FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR
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FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR
Graciela M. Escandar
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FLUORESCENCIA
luz incandescente
luz ultravioleta
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FOSFORESCENCIA
1:00:00 1:00:30 1:10:40
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RELAJACIÓN NO-RADIANTE LUMINISCENCIA
singlete singlete* triplete*
So
S1
S2
ABSORBANCIA
So
S1
S2
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Fluorescencia molecular
Es un proceso de fotoluminiscencia en
que las moléculas se excitan por
absorción de radiación electromágnética.
La especie excitada posteriormente se
relaja hasta el estado fundamental, con
la liberación de su exceso de energía en
forma de fotones
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ABSORCIÓN
CI
F
CS
CE
1 2 3 4
P
S2
S0
E N E R G í A
S1
T1
RV
DIAGRAMA DE ENERGÍA (Jablonski)
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solvente
estructura
temperatura
LUMINISCENCIA EN SOLUCIÓN
concentración
tipo de transición
apagadores químicos
pH
Factores que influyen en la señal fluorescente
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tipos de transición
estructura
n
Compuestos aromáticos, estructuras con dobles enlaces conjugados, anillos aromáticos fusionados. Rigidez. Sustituyentes
bifenilo
CH2
fluoreno
Factores que influyen en la señal fluorescente
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Su aumento, disminuye la intensidad de fluorescencia por aumento de probabilidad de conversión externa
temperatura
solvente Efectos generales y específicos
Factores que influyen en la señal fluorescente
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La fluorescencia de compuestos aromáticos con propiedades ácido-base es generalmente pH-dependiente
N NH H
NH H H H+
anilina
N
H HH
+
ion anilinio
pH
Apagamiento dinámico y estáticoapagadores
químicos
Factores que influyen en la señal fluorescente
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F
EXCITACIÓN EMISIÓN
BANDAS DEL ESPECTRO
Corrimiento de Stokes
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F
RAYLEIGH
RAMAN
FRAYLEIGH 2° orden
RAMAN2° orden
RAYLEIGHS0
S1
RAMAN RAMAN
BANDAS DEL ESPECTRO
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IF = IA =
= (Io – IT) =
= Io (1– IT/Io) =
= Io (1 – e-2.303bC) =
IF = Io (1 – e-kbC)
ANÁLISIS CUANTITATIVO
= No fotones emitidos/No fotones absorbidos
= IF/IA
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IF = Io (1– 1 + kbC) = Io kbC IF = KC
Recordando que: x x2 x3 1! 2! 3!
si x es muy pequeño: e-x = 1-x
+- -1e-x =
K
ANÁLISIS CUANTITATIVO
IF = Io (1 – e-kbC)
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F
C
IF = KC
IF vs C (a bajas concentraciones de analito)
ANÁLISIS CUANTITATIVO
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ESPECTROFLUORÍMETRO
monocromador
monocromador
M
fotomultiplicador de muestrafotomultiplicador
de referencia amplificador
dispositivo de lectura
atenuador del haz
fuente
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OBTENCIÓN DE ESPECTROS DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN
1) Obtención del espectro de absorbancia para determinar la longitud de onda de absorción
F
EXCITACIÓN EMISIÓN
2) Fijar el monocromador de excitación a esta y obtener el espectro de emisión
3) Fijar el monocromador de emisión a la seleccionada en el punto 2 y obtener el espectro de excitación.
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CAUSAS DE DESVÍO DE LINEALIDAD
F
C
Término lineal
Lineal+cuadráticoLineal+cuadrático+cúbico
Si kbC es grande (absorbancia 0.02)
IF = Io [kbc –
(kbc)2
2(kbc)3
6...-+ ]
IF = Io (1 – e-kbC)
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FILTRO INTERNO
Producido por el propio analito (alta concentración)
- Variación de potencia de luz incidente en el trayecto- Autoapagamiento- Autoabsorción
Afecta la linealidad de la curva de calibrado y el perfil de los espectros de excitación y/o emisión
Producido por otra sustancia
- Sustancia que absorbe en la región de de excitación o emisión del analito
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FILTRO INTERNO
Excitación
Detección de la emisión
Alta concentración: la emisión disminuye en el trayecto de la luz incidente
Detección de la emisión
Baja concentración:emisión uniforme
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Curva de calibración de sulfato de quinina
ppm
F
100 200 300
F
ppm0 2 4 6 8 10
Linealidad
Término cúbico o mayor
Filtro interno