EXPLORANDO EL POTENCIAL TERAPÉUTICO DEL

TRASPLANTE DE CÉLULAS MADRE INTESTINALES EN

ENFERMEDADES INFLAMATORIAS DEL INTESTINO

Eduard Batlle Gómez

Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona

Azucena Salas Martínez

Institut d'Investigació Biomèdica August Pi i Sunyer

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1. Resumen

El grupo de investigación que lidera Eduard Batlle ha sido pionero en el desarrollo de

una tecnología que permite cultivar en el laboratorio células madre intestinales adultas.

Las células madre intestinales poseen unas propiedades intrínsecas que les permiten

organizarse en los cultivos in vitro en estructuras tridimensionales a las que

denominamos organoides, y que en múltiples aspectos reflejan las propiedades

estructurales y funcionales del epitelio intestinal. Los organoides representan un

avance técnico excepcional para muchas líneas de investigación, y entre ellas cabe

destacar que claramente representan una oportunidad para su aplicación en medicina

regenerativa.

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) incluye un conjunto de patologías crónicas

del intestino de etiología desconocida que afectan a más de dos millones de personas

en Europa con una prevalencia que va en aumento. Complicaciones comunes en

pacientes con EII son fibrosis, fístulas y ulceraciones del epitelio intestinal que se

asocian con una elevada morbilidad. El tratamiento actual de la EII consiste en la

administración de medicación inmunosupresora o más específicamente de anticuerpos

anti-TNF-alfa. Desafortunadamente estas terapias no consiguen la remisión del

episodio inflamatorio en un porcentaje elevado de pacientes. A largo plazo, la única

solución terapéutica en pacientes avanzados es la resección del fragmento del colon

afectado.

Este proyecto ha querido explorar la posibilidad de aplicar la tecnología de organoides

a la curación de las lesiones intestinales presentes en pacientes con EII. Asimismo, ha

utilizado la tecnología de los organoides para entender mejor la enfermedad, a través

del estudio de las células madre intestinales de pacientes afectados.

2. Resultados

El uso de organoides en medicina regenerativa requiere la superación de varios

obstáculos que permitan adaptar la tecnología a la clínica. Entre ellos, la obtención de

una fracción pura de células madre adultas con una elevada capacidad regenerativa a

partir de pequeñas biopsias; la modificación de las condiciones de crecimiento de los

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cultivos tridimensionales al uso de materiales que permitan su trasplante en seres

humanos sin provocar rechazos; el estudio de moléculas que favorezcan la

regeneración tisular; el desarrollo de modelos preclínicos que nos permitan ensayar y

optimizar las condiciones de trasplante, y la implementación de diferentes protocolos

para definir el que permita un injerto eficiente de los organoides en pacientes con EII.

Hemos trabajado intensamente en todos y cada uno de estos objetivos avanzando

considerablemente en la mayoría y hemos establecido, por tanto, las condiciones

óptimas para el trasplante de organoides en lesiones de EII. No obstante, y

desafortunadamente, en ocasiones nos hemos encontrado con verdaderos callejones

sin salida. En cualquier caso, el trabajo realizado no habría sido posible sin la

colaboración estrecha y la experiencia de los dos grupos implicados en esta

investigación.

Uno de los requisitos principales para el trasplante de organoides es la obtención de

una fracción pura de células madre con elevada capacidad regenerativa a partir de una

pequeña biopsia procedente del paciente. Teniendo en cuenta que en los organoides

actuales solamente un pequeño porcentaje de células presenta capacidad regenerativa

y, por tanto, solo esta subpoblación representa células madre adultas fetén, hemos

dedicado un objetivo del proyecto a identificar y purificar esta subpoblación de células.

Resultados de este proyecto incluyen la identificación de un marcador de superficie,

PTK7, que permite la obtención de esta fracción de CoSC (Jung et al., 2015).

Anticuerpos anti-PTK7 aíslan de manera eficiente esta subpoblación de células madre

adultas con elevada capacidad regenerativa mediante FACS a partir de organoides en

cultivo. El PTK7 claramente supera el nivel de enriquecimiento en células madre

alcanzado por cualquier otro marcador utilizado con anterioridad. Estamos convencidos

de que las células CoSC PTK7+ presentan un potencial excepcional para terapias

regenerativas.

La adaptación de los cultivos de organoides al escenario clínico mediante cambios en la

composición de los cultivos que eviten rechazo en el trasplante ha sido trabajada con

éxito en su mayor parte, excepto en una condición que ha resultado inviable. Los

organoides crecen como estructuras 3D en una matriz extracelular indefinida extraída a

partir de cultivos de células de ratón (Matrigel, BD Science). Esta matriz debe ser

sustituida por un cóctel de moléculas definido y de origen humano para evitar el

rechazo del injerto. Durante la realización del proyecto hemos testado el crecimiento

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de organoides en numerosas matrices comerciales que cumplen estas características

sin éxito (CTS, CELLstart, Algimatrix, Hydromatrix MaxGel, MAPTrix, Hystem Hidrogel).

Como alternativa, hemos intentado también el cultivo de los organoides en varios

componentes clásicos de matriz extracelular de origen humano como colágeno tipo I,

colágeno tipo IV, laminina, fibronectina y vibronectina. De nuevo, los resultados han

sido negativos. Ninguno de estos componentes solo o en combinación con los demás

mantiene el crecimiento de las CoSC. El motivo de estos resultados negativos no está

claro, pero nos consta que hay más grupos investigando el campo de las células madre

que también persiguen identificar matrices sintéticas o definidas que permitan expandir

CoSC y que no han sido capaces de conseguirlo a día de hoy. Por motivos que

desconocemos y que seguimos investigando, este aspecto sigue representando una

barrera para la medicina regenerativa que deberemos abordar mediante estrategias

alternativas en el futuro. Aun así, a través de estos esfuerzos hemos identificado una

matriz derivada de ratón, BME2, que permite el cultivo y mantenimiento de las CoSC

de manera eficiente. Aunque el BME2 no puede usarse en medicina regenerativa,

económicamente cuesta la mitad que Matrigel y su uso ha representado una ventaja

financiera para el proyecto y el trabajo de ambos laboratorios. El resto de los

componentes necesarios para el cultivo de CoSC ha sido adaptado al escenario clínico

con éxito.

Se ha conseguido establecer dos modelos preclínicos de EII en el colon. Estos modelos

son representativos de las lesiones que se pretenden curar mediante el trasplante y

posterior evaluación de la evolución del injerto. El grupo de la Dra. Salas ha

establecido las condiciones para inducir químicamente colitis ulcerosa en ratas Spague-

Dawley. Por otro lado, se han adquirido ratas transgénicas para GFP, que permiten una

mejor evaluación del injerto a través de la detección de la proteína fluorescente GFP.

La colaboración estrecha entre ambos grupos ha permitido establecer las condiciones

de purificación y cultivo de las CoSC de las ratas GFP en forma de organoides para su

posterior trasplante en las lesiones ulcerosas. Se han realizado ajustes en las

condiciones de cultivo, como por ejemplo la introducción del BME2 como matriz

extracelular y la adición de medio condicionado que contiene Wnt3a y el factor R_SPO1

para mantener la señalización por Wnt. Para permitir la expansión de los organoides de

rata es necesario inhibir la señalización mediada por BMPs mediante la adición de

noggin. La presencia del factor de crecimiento EGF es necesaria para promover la

proliferación. También hemos observado que el inhibidor A83-01 (Stemgent), que

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bloquea el receptor del TGF-beta tipo 1 ALK5, el receptor de activina, y los receptores

de nodal ALK4 y de nodal ALK7, incrementa la eficiencia de obtención de los cultivos.

Una vez establecidas las condiciones óptimas de cultivo, hemos sustituido el medio

condicionado que contiene Wnt3a por 200 ng/ml de Wnt3a recombinante para

evitar el uso de suero fetal que pueda provocar rechazos y definir de manera más

precisa y reproducible las condiciones de cultivo. Por motivos similares sustituimos

noggin de origen recombinante por el inhibidor específico de BMPs DMH-1 (Tocris

Bioscience). En estas condiciones, las CoSC de rata se expanden

satisfactoriamente en el tiempo durante varios pases y semanas (n > 10

semanas). La retirada de los factores de crecimiento del medio resulta en la

diferenciación hacia los diferentes linajes del intestino, indicativo de que los organoides

contienen CoSC fetén. Dentro de este objetivo también se puso a punto un modelo de

ratón inmunodeficiente que permitiera el ensayo de trasplante de células CoSC

humanas mediante un protocolo derivado del reportado por Yui et al. en Nature

Medicine (2012).

A lo largo del proyecto hemos realizado numerosos experimentos de trasplante de

células COSC expandidas en forma de organoides a lesiones dañadas del epitelio.

Inicialmente utilizamos las CoSC-GFP de rata mencionadas en el párrafo anterior.

Las CoSC GFP+ se expandieron in vitro sin problemas y se transfirieron a ratas con

EII. Se ha puesto a punto un protocolo de microinyección combinada con

endoscopia que permite la administración guiada de las células en las

inmediaciones de la lesión ulcerosa para favorecer el injerto en la región dañada.

Hemos realizado multitud de experimentos utilizando diferentes proporciones de

CoSC así como de vehículos que pudieran favorecer el injerto como la

suplementación con Y-27632 (rock-inhibitor), R- Spondin1, noggin y EGF. A pesar

de los numerosos intentos y condiciones ensayadas, muy lamentablemente no

hemos conseguido observar células GFP+ en los animales receptores tras el

trasplante.

Por este motivo decidimos también abordar el trasplante de CoSC humanas en ratones

inmunodeficientes. Estos experimentos tampoco tuvieron éxito. No hemos podido

observar proliferación del injerto en animales trasplantados (n > 10). Como control

positivo en estos experimentos, trasplantamos también organoides tumorales

derivados de pacientes con cáncer colorrectal, que se injertaron sin problema en un

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40% de los casos. En la actualidad no entendemos el motivo o motivos por los cuales

las células normales no injertan. No obstante, a través de conversaciones con Hans

Clevers y otros científicos del campo hemos averiguado que la eficiencia de injerto de

CoSC murinas en ratón es muy baja, por lo que no sorprende que sea más difícil

todavía conseguir injertar células CoSC humanas. También hemos averiguado que

otros científicos han fracasado en el intento de trasplantar CoSC en ratones

inmunodeficientes de la cepa NSG utilizando protocolos similares al que hemos seguido

nosotros. Por tanto, parece que existen todavía barreras intrínsecas que no podemos

superar con la tecnología y conocimientos actuales y que impiden el éxito de estos

experimentos. En cualquier caso, aunque el proyecto financiado por La Marató haya

terminado, nosotros seguimos persiguiendo nuestro objetivo sin descanso y estamos

realizando experimentos utilizando CoSC purificadas mediante el marcador PTK7 así

como testando algunas de las moléculas que hemos descubierto en otros objetivos del

proyecto que puedan favorecer el éxito de los trasplantes de organoides (véase más

abajo).

Hemos estudiado varias moléculas señalizadoras que permitan mejorar el injerto

de CoSC en modelos de EII. Dado que no hemos tenido éxito en los experimentos

de trasplante, tampoco hemos podido evaluar si estas moléculas pueden favorecer

el crecimiento del injerto. Aun así, hemos descubierto tres moléculas señalizadoras

que aumentan la velocidad de crecimiento y la capacidad autorregenerativa de las

CoSC. Estamos convencidos de que estas propiedades observadas in vitro pueden

ser explotadas para mejorar el injerto en el escenario terapéutico. En colaboración

con el grupo de Paolo Fiorina (Havard Medical School, EE. UU.), que estudia

enteropatías intestinales en pacientes diabéticos, hemos descubierto que IGF1 puede

inducir señalización vía Wnt (D’Addio et al., Cell Stem Cell, 2015). El trabajo

relacionado con las otras dos moléculas de momento no ha sido publicado. No

obstante, tal y como se ha mencionado en el párrafo anterior, estas moléculas se están

testando en experimentos utilizando CoSC positivas para el marcador PTK7.

Los organoides han demostrado ser una herramienta muy valiosa para investigar

alteraciones epiteliales en el contexto de las EII. En la solicitud ya sugeríamos que

pacientes con EII podrían presentar cambios en el compartimento progenitor de las

criptas intestinales que se podrían reflejar en la función del epitelio diferenciado que

cubre la mucosa intestinal. Estos cambios potenciales han sido estudiados con éxito en

el marco del presente proyecto. Aunque la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn se

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agrupan bajo el concepto de EII, fenotípicamente son bastante diferentes, por lo que

en este objetivo inicialmente nos hemos centrado en pacientes con colitis ulcerosa.

Se ha generado una colección de organoides a partir de biopsias intestinales de una

cohorte de pacientes con colitis ulcerosa. También se han realizado biopsias en un

grupo de pacientes control, sin enfermedad inflamatoria, ingresados por otros motivos

en el Hospital Clínico de Barcelona de acuerdo con todos los criterios éticos y de

protección de datos.

La eficiencia de expansión de los organoides control y aquellos provenientes de

pacientes con colitis ulcerosa fue similar. Generamos adicionalmente organoides

provenientes del íleon. Los organoides se expandieron como estructuras esferoides

tridimensionales con capacidad autorregenerativa y de diferenciación hacia todos los

linajes intestinales principales. Mediante análisis de expresión génica y proteica,

confirmamos que los organoides estaban enriquecidos en células madre y progenitores

tempranos tanto si provenían del íleon como si habían sido derivados del sigma,

mientras que cuando los organoides eran inducidos a diferenciar, se apreciaba una

modulación significativa al alza de marcadores típicos de células diferenciadas

funcionales, como enterocitos o células mucosecretoras. Es más, los organoides

cultivados in vitro fueron capaces de mantener la información relativa a su procedencia

en lo que se refiere a marcadores propios de intestino delgado (íleon) o grueso

(sigma).

La comparación de los perfiles de expresión génica de organoides control con

organoides procedentes de pacientes con colitis ulcerosa ha permitido descubrir una

firma génica específica que sugiere la presencia de defectos intrínsecos presentes en el

compartimento progenitor de pacientes con EII (Mora Buch et al., 2016; Dotti et al.,

2016). Las diferencias observadas in vitro en los organoides son similares a las

observadas en el tejido de estos pacientes, lo que apoya la idea de que son

alteraciones en la biología de estas células epiteliales progenitoras lo que perpetúa la

enfermedad. Asimismo hemos descubierto un patrón alterado en las proteínas

antimicrobianas producidas por el epitelio que podría jugar un papel en el desequilibrio

en la composición de la flora intestinal frecuentemente observado en pacientes con

colitis ulcerosa.

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Además de la información obtenida, la tecnología de organoides epiteliales presenta un

potencial enorme no solo para la medicina regenerativa, sino también para la medicina

personalizada. Por ejemplo, permite determinar la respuesta individual de cada

paciente a diferentes estímulos. Como prueba de concepto hemos podido analizar en

detalle los efectos de factores presentes en el microentorno estromal del intestino

(Wnt5b o TGF-beta) y/o metabolitos bacterianos (ácidos grasos de cadena corta) en

células epiteliales primarias gracias al cultivo de organoides. Este análisis ha dado

resultados informativos del proceso de reparación tisular. Por ejemplo, hemos

descubierto que el factor Wnt5b se modula al alza durante la inflamación intestinal. El

estudio del efecto de la adición de Wnt5b a organoides epiteliales nos ha llevado a

describir que este factor induce un proceso de transición epitelio-mesénquima y la

adquisición de un fenotipo de célula migratoria, que prevemos que es necesario para la

regeneración del tejido en respuesta al daño tisular.

3. Relevancia y aplicaciones

El proyecto ha resultado en una serie de avances considerables para la futura

aplicación del cultivo de células madre del colon (CoSC) en medicina regenerativa del

tracto intestinal. Hemos conseguido establecer modelos preclínicos que emulan la

enfermedad, así como la mayoría de condiciones necesarias para el trasplante de CoSC

en lesiones de pacientes con EII. A pesar de no haber observado injertos, nos

mostramos muy optimistas de cara a nuestros esfuerzos futuros, que esperamos que

en breve fructifiquen en éxito a pesar de las dificultades a las que nos hemos

enfrentado durante la realización del proyecto, y que en ocasiones no hemos podido

resolver. Así, merece la pena destacar la identificación del marcador de superficie PTK7

(Jung et al., 2015), que permite aislar una subpoblación de CoSC con elevada

capacidad autorregenerativa. Confiamos que la realización de trasplantes utilizando

esta subpoblación PTK7+ resultará en una mejor capacidad de injerto y regeneración

del tejido dañado. La implementación del trasplante de CoSC en el escenario clínico,

por tanto, se realizará en dos pasos. En primer lugar, se expandirá la mucosa intestinal

en forma de organoides 3D enriquecidos en células madre a partir de una pequeña

biopsia, lo que permitirá amplificar el número de células del paciente. En segundo

lugar, se procederá a la purificación de las células madre altamente regenerativas

mediante el marcador PTK7, que serán trasplantadas al paciente. Seguimos analizando

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la efectividad de este proceso a pesar de la finalización de la financiación recibida.

Adicionalmente, la identificación de las células PTK7+ abre nuevas fronteras que

permiten explorar la biología de esta población celular. Estamos convencidos de que el

conjunto de avances descritos ayudará a que avance la investigación básica en esta

área, que sin duda se traducirá en beneficios clínicos para los pacientes. A pesar de no

haber conseguido precisar una matriz tridimensional de composición definida que dé

soporte al cultivo de organoides o del injerto de los trasplantes, hemos mejorado y

puesto a punto modelos preclínicos para ensayar diferentes condiciones de trasplante y

hemos optimizado los protocolos de cultivo y trasplante para su uso futuro. Esperamos

que nuestros éxitos y fracasos ayudarán a mover el campo hacia opciones y

estrategias alternativas.

El cultivo de organoides también ha permitido avanzar sustancialmente en el estudio

de la función epitelial en el contexto de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII).

Vale la pena recalcar que es la primera vez que se aplica esta tecnología al estudio de

pacientes con una disfunción intestinal inherente. Por tanto la colección de organoides

generada durante el proyecto representa un recurso excepcional para este campo de

investigación.

Asimismo, el artículo publicado en la revista Gut (Dotti et al., 2016) representa el

primer estudio en el que se han utilizado organoides derivados de EII para identificar

una firma de expresión génica y un fenotipo únicos en las células madre intestinales

derivadas de pacientes con colitis ulcerosa. La firma génica identificada revela

alteraciones importantes en el compartimento progenitor que se transmiten al epitelio

funcional diferenciado y que resultan en una barrera epitelial defectuosa en la EII.

Finalmente, los resultados de este proyecto han servido para abrir nuevas líneas de

investigación en lo que se refiere a la biología de las células madre intestinales y su

papel en la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn.

4. Bibliografía

-Dotti I , Mora-Buch R, Ferrer-Picón E, Planell N, Jung P, Masamunt MC, Leal RF, Martín

de Carpi J, Llach J, Ordás I, Batlle E, Panés J, Salas A.

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Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent

changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis.

Gut. 2016. doi: 10.1136/gutjnl-2016-312609.

-Mora-Buch R, Dotti I, Planell N, Calderón-Gómez E, Jung P, Masamunt MC, Llach J,

Ricart E, Batlle E, Panés J, Salas A.

Epithelial IL-1R2 acts as a homeostatic regulator during remission of ulcerative colitis.

Mucosal Immunol. 2016, 9(4):950-9.

-Jung P, Sommer C, Barriga FM, Buczacki SJ, Hernando-Momblona X, Sevillano M,

Duran-Frigola M, Aloy P, Selbach M, Winton DJ, Batlle E.

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Stem Cell Reports. 2015, 5(6): 979-87.