Extraccin y separacin de pigmentos fotosintticos (PR-25)

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVAFACULTAD DE ZOOTECNIA

Departamento acadmico de ciencias animal

Zootecnia camino a la calidad educativa

EXTRACCIN Y SEPARACIN DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS

CURSO

:Fisiologa VegetalDOCENTE: Gonzales Huiman; Fernando S.ALUMNOS : Bonifacio Espinoza; Jherson.TINGO MARIA 2014-II. INTRODUCCION.

Uno de los procesos metablicos ms importantes de las clulas vegetales lo constituye la Fotosntesis. Durante la fase luminosa de la misma es imprescindible la participacin de diferentes pigmentos fotosintticos que se encuentran dentro de los plastidios, y que le confieren la coloracin caracterstica de las hojas de las plantas. Los pigmentos de mayor importancia son las clorofilas: la clorofila A que tiene un color verde azulado, y la clorofila B de color verde amarillento. Tambin son importantes los carotenoides, de color anaranjado-rojizo, y las xantofilas de color amarillo.

El surgimiento de los mtodos cromatogrficos est marcado precisamente por el estudio realizado por el cientfico ruso M.S.Tswett, quien en 1903 public un trabajo sobre la separacin de pigmentos vegetales a travs de una columna llena de un compuesto adsorbente (yeso, almina, almidn u otro) al aplicar un extracto de plantas preparado con solventes orgnicos (etanol, acetona, benceno, etc.). La separacin de estos pigmentos se puede realizar tambin mediante cromatografa en capa fina o en papel, utilizando diferentes sistemas de solventes.

La fotosntesis, proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energa que necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos jvenes de pigmentos, capaces de captar la energa lumnica.

Entre todos los caracteres ms externos de los vegetales, el ms notable y caracterstico es probablemente el color. El color no es nicamente un carcter llamativo de la vegetacin, sino que, adems, algunos de los pigmentos que lo condicionan estn estrechamente ligados a las actividades fisiolgicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudio de cmo las plantas viven y se desarrollan requieren el previo conocimiento de los pigmentos vegetales.

Objetivos:

Demostrar que los pigmentos fotosintticos pueden ser extrados fcilmente con solventes orgnicos.

Separar por diversos mtodos los pigmentos fotosinttizantes.

Estudiar algunas de las propiedades fsicas y qumicas.II. REVISION LETERARIA

2.1. Pigmentos fotosintticos.

Los mas importantes son las clorofilas, pigmentos verdes con estructuras policclicas que se parecen a la protoporfirina de la hemoglobina, la molcula esta compuesto de un sistema de anillos heterocciclicos (cuatro anillos pirrlicos sustituidos y un quinto anillo no pirrlico) adems contiene una larga cadena hidrofbica de un alcohol, el fitol, esterificando a un acido sustituyente de un de los pirroles. El sistema de anillos heterocclicos tiene un estructura con alternancia de enlaces sencillos y doble (conjugados) que constituyen el grupo cromforo responsable de la absorcin de la luz. Los cloroplastos de las plantas superiores contienen siempre dos tipos de clorofila. Una invariablemente la clorofila A, mientras que la segunda es la clorofila B, que slo difiere de la clorofila a en que tiene un grupo aldehdo en lugar de un grupo metilo en el anillo ll. La mayora de las plantas superiores contienen aproximadamente el doble de clorofila A que de clorofila B. en organismos fotosintetizadores inferiores existen otras clorofilas con pequeas diferencias qumicas.

Adems de las clorofilas, las membranas tilacoidales contienen pigmentos secundarios que tambin absorben la luz, llamados conjuntamente pigmentos accesorios. Entre ellos se encuentran los carotenoides que incluyen a los carotenos, no oxigenados, y las xantofilas, decolores rojo al amarillo y las ficobilinas que son pigmentos tetrapirrlicos pero no cclicos, presentes en lagas rojas y en cianobacterias e incluyen a la ficocianina (azul) y a la ficoeritrina (roja).

La accin neta del agua en fotosntesis es dividir el agua proporcionando el hidrogeno necesario para las reducciones y eliminando el oxgeno como un producto intermedio.

12 H20 ---------- LUZ -------------> 24 H+ + 6 O2

Los tomos de hidrgeno se emplean en reducir el dixido de carbono con la ayuda de ATP para dar carbohidratos y agua.

6 C02 + 24 H---------- 18 ATP ----------- > C6H12O6 + 6 H20

La reaccin completa se puede describir como:

6 C02 + 12 H20 ------- LUZ ----> C6H12O6 + 6 H20 + 6 O2

Para fijar una molcula de CO2 en la forma de carbohidratos se precisa de 4 tomos de hidrogeno y 3 molculas de ATP. Ahora se sabe que la energa absorbida como luz en los cloroplastos genera tambin ATP. De hecho, cloroplastos aislados pueden realizar el proceso fotosinttico completo. En eucariotas la fotosntesis tiene lugar en el cloroplasto, que se sabe desde hace tiempo que tiene caractersticas procariticas. Se cree que han evolucionado de cianobacterias o especies relacionadas que establecieron una relacin simbitica con una clula eucariota no fotosinttica que las englob. La clula y la cianobacteria estaran en una relacin beneficiosa para ambas al compartir el organismo fotosinttico los carbohidratos producidos con la clula y esta proveyendo de otros componentes a la cianobacteria.

El procariota cedera poco a poco su independencia y su pared celular, transfiriendo parte de su contenido gentico a la clula. El resultado es un cloroplasto que mantiene un DNA circular de pequeo tamao con la informacin para ciertas protenas de la membrana necesarias que no pueden ser fcilmente transportadas o dirigidas hacia el orgnulo desde el citoplasma. Ocasionalmente se encuentran organismos fotosintticos que tienen cloroplastos que retienen algunas caractersticas ms de cianobacterias.2.2. Qu son los pigmentos?

Si es posible encontrar en el reino vegetal todos los matices y combinaciones de colores del espectro, existe un predominio general de los colores primarios: verde, amarillo, rojo, azul. Estos colores son conferidos a los vegetales por determinados compuestos qumicos definidos, llamados pigmentos. El color particular que presenta un determinado rgano vegetal depende generalmente del predominio de uno u otro o la combinacin de ellos. Se debe tener claro que cuando un vegetal presenta un color blanco, es debido a la falta de tales pigmentos. La luz solar que incide sobre ellas no es absorbida selectivamente como ocurre en las partes coloreadas, sino que es transmitida o reflejada prcticamente sin sufrir modificacin.

Las Clorofilas. El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b . Se encuentran prcticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las races, tallos, hojas y frutos a condicin de que estos rganos estn situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz. Tambin aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso all la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los dems pigmentos. 2.3. Dnde estn los pigmentos?Estos pigmentos se encuentran en el interior de la clulas vegetales especficamente en una organela llamada cloroplasto . Los cloroplastos son simplemente plstidos que contienen pigmentos cloroflicos. Los compuestos cloroflicos estn ligados qumicamente con las estructuras internas del cloroplasto (membrana tilacoides) y se hallan retenidos en estado coloidal. Asociados con las clorofilas, existen tambin en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son los xantofilas y carotenides. 2.4. Cmo se dividen los solventes?Los pigmentos cloroflicos son insolubles en el solvente universal llamado agua. Pero s son solubles (afinidad qumica) en solventes orgnicos como por ejemplo alcohol etlico y acetona. A los solventes que extraen simultneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamar extractantes. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el ter de petrleo.

En el mtodo de extraccin simple, como se desarrolla ms adelante se utilizar como extractante el alcohol etlico y como separador el tetracloruro de carbono. Estos dos solventes orgnicos responden en forma diferente a los pigmentos cloroflicos, como as tambin a sus diferencias fsicas que hacen que sean dos lquidos no misibles y con diferente peso especfico.

En el segundo mtodo por cromatografa se utilizar como extractante la acetona y como separador el ter de petrleo. Este mtodo se trata de una separacin ms fina de los pigmentos, y se basa en la absorcin y solubilidad diferenciales de varias sustancias entre las que se incluyen los pigmentos. Un soporte inerte como papel de filtro para la corrida y unos granos de carbonato de calcio para deshidratar la muestra, son los componentes necesarios para desarrollar la tcnica.

2.5. Clorofila.

Pigmento que da el color verde a los vegetales y que se encarga de absorber la luz necesaria para realizar la fotosntesis, proceso que transforma la energa luminosa en energa qumica. La clorofila absorbe sobre todo la luz roja, violeta y azul, y refleja la verde. La gran concentracin de clorofila en las hojas y su presencia ocasional en otros tejidos vegetales, como los tallos, tien de verde estas partes de las plantas. En algunas hojas, la clorofila est enmascarada por otros pigmentos. En otoo, la clorofila de las hojas de los rboles se descompone, y ocupan su lugar otros pigmentos.

La molcula de clorofila es grande y est formada en su mayor parte por carbono e hidrgeno; ocupa el centro de la molcula un nico tomo de magnesio rodeado por un grupo de tomos que contienen nitrgeno y se llama anillo de porfirinas. La estructura recuerda a la del componente activo de la hemoglobina de la sangre. De este ncleo central parte una larga cadena de tomos de carbono e hidrgeno que une la molcula de clorofila a la membrana interna del cloroplasto, el orgnulo celular donde tiene lugar la fotosntesis. Cuando la molcula de clorofila absorbe un fotn, sus electrones se excitan y saltan a un nivel de energa superior (vase fotoqumica) esto inicia en el cloroplasto una compleja serie de reacciones que dan lugar al almacenamiento de energa en forma de enlaces qumicos.

Hay varios tipos de clorofilas que se diferencian en detalles de su estructura molecular y que absorben longitudes de onda luminosas algo distintas. El tipo ms comn es la clorofila A, que constituye aproximadamente el 75% de toda la clorofila de las plantas verdes. Se encuentra tambin en las algas verde azuladas y en clulas fotosintticas ms complejas. La clorofila B es un pigmento accesorio presente en vegetales y otras clulas fotosintticas complejas; absorbe luz de una longitud de onda diferente y transfiere la energa a la clorofila A, que se encarga de transformarla en energa qumica. Algunas bacterias.

2.6. Carotenoides.

Actan como pigmentos accesorios en el proceso de la fotosntesis .Existen dos tipos de pigmentos carotenoides :carotenos y xantofilas .Los carotenos son hidrocarburos isoprenoides que no contienen oxgeno y estn formados por largas molculas con un sistema de enlaces conjugados alternantes, dobles y Sencillos , rematados en cada extremo por un anillo de ciclohexano insaturado- tienen color amarillo-anaranjado . Las xantofilas tienen una estructura muy similar a la de los carotenos y su diferencia estriba en la incorporacin de oxgeno en los extremos de la molcula. Segn el grupo que se incorpore existen variedades dentro de las xantofilas. Son de color amarillo.

Los luminosos colores otoales caractersticos de las hojas de muchas plantas se deben a la presencia de otros pigmentos que contribuyen a los procesos que se dan en la fotosntesis al captar longitudes determinadas de la luz solar. Estos pigmentos, llamados carotenoides, slo se ven cuando la hoja muere en otoo.

2.7. Pigmentos accesorios.

Son pigmentos que absorben la energa luminosa y la pasan a la clorofila a (pigmento principal), que es el pigmento ms relacionado con la transferencia de electrones hacia los enlaces qumicos. Los pigmentos accesorios permiten a las algas vivir en una variedad de lugares mucho mayor a la que se podra tener si carecieran de ellos. Debido a que la composicin e intensidad de la luz cambia con el incremento de la profundidad del agua.

Las caractersticas de la luz recibida y absorbida por las algas marinas depende en gran medida de la profundidad donde estn. La variacin en la composicin pigmentaria para un uso optimo de la luz disponible es por lo tanto muy importante. La longitud de onda corta (ms energtica) no Penetra ms all de 5 metros de profundidad. Las algas pardas y verdes se instalan en la zona litoral superior, en tanto que en la zona profunda predominan las algas rojas. Esto se puede observar generalmente en la zona intermareal rocosa, las algas ubicadas mas arriba corresponden a Ulva (lechuga de mar) y Enteromorpha (algas verdes).

Las algas pardas generalmente estn ubicadas en la zona media y baja del intermareal, este es el caso de Lessonia nigrescens ("huiro negro") y Durvillaea ("cochayuyo"). Por ltimo las algas rojas las podemos encontrar en mayor abundancia y diversidad en la zona submareal, como por ejemplo, Gracilaria chilensis (pelillo) y Chondracanthus chamissoi (chicoria de mar).

III. MATERIALES Y METODOS.3.1. Lugar y Fecha.

La presente prctica se desarroll en el laboratorio de agronoma de La Universidad Nacional Agraria de la Selva el da martes 03 de Junio del presente ao a horas de 02 a 04 p.m., en la ciudad de Tingo Mara, Provincia de Leoncio Prado, Departamento de Hunuco a coordenadas geogrficas: Latitud Sur: 91708, Longitud Oeste: 755952, a 660m s.n.m, con un temperatura promedia de 27 C aproximadamente.3.2. Materiales. Plantas: hojas de alfalfa. Instrumental: mortero de porcelana, embudos de separacion, vasos, cocina elctrica, pipetas de 10 ml, buretas de 100 ml, , pisetas, soporte de madera o metal, etc. Reactivos: Acetona a 80 %, ter de petrleo 90%, ter etlico, KOH al 20 % en metanol, gua destilada.3.3. Metodologa.1. Extraccin de los pigmentos de los cloroplastos:

Hierva 20g de hojas frescas en agua durante 2 min. No ms, inmediatamente transferirlas a una licuadora y licuarlo con 80ml. De acetona al 80% luego lavamos el vaso de la licuadora con los otros 20ml. De acetona y filtramos.2. Separacin de los pigmentos del cloroplasto:

Hicimos por el mtodo de la distribucin de los pigmentos frente a solventes inmiscibles. Esto naturalmente esta en funcin del coeficiente de participacin de cada pigmento, sea del grado que una sustancia o grupo de sustancias es fraccionada por dos solventes inmiscibles.3. Separacin por solventes inmiscibles:a) Vertimos 80ml. Del extracto acetonico en un embudo de separacin y aadimos 50ml. De ter de petrleo y cuidadosamente agite por unos minutos (1-2). Deje reposar hasta observar la formacin de dos capas, la capa superior contiene a los pigmentos fotosintetizados disueltos en el ter de petrleo, la capa inferior es una mezcla de acetona, antocianinas y agua los que son intersolubles.

b) Descartamos la capa inferior abriendo la llave del embudo reteniendo solamente la porcin superior. Lavamos con agua destilada 3-4 veces, descartando en cada separacin la porcin inferior.

c) E seguida aadimos 40ml. De metanol al 90% (toxico), y mezclamos cuidadosamente, se observa la formacin de dos capas. La porcin es ter de petrleo, que retiene a la clorofila y al caroteno. En el inferior esta la clorofila b y la xantofila disuelta en el metanol.d) Transferimos la porcin inferior a otro embudo de separacin, sin dejar pasar liquido de la pocin superior contenida en el embudo inicial que denominamos embudo A el cual contiene a la clorofila a y el caroteno, el embudo B que contiene la clorofila b y la xantofila.

Embudo A; vierta 20ml. De KOH al 20% en etanol recientemente preparado, tape, agite y deja en reposo. Note la formacin de dos capas.

Vierta 20ml. De agua destilada, mezcle nuevamente y deja en reposo. Las dos capas que se forman contienen respectivamente la superior caroteno y la inferior la clorofila a.Embudo B; vierta 40ml. De ter etlico, lave cuidadosamente con 20ml. De agua destilada, repitiendo el proceso 2 3 veces descartando sucesivamente la porcin inferior que contiene metanol y agua.La clorofila b y la xantofila ahora estn contenidas en un extracto de ter etlico. Vierta 20ml. De KOH al 20% en metanol. Tape bien el embudo, agite con cuidado y deje en reposo durante 10min. Aada luego de los 10min, 20ml de agua destilada y deje en reposo hasta que se separen en dos capas. La capa superior contiene xantofila y la inferior clorofila b. as se tiene separados los cuatro pigmentos principales de los cloroplastos, en funcin de sus coeficientes de particin en lquidos inmiscibles. IV. RESULTADOS

Al aadir 50 ml. de ter de petrleo se produce la separacin de los pigmentos formndose dos capas (A y B).

Aadimos 40 mL de metanol al 90% y se forman otras dos capas (C y D).

Tubo A. Con KOHTubo B. ter Etlico

La extraccin, separacin e identificacin de los pigmentos fotosintticos se realizo de las hojas de pasto.

PigmentosObservaciones

XantofilaVerde amarillento claro.

CarotenoVerde amarillento oscuro

Clorofila AVerde oscuro

Clorofila BVerde claro

V. DISCUSIN

LUDWING, (1984), menciona que la extraccin de pigmentos del cloroplasto esta basado en la accin de solvente orgnicos sobre los lquidos del cloroplasto dentro de los cuales se hallan disueltos, los pigmentos liposolubles, por lo que estos pueden ser extrados. As mismo, para la separacin de los pigmentos del cloroplasto por solventes inmiscibles, permite separar una mezcla de sustancias en funcin de su solubilidad en distintos compuestos inmiscibles.

Estos conceptos se pudieron comprobar en la realizacin de esta prctica, existiendo as una concordancia de lo que se menciona en la teora y los resultados obtenidos en la prctica.

VI. CONCLUSIN

Se logr determinar que los pigmentos fotosintticos pueden ser extrados fcilmente con solventes orgnicos.

Los pigmentos fotosintetizantes se pueden separa por diversos mtodos.

Se lleg a estudiar algunas de las propiedades fsicas y qumicas.

VII. BIBLIOGRAFA

DELVIN ROBERT, M. 1980. Fisiologa Vegetal.1ra Edicin. Editorial OMEGA Barcelona-Espaa.468 p.

LUDWING, E. 1984. Manual de Laboratorio de Fisiologa Vegetal .Costa Rica. 165 p.

MARTINEZ, E. 1995. La Fotosntesis. 2da edicin. Edit. Mundi Prensa. Madrid Espaa. Pg.

SALDIVAR, R. 1994. Fisiologa Vegetal 1: Nutricin y transporte. Edit. Sntesis S. A. Espaa. SANCHEZ DIAZ, M.; APARICIO TEJO, P. y PEA CALVO, (1980) Prcticas de Fisiologa Vegetal.

VIII. ANEXO: (Procedimiento De La Prctica)

1.- Pesamos las hojas2.- Colocamos en agua2.- Hervir por 2min.

4.- separamos las hojas del agua hervido5.- obtencin de antocianinas6.- licuamos las hojas con acetona

acetona7.- Filtramos el licuado8.- medimos en una probeta el filtrado

9.- hechamos al embudo de separacion10.- observamos la separacin de las fases11.- lavado con agua destilada

Como resultado obtuvimos las separaciones de los pigmentos.Clorofila a + carotenosClorofila b + xantofila

EMBED MSPhotoEd.3

Mezcla de Acetona, Antocianina y Agua

Pigmentos Fotosintetizantes disueltos en ter de petrleo

ter de petrleo con Clorofila y Caroteno

Clorofila b y Xantofila disuelta en Metanol

Clorofila a

Caroteno

E

Xantofila

Clorofila b

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