Bruc. canis – caninos, Bruc. ovis- ovinos, Bruc. neotomae – ratas de lamadera del desierto y Bruc. maris – lobosmarinos y delfines.
El factor de mayor relevancia de laBrucelosis radica primariamente en afec-tar seriamente la salud humana, ya seapor contagio directo con: placentas, fe-tos y secreciones uterinas o por consu-mo de leche y sus derivados contamina-dos. La Brucelosis causa graves pérdi-das económicas a la salud pública debi-do a: tratamientos, hospitalización, díasde ausencia en el trabajo, indemnizacio-nes y juicios laborales. Por otro lado lasrepercusiones económicas también songraves para la producción animal por:abortos, esterilidad, merma de la produc-ción lechera, gastos veterinarios, reposi-ción de los animales y pérdidas de mer-cados nacionales e internacionales (13).
En Latinoamérica la enfermedad estápresente en todos los países, algunoscomo México y Perú con prevalenciasmuy altas y otros como Uruguay cuyaprevalencia es baja pero aún se manifies-tan brotes aislados (3, 12, 14, 15, 16, 17, 30).
15Brucelosis bovina
Este proyecto se concentrará en labrucelosis de los bovinos causada porBrucella abortus.
Antecedentes Nacionales
Los antecedentes de la BrucelosisBovina en el Uruguay, comienzan con elprimer aislamiento e identificación sero-lógica en bovinos que fuera realizada porCassamagnaghi en 1926 y su constata-ción en humanos por Nin y Silva en 1931(2, 3, 39).
Las acciones contra esta enfermedadse iniciaron en 1928, con su inclusión enel Art. 2 de la Ley 3.606 con lo cual setornó de denuncia obligatoria. Si bien lavacuna contra la brucelosis bovina yaestaba disponible en el país desde 1946,recién en 1964 se hace obligatoria suutilización hasta 1996 en que es suspen-dida por el decreto 522/996 (7).
El código zoosanitario de la Organiza-ción Mundial de Sanidad Animal (OIE)establece que un país o región libre debrucelosis será aquella que tenga menosde 0,2% de los rebaños con presencia dela enfermedad, que ningún animal hayasido vacunado en los últimos tres años yque todo animal positivo haya sido sacri-ficado (7). En función de esta normativauna posible estrategia sería declarar alpaís libre a través de la declaración derebaños oficialmente libres.
El objetivo actual es bajar la prevalen-cia de la enfermedad de forma significa-tiva, lo cual posibilitará que la gran mayo-ría de los establecimientos se libren de laenfermedad y por lo tanto de los riesgosy pérdidas que esto implica para la saludpública, el productor y la economía engeneral.
Inicialmente la vigilancia de los esta-blecimientos lecheros se ha basó en laspruebas de anillo en leche tanque (PAL)con frecuencia trimestral y para todo elganado vacuno serología teniendo comoprueba presuntiva la de Rosa de Bengala(RB) y como confirmatoria la prueba deRivanol.
Se establecieron criterios para clasi-ficar los establecimientos a través deldecreto 20/998 del 22 de enero de 1998(6, 11). Este decreto estableció seis cate-gorías para rebaños lecheros y cuatro
para rebaños de producción de carne omixtos, pero su utilización cayó en eldesuso con el correr de los años.
También a través de este decreto(20/998), en todos los casos que sedetecta animales reaccionantes positi-vos a las pruebas confirmatorias; estosdeben ser eliminados (enviados a sacrifi-cio) en un plazo de 30 días a partir de lafecha del diagnóstico.
Justificación
Si bien las actividades de vigilanciaepidemiológica en la lechería se imple-mentaron en forma inmediata a través delPAL, los establecimientos para carnecomenzaron a ser vigilados activamentea través de plantas de faena recién a finesdel año 2002 con una muestra de 18.997sueros (11) y en muestreos nacionales con25.332 sueros aleatorios (16, 17).
Como ya se mencionó la campañamostró su primer alerta en el año 2002,cuando se detectaron los 104 estableci-mientos positivos en ganadería para car-ne en el departamento de Rocha. En estedepartamento se aplicó además de lacuarentena (interdicción), la obligatorie-dad de serología negativa previa al movi-miento de los ganados en cinco seccio-nales policiales y para acelerar el proce-so de saneamiento se comenzó a utilizarla vacunación con RB51 (vacuna que nointerfiere con el diagnóstico serológico),que se autorizó a través del decreto 432/2002 6/11/02 (7).
En los Cuadros 1 y 2 se observa laevolución de las prevalencias aparentesestimadas de los bovinos y rebaños segúnel rubro productivo entre 2002 y 2008 (14, 15).
A mediados del 2003 también surgióuna situación de preocupación en el de-partamento de San José, donde existíanun número importante de focos en esta-blecimientos lecheros. Esta situación seagravó en el 2005 al detectarse una seriede nuevos focos en ese departamento loque obligó a: reglamentar los campos derecría, extender la vacunación con RB51al departamento de San José y exigirserología para la habilitación y refrenda-ción anual de todos los tambos del país(decreto Nº 135/005 del 15/04/05 y reso-lución 45/005 del 19/05/05).
16 Brucelosis bovina
La sola adopción de la serología parala refrendación anual implica teóricamen-te unas 440 mil pruebas serológicas poraño. Estas serologías según el arancel2010 de la Sociedad de Medicina Veteri-nar ia del Uruguay SMVU (http: / /www.smvu.com.uy/aranceles.php) tienenun costo de $75 c/u lo que equivaleaproximadamente a U$S 3,75 e implicanun gasto anual superior a 1,6 millones dedólares americanos.
Diversos actores han cuestionado lacapacidad de las pruebas utilizadas parahacer un trabajo eficiente y promovieron«la investigación y evaluación de las prue-bas diagnósticas...» como fue reclama-do por la Sociedad de Medicina Veterina-ria del Uruguay (Informe del Grupo detrabajo de Brucelosis 18/05/2005). No seha realizado un trabajo sistemático devalidación de las pruebas oficiales a nivelnacional y se utilizan estimaciones desensibilidad y especificidad tomadas dela literatura. Es así que se asume que laprueba de rosa de bengala RB tiene unasensibilidad de 95,2% y una especifici-dad de 98,5% (22), pero por otro lado no sedesconoce que hay reportes en la litera-tura de sensibilidades mucho más bajasestimadas con animales con aislamien-tos positivos (35). Una reciente revisión dela literatura reporta los siguientes valoresmedios para las técnicas que se utilizanen el país Rosa de Bengala sensibilidad81,2% y especificidad 86,3%, Rivanolsensibi l idad 89,6% y especif ic idad63,1%. Prueba de anillo en leche tanquePAL sensibilidad 89,5% y especificidad74,5% (10). En otra revisión se expresa que
el rango de variaciones de RB para sen-sibilidad va de 21,0% a 98,3% y paraespecificidad de 68,8% a 100% y enRivanol la variación es de 50,5% a 100%en sensibilidad y 21,9 a 100% en especi-ficidad (26).
Resulta obvio que el comportamientode todas las pruebas que se están utili-zando en Uruguay tienen una especifici-dad superior a la media estimada por Gally col. (8), ya que si no tendríamos más deun 25% de reactores en el PAL y unaserología positiva superior al 8% asumien-do un comportamiento independiente delRB y el rivanol y una prevalencia de 0.
En base a los datos del Cuadro 1 sepuede afirmar que la combinación depruebas serológicas que se están utili-zando en el Uruguay están teniendo uncomportamiento de especificidad supe-rior al 99%. Por otro lado no se cuentacon elementos que permitan hacer unaestimación de la sensibilidad de las prue-bas que se están utilizando, lo cual jus-tifica la preocupación de los actores yaque este es un elemento esencial para ladetección de los focos existentes y elavance de la campaña.
Como podemos observar el control deesta enfermedad requiere una actualiza-ción constante de los instrumentos yestrategia del combate que se resumenen:
• vigilancia epidemiológica,
• control de movimientos,• vacunación y• eliminación de reactores.
Cuadro 1. Prevalencia estimada expresada en porcentaje de la Brucelosis bovina en el Uruguay
Nota: Prev = Prevalencia; EE = Error Estándar; n = tamaño de la muestra.
Cuadro 2. Porcentaje de establecimientos estimados como positivos a la Brucelosis bovina en el Uruguay
Bovinos 2002 2004 2006 2007 2008 Prev E E n Prev E E n Prev E E n Prev E E n Prev E E nCarne 0,24 0,14 18977 0,16 0,08 12621 0,23 0,21 11940 0,05 0,04 17205 0,30 0,14 20774
Leche 0,02 0,02 6355 0,42 0,26 6840 —— —— 6609 0,04 0,04 9886 —— —— 7168
Todos 0,22 0,13 25332 0,17 0,08 19461 0,22 0,20 18549 0,05 0,04 27091 0,26 0,12 27942
Nota: Prev = Prevalencia; EE = Error Estándar; n = tamaño de la muestra.
Bovinos 2002 2004 2006 2007 2008 Prev E E n Prev E E n Prev E E n Prev E E n Prev E E nCarne 2,04 1,65 246 0,92 0,49 437 2,20 1,15 342 1,45 0,72 346 1,30 0,66 399
Leche 0,25 0,19 119 4,50 2,38 230 —— —— 134 0,69 0,69 192 —— —— 137
Todos 1,70 1,34 365 1,06 0,49 667 2,02 1,06 477 1,39 0,67 538 1,10 0,55 536
17Brucelosis bovina
El ajuste de estos instrumentos de-terminará el éxito o fracaso del programa(campaña) y el costo involucrado en elmismo. Dado la variedad de estrategiasposibles para erradicar la enfermedad,probar cada una en situaciones en terre-no es poco práctica, extremadamentecostosa y los resultados tardarían mu-cho tiempo en ser obtenidos.
Otra alternativa es desarrollar un «mo-delo» de simulación de la dispersión dela enfermedad en tiempo y espacio quepermita predecir los posibles resultadosy costos de cada cambio estratégico,como forma de ayudar a la planificacióny toma de decisiones.
De esta forma se podrán considerarlas interacciones entre factores epide-miológicos, ambientales y sociopolíti-cos, seleccionar la forma más eficientede erradicar la enfermedad e identificar
las principales restricciones del progra-ma.
Los modelos de simulación para bru-celosis son escasos y en su mayoría secentran sobre aspectos económicos delos programas (1, 5, 36), en la dinámica po-blacional de especies salvajes (29), o en ladifusión predial (9, 18) y solo uno en losaspectos epidemiológicos esenciales desu control (4, 20).
OBJETIVO GENERALEvaluar los instrumentos de vigilancia
epidemiológica disponibles para la gana-dería de leche y desarrollar un modelo desimulación de la dispersión de Brucelo-sis bovina en el país, como herramientaspara la toma de decisión en la campañade control /erradicación de la Brucelosisbovina en Uruguay.
19Brucelosis bovina
II. Sensibilidad analíticade las pruebas de
diagnóstico aplicadassobre leche mezcla
INTRODUCCIÓNLa Prueba de Anillo en Leche (PAL) ha
sido y es utilizada mundialmente para lavigilancia de los rebaños lecheros con undesempeño aceptable. En el Uruguay hatenido un desempeño malo, no permi-tiendo la detección de la mayoría de losfocos que han afectado al sector lechero.Por esta razón se torno imprescindible larealización de serologías completas delos rebaños lecheros, a los efectos depoder detectar los focos de la enferme-dad en este sistema productivo.
La Prueba de Anillo en Leche (PAL)fue originalmente utilizada en Dinamarcapara la detección de rebaños infectadospor Brucella abortus en estudios sobre laleche de los tarros recibidos en las plan-tas (32). Posteriormente un estudio similardemostró que juntar dos o tres tarros deleche no reducían significativamente elcomportamiento de esta prueba, pero sireducían los costos y esfuerzos que im-plica este tipo de vigilancia (33).
El pasaje de la utilización de tarros atanques refrigerados colectores de lechepuso las primeras dudas sobre la habili-dad del PAL para detectar la enfermedad.
La prueba diagnóstica a utilizar sobreleche del tanque debe ser muy sensiblepara poder detectar la enfermedad enforma temprana y superar el efecto dedilución de la mezcla en el tanque. Poresta razón se determinará la sensibilidadanalítica que permitirá establecer el al-cance de cada prueba.
El objetivo de estos ensayos es deter-minar la sensibilidad analítica de las
pruebas disponibles (PAL, ELISA y Pola-rización Fluorescente), para ser utiliza-das sobre leche mezcla simulando laextraída de los tanques de ordeñe.
MATERIALES Y MÉTODOSPara esto se recurrió a animales in-
fectados naturalmente, que fueron identi-ficados por la vigilancia realizada dentrodel programa de brucelosis. Se identifi-caron 17 vacas lecheras, que fueron po-sitivas a las pruebas serológicas oficia-les (Rosa de Bengala y Rivanol) y perte-necían a establecimientos lecheros conaislamiento del agente. Previo al envío afaena de estas vacas, se procedió a latoma de muestras de sangre y leche quese remitió refrigerada para su análisis enel laboratorio. Una vez que las muestrasfueron recibidas en el laboratorio se repi-tieron las pruebas serológicas y la lecheindividual fue controlada por la Prueba deAnillo en Leche (PAL).
Las leches negativas que se utilizaronpara las diluciones fueron extraídas delos tanques de ordeñe de establecimien-tos que no tuvieron antecedentes de laenfermedad en los últimos 10 años, queno registraban antecedentes de PAL po-sitivo y que las serologías anuales devigilancia (Rosa de Bengala y Rivanol)sobre todas sus vacas siempre fueronnegativas. Luego de agitar en forma con-veniente la leche en los tanques de refri-geración se procedió a la toma de estasmuestras y su envío al laboratorio. Unavez recibidas las muestras en el labora-torio fueron verificadas a través de larealización de las pruebas involucradas
Andrés D. Gil*, Mariela Silva*, Ale-jandra Suanes*, Beatriz di Pace**,Ricardo Zaffaroni***, MaríaNatalia Chans*, José Piaggio*,Álvaro Núñez*
*Dirección General de los ServiciosGanaderos - MGAP**Facultad de Veterinaria****Ejercicio Libre
20 Brucelosis bovina
en este ensayo: PAL, ELISAs y Ensayode Polarización Fluorescente (FPA).
Las diluciones utilizadas para las le-ches positivas fueron realizadas sobrebase 2, arrancado de la muestra indivi-dual. Las diluciones obtenidas fueron de1 en: 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512y 1.024. En el caso de las pruebas deELISAs se repitió el mismo ensayo ydiluciones por dos operadores diferen-tes, de forma de estimar si el operadorpodría influir en pruebas que se estimanobjetivas en cuanto a la medición delresultado de las mismas.
La prueba PAL fue realizada de acuer-do al protocolo que se utiliza oficialmenteen el Uruguay y que surge de las reco-mendaciones de CEPANZO (6). A los efec-tos de estandarizar la prueba y de acuer-do a la experiencia del laboratorio oficial,las pruebas de PAL se realizaron aproxi-madamente a las 48 horas de obtener lasmuestras de leche para obtener los re-sultados más confiables. El protocolorecomienda que las muestras se proce-sen entre las 24 y 72 horas. Las mues-tras diluidas se mantuvieron refrigeradasa una temperatura de 4 a 6 °C hasta unahora previa a la realización del PAL,momento en que se las lleva a tempera-tura ambiente. De acuerdo al protocolooficial se ajustó el volumen de acuerdo altamaño del rebaño (n° de animales enlactación). Para diluciones menores a150 se utilizó 1 ml, para diluciones de151 a 450 2 ml y para muestras superio-res a 451 3 ml. Las muestras se conside-raron negativas cuando el anillo de cremaes blanco y la columna azul, en los otroscasos fueron considerados positivos.
Las tres pruebas de ELISAs indirec-tas utilizadas fueron realizadas con kitscomerciales de IDEXX, POURQUIER ySVANOVA. Se realizaron de acuerdo alos protocolos recomendados por estoslaboratorios y utilizaron los puntos decorte también por ellos recomendados.Para la medición de las densidades ópti-cas de las pruebas de ELISA se utilizó unlector de placas Mult iskan I I , deLabsystem.
El Ensayo de Polarización Fluores-cente se realizó con antígenos conjuga-do con fluoresceína, utilizando el kit co-mercial de PRIONICS, realizando la lec-tura en un lector Sentry para una mues-
tra. Previo al procesamiento de las mues-tras el equipo es calibrado según especi-ficaciones del proveedor.
En el análisis de los datos se observóla correlación entre los operadores encada una de las pruebas de ELISA paralos títulos obtenidos. Una vez que losdatos fueron categorizados en positivosy negativos para cada operador y porprueba de ELISA se estudio el acuerdoentre los operadores a través del estadís-tico Kappa de Cohen.
La resultados obtenidos para cadaprueba fueron analizados por la regresiónde «probit» donde la variable respuestade carácter binario fue el «resultado»(negativo=0 y positivo=1) de la prueba ycomo variables explicativas independien-tes se incluyeron el logaritmo de base 2de la dilución «log_dil» y la variable cate-górica «prueba» que corresponde a laprueba de diagnóstico utilizada.
Este modelo permite calcular la pro-babilidad de obtener un resultado positi-vo basado en la dilución y la pruebautilizada, así como su error estándar deestimación lo cual se utilizó para lasestimaciones. El modelo probit utiliza lafunción de distribución acumulada de lanormal estandarizada. Una vez ajustadoel modelo se probaron a través de unaprueba lineal de hipótesis todos los pa-res posibles de pruebas de diagnóstico.Rechazándose la hipótesis de igualdadentre las pruebas cuando su valor deprobabilidad es menor a 0,05.
Para los análisis estadístico se utilizóel paquete STATA versión 11 (34).
A los efectos de tener una visión delimpacto de cada dilución en función de lapoblación de establecimientos lecherosdel Uruguay, se analizó la composicióndel rebaño lechero en función del númerode vacas en ordeñe según la declaraciónjurada de DICOSE 2008.
RESULTADOSLos valores de correlación entre los
títulos obtenidos por los dos operadoresdiferentes en las pruebas de ELISA fue-ron: IDEXX 0,96; Pourquier 0,85 y SVA-NOVA 0,94. Estos valores son en todoslos casos altamente significativos y fue-ron calculados sobre 176 observaciones.
21Brucelosis bovina
Cuadro 3. Grado de acuerdo entre los dos operadores que realizaron las pruebas de ELISA para lechemezcla en todas las diluciones, los valores de Kappa y su nivel de significación
Figura 1. Valores estandarizados de los títulos de ELISA (y) en función dela dilución de la leche brucelósica.
La prueba de Kappa, cuyos resulta-dos se muestran en el Cuadro 3, confir-man las mismas tendencias observadasa través de los coeficientes de correla-ción.
En la Figuras 1 se muestran lostítulos para cada kit de ELISA estandari-zados al punto de corte recomendadopor cada uno de los laboratorios produc-tores. Una línea paralela imaginaria al ejede las «x» que corta el eje de las «y» enel cero está separando los resultadospositivos de los negativos.
En el Cuadro 4 observamos el modelode regresión probit, observando que setrata de un modelo significativo donde lasvariables explicativas logaritmo en base2 de la dilución y prueba diagnóstica sonsignificativas.
La Figura 2 nos permite observar lacaída de la sensibilidad analítica en fun-
ción del factor de dilución para cada unade las pruebas en los valores estimadospara las mismas a través del modelo deregresión.
La Figura 3 nos muestra la relaciónentre la sensibilidad analítica y la dilu-ción de real de una vaca positiva según laestimación del modelo probit. En ambasFiguras 2 y 3 es fácil discriminar entrelas cinco pruebas diagnósticas utiliza-das y ponerlas en orden de sensibilidad.
Lo que estas figuras no dicen es si lasdiferencias observadas son estadística-mente significativas o se pueden atribuira las variaciones del muestreo.
En el Cuadro 5 se observan los valo-res de las prueba de hipótesis posterio-res al modelo probit, que comparan cadauna de las pruebas diagnósticas conrespecto a las otras utilizadas en estetrabajo.
ELISA Acuerdo Kappa Error Estándar z p-value Observado Esperado
IDEXX 97,73% 84,41% 0,8542 0,0754 11,33 0,0000
Pourquier 91,48% 72,63% 0,6886 0,0678 10,16 0,0000
SVANOVA 94,32% 79,80% 0,7188 0,0743 9,67 0,0000
22 Brucelosis bovina
Cuadro 4. Modelo de regresión «probit» del resultado de la prueba diagnóstica en función de la prueba (PAL,ELISAs y FPA) y log de la dilución
Probit regressionNumber of obs = 891LR chi2(5) = 185.77Prob > chi2 = 0.0000
Log likelihood = -381.57534 Pseudo R2 = 0.1958
result Coef. Std. Err. z P>|z| [95% Conf. Interval]
log_dil -.1777257 .0151847 -11,70 0,000 -.2074871 -.1479643
Prueba 1 .3205961 .1442362 2,22 0,026 .0378983 .6032939 2 1.323628 .1465094 9,03 0,000 1.036475 1.610781 3 .93419 .1337148 6,99 0,000 .6721138 1.196266 4 1.085494 .1369201 7,93 0,000 .8171352 1.353852 _cons 1.164675 .1277665 9,12 0,000 .9142571 1.415093
Figura 2. Sensibilidad analítica de las pruebas de diagnóstico sobre leche mezcla (pool)en función de la dilución de la leche de animales positivos.
1
.8
.6
.4
.2
0 2 4 6 8 10
Sen
sibi
lidad
Log base 2 de la dilución
PALIDEXXSVANOVA
FPAPOURQUIER
23Brucelosis bovina
Pruebas FPA IDEXX POURQUIER SVANOVAChi2 p-value Chi2 p-value Chi2 p-value Chi2 p-value
PAL 4,94 0,0262 81,62 0,0000 48,81 0,0000 62,85 0,0000
FPA 44,84 0,0000 19,88 0,0000 29,53 0,0000
IDEXX 8,03 0,0046 2,87 0,0904
Pourquier 1,39 0,2386
Figura 3. Sensibilidad analítica de las pruebas de diagnóstico sobre leche mezcla (pool)en función de la dilución real de la leche de 1 animal positivo.
Cuadro 5. Chi2 de Wald y valor «p» de significación de las pruebas lineales de hipótesis de comparaciónde pares de las prueba utilizadas
En el Cuadro 6 observamos la sensi-bilidad analítica estimada para cada prue-ba diagnóstica ensayada y su correspon-diente error de estimación.
En la Figura 4 podemos observar paraUruguay la distribución de las vacas le-cheras y los establecimientos lecheros(tambos) de acuerdo a las dilucionesutilizadas para la evaluación de las prue-bas de acuerdo a la Declaración Juradade Lechería de DICOSE.
DISCUSIÓNLos altos valores de correlación lineal
entre los títulos en las pruebas de ELISA,obtenidos en forma ciega por dos opera-
dores sobre las mismas muestras, po-nen en evidencia que más allá de erroresoperativos se trata de pruebas objetivasque le pueden aportar transparencia a lavigilancia de los rebaños lecheros.
El acuerdo entre los resultados obte-nidos por dos operadores con las prue-bas de ELISAs, utilizando la interpreta-ción de Landis y col. (27) nos muestra queen el caso de IDEXX fue casi perfecto y enlos otros dos kits muy buenos (substan-cial). En base a estos indicadores pode-mos concluir que las pruebas de ELISAsnos ofrecen resultados con una alta repe-titividad y objetividad.
Los resultados de ELISAs estandari-zados, que observábamos en la Figura 1,
Sen
sibi
lidad
1
.8
.6
.4
.2
0 200 400 600 800 1000
Dilución
PALIDEXXSVANOVA
FPAPOURQUIER
24 Brucelosis bovina
187
,79
12,7
767
93,1
313
,570
999
,36
14,9
740
98,2
113
,202
198
,78
13,5
083
283
,82
11,8
736
90,4
512
,661
598
,96
13,9
315
97,2
612
,116
398
,09
12,4
529
479
,08
11,1
055
87,0
711
,877
398
,35
12,9
833
95,9
411
,132
197
,09
11,5
016
873
,61
10,5
021
82,9
511
,244
497
,47
12,1
513
94,1
310
,278
895
,70
10,6
823
1667
,50
10,0
929
78,0
610
,789
696
,22
11,4
611
91,7
49,
5915
93,8
110
,027
3
3260
,87
9,90
2172
,46
10,5
359
94,5
210
,939
388
,69
9,10
7791
,33
9,57
05
6453
,92
9,94
2366
,24
10,4
979
92,2
510
,611
084
,91
8,86
0988
,18
9,34
09
128
46,8
410
,210
659
,53
10,6
780
89,3
310
,494
280
,37
8,87
0984
,28
9,35
54
256
39,8
510
,690
052
,53
11,0
654
85,6
910
,596
075
,08
9,13
6879
,63
9,61
28
512
33,1
811
,353
745
,45
11,6
395
81,2
910
,910
269
,12
9,63
7574
,24
10,0
945
1024
27,0
112
,171
738
,51
12,3
744
76,1
511
,419
462
,61
10,3
389
68,1
910
,770
5
Es
timac
ión
Err
or E
st.
Est
imac
ión
Err
or E
st.
Est
imac
ión
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.
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ELI
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6. E
stim
acio
nes
punt
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sen
sibi
lidad
ana
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a y
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resi
ón p
robi
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dilu
ción
25Brucelosis bovina
ponen en evidencia la tendencia a lacaída de la sensibilidad cuando se incre-menta la dilución y que a su vez aumentala variabilidad de los resultados lo cual esuna situación esperable dado las carac-terísticas de este estudio.
En el modelo de regresión de «probit»(Cuadro 4) la variable de respuesta es ladistribución acumulada de la normal es-tandarizada. El modelo incluye dos varia-bles independientes el logaritmo de base2 de la dilución como variable cuantitativay la prueba como variable con cincocategorías. Las dos variables muestranun alto nivel de significación para el mo-delo.
Como es esperable la dilución tieneun coeficiente negativo significando quecuando aumenta cae la sensibilidad ana-lítica para todas las pruebas involucra-das.
La variable prueba toma como referen-cia al PAL correspondiendo los númerosdel cuadro a: 1 = FPA, 2 = IDEXX, 3 =Pourquier y 4 = SVANOVA. Del cuadrose desprende que todos los coeficientesson superiores al cero (positivos) lo quesignifica que todas las pruebas muestranser superiores al PAL y esto es significa-tivo como podemos ver por los valores dez y sus valores de probabilidad que entodos los casos son menores a 0,05.
El tamaño de los coeficientes delmodelo nos permite ver cuán superioresson cada una de las pruebas al PAL yobservamos que el coeficiente menor esFPA y el de mayor valor se correspondecon la prueba de IDEXX. El ordenamiento
de las pruebas se puede observar tam-bién a través de las Figuras 2 y 3. Enestas figuras observamos que las prue-bas de ELISAs tienen en todos los casosmayor sensibilidad analítica y que estánbien separadas de la prueba PAL y FPA.
El Cuadro 5 muestra los resultados dela comparación de cada una de las prue-bas entre sí. En la primera fila del cuadroaparece la comparación de pares entre elPAL y las otras pruebas lo cual reprodu-ce la misma información que lo que veía-mos en el Cuadro 4 ya que el Chi2 en estecaso es igual al valor de «z» elevado alcuadrado. Las otras filas del cuadro 5muestran que así como la prueba PAL essignificativamente diferente a todas laspruebas, también lo es la prueba FPAdejando claro que los ELISAs tiene uncomportamiento superior. La compara-ción entre los ELISAs estaría mostrandodiferencia entre el kit de IDEXX y Pour-quier, inclusive si utilizamos la correc-ción de Bonferroni para controlar por elnúmero de comparaciones realizadas através del valor de significación. No con-tamos con elementos que muestren dife-rencia entre el kit de IDEXX y SVANOVAen cuanto a la sensibilidad analítica.
En el Cuadro 6 vemos la sensibilidadanalítica de las diferentes pruebas, locual nos podría ayudar a tomar una deci-sión si quisiéramos considerar como va-riable el grado de dilución que se traducea través del número de vacas en ordeñeen los establecimientos. Aquí podemosobservar que la sensibilidad analíticamenor de los ELISAs a la más alta dilu-ción (1/1.024) es de 63% lo cual es un
Figura 4. Distribución de la población de establecimientos lecheros y vacasen función del número de vacas lecheras en el establecimiento.
5%
9%
17%
26 Brucelosis bovina
valor comparable al obtenido por el PALa la dilución (1/32) y con el FPA a ladilución (1/128).
Los valores de sensibilidad analíticadel PAL obtenidos son bastante inferio-res a los que obtuviera Roepke y col (32) locual se puede explicar por otras varia-bles, como las mencionadas por Gonzá-lez Tomé y col (19), no consideradas eneste estudio como ser el título de la lechede vacas infectadas. No obstante esto setrata de las mismas muestras para cadaprueba, lo que a los efectos comparati-vos es útil.
Pensando en el peor escenario para ladetección de un animal positivo, que escuando hay una sola vaca infectada en elrebaño, claramente las pruebas de ELI-SA serían las recomendables. Si bieneste es el peor escenario para la detec-ción de una muestra por otro lado es elmejor escenario para el control de laenfermedad, o sea su detección en lasetapas más tempranas y no esperar aque tengamos muchos abortos y variasvacas infectadas.
Observando cómo se distribuye lapoblación de establecimientos lecheros
(tambos) en Uruguay (Figura 4), el cam-bio de prueba de diagnóstico en los esta-blecimientos con menos de 32 vacas enordeñe no tendría un impacto significati-vo en cuanto a la detección de estaenfermedad e incrementaría los costosde la prueba en el 50% de la población demenores recursos. Por otro lado el 86%de las vacas en ordeñe están en el 50%de los tambos que ordeñan más de31 vacas. Probablemente la diferencia decostos por el cambio de técnica (pasarde PAL a ELISA) será muy rentable paraaquellos que hagan una detección tem-prana de la brucelosis bovina en susrebaños, lo cual es un objetivo primordialdel programa de combate de esta enfer-medad.
En conclusión, estos resultados nosllevan a recomendar el cambio de prue-bas para la vigilancia sobre leche tanque,pero previo a ello deberíamos tener infor-mación sobre la especificidad de estaspruebas a nivel de terreno. Un incremen-to en el número de «Falsos Positivos» nosolo aumentaría los costos sino que ha-ría perder credibilidad a la herramienta devigilancia que apliquemos sobre la lechetanque y al propio programa.
27Brucelosis bovina
Andrés D. Gil*, Alejandra Suanes*,Alfredo Garín*, Beatriz di Pace**,Mariela Silva*, Beatriz diPace*, José Piaggio*, Álvaro Núñez*
*Dirección General de los ServiciosGanaderos - MGAP**Facultad de Veterinaria
III. Evaluación de lasensibilidad y
especificidad de lasprincipales pruebas dediagnóstico utilizadas
para la vigilancia derebaños lecheros
INTRODUCCIÓN
Es conocido que la probabilidad dedetección de vacas infectadas porBrucella abortus con la prueba del anilloen leche (PAL) decrece en la medida queaumenta el tamaño del rebaño, dada ladilución de la muestra (19, 32). Este cuestio-namiento llevó, en el capítulo preceden-te, al estudio de las sensibilidades ana-líticas de las diferentes pruebas disponi-bles para su aplicación sobre muestrasde leche mezcla obtenidas de los tan-ques de ordeñe. En los resultados pudi-mos observar que si bien la diluciónafecta a todas las pruebas, la mayoría deellas son menos afectadas que el PAL ypor lo tanto deberían ser menos cuestio-nadas que esta prueba para su utiliza-ción en la vigilancia epidemiológica.
La sensibilidad analítica de las prue-bas de diagnóstico establece la capaci-dad de dichas técnicas para detectarpresencias mínimas de anticuerpos enlas muestras compuestas procesadas Sibien la sensibilidad analítica es un buenindicador sobre una prueba de diagnósti-co, la misma no nos da información sobrela sensibilidad y especificidad diagnósti-cas de las pruebas involucradas.
Definimos como sensibilidad de unaprueba diagnóstica la capacidad que tie-ne la misma de identificar como positivoa un individuo, dado que el mismo tiene laenfermedad o infección de interés.P(T+|E+) = Probabilidad de prueba posi-tiva (T+) dado que el individuo está enfer-mo (E+).
La probabilidad complementaria de lasensibilidad es la probabilidad de obte-ner un Falso Negativo (FN), o dicho deotra forma la posibilidad de obtener unaprueba negativa dado que el individuoestá enfermo o infectado.
FN = P(T-|E+) = 1-Sensibilidad.Definimos como especificidad de una
prueba diagnóstica la capacidad que tie-ne la misma de identificar como negativoa un individuo dado que el mismo estásano, no tiene la enfermedad o infecciónde interés. P(T-|E-) = Probabilidad deprueba negativa (T-) dado que el individuoestá sano (E-).
La probabilidad complementaria de laespecificidad es la probabilidad de obte-ner un Falso Positivo (FP), o dicho deotra forma la posibilidad de obtener unaprueba positiva dado que el individuo estásano.
FP = P(T+|E-) = 1-Especificidad.Obviamente la prueba de diagnóstico
ideal es aquella que tiene un 100% desensibilidad y de especificidad, lo quedeterminaría la no existencia errores: nifalsos positivos, ni falsos negativos. Esteideal de una prueba perfecta casi nuncaes logrado, ya que el aumento de una delas características de las pruebas (sen-sibilidad o especificidad) generalmenteopera en forma contraria a la otra carac-terística. Según los avances en los pro-gramas de control de una enfermedad sepodrá priorizar alguno de estos aspectosen detrimento del otro, según los costosinvolucrados con un resultado falso. En
28 Brucelosis bovina
general con situaciones de altas preva-lencias se busca pruebas más sensiblesy con bajas prevalencias pruebas másespecíficas, pero obviamente con un ba-lance adecuado de ambas característi-cas. En las pruebas que obtienen comoresultado una medición (Densidad Ópti-ca, Polarización, etc.) se puede ajustarel punto de corte de acuerdo al objetivo ycostos del programa. En las pruebas decarácter categórico no es recomendablemodificar el criterio de categorización,pues se incrementa la subjetividad en laevaluación de los resultados.
Los resultados del estudio de sensibi-lidad analítica destacan que las pruebasde ELISA tienen comparativamente unamayor capacidad de detección en mues-tras muy diluidas que las otras pruebasutilizadas (PAL y FPA). Reportes de laliteratura muestran para las pruebas deELISA valores de sensibilidades entre95,3 y 98,1% y especificidades entre88,1 y 95,1% (31, 40), los cuales ya de porsi son muy buenos y son corroboradospor otros autores que comparando laprueba PAL con ELISA encuentran 8,3%mayor sensibilidad en estas últimas (28).
Dadas las condiciones de evolucióndel programa de control de brucelosis enel Uruguay y la potencialidad de otraspruebas diagnósticas para la vigilanciasobre muestras de leche extraídas deltanque de ordeñe, se considera necesa-rio: evaluar la sensibilidad y especifici-dad de las pruebas de rebaño (PAL,ELISA y Polarización Fluorescente) paralas condiciones de producción lecheranacional.
MATERIALES Y MÉTODOSPara la sensibilidad y especificidad
de las pruebas de rebaño se utilizaronrebaños positivos (focos) y negativos queserán validados por serología. Requirién-dose además que los establecimientosnegativos no tuvieran antecedentes re-gistrados de la enfermedad en los últi-mos 10 años.
Se trabajó fundamentalmente sobre eluniverso de establecimientos lecherosremitentes a plantas pasteurizadoras entodo el país. De cada uno de ellos através de su número de DICOSE se co-rroboró sobre la base de datos del Siste-
ma de Información en Salud Animal (SISA)del MGAP los antecedentes sanitariosrelativos a brucelosis de cada uno de losestablecimientos involucrados.
Se obtuvieron un total de 1.075 mues-tras de leche del tanque de ordeñe quefueron enviadas al laboratorio para suprocesamiento. De los establecimientosnegativos a la brucelosis bovina se utili-zaron 990 muestras y de los estableci-mientos positivos (focos) 85 muestras.
Las muestras de leche de tanquefueron colocadas en frascos de 50 ml yrefrigeradas en el laboratorio, posterior-mente a la identificación con un númerocorrelativo y distintivo.
Las muestras de leche fueron enfria-das en heladera a 4 ºC por 2 h. Lasmuestras fueron probadas por la Pruebade Anillo en Leche y luego fueron descre-madas mediante el método de centrifu-gación por 10 minutos a 3.500 r.p.m. y lafracción clarificada se conservó en free-zer a -20 °C para su posterior análisis porlas pruebas de Polarización Fluorescen-te y ELISAs.
Para el PAL una hora antes de comen-zada la prueba las muestras fueron reti-radas de la heladera y llevadas a tempe-ratura ambiente. La prueba de PAL esuna prueba que detecta anticuerpos (Ac)en leche contra la Brucella abortus. Losanticuerpos reaccionan con el antígenocoloreado de Brucella formando un com-plejo que se adhiere al glóbulo de grasade la leche y asciende con ellos paraformar una capa de crema coloreada.
El protocolo utilizado fue el siguiente:
1. Se dejó una hora antes a tempera-tura ambiente la muestra de lechey antígeno.
2. Se mezcló cada muestra invirtien-do varias veces el recipiente.
3. Se colocó 1 ml de leche en un tubode 12 x 75 mm
4. Se agregó 0,03 ml de antígeno acada tubo, y mezcló bien invirtien-do el tubo varias veces.
5. Se incubó a 37 ºC por 1 hora.
De acuerdo al protocolo se ajustó elvolumen de acuerdo al tamaño del rebaño(n° de animales en lactación). Para dilu-ciones menores a 150 se utilizó1 ml,
29Brucelosis bovina
para diluciones de 151 a 450 2 ml y paramuestras superiores a 451 3 ml. Lasmuestras se consideraron negativas cuan-do el anillo de crema es blanco y lacolumna azul, en los otros casos fueronconsiderados positivos.
Para la detección de anticuerpos contraBrucelosis bovina se utilizó la técnica deELISA indirecto. Se emplearon 3 kits co-merciales de ELISA indirecto del laborato-rio IDEXX, POURQUIER® y SVANOVA.
El principio general de la prueba deELISA indirecto, consiste en que lasplacas de micro-titulación están tapiza-das con un antígeno inactivado deBrucella abortus. Cualquier anticuerpoespecífico para B. abortus se une alantígeno que tapiza el pocillo de la placade micro-titulación y forma un complejoantígeno anticuerpo en la superficie. Elmaterial que no queda unido se eliminamediante lavados. Posteriormente se aña-de un conjugado formado por una IgG-anti-bovina marcada con una enzima,susceptible de unirse a los anticuerposbovinos que forman el complejo con elantígeno de B. abortus. El conjugado nounido se elimina mediante lavados. Porúltimo se añade un sustrato a los poci-llos. El grado de color desarrollado (me-dido como densidad óptica OD) es direc-tamente proporcional a la cantidad de Acespecíficos contra B. abortus presentesen la muestra.
Si bien el principio de las pruebas deELISA fue el mismo, existieron diferen-cias sobre todo en los tiempos de incu-bación para las diferentes etapas en losdiferentes kits comerciales. Para el kitde IDEXX como para el de SVANOVA lasmuestras requirieron de una incubación a37 ºC por 1 hs. Para el kit de Pourquier laincubación fueron de 21 ºC por 1 y 30 h.
Para los 3 kits la densidad óptica fuemedida a 450 nm en un lector de placasMultiskan II, de Labsystem.
La interpretación de la prueba de ELISAIDEXX y Pourquier se realizó a partir de losvalores de densidad óptica obtenidos a 450nm (DO450). Este valor se obtuvo a partir dela fórmula: S/P = (DO450 de la muestra -DO450 control negativo) / (DO450 del controlpositivo - DO450 control negativo * 100).Para el kit de SVANOVA se determino elporcentaje de positividad (PP): DO de lamuestra/ DO control positivo * 100.
Para los tres kit se colocaron contro-les positivos y negativos los cuales fue-ron validados en función de las caracte-rísticas solicitadas por cada proveedor.
Interpretación de los resultados:• IDEXX (S/P): negativo < 30%, posi-
tivo ≥ 30%.• Pourquier (S/P): negativo < 55% y
positivo ≥ 55%. (Si bien el fabrican-te define como resultados dudo-sos los que caen entre >45 y <55a nuestros efectos fueron conside-rados negativos).
• SVANOVA (PP): negativo < 10 %,positivo ≥ 10 %.
El principio de la prueba de Polariza-ción Fluorescente (FPA) se basa en larotación aleatoria de las moléculas ensolución. El tamaño molecular es el fac-tor principal que influencia la velocidadde rotación de las moléculas. Las molé-culas pequeñas, antígeno (Brucellaabortus) marcado con isotiocianato defluoresceína emitirá una reacción quepuede medirse por la luz polarizada. Siesta molécula se une a los anticuerposen solución, presentes en la muestra,aumentará su tamaño y la velocidad derotación de las mismas descenderá, pro-vocando una medida menor.
La prueba de polarización fluorescen-te se realizó con un kit comercial dePRIONICS. Para la lectura se utilizó unlector de polarización de fluorescencia(Sentry) para una muestra.
Previo al procesamiento de las mues-tras el equipo es calibrado según especi-ficaciones del proveedor.
El proveedor del kit utiliza comoantígeno un fragmento de bajo peso mo-lecular del OPS del lipopolisacárido deB. abortus marcado con isotiocianato defluoresceína.
Este antígeno se añade al suero deleche diluido y posteriormente se incu-ba. Por último se obtiene una medidadel contenido de anticuerpos medianteun analizador de polarización de fluo-rescencia en unidades de milipolariza-ción (mP).
El título de corte usado para lasmuestras de leche fue para los positivosde ≥ 90 mP.
30 Brucelosis bovina
Protocolo de la PFA:1. Se añade 1 ml de tampón Tris (Bu-
ffer) a tubos de vidrio de borosilica-to de 10 x 75 mm y después 10 μlde suero de leche. Se mezcla bien.Se obtiene una lectura en el equipoSentry para determinar la disper-sión de la luz.
2. Se añade 10 μl al tubo, volumen deantígeno que corresponda a unaintensidad total de fluorescenciade 250-300 x 103 y se mezcla bien.Se obtiene una segunda lectura enel equipo Sentry después de unaincubación a temperatura ambien-te de 2 minutos.
3. Una lectura superior al umbral pre-determinado indica una reacciónpositiva.
El análisis de los resultados se reali-zaron utilizando la curva de caracteriza-ción operativa ROC (Receiver OperatingCharacteristic análisis) para cada uno delos ensayos de tipo cuantitativo (ELISAsy FPA). Este análisis genera los gráficosde la sensibilidad en función de los falsospositivos (1-Especificidad) para cadaposible punto de corte de las pruebas ycomparar las áreas definidas para cadaprueba.
El análisis ROC cuantifica la certezade una prueba diagnóstica u otras moda-lidades utilizadas para discriminar entredos estados o condiciones (en este caso
infectadas o no infectadas por brucelosisbovina). Esta certeza discriminatoria esmedida por la habilidad para clasificarcorrectamente un individuo (muestra) enlas dos categorías posibles (enfermosano, infectado no infectado, positivo onegativo). El comportamiento global deuna prueba es resumido por el área bajola curva ROC. Esta área se interpretacomo la probabilidad que el resultado deuna prueba diagnóstica de un individuoinfectado seleccionado aleatoriamente,obtenga resultados más altos que losobtenidos por la misma prueba en otroindividuo seleccionado aleatoriamenteentre los no infectados. Cuanto mayor elárea de la curva ROC mejor comporta-miento tiene la prueba diagnóstica, co-rrespondiendo el área de una a una prue-ba perfecta y la de 0,5 a una prueba queno es mejor que el azar para clasificar aun individuo.
Los análisis fueron realizados con elprograma STATA/SE versión 11.0 (34).
RESULTADOSEn la Figura 5 se observa la distribu-
ción de las muestras de leche tanquepara la población de establecimientospositivos (BrB+) y negativos (BrB-) a labrucelosis bovina participante de esteestudio. Se observa que la distribuciónno fue similar, observándose una tenden-cia a muestras de establecimientos gran-
Figura 5. Distribución de las muestras de leche tanque en función delnúmero de vacas en ordeñe para las poblaciones deestablecimientos positivos y negativos a Brucelosis bovina.
15% 15%
8%
31Brucelosis bovina
Cuadro 7. Valores estimados de especificidad, error estándar y límites de confianza del 95%para cada prueba diagnóstica utilizada sobre leche mezcla extraída del tanque deordeñe de establecimientos sin brucelosis bovina
Cuadro 8. Valores estimados de sensibilidad, error estándar y límites de confianza del 95% paracada prueba diagnóstica utilizada sobre leche mezcla extraída del tanque de ordeñede establecimientos en saneamiento por brucelosis bovina
Prueba Especificidad Interv. Confianza 95% nEstimación Error Estand. Lím Inf Lím Sup
PAL 98,14% 0,4353 97,28% 98,99% 966
FPA 94,94% 0,8003 93,37% 96,51% 751
IDDEX 92,63% 0,8310 91,00% 94,26% 990
POURQUIER 98,79% 0,3483 98,10% 99,47% 989
SVANOVA 97,17% 0,5277 96,13% 98,20% 989
Prueba Sensibilidad Interv. Confianza 95% nEstimación Error Estand. Lím Inf Lím Sup
PAL 55,29% 5,42 44,51% 66,08% 85
FPA 67,50% 5,27 57,01% 77,99% 80
IDDEX 91,25% 3,18 84,92% 97,58% 80
POURQUIER 82,50% 4,27 74,13% 90,87% 80
SVANOVA 88,75% 3,56 81,67% 95,83% 80
des en los negativos y una tendencia aestablecimientos con menos vacas enordeñe en las muestras positivas.
En el Cuadro 7 podemos observar losvalores de especificidad para cada una delas pruebas empleadas en este estudio asícomo los errores estándares de la estima-ción y los límites de confianza del 95%.
Las estimaciones de punto más ex-tremas 92,6% (IDEXX) y 98,8% (Pour-quier) correspondieron a las pruebas deELISA, pero el desempeño general eneste parámetro es en todos los casosalto.
Se observa que en el caso del PAL seperdieron 24 muestras (2,4%) y en elcaso de la FPA se perdieron 239 lasmuestras (24%). En el primer caso no sepudieron realizar en tiempo de acuerdo alprotocolo y en el segundo correspondenal primer año del estudio donde aún no sehabía puesto a punto la técnica comopara obtener resultados confiables.
En el Cuadro 8 observamos las esti-maciones de punto para las sensibilida-des, los errores estándares de las mis-mas y sus intervalos de confianza. Eneste caso se puede observar que los
errores estándares en valores absolutosson muy superiores a los obtenidos paralas especificidades lo cual está determi-nado fundamentalmente por los tamañosmuestrales utilizados en uno y otro caso.Estos resultados muestran una superio-ridad para estos parámetros de las prue-bas de ELISAs frente al PAL y FPA, locual se puede observar a través de losintervalos de confianza.
En las Figuras 6, 7 y 8 observamoslas curvas ROC para cada una de laspruebas de ELISA y en su conjunto. Seobserva que salvo pequeñas variacionestodas ellas muestran un buen poder dis-criminante entre las poblaciones involu-cradas con áreas cercanas a la perfec-ción. En el Cuadro 9 se reportan las áreasajustadas para cada prueba y los resulta-dos de la prueba de hipótesis sobre dife-rencia entre el tamaño de las áreas. ElChi2 de Wald muestra que no es posiblerechazar la hipótesis nula y por lo tantono se puede demostrar diferencias esta-dísticamente significativas entre las prue-bas de ELISA involucradas (p≥ 0,26).
En el Cuadro 10 se resumen los datosa los fines comparativos tomando comovalor fijo de la especificidad el logrado por
32 Brucelosis bovina
ROC -Asymptotic Normal-ELISAs Obs Area Std. Err. [95% Conf. Interval]
IDEXX 1070 0,9663 0,0132 0,94046 0,99207
POURQUIER 1069 0,9216 0,0260 0,87072 0,97250
SVANOVA 1069 0,9446 0,0200 0,90533 0,98390
Figura 6. Curvas ROC para las pruebas de ELISA IDEXX y Pourquier.
POURQUIERIDEXX
SVANOVA
Figura 7. Curva ROC para la prueba de ELISA SVANOVA.
Figura 8. Curvas ROC para las pruebas de ELISA. Loscolores corresponden a: azul=IDEXX,marrón=Pourquier y verde= SVANOVA.
Cuadro 9. Áreas ROC y errores estándares de su estimación para las prueba de ELISA
Cuadro 10. Valores de sensibilidad y clasificación correcta para una especificidadfija de 98,14%
Ho:área(1) = área(2) = área(3). chi2(2) = 2.64 . Prob>chi2 = 0,2668.
Prueba Punto de Corte Sensibilidad % correcciónPAL NC 55,29 NCIDEXX 78,47 82,50 97,01%POURQUIER 22,69 88,75 97,38%SVANOVA 15,69 86,25 97,29%
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
Sen
sibi
lidad
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
Sen
sibi
lidad
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
1- Especificación 1- Especificación
Área por debajo de la curva ROC = 0,9663 Área por debajo de la curva ROC = 0,9216
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
Sen
sibi
lidad
0,00 0,25 0,50 0,75 1,001- Especificación
Área por debajo de la curva ROC = 0,9446
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
Sen
sibi
lidad
0,00 0,25 0,50 0,75 1,001- Especificación
33Brucelosis bovina
la prueba PAL 98,14%. Se determinanlos puntos de corte de las diferentespruebas de ELISA para esa especificidady se extraen los valores de sensibilidad yporcentaje de clasificación adecuada dela población.
DISCUSIÓNCuando se diseño este estudio existía
un gran número de establecimientos le-cheros que estaban identificados comofocos activos de la enfermedad. Duranteel proceso de evaluación, aprobación ycomienzo efectivo del proyecto, la granmayoría de estos establecimientos sesanearon; lo cual llevo a una extensiónen el tiempo de la captura de este tipo deestablecimientos para el cumplimientode los objetivos planteados.
El muestreo de establecimientos ne-gativos fue suficiente en número comopara permitir hacer estimaciones sólidasy representativas de la población de es-tablecimientos que remiten leches a plan-tas procesadoras. Si observamos lasFiguras 4 y 5 veremos que las tendenciasde los establecimientos negativos a bru-celosis bovina de la Figura 5 tienen unadistribución más aproximada al de lapoblación de vacas de la Figura 4. Estasituación probablemente se debe a quelos establecimientos con pocas vacas enordeñe tienen una producción más arte-sanal en el propio establecimiento sinremitir a plantas procesadoras.
Los valores de especificidad obteni-dos por todas las pruebas (PAL, ELISAsy FPA) en el peor de los casos fue del92,6% lo cual se puede considerar satis-factorio para este tipo pruebas que seránutilizadas en la vigilancia epidemiológicacomo de «screening».
Los valores de sensibilidad obtenidosvan desde el PAL con 55,3% hasta unELISA (IDEXX) 91,3%. Estos valores desensibilidad muestran diferencias entrelas diferentes pruebas como ya habíasido demostrado en las pruebas de sen-sibilidad analítica. Probablemente la bre-cha entre las pruebas es menor debido aque las muestras tienden a provenir deestablecimientos con menor cantidad devacas en ordeñe que lo que sería previsi-ble para los establecimientos remiten-tes. De todas formas las pruebas de
ELISA muestran su superioridad en sen-sibilidad con respecto al PAL y FPA.
De la comparación de las áreas de lascurvas ROC de las pruebas de ELISA seobserva que las mismas se aproximan alárea máxima y sus diferencias no sonestadísticamente significativas. Esta si-tuación y las diferencias en sensibilidady especificidad de las pruebas de ELISAponen en evidencia que las diferenciasson más atribuibles a los puntos de cor-tes que a los comportamientos de laspruebas; ya que las de mayores sensibi-lidades fueron las peores cuando se tratode especificidad.
Este aspecto queda más clarificadocuando establecemos un punto de cortearbitrario para cada prueba de forma deque todas tengan una especificidad comola obtenida por el PAL 98,14% (Cuadro10). En este caso queda evidente que elPAL sigue teniendo una sensibilidad cla-ramente inferior y que las pruebas deELISA tiene un comportamiento similarentre ellas.
Los valores de sensibilidad reporta-dos en el Cuadro 10 oscilan entre 82 y89% los cuales son inferiores a otrosreportes de la literatura. Esto puede serdebido a que cuando se extrajeron algu-nas de las muestras ya hubieren sidoeliminados algunos de los reaccionantespositivos. Por otro lado, el tamaño relati-vamente bajo de la muestra de estableci-mientos positivos aumentó los errores demuestreo los cuales podrían estar inci-diendo. De todas formas hay un ampliomargen para ajustar los puntos de cortesde las técnicas de forma de incrementarsustancialmente la sensibilidad sin detri-mento de la especificidad.
Estos resultados como los anteriorespermiten concluir que sería una medidaestratégica el cambio de la vigilancia delos establecimientos lecheros a travésde la leche tanque con pruebas deELISA. De esta forma se tendría unamayor objetividad en las pruebas y sepodría reducir sustancialmente los costode vigilancia en el sector, si pérdidasignificativa de la eficacia.
Habíamos informado que la utilizaciónde una serología anual por estableci-miento lechero tenía un costo aproxima-do 1,6 millones de dólares.
34 Brucelosis bovina
Con un costo individual por serologíade 3,75 dólares según el arancel de laSMVU.
En el Cuadro 11 se trabajo los datossegún la hipótesis de cambiar la serolo-gía anual por 4 muestreos anuales deleche tanque por establecimiento. Secalcula el costo en función de un costoestimado de US$ 17 por muestra deleche tanque y se estima el número deestablecimientos falsos positivos y elnúmero de serologías que esto determi-
naría por ciclo. El costo final de las14.500 muestras de leche tanque en elaño y de las serologías de los 288 resul-tados falsos positivos que requerirán40.088 serologías se estima para el añoen US $ 396.836.
Estos valores significarían un ahorrode 1,2 millones de dólares o una reduc-ción del 75% de los costos actuales devigilancia para el rubro lechero, lo cualtendría un impacto muy favorable.
Vacas en N° Tambos N° de N° Falso Serologías US$ Elisa US$ Total/ 4 ciclos/ordeñe ELISAs positivos por FP serología ciclo anuales
1 -30 778 778 16 240 13226 900 14126 56504
31- 65 919 919 18 864 15623 3240 18863 75452
66 -100 573 573 11 968 9741 3630 13371 53484
101 -200 742 742 15 2250 12614 8438 21052 84208
200 -500 452 452 9 3150 7684 11813 19497 77988
Más de 500 161 161 3 2550 2737 9563 12300 49200
Total 3625 3625 72 10022 61625 37584 99209 396836
Cuadro 11. Población de establecimientos lecheros, número de ELISAs por ciclo de vigilancia, previsión defalsos positivos (FP) y costos involucrados
35Brucelosis bovina
IV. Difusión de labrucelosis entre
rebaños, característicasdemográficas y
epidemiológicas paradefinir estrategias de
vigilancia y control
INTRODUCCIÓNDefinimos como modelo una repre-
sentación simplificada de un sistema oproceso real ya sea en forma verbal,física o matemática. Un sistema es unacolección de componentes que trabajanconjuntamente para producir un resulta-do, que es consecuencia de la operaciónde todas las partes del mismo. La modi-ficación de las entradas del sistema ten-drá influencia en esos componentes yafectará los resultados de salida.
En el Uruguay no hay antecedentesde modelos estocásticos de simulaciónsobre enfermedades de interés veterina-rio. Se considera esta una buena oportu-nidad de comenzar a desarrollar estaárea, que es muy importante en los as-pectos de planificación y apoyo a losprogramas de control y/o erradicación delas enfermedades.
En el desarrollo de esta propuestaparticiparon las unidades de la DirecciónGeneral de los Servicios Ganaderos invo-lucradas en el Programa de BrucelosisBovina y por otro lado el departamento deBioestadística e Informática de la Facul-tad de Veterinaria.
La mayoría de los modelos de simula-ción para enfermedades animales másdesarrollados, han sido creados para si-mular la dispersión de fiebre aftosa yotras enfermedades altamente contagio-
sas. Solo unos pocos modelos han sidodesarrollados para simular la dispersiónde enfermedades endémicas de caráctermás crónico como lo es la Brucelosisbovina (1, 4, 5, 9, 18, 20, 26, 29, 36, 37, 38).
Un modelo de simulación de una en-fermedad generalmente es utilizado paraanalizar los efectos de planes alternati-vos de control y estimar las perdidas enproductos como ser carne y leche. Ladeterminación de las pérdidas físicas ylos costos de las intervenciones, quegeneralmente son incluidos en las sali-das de los modelos de simulación, pue-den ser utilizados como los parámetrospara los posteriores estudios económi-cos (1).
La primera etapa en el desarrollo deun modelo de simulación es el desarrollode un modelo conceptual, que recoja losprincipales componentes del sistema asimular. En este caso el modelo concep-tual deberá recoger los principales ele-mentos epidemiológicos que determinanla presencia y difusión de la enfermedad,así como también los procesos de inter-vención que se pudieran aplicar para sucontrol.
La siguiente etapa consiste en el de-sarrollo de módulos del modelo de simu-lación que permitan estimar la difusiónde la enfermedad entre rebaños en lascondiciones pastoriles del Uruguay fren-te a diferentes: giros productivos (leche-
Andrés D. Gil*, Alfredo Garín*,Gabriel Mautone* José Piaggio*
*Dirección General de los ServiciosGanaderos - MGAP
36 Brucelosis bovina
ros y ganaderos), estrategias de vigilan-cia y control y factores geográficos yepidemiológicos. El objetivo del modeloentre-rebaños es observar los resultadosde la interacción entre la presencia ydifusión de la enfermedad y los sistemasde vigilancia y prevención de la Brucelo-sis bovina que se pudieran aplicar. Lassalidas permitirán el estudio de costos,pérdidas y recursos necesarios para elcombate.
MATERIALES Y MÉTODOSA través de la conformación de un
equipo multidisciplinario, la revisión de laliteratura y a la opinión de expertos sedesarrolló el modelo conceptual con dosmódulos principales. El primer módulorepresenta la epidemiología y difusión dela enfermedad entre rebaños (Figura 9) yel segundo las diferentes intervencionesque puede aplicar un programa de controlde la Brucelosis bovina (Figura 12).
Se simulará la difusión de la enferme-dad entre rebaños en las condicionespastoriles del Uruguay frente a diferen-tes: tipos de producción (lecheros y ga-naderos), estrategias de vigilancia y con-trol y factores geográficos y epidemioló-gicos. Se procederá a la descripcióncada uno de los componentes concep-tuales del modelo y luego se establece-rán las relaciones entre los mismos.Para los análisis preliminares y la imple-mentación se utilizó como software debase @risk y Stata/SE (34).
La información de base analizada, secorresponde a los sistemas de informa-ción de la Dirección General de los Ser-vicios Ganaderos (DGSG) a través de lossistemas información en Salud Animal(SISA), muestreos nacionales, sistemasde información geográfica, bases de da-tos de movimientos y bases de datos deexistencias ganaderas. Estos datos pro-porcionarán los insumos básicos de en-trada en el modelo.
MODELO EPIDEMIOLÓGICOEl ciclo natural de esta enfermedad se
puede separar arbitrariamente en su difu-sión a través de los rebaños y su difusióndentro de los mismos. En este capítulo
nos centraremos exclusivamente en lasituación entre los rebaños en el Uru-guay, siendo por lo tanto estos nuestraprincipal unidad de análisis.
Se define como rebaño a un conjuntode animales que comparten un espaciofísico (establecimiento ganadero) y unmanejo común independiente de los pro-pietarios de esos animales (28).
En el Uruguay se definen 44.808 uni-dades físicas productivas con bovinos,que a los efectos de este trabajo seránconsideradas como rebaños. Los reba-ños se caracterizan según su giro pro-ductivo (ganadería de carne o lechería),pues su manejo, composición y riesgofrente a la enfermedad son diferentes. Lasituación sanitaria de estos rebaños seesquematiza en el modulo 1 del modeloconceptual que dio origen a la Figura 9.
La unidad de tiempo que utilizará elmodelo «t» será anual, ya que la carac-terística de ser crónica de esta enferme-dad y su asociación al ciclo reproductivodel bovino que también es anual permitencaracterizar la evolución del estado sani-tario de un año hacia otro (8, 17, 24, 25).
Desde el punto de vista de la enferme-dad los rebaños son categorizados en untiempo «t0» como infectados o libres de laenfermedad. La transmisión entre reba-ños se dará desde los infectados a los noinfectados en forma genérica por movi-miento de material infectivo o contamina-do (fetos, placentas, instrumentos, etc.)y de los contactos a través de los alam-brados que determinan los límites entrelos rebaños (contacto por contigüidad olinderos).
Los rebaños infectados se clasificanen dos grupos los detectados y los nodetectados. Estos últimos son estable-cimientos infectados sin programas decontrol y sin limitaciones para transmitirla enfermedad.
Los rebaños detectados (focos de laenfermedad) son aquellos que su estatussanitario ha sido determinado por lossistemas de vigilancia aplicados. Estosrebaños están cuarentenados (imposibi-litados de mover animales susceptiblescon destino a otros rebaños) y en proce-so de saneamiento que consiste en laidentificación de animales infectados ysacrificio de los mismos, hasta la extin-
37Brucelosis bovina
ción de la infección y eliminación de lasfuentes de infección. Una vez concluidoel proceso de saneamiento estos reba-ños pasan a la categoría de «No Infecta-dos».
Los rebaños «Infectados», «No De-tectados» son las principales fuentes detransmisión entre rebaños ya que elmovimiento de cada animal portador condestino a un establecimiento «No Infec-tado» determinará que este se infecte ypase a la categoría de un nuevo rebañoinfectado «No Detectado».
Se realizó un análisis de la base dedatos de movimientos del año 2009 paralas categorías susceptibles por tamañosde los rebaños dentro de cada giro pro-ductivo de forma de poder caracterizar(modelar) los mismos.
Según el Sistema de Información enSalud Animal (SISA), al mes de abril del2010 hay 343 rebaños infectados-detec-tados, de los cuales aproximadamente el8% son del giro lechero, Figura 10. Losrebaños «infectados-no-detectados», porel actual sistema de vigilancia, se esti-
maron a través de un muestreo nacionalque se finalizó a diciembre del 2009 (21).
Dentro de los rebaños «No Infecta-dos» se han categorizado los mismos endos grupos «Susceptibles» y «No sus-ceptibles». Los rebaños susceptibles sonaquellos que se infectarán cuando ten-gan oportunidad de contactarse con fuen-tes de infección.
Se consideran rebaños «No Suscepti-bles» aquellos en que sus categoríassusceptibles han sido vacunadas, asu-miéndose para estos casos que el con-tacto con fuentes de infección no seránefectivas para la transmisión de la enfer-medad. Se establecerá la proporción deestos rebaños en función de la tasa decobertura de vacunación de rebaños.
La tasa de difusión de la brucelosis anuevos rebaños se estimará en funcióndel número de animales portadores quese moverán de establecimientos infecta-dos-no-detectados a susceptibles. Latasa de detección de rebaños infectadosserá función de la historia natural de laenfermedad y de la cobertura del sistemade vigilancia.
Figura 9. Modelo conceptual de difusión de la Brucelosis bovina entre rebaños.
Lechería: 3.634Ganadería: 41.174
Transmisión por contigüidad
Transmisión por movimiento
No infectadoInfectados
DetectadosCuarentenados
No Detectados Susceptibles No SusceptiblesVacunados
Saneados
38 Brucelosis bovina
Se ajustará un modelo estocástico detransición SIC (susceptible-infectado-cuarentenados) (38), Figura 11. La sumadel número de rebaños en cada uno deestos estados es igual a la población.
El modulo 2 del modelo conceptual serefiere a las principales intervencionesque se pueden aplicar para el control yerradicación de la enfermedad. En estemodulo nos centramos sobre los aspec-tos de vigilancia epidemiológica, dadoque aspectos como vacunación han sidoliberados al uso voluntario con nivelesmuy bajos de implementación y el sa-neamiento está regulado de forma similara los programas de control y erradicacióntradicionales. De esta forma la variableque ofrece más opciones y tienen unmayor impacto sobre costos y detecciónde rebaños enfermos es la vigilancia y su
Ganadería para Carne Ganadería para Leche
Figura10. Distribución de los rebaños infectados (focos) de Brucelosis bovina actuales y saneados para losgiros de ganadería para carne y lechería.
Figura 11. Modelo sencillo de transición de estado de la Brucelosis bovina entre rebaños. SIC(Susceptible, Infectado y Cuarentenado).
cobertura lo cual es esquematizado en laFigura 12.
La denuncia de abortos es de carácterobligatorio en el Uruguay, pero no esrealizada asiduamente por los producto-res. En la literatura es reconocida estaforma de vigilancia como muy efectivapara la detección temprana de la enfer-medad (20, 37). Dado el manejo y el mayorcontrol ejercido en la ganadería para le-che sobre el rebaño, es más probableque el aborto sea detectado en estos ypoco probable de hacerlo en la ganaderíapara carne extensiva donde hay un bajonivel de control individual. Los datos his-tóricos permiten simular esta situación.
Los muestreos de campo son realiza-dos para establecer la evolución de laprevalencia de la enfermedad y los cam-
AbiertosSaneadosLim_dep.shp
Focos ganadería.shp
AbiertosCerradosLim_dep.shp
Focos lechería.shp
39Brucelosis bovina
bios en las tendencias en estas. Suobjetivo no es precisamente la vigilanciay detección de la enfermedad, pero cuan-do esta es detectada se aplican las nor-mativas vigentes. Esta situación lleva aque, para algunos, estos esfuerzos seanconsiderados como una forma más devigilancia. Como el modelo de muestreoaplicado está definido se puede simularsin inconvenientes.
Los rastreos que implican la investi-gación de los linderos de los rebañosinfectados-detectados, así como losmovimientos de entrada y salida de ani-males susceptibles por lo menos de losproducidos en el último año, son unaherramienta fundamental en todo progra-ma de control de la brucelosis. La mode-lación de los movimientos con destino aotros rebaños y la distribución del núme-ro de rebaños linderos permiten simularlos «rastreos».
La serología anual completa es apli-cada desde hace varios años a los reba-ños lecheros y en algunos momentos sepropone como una opción para los gana-deros para algunas áreas geográficas.Se trata de un sistema de vigilancia con
una alta efectividad, pero con un muy altocosto y con problemas logísticos impor-tantes que deben ser analizados cuandose considera su aplicación.
Los muestreos en plantas de faena(MPF) son una estrategia aplicada ennumerosos países que han erradicado laenfermedad durante el proceso de erradi-cación y como sistema de vigilancia lue-go que esta ha sido lograda (37). En Uru-guay se aplicó en forma limitada y actual-mente se está incrementando en formasustancial. Un insumo trascendente paraesto es la caracterización de los movi-mientos con destino a faena de las cate-gorías susceptibles de los rebaños, locual se ha realizado con la base de datosde movimientos del año 2009.
Las pruebas de rebaño se vienen apli-cando en los lecheros a través de laprueba de anillo en leche (PAL), que noha funcionado correctamente en el Uru-guay. En los capítulos precedentes sereporta información de cómo mejorar ladetección de las pruebas sobre lechetanque, a través de los cambios de prue-ba a utilizar. Este método es general-mente considerado muy eficiente en rela-
Figura 12. Métodos de Vigilancia Epidemiológica que se aplican (líneas oscuras) o puedenaplicar (líneas más claras) a la brucelosis bovina según los giros de producciónde ganadería (carne o leche).
Denuncia deabortos
Muestreos decampo
Rastreos
Serología anualcompleta
Muestreos deplanta de faena
Pruebas derebaño
Serología previaa movimientos
Vigilanciaperiódica
Ganadería paracarneLechería
40 Brucelosis bovina
ción al costo involucrado.Pruebas de re-baño para ganadería para carne, solosería posible a través de la utilización demuestras compuestas (pooles) de sue-ros, lo cual podría ser una opción aplica-ble a través de los MPF o en otrassituaciones.
La serología previa a movimiento hasido aplicada en la mayoría de los paísesque han logrado erradicar la enfermedad (8).Se trata de una medida preventiva queevitaría el ingreso de la enfermedad en lamayoría de los rebaños y que en lamedida que el productor la entienda, laexigiría en forma independiente de suobligación legal. En el Uruguay es cues-tionada por algunos sectores y se aplicaen forma parcial según diferentes áreasdel territorio.
La Vigilancia Periódica de los reba-ños que podría ser realizada en formasistemática a través de muestreos anua-les, es una opción alternativa y/o com-plementaria, que si bien no tiene antece-dentes internacionales podría teóricamen-te ofrecer una opción de costo limitadopara disminuir el riesgo y aumentar ladetección de rebaño infectados-no-de-tectados.
Estos sistemas de vigilancia podránser modelados con distintos niveles decobertura y utilizando diferentes herra-mientas de diagnóstico de laboratorio,considerando sus costos y modelandotambién su comportamiento.
MODELO DE SIMULACIÓNComo se expreso en la figura IV.3 el
modelo de transición de estados es rela-tivamente sencillo. A los estados de tran-sición propuestos para los rebaños SIC(Susceptible, Infectado y Cuarentenado)debemos agregar el estado de «No Sus-ceptible» (Vacunado) que se puede con-siderar como fuera del modelo de simula-ción al asumir que no transita de unestado al otro en el período. Dicho de otraforma los rebaños vacunados no jueganningún papel en el modelo, ya que asumi-mos resistencia a la infección y no sonfuente de la misma, lo que equivale a suremoción del sistema.
El número de individuos (rebaños) encada estado y en cada período dependedel número de individuos en cada estado
en el período anterior y de las probabili-dades de transición.
En un modelo de transición de estadodeterminista: las probabilidades de cadatransición nunca cambian. En el modeloplanteado las probabilidades de transi-ción cambiaran con el tiempo en formaestocástica para representar eventosaleatorios o variación natural.
Como se observó en la Figura 9 losrebaños infectados se categorizan en«Detectados» y «No detectados». Losrebaños detectados Cuarentenados (In-terdictados) y en proceso de Saneamien-to. Los rebaños no detectados están enfunción de la introducción reciente delagente en «incubación o latencia» (sinevidencias serológicas) y de la falta desensibilidad del sistema vigilancia por:baja prevalencia, pruebas diagnósticasimperfectas y/o falta de cobertura en lavigilancia.
Como se observó en la Figura 10 ladistribución geográfica de la enfermedadno parece aleatoria, sino como en lamayoría de las enfermedades infecto-contagiosas se observan conglomeradosgeográficos que determinan que el riesgono sea homogéneo en todo el territorio.Esto se ve reforzado en un sistema ex-tensivo de producción basado en pastu-ras, ya que el tipo de suelo estará deter-minando la potencialidad para diferentessistemas productivos, así como la densi-dad de animales, lo cual afectará directa-mente la tasa de contacto entre los mis-mos y los manejos aplicados. Basado enestos aspectos se decidió que la unidadgeográfica de trabajo para el modelo es laSección Policial.
Para la caracterización geográfica delas secciones policiales para la brucelo-sis bovina se pensó que podría hacerseen función de tres parámetros ya sea enforma independiente o combinada, sien-do estos: prevalencia en la población debovinos, porcentaje de animales expues-tos y prevalencia de los rebaños bovinos.El primer parámetro fue descartado, yaque los datos disponibles no eran debuena calidad.
En función del segundo parámetropropuesto se tomaron como base losrebaños para cada sección policial (SP)que eran focos activos a diciembre del2008 o fueron identificados como infecta-
41Brucelosis bovina
dos entre enero 2009 y abril 2010. Deestos rebaños se asumió que toda supoblación susceptible había sido expues-ta y se calculó su porcentaje para cadasección policial con respecto a la decla-ración jurada de DICOSE 2009. En laFigura 13 se observa la distribución delas categorías de las seccionales segúnel porcentaje de sus animales suscepti-bles involucrados.
Para el tercer parámetro propuestotambién se tomaron como base los reba-ños que eran focos activos a diciembredel 2008 o fueron identificados comoinfectados entre enero 2009 y abril 2010.En función de ese número de focos y lapoblación de rebaños de cada secciónpolicial, con respecto a la declaraciónjurada de DICOSE 2009, se calculó laprevalencia de rebaños con brucelosisbovina. En la Figura 14 se observa ladistribución de las categorías de las sec-cionales, según la prevalencia de reba-ños para la brucelosis bovina.
Se puede observar cierto paralelismoentre la categorización de ambos ma-pas, pero se optó por la categorizaciónen función de la prevalencia de rebañosafectados porque se trata de un modelode difusión entre rebaños y es la situa-ción donde no se debió hacer supuestosmuy fuertes.
El único supuesto es que no existansesgos importantes en la detección en-tre las diferentes seccionales policiales.Obviamente este supuesto se debe derealizar para los dos sistemas de catego-rización. Además, la calidad de los datoscon los cuales se elaboró está informa-ción son los que ofrecen mayor seguri-dad; ya que se puede asumir que el nivelde omisión debe ser mínimo en el regis-tro de los focos detectados y la poblaciónde rebaños surge de la declaración jura-da de DICOSE. En conclusión, la catego-rización geográfica de la Figura14 es lautilizada en el modelo.
Esta categorización diferencia cincotipos de seccionales policiales en fun-ción de su prevalencia de rebaños a laBrucelosis bovina yendo desde el noregistro de la enfermedad hasta más del4% de los rebaños afectados en el perío-do analizado.
En el cuadro 12 podemos observar ladistribución de los rebaños, focos de laenfermedad y población susceptible enfunción de la categorización geográficade la enfermedad. De este cuadro seobserva que el 42% de los rebaños delpaís están en áreas sin registros de laenfermedad, así como el 36% de la po-blación susceptible. Por otro lado si nosfijamos en las áreas con mayores preva-lencias 2% o más de los rebaños afecta-dos estas áreas concentran el 67% delos focos y solo el 16% de los rebaños yel 24% de la población susceptible.
Figura 13. Caracterización de las Seccionales Policialesdepartamentales en función del porcentaje debovinos susceptibles a la Brucelosis bovinaexpuestos en las mismas.
Prevalencia de hembras expuestas
LibrePrev. < 1%1-5%5-15%> 15%
42 Brucelosis bovina
Además del factor regional y del giroproductivo (carne, leche), ya menciona-dos como componentes poblacionalesrelevantes, consideramos un tercero quees el del tamaño de los rebaños. Eltamaño de los rebaños está generalmen-te asociado al tipo de producción, mane-jo y riesgo para Brucelosis bovina. Enfunción de esos aspectos se establecie-ron siete categorías de rebaños en fun-ción de la población susceptible (hem-bras y machos enteros bovinos de 1 añode edad o mayores).
En el Cuadro 13 observamos cómo sedistribuyen los rebaños para cada giroproductivo en función de la poblaciónsusceptible que ellos tienen. Se destacade ese cuadro que hay 2.473 rebañosbovinos (5,5%) sin población suscepti-ble, obviamente se trata de estableci-mientos exclusivamente engordadores denovillos o campos recría de terneras.
Al observar la distribución para cadagiro en función de las frecuencias relati-vas de las diferentes categorías de tama-ño se manifiesta un comportamiento dife-rente para cada uno de ellos, Figura 15.La distribución de los establecimientoslecheros es más simétrica y en ciertamedida más homogénea. Por otro lado elgiro de rebaños para carne tiene un altoporcentaje de rebaños con poblacioneschicas, destacándose que el 41% estánen la categoría de 1 a 30 animales sus-ceptibles.
Si bien resulta obvio que el manejoestá muy influenciado por el tipo de pro-ducción y el tamaño poblacional, proba-blemente no lo sea tanto para el riesgo dela brucelosis bovina aunque este reporta-do en la literatura. Es fácil de imaginarque rebaños más grandes ofrecen mayo-res posibilidades de mantener el agenteen la población una vez que este seinstala. Un ejemplo claro de cómo seincrementa el riesgo para cada giro deproducción se observa en la Figura 16donde se gráfica el número de focos cadamil rebaños en función de la poblaciónsusceptible de los mismos en el Uru-guay.
Figura 14.Caracterización de las Seccionales Policialesdepartamentales en función del porcentaje derebaños afectados por la Brucelosis bovina en elperíodo enero 2009 – abril 2010.
Cuadro 12.Distribución de los rebaños bovinos, rebañosafectados (focos) y población bovina susceptiblesegún los niveles de prevalencia de los rebañosen el Uruguay
Regiones Rebaños Focos Pobl. Susc.Sin registro 18.989 0 2.255.469< 1% 12.150 65 1.418.0051 - 2% 6.565 97 1.111.6572 - 4% 4.496 133 885.012> 4% 2.608 196 599.798Total 44.808 491 6.269.941
Prevalencia de establecimientos
LibrePrev. < 1%1%2-4%> 4%
43Brucelosis bovina
Cuadro 13. Distribución de los rebaños bovinos por giro deproducción según el tamaño poblacional de lascategorías susceptibles a la brucelosis bovina en elUruguay
Figura 15.Distribución de la población de rebaños por tamañopoblacional (n° de bovinos susceptibles) para cada giroproductivo.
Figura 16. Número de focos de Brucelosis bovina cada mil rebaños,para cada giro productivo, en función del tamaño de lapoblación susceptible de los mismo.
Población Ganadería Lechería Total0 2.464 9 2.473
1 -30 16.818 778 17.59631- 65 6.345 919 7.26466 -100 3.345 573 3.918101 -200 4.922 742 5.664200 -500 4.533 452 4.985
Más de 500 2.747 161 2.908Total 41.174 3.634 44.808
0%
21%
4%
12%
12
44 Brucelosis bovina
En conclusión las unidades de entra-da al modelo implican una caracteriza-ción geográfica de las seccionales poli-ciales en cinco regiones en función de laprevalencia de los rebaños a la brucelo-sis bovina y dentro de estos están cate-gorizadas en dos giros productivos (car-ne y leche) y dentro de los mismos ensiete categorías en función del tamaño delrebaño. Estos anidamientos nos dan 70unidades teóricas de entrada al modelo.
Como resumen de la información ma-nejada en la Figura 17 se observa ladistribución de los rebaños, poblaciónsusceptible y focos de la enfermedad locual marca diferencias sustanciales en-tre las regiones determinadas eviden-ciando la importancia de esta categori-zación.
TRANSMISIÓN ENTREREBAÑOS
Como se esquematizó en la Figura 9,la transmisión entre rebaños se prevé através del movimiento de animales porta-dores o por contigüidad de los rebañosinfectados y susceptibles.
Transmisión por movimiento deportadores
Nos referiremos en primera instanciaa la transmisión de la brucelosis bovina a
través del movimiento de un reemplazoinfectado que ingresa a un estableci-miento limpio (susceptible).
El primer supuesto importante en estetipo de transmisión es que los rebañosinfectados detectados (focos) de la en-fermedad están cuarentenados (interdic-tados) y por lo tanto no participan de estatransmisión (son excluidos de la consi-deración en esta transmisión).
Como base para modelar esta trans-misión de la brucelosis utilizaremos lafunción doble binomial desarrollada porBeal y reportada por Amosson y Dietrich (1).
Los parámetros de la función son: p,s, q, m y n definiéndose de la siguienteforma:
p = proporción de vacas en rebañosinfectados con relación al total de vacasde la población. Podríamos decir que esla proporción de vacas expuestas pasi-bles de ser movidas, ya que no han sidodetectadas la enfermedad en el rebaño.En este caso asumimos que todas lasvacas de un rebaño infectado son ex-puestas y pasibles de ser movidas condestino a otro rebaño.
q = 1 – p = complemento de p oproporción de vacas en rebaños no infec-tados con relación al total de vacas de lapoblación. Es la proporción de vacas noexpuestas y susceptibles.
n = número de orígenes (fuentes) dife-rentes de los reemplazos que se ingresan.
Figura 17. Distribución de los porcentajes de rebaños, focos y poblaciónbovina susceptible para cada una de las categorías regionalesdefinidas.
0%
13% 14%
10%
18%
45Brucelosis bovina
m = número medio de reemplazosingresados por origen de los mismos. Esel cociente del número de reemplazosingresados en el año sobre n (el númerode orígenes diferentes de estos reempla-zos).
s = complemento de la prevalencia enrbaños infectados (1 – prevalencia). Di-cho de otra forma s es la prevalencia delas vacas no infectadas en rebaños infec-tados no detectados.
La función doble binomial definida porBeal (1) que estima la probabilidad detransmisión de la brucelosis a través delos movimientos de portadores para cadaregión, giro y tamaño poblacional es:
El número de rebaños nuevos infecta-dos por región, giro y tamaño de rebañoes igual a la probabilidad de comprar unoo más reemplazos infectados para esaregión, giro y tamaño de rebaño por elnúmero de rebaños susceptibles en esegrupo.
N1 = N° de rebaños nuevos infectadosPPhij = Probabilidad de comprar uno o
más animales infectados (portadores) parala región i, giro h y tamaño de rebaño j,
Nhij = N° de rebaños susceptibles (lim-pios) en la región, giro y tamaño derebaño de destino
h = 1, 2 giro productivoi = 1, 2, 3, 4 y 5 regionesj = 1, 2, …, 6 y 7 tamaño de rebañosLL = origen del reemplazo adquirido
en una región, giro y tamaño de rebañodado.
pr = probabilidad de compra de unreemplazo en una región, giro y tamañode rebaño dado.
A los efectos de estimar la prevalen-cia de la brucelosis bovina en el Uruguayla Dirección General de los ServiciosVeterinarios realizó un muestreo nacio-nal en el período agosto-diciembre del2009. La selección de la muestra fueproporcional a la población de los esta-blecimientos (PPS) e implicó la visita ytoma de muestra de 587 rebaños en todoel país y la obtención de muestras sero-lógicas de 27.641.
La prevalencia aparente estimada enhembras bovinas fue 0,25% con un errorestándares 0,0885% siendo 0,080 – 0,415el intervalo de confianza del 95%.
La estimación de punto de la prevalen-cia aparente de los rebaños fue de 1,62%con un error estándar de 0,757%. En elCuadro 14 se muestran los resultados deuna pos-estimación por giro productivode la prevalencia de rebaño y el límitesuperior del intervalo del 95%.
Dado el conocimiento que se tiene delnúmero de focos detectados (cuarente-nados), la diferencia entre los mismos ylas estimaciones del muestreo nacional
1nmq ps
En nuestro modelo los parámetros dela función de transmisión en realidad noson conocidos y por lo tanto se utilizanestimadores que variaran estocástica-mente en función de los valores de lasdistribuciones que mejor los represen-ten, para cada una de las interaccionesdel modelo.
Los parámetros p, s y q dependen delnúmero de vacas y rebaños infectadosno detectados en la región, por lo tantocambiaran de año en año según que lapoblación no detectada se expanda ocontraiga.
La distribución que estima los pará-metros m y n se establecerá para el añoinicial del modelo por región, giro y grupode tamaño de rebaño y se ajustará en losdiferentes años de simulación según losajustes poblaciones que vaya teniendo elmodelo.
Cada región tiene cierta posibilidadde comprar en su propia región o en c/ude las otras regiones, estas probabilida-des suman 1 y se mantienen constantesdentro de cada interacción del modelo.La probabilidad de transmisión a unaregión dada desde otra será el productode la probabilidad de transmisión (doblebinomial) por la probabilidad de adquirirreemplazos en esa región.
5
1
(1 (( ) )m nhij r hijhiLL
LL
PP p q PS
46 Brucelosis bovina
aportan los elementos necesarios paraestimar el número de rebaños infectadosno detectados.
En la Figura 18 podemos observarque el número de movimientos entre re-baños de categorías susceptibles crececlaramente en función del tamaño de losmismos, por lo cual caracterizar estarelación aporta un elemento fundamental
para estimar los riesgos en cada catego-ría propuesta.
En el Cuadro 15 podemos observarque no solo el número de movimientossino que el número de vacas aumentasustancialmente cuando aumenta el nú-mero de rebaños. Obviamente la variablenúmero de movimientos y número deanimales movidos están altamente co-
Cuadro 14. Estimación de la prevalencia de rebaños y del número de rebañosafectados por brucelosis bovina y la posestimación por giro productivo(leche, carne).
Figura 18. Número de movimientos anuales por rebaño enfunción del tamaño de rebaño expresado en númerode cabezas susceptibles.
Cuadro 15. Número de rebaños, número de movimientos y número devacas movilizadas de rebaño a rebaño, según tamaño de losrebaños en número de vacas por rebaño
Giro Prevalencia Nº de RebañosEstimación Límite superior Estimación Límite superior
Leche 2,24% 6,66% 74 222Carne 1,42% 3,11% 536 1.172Rebaños 1,62% 3,11% 667 1.271
Población Rebaños N° mov. N° vacas0 2.473 514 8.301
1 -30 17.596 4.730 50.85531- 65 7.264 5.473 64.05566 -100 3.918 4.064 55.783101 -200 5.664 9.364 155.118200 -500 4.985 13.479 283.307
> 500 2.908 20.801 612.559Total 44.808 58.425 1.229.978
47Brucelosis bovina
rrelacionadas y a su vez están asociadascon el tamaño de los rebaños ya que auna misma tasa de reemplazo rebañosmás grandes requerirán más animalesen números absolutos.
Si bien el número de movimientos y deanimales movidos de una región a otrason un factor de riesgo fundamental parala transmisión de la brucelosis bovina, lacaracterización del riesgo de las regio-nes origen de los reemplazos estará aso-ciada al riesgo de la transmisión de laenfermedad. En la figura IV.11 se obser-va que en todas las regiones los movi-mientos más importantes son dentro dela propia región, pero también son impor-tantes los movimientos recibidos de otrasregiones con un riesgo epidemiológicodiferente.
Transmisión por contigüidad(linderos)
La otra posibilidad de transmisión dela infección hacia un rebaño susceptible(limpio), que se esquematizó en la FiguraI19, es a través del contacto con unrebaño vecino infectado.
Asumimos que un rebaño cuarentena-do (interdicto) tiene menos probabilidadde difusión que uno no detectado, porqueseguramente se han tomado medidasprecautorias para tratar de evitar la trans-misión de la brucelosis entre linderos.
Otros factores que pueden incidir enla potencialidad de transmisión son: elnúmero de años de infección, el tamañototal del rebaño y el número de linderossusceptibles.
En la Figura 20 se observa la distribu-ción de los tiempos de saneamiento ne-cesario para los focos que se sanearon aabril del año 2010, observándose que encasos excepcionales se requirió hastasiete años para sanear algún foco aun-que la mayoría requirió tres años o me-nos. También se observa en la Figura 21que en los focos activos de la enferme-dad se mantienen vigentes algunos focosde larga data.
Figura 19. Porcentaje de animales susceptibles movilizados de rebaño a rebañopor región de origen según región de destino.
hij hij hij hijInf T Pd Lind
Infhij = nuevos rebaños infectados porregión, pasan a engrosar la categoría deinfectados no detectados
Thij = total de rebaños infectados porregión, giro y tamaño, ajustados por nú-mero de años infectados y estatus (de-tectado o no).
Pdhij = probabilidad de transmisión porcontigüidad a un lindero ajustado porregión, giro y tamaño.
Lindhij = número de rebaños linderossusceptibles por rebaño infectado.
48 Brucelosis bovina
Las estimaciones de las variables quedeterminan los nuevos rebaños infecta-dos por contigüidad variaran estocásti-camente en cada uno de las interaccio-nes de acuerdo a las funciones de proba-bilidad adecuada para cada uno de ellos.
Programas de Vigilancia
Los programas de vigilancia estánesquematizados en la Figura 22. La base
de datos de rebaños infectados detecta-dos tiene algunas variables incompletas,en especial la causa o forma de detec-ción de los focos donde no está registra-da la misma para el 51% de los mismos.No obstante este sesgo potencial sepueden observar las principales causasde detección de aquellos que tienen estávariable registrada.
Figura 20. Días necesario para el saneamiento de los focos de Brucelosis bovinasaneados a abril 2010.
Figura 21. Días en saneamiento de los focos de Brucelosis bovina activos en abril2010.
20
15
10
50
00 500 1000 1500 2000 2500
d_cierre
0 500 1000 1500 2000 2500d_abierto
20
15
10
50
0
Por
cent
aje
Por
cent
aje
49Brucelosis bovina
Otro sesgo importante que estos da-tos tienen, además de la omisión deregistro, es que en el período considera-do (2002-2010) los sistemas de vigilan-cia no fueron constantes y se registraronvarios cambios importantes en la estra-tegia y cobertura. Por lo expuesto no esposible evaluar los sistemas de vigilanciasin considerar los aspectos menciona-dos.
En general la probabilidad de detec-ción de un rebaño infectado para cadauno de ellos estará determinada por lacobertura anual del programa (Cahij), lasensibilidad de rebaño de la prueba oestrategia diagnóstica utilizada (HSehij),como se selecciona la muestra, el tama-ño de la muestra (n) y el número derepeticiones anuales (R) con que la mis-ma es aplicada por rebaño.
La cobertura anual del programa es laproporción de los rebaños de la pobla-ción que son vigilados (investigados através de una muestra) en cada año paracada región, giro productivo y tamaño depoblación.
Pap = prevalencia aparente. Proporciónde individuos que resultan positivos a unaprueba diagnóstica. Dependerá de la pre-valencia real (P) y de la sensibilidad (Se)y especificidad (Sp) individual de la prue-ba o estrategia diagnóstica utilizada.
Figura 22. Distribución histórica de las formas de detección de rebañosinfectados.
(1 ) (1 )apP P Se P Sp
HSe = sensibilidad de la prueba derebaño utilizada dependerá de la sensibi-lidad (Se) y especificidad (Sp) individualde la prueba de diagnóstico utilizada, laprevalencia intra-rebaño de la enferme-dad (P) investigada, del tamaño de lamuestra analizada (n) y del criterio utili-zado para considerar como positivo elrebaño (en general se considera positivocuando 1 o más individuos tiene un resul-tado positivo en la prueba) (23).
Para el caso en que se considerapositivo un rebaño si al menos alguno delos individuos muestreados son positivosy que la fracción de muestreo es baja, lasensibilidad de rebaño es estimada através de:
1 (1 )napHSe P
nHSp Sp
HSp = especificidad de la prueba derebaño utilizada dependerá de la especi-ficidad (Sp) individual de la prueba dediagnóstico utilizada, del tamaño de lamuestra analizada (n) y del criterio utili-zado para considerar como positivo elrebaño (número de individuos positivosnecesarios para declarar positivo a unrebaño) (23).
Para el caso en que se considerapositivo un rebaño si al menos alguno delos individuos muestreados son positivosy que la fracción de muestreo es baja laespecificidad de rebaño es estimada através de:
50 Brucelosis bovina
El número de rebaños infectados de-tectados para cada región giro y tamañopoblacional será función de la probabili-dad de detección del sistema de vigilan-cia PDet(+) empleado por el número derebaños infectados no detectados en esaregión, giro y tamaño poblacional en eseaño considerado.
gráfico podría inducirnos a pensar que lagravedad de esta enfermedad es muchomayor en la ganadería de carne, peroesto ignora que este sistema es muchomás importante en número absolutosque la lechería.
En la Figura 24 se pone en perspecti-va la situación de los focos de brucelosisen cada giro productivo al referenciar elnúmero de estos cada mil rebaños de lapoblación. Este gráfico pone en eviden-cia que la presencia de la brucelosis enla lechería ha sido mucho más importan-te que en la ganadería para carne y quelas medidas que se han tomado han sidoefectivas.
Por otro lado la ganadería para carne,si bien no ha sido tan afectada, muestraen los últimos años un crecimiento en elnúmero de focos; lo cual puede ser atri-buido a un avance en la enfermedad o quese aumentó la detección por un incre-mento en la vigilancia.
En la Figura 25 se expresa cual hasido la cobertura de vigilancia serológicacada mil hembras. Esta muestra que enel giro lechero se han invertido muchomás recursos, lo cual explica su avancey que en la ganadería para carne si bienha invertido mucho menos está mostran-do que en los últimos años un incrementoimportante. Este incremento en la vigi-lancia serológica en ganado para carneexplica al menos en parte los avances enla detección de los rebaños infectados.
1
( )hij hij
R
Det hij a hij rebr
P C HSe P
El número de rebaños falsos positivos
resultantes FPhij para cada región giro ytamaño poblacional será función de lacobertura del sistema, de la especifici-dad de la prueba de rebaño empleada yde la proporción de rebaños susceptiblesen la población en esa región, giro ytamaño poblacional en ese año conside-rado.
El número de rebaños detectadosanualmente determinará quiénes seránlos nuevos cuarentenados (interdictados)en la población de rebaños y que inicia-rán el proceso de saneamiento.
La Figura 23 que describe el númerode focos de brucelosis (rebaños infecta-dos) por giro productivo detectados poraño muestra una tendencia creciente enla ganadería para carne, mientras que enla ganadería para producción de lecheluego del pico que significo el año 2005viene cayendo en forma sostenida. Este
Figura 23. Número de rebaños infectados detectados por año segúngiro productivo. Enero 2002 a abril 2010.
1032
59
100
5135 31 25
51Brucelosis bovina
Supuestos
Resumiendo los supuestos que elmodelo entre-rebaños asume se debenmencionar los siguientes:
• Unidad de tiempo anual.• Unidad de estudio rebaño.• Establecimientos infectados-de-
tectados no mueven, bajo ningunacircunstancias, animales de ries-go con destino a un establecimien-to susceptible. No transmiten porMovimientos.
Figura 24. Número de rebaños infectados detectados cada milrebaños por año según giro productivo. Enero 2002 aabril 2010.
Figura 25. Evolución de la vigilancia a través del número deserologías registradas cada mil hembras bovinas poraño según giro productivo. Enero 2005 a abril 2010.
• Todos los rebaños infectados pue-den transmitir la enfermedad porcontigüidad (linderos).
• Los rebaños vacunados son total-mente resistentes a la enferme-dad.
• Los rebaños infectados saneadosvuelven a la categoría infectados.
• Los rebaños susceptibles que re-ciben un portador se infectan.
• Unidad geográfica de trabajo parael modelo es la Sección Policial.
52 Brucelosis bovina
Salidas del Modelo
Las principales salidas que el modeloproporcionará por región, giro y tamañopoblacional para las estrategias de vigi-lancia seleccionadas son:
• Número de rebaños infectados.• Número de rebaños detectados y
cuarentenados.• Número de rebaños falsos positi-
vos.• Incidencia anual de la enfermedad
en rebaños.• Incidencia anual de la enfermedad
en bovinos.• Número de bovinos a ser sacrifica-
dos.
• Número de análisis de laboratorionecesarios por técnica de diag-nóstico utilizada.
• Necesidades de producción o im-portación de reactivos de diagnós-tico.
• Estimación de pérdidas físicas (le-che y carne) asociadas con cadaprograma.
• Costo de la indemnización por elsacrificio de reactores.
• Costo de la vigilancia epidemioló-gica.
• Costo global del programa selec-cionado.
Estas salidas podrán ser por año opara un determinado número de años.
53Brucelosis bovina
TIPO DE PRODUCCIÓN"LECHERA"
Para modelar la difusión de la Bruce-losis dentro de un Rebaño Lechero sedesarrolló un modelo estocástico basa-do en cada individuo, que en conjuntoconforman la población del estableci-miento [stochastic individual-based mo-del (IBM)]. De esta manera los eventosocurren en un animal dado (infección,aborto, refugo, etc.), siendo posible eva-luar el rebaño por medio de la sumatoria
de eventos individuales en cualquier pe-ríodo o en un conjunto de períodos.
Para los modelos IBM debe definirseuna población de partida, que será lamisma cada vez que comience la prime-ra iteración de cada simulación. Es posi-ble variar esta población para generardiferentes escenarios, cómo podría serestablecimientos chicos, o estableci-mientos grandes. En el modelo desa-rrollado se consideró un rebaño lechero de120 vacas en ordeñe (DICOSE 2008, me-diana=103 bovinos para giro lechero).
V. Modelo de difusiónde la Brucelosis
bovina intra rebaños
José Piaggio*, Andrés D. Gil*
*Dirección General de los ServiciosGanaderos - MGAP
Vacas portadoras Ingreso Brucellarebaño
Trasmisión
Material infectante
Terneras Vaquilonas 1-2 Vaquilonas > 2 Vacas cría Vacas refugo
Ternero normal
Ternero infectado
Liberación Brucellas
Ternero normal
Ternero infectadoLiberación Brucellas
Portadoras intermitentesAbortos
Seroconversión
PartoPreñez
Aborto
Figura 26. Composición del rebaño y ciclo de la brucelosis bovina dentro del mismo.
54 Brucelosis bovina
En la población inicial, se incluye unanimal infectado, de manera de simularla evolución de la infección dentro delrebaño durante el transcurso de los dife-rentes períodos (en todas las iteracionesse parte de la misma situación inicial).En diferentes simulaciones se puedevariar la categoría del animal infectadopara evaluar el comportamiento del mo-delo en estos diferentes escenarios.
Al ser un modelo estocástico, paracada variable de salida se obtendrá unadistribución de resultados. Esta distribu-ción estará constituida por el resultadode esa variable en cada iteración.
El modelo planteado es un modelo detransición de estados para tiempo dis-creto. La unidad de tiempo que componeun período es un mes, y el número deperíodos que forman una iteración es de180 meses (15 años).
MODELO CONCEPTUAL
Estados:
• Susceptible (hembras a partir delos 18 meses, con excepción detransmisión vertical).
• Infectado (incluye latencia).• Inmune (por vacunación).
PARÁMETROS DEL MODELOVaquillonas: Pubertad: 18 meses.
Comienzo de la 1ra gesta-ción 24 meses de edad. 1er parto 33 meses de edad.
Gestación: 9 meses.Parto - Concepción: 3 meses.Duración de la lactancia: 10 meses.Período seco: 2 meses.N° de Lactancias: 5.Causas de Refugo: 90 meses de edad,acumulación de 2 abortos y otras causas(estado de la ubre y mastitis, problemaspodales, baja producción etc.).Tamaño del rebaño: 120 vacas (medianaDICOSE 2008, 103 bovinos para girolechero).Parición continúa.Sexo de la cría: terneras 50%.Venta de vaquillonas (28 meses) se ajustapara mantener nº de vacas en ordeñe (VO).
La demografía del establecimiento seafectará por los abortos (Br.Bovina yotras causas), la mortalidad desde elparto al final de la recría y el refugo deanimales.
Probabilidad de aborto por otras cau-sas: 0,025 (2,5%)
Los sobrantes de los reemplazos sevenderán como vaquillonas preñadas (a
Figura 27. Modelo de transición de estados.
Susceptible Infectado
Inmune* cada individuo de la población existe en un
estado de enfermedad (que también puedeser la ausencia de enfermedad)
* los individuos no pueden tener más de unestado de la enfermedad
55Brucelosis bovina
los 28 meses de edad). Si entre lasvaquillonas vendidas hubiera alguna in-fectada, será registrada en los outputsdel modelo (salida de animales infecta-dos), para ser considerado por el modelode difusión entre rebaños.
Los terneros machos no serán consi-derados para la transmisión (saldrán delmodelo), no quedando como reproducto-res en el establecimiento, pudiendo serconsiderados dentro de la evaluacióneconómica.
Susceptibilidad
Debido a que está asociada fuerte-mente a la madurez sexual, los animalesinmaduros (vaquillonas menores de 18meses) no se consideran susceptiblesen el modelo para la transmisión horizon-tal de la enfermedad, mientras que losanimales maduros son altamente sus-ceptibles a la enfermedad. En la probabi-lidad de infección se consideran la elimi-nación de material infectivo (membranas,fetos) al medio, la sobrevida del agenteen el tiempo y la probabilidad de exposi-ción, siendo la susceptibilidad de losanimales maduros sexualmente (no va-cunados) del 100%.
Figura 28. Esquema de la dinámica poblacional de individuos normales.
Figura 29. Esquema de la dinámica poblacional de individuos infectados.
Mortalidad (parto, cría, recría yadultos)
La mortalidad desde el parto hasta lafinalización de la recría será consideradaen su globalidad con un valor del 4%(muerte de animales por toda causa). En elmodelo se considera en forma probabilísti-ca asignando a cada animal una probabili-dad=0.04 de morir al momento del parto.
La dinámica poblacional sin infeccióndefine el Perfil Productivo del Sistema, yes considerado el Control para analizarlas diferencias con los predios cuandoexiste infección. Para ello se corre elmodelo de simulación para obtener esti-maciones de algunas variables como laventa de vaquillonas, período interparto yproducción de terneros.
MODELO CON INFECCIÓNCada animal infectado transcurrirá en
los siguientes períodos, registrándoselas variables de interés como si aborta otiene un parto normal, la presencia deanticuerpos en suero y leche, si es ven-dido o refugado.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
a) Dinámica reproductiva normal de un animal sano durante 90 meses
Edad (meses)Est. preñezEst. lactancia
Animal joven (antes de la primera gestación) 1ra preñez 2da preñez
46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 903ra preñez 4ta preñez 5ta preñez
2da lactancia 3ra lactancia 4ta lactancia 5ta lactancia
1. Introducción de Brucella abortus en el establecimiento.b) Posible infeccion, eventos reproductivos y detección de anticuerpos en un animal de 1,5 años al introducirse la Brucella en el establecimiento.
Edad (meses)Est. preñezEst. lactanciaSerologíaATC en leche
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 4518 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
1ra preñez 2da preñez 3ra preñez 4ta preñez
Lactancia Lactancia+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + +Infección del animal 1er aborto Refugo
56 Brucelosis bovina
PROBABILIDAD DE ABORTOEl aborto por brucelosis bovina (BrB)
puede ocurrir desde el período siguienteal de infección (no en el período en el cualse infecta el animal), y dependerá delmomento de la infección:
A) Animales vacíos (no gestados) almomento de la infección, o con infeccióndurante la gestación temprana (1er a 6to mesde gestación), abortarán [P(aborto)=1] du-rante la gestación actual (para los gestan-tes) o en la próxima gestación (animalesvacíos al momento de la infección).
Para asignar una probabilidad en cadaperíodo, de forma que en esa gestación laprobabilidad de abortar sea P(aborto)=1,se asignan valores crecientes de probabi-lidad de abortar (los valores de p_acum enel Cuadro 16) de manera que para el 9ºmes, si aun no se ha producido el aborto,la probabilidad será=1.
En el Cuadro 17 se observa el momen-to de infección y las probabilidades deaborto (p_acum) para cada mes de ges-tación.
Cuadro 16. Probabilidad de aborto en animales vacíos
a.Infectados durante 7º u 8º mes degestación. Si la infección ocurre du-rante 7º mes de gestación, las pro-babilidades de abortar en el 8º mes(0.25) o 9º mes (0.45) determinan,en conjunto, que un animal infectadodurante el 7º mes presente una pro-babilidad de abortar P(aborto)=0.587.b.Para animales infectados duranteel 8º mes de gestación la probabili-dad de aborto será únicamente en el9º mes de gestación (p=0.45).
B) Si la infección ocurre durante el 9ºmes de gestación, no se producirá abor-to. Pero la probabilidad de mortinato seráde 0.10. También existirá seroconversiónluego del parto.
C) Probabilidad de que un animal in-fectado aborte en gestaciones siguien-tes será P(ab)=0.3. La asignación de laprobabilidad de abortar durante un mesen particular se determina mediante elsolver del Excel de forma que la probabi-lidad global sea = 0.30. Esta probabilidadsurge del Cuadro 18 y de la Figura 30.
Cuadro 18. Proba
Gestación temprana (meses 1,2,3, y 4) p p acum.5to 0,05 0,05
6to 0,1 0,15
7mo 0,4 0,55
8vo 0,4 0,95
9no 0,05 1
5to 0 0
6to 0,05 0,05
7mo 0,3 0,35
8vo 0,45 0,8
9no 0,2 1
5° mes gestación p p acum.
6° mes gestación p p acum.
5to 0 0
6to 0 0
7mo 0,1 0,1
8vo 0,45 0,55
9no 0,45 1
57Brucelosis bovina
Cuadro 17. Probabilidad de aborto para animales infectados en el mes 7 y 8 gestación
Cuadro 18. Probabilidad de aborto en gestaciones siguientes
18. Probabilidad de aborto en gestaciones siguientes
Figura 30. Aborto: árbol de probabilidades de aborto en gestaciones siguientes (probabilidad deaborto cada mes).
5to 0 06to 0 07mo 0 08vo 0,25 0,259no 0,45 0,7
7° mes gestación p p acum.
8° mes gestación p p acum.5to 0 06to 0 07mo 0 08vo 0 09no 0,45 0,45
0,5875P (abortar) = 1- [(1-0,25)*(1-0,45)]
Mes gestación Frecuencian P (aborto) 1 0 2 0 3 0 4 0
5to 0,05 0,016797676to 0,1 0,033595347mo 0,4 0,134381358vo 0,4 0,134381359no 0,05 0,01679767
1P (aborto) 0,30000003
No aborta
Aborta
aborta
aborta
aborta
aborta
aborta
mes 5
mes 6mes 7
mes 8mes 9
58 Brucelosis bovina
D) También se consideran abortos porotras causas (2,5%). La metodología paraasignar un valor en cada mes de gesta-ción es la misma que para el puntoanterior, construyendo un árbol de proba-bilidades y calculando mediante el solverdel Excel las probabilidades de formaque, para cada animal, la probabilidadglobal de abortar durante la gestaciónsea 0.025 (Cuadro 19).
REFUGO POR OTRASCAUSAS
Se utilizó la misma metodología, asig-nando un valor de probabilidad de refugoen cada lactancia, construyendo un árbolde probabilidades y calculando medianteel solver del Excel las probabilidades deforma que, para cada animal, la probabi-lidad global de abortar durante todas suslactancias sea 0.02 (Cuadro20).
TRANSMISIÓNLa propagación de la infección entre
las unidades (animales susceptibles aBrB del establecimiento) puede producir-se en forma horizontal o vertical.
Probabilidad de infecciónhorizontal
Se producirá infección horizontal cuan-do se libera material infectivo en el medioambiente y existe contacto con animalessusceptibles. Los modelos de transmi-sión de la Br. Bovina consideran única-mente los eventos de mayor importanciay significación, como ser la liberación debacterias cuando se produce un aborto oparto de un animal infectado (se liberan1014 bacteria/gr) dejando de lado las po-sibles contaminaciones que produce almedio un animal infectado, por secrecio-nes o excreciones, por considerarlas deescaza importancia en la transmisión.Igualmente para la susceptibilidad, sibien existen variaciones individuales, seconsiderará que un animal adulto (luegode la pubertad) será 100% susceptible.
La probabilidad de infección será máxi-ma en el período en que ocurre el abortoo parto, para luego disminuir progresiva-mente. Será determinada por la probabi-lidad de contacto (o exposición) conmaterial infectivo y de características delagente como la viabilidad, que varía conel tiempo y es afectada por las condicio-nes ambientales (temperatura y hume-dad).
De acuerdo a la literatura, consideran-do nuestras condiciones de producción,el modelo considera un tiempo máximode 6 meses para que un material infecti-vo, luego de aborto o parto pueda produ-cir infección de un animal susceptible.Respecto a estos últimos, no se consi-derarán animales susceptibles a la trans-misión horizontal los animales menoresde 18 meses.
La probabilidad de infectarse que tie-ne un animal, será el producto de laprobabilidad de tener contacto con mate-rial infectivo (Cuadros 21 y 22) por laprobabilidad de infección dado que hasido expuesto.
Cuadro 19. Abortos por otras causas
Cuadro 20. Probabilidad de refugo
Mes gestación Frecuencia P (aborto) Frec. relativa
1 0,1 0,00091849 0,033898312 0,2 0,00183698 0,033898313 0,2 0,00183698 0,067796614 0,3 0,00275547 0,101694925 0,75 0,00688866 0,254237296 0,6 0,00551093 0,202389837 0,5 0,00459244 0,169491538 0,3 0,00275547 0,101694929 0,1 0,00091849 0,03389831
2,95 1
P (aborto) 0,025
Lactancia Frecuencia P (refugo) Frec. relativa
1 5 0,00201294 0,076923082 10 0,00402587 0,153846153 10 0,00402587 0,153846154 20 0,00805175 0,307692315 20 0,00805175 0,30769231
65 1
P (refugo otras) 0,01999997
59Brucelosis bovina
Cuadro 21. Tiempo de supervivencia de la brucella según tipo demateriales contaminado
La probabilidad de infectarse que tie-ne, un animal susceptible si es expuesto(contacto con material contaminado)Prob(inf) pm, estará asociada a la infec-ciosidad del material contaminado y suvariación en el tiempo (dependiendo de laviabilidad del agente), por lo que se leasigna un valor mensual, por un lapso de6 meses.
El valor de pm durante el período delaborto o parto es igual a 1, para luego
Fuente: Acta Bioquim Clin Latinom 2005; 39(2): 203-16.
Cuadro 22. Tiempo de supervivencia de la brucella según mediocontaminado
Fuente: adaptado de Nicoletti (1980).
decaer pronunciadamente. En este pun-to fue considerando el largo de cadaperíodo (un mes) y nuestras condicionespastoriles de producción (Cuadro 23).
La probabilidad de contacto con elmaterial contaminado pc (fetos, membra-nas …) será máxima en el período en queocurre el aborto o parto de un animalinfectado (0.10 para animales del tam-bo), dado el comportamiento de los bovi-nos (acercarse a olfatear y lamer el feto,
Material Tiempo de supervivenciaSuelo y estiércol 80 díasPolvo 15 – 40 díasLeche a temperatura ambiente 2 – 4 díasFluidos y secreciones en verano 10 – 30 minutosLanas de depósitos 110 díasAgua a 37 °C y pH 7,5 Menos de 1 díaAgua a 8 °C y pH 6,5 Más de 57 díasFetos mantenidos a la sombra 6 – 8 mesesDescarga vaginal mantenida en hielo 7 mesesManteca a 8 °C 1 – 2 mesesCuero manchado con excrementos de vaca 21 díasPaja 29 díasGrasa de ordeñe 9 díasHeces bovinas naturales 1 – 100 díasTierra húmeda a temperatura ambiente 66 díasTierra desecada a temperatura ambiente 4 días
Medio Temperatura/ambiente ViabilidadLuz solar <31 °C 4,5 horasAgua -4 °C 114 díasAgua Ambiente 77 díasSuelo Ambiente seco <4 díasSuelo Húmedo 66 díasEstiércol Verano (Rusia) 1 díaEstiércol líquido Verano (Rusia) 108 díasEstiércol Invierno (Rusia) 53 díasEstiércol líquido Invierno (Rusia) 174 días
60 Brucelosis bovina
Cuadro 23. Probabilidad mensual de infección
placentas, etc.). Luego esta probabilidadpasará a ser constante en los períodosposteriores, considerando que tanto unfeto cómo las membranas permanecensólo en el período del aborto o parto, enel medio, debido a la existencia de zo-rros, perros, aves rapaces etc. A partirdel 2do mes, por lo tanto, la probabilidadde contacto será únicamente con losmicroorganismos presentes en la pastu-ra y bosta (no por contacto con fetos nimembranas), la cual será constante porel resto de los períodos. Otros modelossuponen que dado un aborto o parto, seinfectará un número dado de animales,ej. 2, incluso puede modelarse medianteuna distribución Poisson.
El número de animales que puedanser infectados variará con el número deanimales presentes en el lugar que seproduce la descarga de microorganis-mos. En el presente modelo se partió delsupuesto de que todos los animales pre-sentes en ese potrero tienen igual proba-bilidad, y constante, de tener un contac-to con el material infectivo, independien-te del número de animales. Para losanimales secos, la probabilidad de con-tacto empleada para el período del abortoo parto fue de 0.20, dado que coincidiránen ese potrero un número muy inferior deanimales.
La probabilidad de infección horizon-tal se consideró diferente por categoríade manejo (debido a que se manejan engrupos para pastoreo, ordeñe etc.), con-siderando la exposición de los animalesque cohabitan en el potrero.
Las Terneras, en principio, no se con-siderarán susceptibles. Las vaquillonasserán consideradas como una categoríahasta el 7mo mes de gestación, en el 8vo y9no se supone que están en conjunto conlas vacas secas, que forman otro grupo
de animales que están juntos. Finalmen-te, todas las vacas en lactación sonconsideradas como un grupo (desde elpunto de vista del contacto). En resu-men, se consideran cuatro compartimen-tos de animales, y el riesgo de exposi-ción se calcula en cada uno de ellos.
La probabilidad de infección (en unperíodo y compartimento dado) pt estarádada por la probabilidad de tener contac-to con el material contaminado pc (fetos,membranas …) multiplicada por la proba-bilidad de infectarse pm, de acuerdo a losabortos o partos de animales infectadosocurridos hasta 6 meses antes del perío-do actual en dicho compartimento (potre-ros usados por esa categoría de anima-les): pt= pm×pc
También se incorpora la posibilidadde ocurrencia de más de uno de estoseventos de contaminación en el mismoperíodo y compartimento, y su posibili-dad de ocurrencia en diversos períodos alo largo del tiempo (6 meses previos).Cuando exista más de un aborto o partoen un período, se calcula la probabilidadde infección debida a esos eventos comoP(inf)=1-P(no infección)= 1-qn donde nes el número de abortos (y/o partos)ocurridos en un mismo período, y q=1-(probabilidad de infección de un animalsusceptible en ese período q=1-pt ). Lossupuestos para aplicar la DistribuciónBinomial, en este caso, son que la proba-bilidad de contacto de todos los anima-les con el material contaminado es cons-tante y la misma para cada uno de los neventos contaminantes.
Finalmente, para considerar la posi-ble infección debida a abortos ocurridosen diferentes períodos (previos) en cadacompartimento, se determinará la proba-bilidad de acuerdo a un árbol de probabi-lidades, en el cual se considerarán las
Mes Exp. P (inf)pm P (cont)pc pm*pc
1 1 0,1 0,100002 0,2 0,01 0,002003 0,1 0,01 0,001004 0,05 0,01 0,000505 0,01 0,01 0,000106 0,001 0,01 0,00001
61Brucelosis bovina
probabilidades de ocurrencia para los 6períodos anteriores. En cada nodo existeuna P(inf), de acuerdo al cálculo ante-rior, por lo cual considerando los 6 perío-dos la Probabilidad final de infecciónP(final) estará dada por 1- la probabili-dad que no se infecte (de acuerdo al árbolde probabilidades).
Cambio de categoría de riesgo pormanejo (potrero): Este cambio, implicaun cambio del lugar en que se encuentrael animal. Por ejemplo, un animal luegodel parto pasará a estar con los animalesque están lactando; entonces el riesgode infección horizontal (exposición) rela-cionado a períodos anteriores será elvinculado a abortos (previos) de vacasque abortaron mientras se encontrabanen lactación. En forma equivalente, parauna vaca que es secada, y por tantocambia de potrero y compañeras, el ries-go de infección horizontal estará vincula-do al área de parto y manejo de las vacassecas (abortos o partos previos de anima-les infectados en ese compartimento) (Fi-gura 31).
Probabilidad de infecciónvertical
In útero, al parto, o por ingestión decalostro, el modelo asume que el 20% delos terneros nacidos de vacas infectadasserán infectados.
Figura 31. Árbol de probabilidades (Probabilidad de infección horizontal).
DETECCIÓNLa detección de los animales infecta-
dos depende de la aplicación de lasmedidas de vigilancia y de la sensibili-dad y especificidad de las pruebas diag-nósticas empleadas (PAL, RB, Rivanol,ELISA, FPA, etc.) y en conjunto, delesquema diagnóstico elegido (pruebasen: serie, paralelo, retest, etc.)
VIGILANCIA
Denuncia Abortos (nº de abortos).Serología (nº de animales sero+).Leche Tanque (nº de vacas que eliminanAnticuerpos en leche).Movimientos (nº animales infectados quesalen).Plantas de Faena (nº de animales infec-tados que salen a PF).
Cada uno de los componentes delsistema de vigilancia epidemiológica semodela como ser: estrategia o esquemadiagnóstico, Se y Sp de las pruebasempleadas, nivel de denuncia de abortos(Ab), muestreos en movimientos, plan-tas de faena y leche tanque. Esta es lamanera de incorporar la variabilidad eincertidumbre, y poder estudiar, median-te el análisis de sensibilidad, la asocia-ción de cada una de estas variables deentrada con los outputs del modelo.
SI
SI
SI
SI
SI
SI
62 Brucelosis bovina
A su vez es posible analizar diferentesescenarios, que pueden constituirsemediante el empleo de diferentes medi-das de vigilancia, o diferentes técnicasde diagnóstico o esquemas a emplear, ocambiando la intensidad o frecuencia demedidas ya existentes.
ANTICUERPOSLas terneras infectadas verticalmente
no expresarán anticuerpos (ATC) hastala ocurrencia del aborto. Las vaquillonasinfectadas previamente a la primera ges-tación mostrarán ATC en suero y leche almomento del aborto, mientras las vacasinfectadas posteriormente a la primeragestación lo harán en forma inmediata ala infección. La expresión de anticuerposen suero y leche se considera simultá-nea (cuando el animal está lactando).
INTERVENCIÓNFoco Saneamiento. Para el
saneamiento del foco se aplican lasmedidas estipuladas por el Programa,con los diferentes sangrados, elimina-ción de positivos y vacunación.
Se incorpora variabilidad como ser eltiempo que demoran los animales positi-vos en ser sacrificados.
Vacunación. Si bien el modelo con-templa el empleo de la vacunación quefigura en el Programa, es posible plan-tear diferentes alternativas o escenarios,ej. empleando diferentes vacunas comoser la cepa19 o incluso evaluar la vacuna-ción general de todas las hembras, comose realizara hasta la década del 90 ennuestro país.
SALIDAS «OUTPUTS» DELMODELO
En una iteración (180 meses – 15años):
• Nº de individuos en cada mes (período) y totales al final de la simulación:
* Infectados.* Que expresan Anticuerpos (Suero y leche).
* Refugados.* Infectados que salen del esta- blecimiento por ventas o refugo (faena).* Nº de Abortos por Brucella y otras causas.* Partos de animales infectados.* Terneras infectadas verticalmente.* Vaquillonas vendidas.* Terneros machos producidos.* Indicadores cómo período inter parto.
• Tiempo transcurrido hasta la de-tección (meses)
• Actividad de vigilancia por la quese realizó la detección
• Saneamiento:o Prevalencia inicial intrarebaño.o Animales eliminados.o Animales vacunados.o Sangrados realizados.o Tiempo para sanear el estable- cimiento.
SALIDAS (OUTPUTS) DE LASIMULACIÓN (5000
ITERACIONES)En cada iteración se obtiene la evolu-
ción de las variables de salida al progre-sar los períodos, y los totales acumula-dos para un número de períodos (5, 10 ó15 años), generando cada valor de ladistribución de salidas que obtenemos alcorrer la simulación del modelo (por ejem-plo 5.000 iteraciones).
• Distribuciones de salida: paracada variable de salida se obtiene unadistribución de valores, lo que permiteconocer mínimo y máximo valor asumi-do, percentiles, valor medio y otras medi-das de tendencia central, medidas devariabilidad y demás características dela distribución que tengan interés. Paraestas variables se realizan gráficos defrecuencias o densidades como el histo-grama, o las curvas acumuladas (Figura32).
63Brucelosis bovina
• Entre otras variables, el modeloregistra: o Animales Infectados o Abortos por BrB o Refugos por BrB o Terneras (BrB) o Tiempo de detección
• Prevalencia a la detección o Tiempo para el saneamiento o Nº animales eliminados o Nº de serologías realizadas (sangrados) o Nº de animales vacunados
o Otras variables (intervalo inter-parto, vaquillonas y ternerosvendidos, etc.).
Figura 32. Distribución de frecuencia.
Esta herramienta permite modelar to-das las variables de entrada empleadasen el modelo, agregando variabilidad eincertidumbre, permitiendo también eva-luar su asociación con las variables desalida del modelo por medio del análisisde sensibilidad. De esta forma es posibleidentificar cuáles variables son críticas omás importantes para explicar la varia-ción de las salidas (outputs).
Figura 33. Ejemplo de 3 períodos en 1 iteración. Cada iteración se completa al finalizar 180 períodos (15años).
Pro
babi
lidad
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
00 7 14 21 28 35 42 49 56 63
Valores en 10<-4
65Brucelosis bovina
VI. Conclusiones
Uruguay sigue invirtiendo en un pro-grama de control avanzado de Brucelo-sis Bovina que apunta como objetivofinal a la erradicación de la enfermedaddel territorio nacional. Las referenciasinternacionales de programas que hanlogrado este último objetivo (EstadosUnidos de América, Reino Unido, Repú-blica Checa, Nueva Zelanda, etc.) mues-tran que el mismo es dificil, insume añosde trabajo y tiene costos de inversiónelevados.
La base del programa es la detecciónde focos de la enfermedad y su sanea-miento a través de la eliminación siste-mática de los animales positivos y lacuarentena hasta que esto es logrado.Para la obtención del exito se requiere lautilización de estrategias de vigilanciaque detecten los establecimientos y ani-males positivos y contar con herramien-tas de diagnóstico que sean certeras(alta sensibilidad y alta especificidad).
Durante estos años, diversos actoreshan cuestionando las pruebas diagnósti-cas utilizadas para hacer un trabajo efi-ciente y promovieron la investigación yevaluación de todas las alternativas dis-ponibles. Coherente con esta situaciónla Dirección General de los ServiciosGanaderos (DGSG-MGAP) y la Comi-sión Nacional Honoraria de Salud Ani-mal (CONAHSA) dieron su apoyo a esteproyecto. El mismo evaluó las pruebasde rebaño utilizadas en los estableci-mientos lecheros y las alternativas ac-tualmente disponibles para sustituirlas,así como el desarrollo de instrumentos deapoyo a las decisones como son los mode-los epidemiológicos de la enfermedad.
Se demostró a través de muestrasciegas para diferentes operadores la altarepetitibilidad de las pruebas de ELISA
en leche, lo cual junto a su objetividadaportan seguridad y transparencias a lavigilancia de los rebaños lecheros.
Se comprobó que los kits comercia-les de ELISA, así como la prueba dePolarización Fluorescente tuvieron uncomportamiento superior (estadística-mente significativos) a la prueba hoyutilizada de anillo en leche (PAL); en lamedida que las muestras compuestas(pooles) incluyen más animales. De lacomparación entre los tres kits de ELISAevaluados y las pruebas de anillo enleche (PAL) y polarización fluorescente(FPA) claramente quedó demostrado lamayor sensibilidad análitica de los pri-meros.
La sensibilidad analítica menor delos ELISAs a la más alta di lución(1/1.024) es de 63%, lo cual es un valorcomparable al obtenido por el PAL a ladilución (1/32) y con el FPA a ladilución (1/128). Basado en estos re-sultados las pruebas de ELISA seríanlas recomendables para la detecciónen las etapas más tempranas de intro-ducción del agente en un rebaño, evi-tando la difusión en el mismo con susconsecuencias inmediatas de muchosabortos y varias vacas infectadas an-tes de la detección.
Dado que la sensibilidad analítica sedetermina a través de un ensayo de labo-ratorio, se puede considerar que no essuficiente para establecer una recomen-dación final. Por esta razón se realizóuna evaluación a nivel de terreno paraestablecer las propiedades de sensibili-dad (probabilidad de detectar un rebañoverdaderamente infectado) y especifici-dad (probabilidad de descartar un rebañoverdaderamente sano) de las técnicasevaluadas.
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Los valores de especificidad obteni-dos en todas las pruebas (PAL, ELISAsy FPA) sobre las mismas muestras en elpeor de los casos fue del 92,6%, lo cualse puede considerar satisfactorio paraeste tipo pruebas que serán utilizadas enla vigilancia epidemiológica como de«screening» (primera clasificación derebaño sospechoso).
Los valores de sensibilidad corrobo-ran lo que ya había sido demostrado enlas pruebas de sensibilidad analítica conuna gran variabilidad entre las pruebasutilizadas. En este caso las pruebas deELISA confirmaron nuevamente su supe-rioridad en sensibilidad con respecto alPAL y FPA y tuvieron un comportamientosimilar entre los tres kits comercialesevaluados.
Estos resultados, como los anterio-res, permiten concluir que sería unamedida estratégica y económicamenterentable el cambio de la vigilancia de losestablecimientos lecheros a través de laleche tanque con pruebas de ELISA. Deesta forma se tendría una mayor objetivi-dad en las pruebas y se podría reducirsustancialmente los costo de vigilanciaen el sector, sin pérdida significativa dela eficacia. Esta recomendación es es-pecialmente significativa para rebañosmayores a 32 vacas en ordeñe, los cua-les incluyen a más del 80% de la pobla-ción de vacas lecheras del país.
Estas recomendaciones han sidotransmitidas a las autoridades sanita-rias, quienes están estudiando los cam-bios normativos que viabilicen el uso deestas herramientas.
El uso de modelos de simulación sonuna herramienta de gran ayuda para la
toma de decisiones. Los avances obteni-dos con el estudio de este proyecto hanmejorado la conceptualización epidemio-lógica de la difusión entre los rebaños,así como sus consecuencias dentro delos mismos. Permitiendo conocer mejorla epidemiología de la brucelosis bovinaen el Uruguay. Estos modelos requierensu perfeccionamiento continuo para re-flejar mejor la realidad sanitaria de unpaís o region por lo cual se consideraimportante continuar trabajando en losmismos.
Este proyecto ha realizado un aporteen las pruebas de diagnóstico para losrebaños lecheros. Si bien los sistemaslecheros han sido historicamente los másgolpeados por esta enfermedad, no hayque olvidar que solo son aproximada-mente un 10% de los rebaños del país yque no contamos con pruebas de rebañopara ser utilizadas para la vigilancia ydetección en ganado de carne.
Mirando hacia el futuro es esencialevaluar las pruebas de diagnóstico parauso a nivel individual, buscar alternativaseconómicas para la vigilancia de rebañosde bovinos para carne, así como alterna-tivas al aislamiento bacteriano que nopongan en riesgo la salud de los operado-res y su entorno.
Por otro lado es necesario conocermejor la epidemiología de la brucelosisbovina en el Uruguay, identificar sus fac-tores de riesgo de forma de diseñar losmétodos de control más efectivos.
La aplicación de la información yaobtenida y la respuesta a la interrogantesque quedan pendientes son elementosesenciales para la erradicar final de estaenfermedad.
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