EVOLUCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS …50:57Z-469… · 5 Distribución porcentual de las...
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REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE INGENIERIA DIVISION DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS EVOLUCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS PRESENTES EN CARNES DE RES PICADAS Y EMPACADAS AL VACÍO Trabajo de Grado presentado ante la Ilustre Universidad del Zulia como requisito para optar la Grado Académico de MAGISTER SCIENTIARUM EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS AUTOR: CAROLINA HELSINSKI FLORES RONDÓN Tutor: Yasmina Barboza Co-tutor: Egar Sánchez Maracaibo, junio 2008
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REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE INGENIERIA
DIVISION DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIA Y TECNOLOGIacuteA DE ALIMENTOS
EVOLUCIOacuteN E IDENTIFICACIOacuteN DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS
PRESENTES EN CARNES DE RES PICADAS Y EMPACADAS AL VACIacuteO
Trabajo de Grado presentado ante la
Ilustre Universidad del Zulia como requisito para optar la Grado Acadeacutemico de
MAGISTER SCIENTIARUM EN CIENCIA Y TECNOLOGIacuteA DE ALIMENTOS
AUTOR CAROLINA HELSINSKI FLORES RONDOacuteN
Tutor Yasmina Barboza
Co-tutor Egar Saacutenchez
Maracaibo junio 2008
Flores Rondoacuten Carolina Helsinski Evolucioacuten e identificacioacuten de bacterias
aacutecido laacutecticas presentes en carnes de res picadas y empacadas al vaciacuteo (2008) Trabajo de Grado Universidad del Zulia Facultad de
Ingenieriacutea Divisioacuten de postgrado Maracaibo Venezuela 63 p
RESUMEN
El propoacutesito de esta investigacioacuten fue evaluar el tiempo de almacenamiento y
la calidad microbioloacutegica de carnes de res empacada al vaciacuteo (CREV) se compararon dos meacutetodos de determinacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
y se identificaron las BAL presentes en estas carnes Para tal fin se utilizaron diez muestras de carne de res procedente del corte Paleta obtenidas a las 48
horas posterior al sacrificio Estas fueron molidas empacadas al vaciacuteo y almacenadas durante 0 7 14 y 21 diacuteas a 5ordmC En cada tiempo de
almacenamiento fueron determinados el nuacutemero de BAL el pH recuento total de aerobios (RTA) coliformes totales (CT) y Escherichia coli (Ecoli) El
tiempo de empacado afectoacute el crecimiento de BAL pH RTA y CT (Plt005) El nuacutemero de BAL se incrementoacute al aumentar el tiempo de empacado
diminuyendo el pH Las BAL fueron el grupo microbiano dominante en las
CREV a partir del diacutea 7 Se determinoacute que la CREV requiere de aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas para lograr un nivel de BAL
adecuado para iniciar un proceso de fermentacioacuten caacuternica sin necesidad de antildeadir cultivo iniciador a la mezcla caacuternica Se identificaron 125 cepas de
BAL el 76 de los aislados correspondioacute al grupo BAL heterofermentativas facultativas seguido por las homofermentativas obligadas 12 y
heterofermentativas obligadas 80 Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y Lactobacillus sakei (256) Otros de los
aislamientos correspondieron Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei (96) Leuconostoc mesenteroides subsp
mesenteroidesdextranicum (8) La utilizacioacuten de CREV por un tiempo miacutenimo de 7 diacuteas con 10 horas es una alternativa viable en la elaboracioacuten de
productos caacuternicos fermentados sin la adicioacuten de cultivo iniciador
Palabras Claves Bacterias aacutecido laacutecticas carnes de res empaque al vaciacuteo
E-mail floresrondon30yahooes
Flores Rondoacuten Carolina Helsinski Evolution and identification of lactic
acid Bacteria en vacuum packed ground beef meat(2008) Trabajo de
Grado Universidad del Zulia Facultad de Ingenieriacutea Divisioacuten de postgrado Maracaibo Venezuela 63 p
ABSTRACT
The purpose of investigation was evaluate storage time and microbiological
quality for vacuum packed ground beef (VPGB) Were evaluated two methods of determination of lactic acid Bacteria (LAB) were compared and
subsequently LAB present in meat were identified Ten samples of beef from the top blade cut obtained to 48 h after slaughter were used These samples
were grounded vacuum packed and stored during 0 7 14 and 21 days to 5ordmC From each storages time of number of LAB pH total aerobics plate
count (APC) total coliforms (TC) and Escherichia coli were determined Storage time affected (Plt 005) number BAL APC and TC It was observed
that number of LAB increase and pH decreased as storage time was longer The LAB were the dominant bacterial group in VPGB from day 7 It was
determined that VPGB required approximately of 7 days and 10 hours to achieve and adequate level of BAL to initiate a process of meat fermentation
without need addition of a commercial starters cultures in meat mixes It was identify 125 LAB strains from which 76 of isolated LAB corresponded
to the group of facultatively heterofermentative followed by the obliged homofermentative (12 ) and obliged heterofermentative (8 ) Dominants
species were Lactobacillus curvatus (288 ) and Lactobacillus sakei (256 ) Other bacterial isolations corresponded to Lactobacillus plantarum (12
) and Lactobacillus paracasei subsp paracasei (96 ) Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroidesdextranicum (8 ) Utilization of VPGB
by a minimum time of the 7 and 10 h is feasible alternative in the elaboration of fermented meat product without addition of a commercial
starters culture
Key words lactic acid bacteria beef meat vacuum packing
E-mail floresrondon30yahooes
DEDICATORIA
A la luz de mi vida Valentina Isabel
A Finlandia Edin Joseacute Alonso
Eleazar Alonso Daniel y a mi difunto
Padre
AGRADECIMIENTOS
Ante todo a Dios todopoderoso por haber permitido la realizacioacuten y
culminacioacuten de esta investigacioacuten
A madre por su dedicacioacuten y abnegados cuidados para valentina y mi persona
A Edin Joseacute por su infinito amor y comprensioacuten
A los profesores Yasmina Barboza Jorge Ruiz y Egar Saacutenchez por sus
invalorables aportes apoyo y colaboracioacuten en la ejecucioacuten de esta investigacioacuten
Al personal del laboratorio de Microbiologiacutea de la FCV Lic Mireya Moreno
Lic Isamar Coronado y Sr Jeroacutenimo por su especial colaboracioacuten en la etapa preliminar de los anaacutelisis microbioloacutegicos realizados
Al personal del laboratorio de Ciencia y Tecnologiacutea de la Carne Lic Merlis Leal y Sr Adolfo vivas por su colaboracioacuten en la recoleccioacuten y procesamiento
de la muestra
Agradezco a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la cual formo parte al y al Consejo de Desarrollo Cientiacutefico y Humaniacutestico de la Universidad del Zulia
(CONDES LUZ) por el soporte financiero para la realizacioacuten de este proyecto sin el apoyo econoacutemico estas liacuteneas no fueran posibles
A mis compantildeeras de maestriacutea Lic Jessonica Chaciacuten y Lic Janeth Romaacuten
por su amistad y apoyo incondicional
A todos los que de alguna manera contribuyeron para que yo lograra este proyecto
A todos infinitas graciashellip
TABLA DE CONTENIDO
Paacutegina
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
Abstracthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
Dedicatoriahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6
Agradecimientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 7
Tabla de contenidohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 8
Lista de Tablas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
Lista de figuras helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
CAPIacuteTULO
I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
II MARCO TEOacuteRICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Antecedentes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Bacteacuterias Aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
Cultivos iniciadores comercialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Empacado al vaciacuteohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
Fermentaciones caacuternicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
III MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Disentildeo de la investigacioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Obtencioacuten y preparacioacuten de las muestrashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y
el tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos
coliformes totales y Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Paacutegina
Determinacioacuten del pHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Identificacioacuten de especies de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Aislamiento de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten del inoacuteculohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten e inoculacioacuten de galeriacutea API 50CHhelliphelliphelliphelliphellip 36
Anaacutelisis estadiacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Disentildeo del experimentohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Modelo matemaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH 39
Tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la
carne de reshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
Calidad microbioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 55
REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 56
LISTA DE TABLAS
Tabla Paacutegina
1 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y pH en carnes
empacadas al vaciacuteo seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphellip 40
2
Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas obtenidas por diferentes meacutetodos de determinacioacuten seguacuten el tiempo de
almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
3 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas y heterofermentativas en carnes empacadas al vaciacuteo seguacuten el
tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
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4 Nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphellip 47
5 Distribucioacuten porcentual de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas aisladas de carnes de res empacada al vaciacuteohelliphelliphelliphellip
50
LISTA DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
40
2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas
al vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmChelliphelliphelliphelliphelliphellip
45
3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes
totales Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
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CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
La contaminacioacuten microbiana de las carnes es consecuencia de los
procedimientos aplicados durante la preparacioacuten de la canal tales como
sangriacutea desollado eviscerado almacenamiento y transporte de la misma
los cuales influyen directamente en el tipo y cantidad de microorganismos
presentes en las carnes (Labadie 1999) Las fallas en los procedimientos
operacionales y adopcioacuten de praacutecticas higieacutenicas inadecuadas hacen posible
que una amplia gama de microorganismos conformen la flora de la carne
fresca (Guerrero y col 1995)
La carne es un medio excelente para mantener el crecimiento bacterial
las caracteriacutesticas que explican el raacutepido crecimiento microbial en la carne
son sus propiedades bioloacutegicas y composicioacuten quiacutemica entre las que se
distinguen un alto contenido de proteiacutenas pH ligeramente aacutecido y una
elevada actividad de agua (Huis y Veld 1996) Es importante mencionar que
la carga inicial de bacterias psicroacutefilas y la dinaacutemica de crecimiento de las
mismas son los factores maacutes influyentes en el deterioro de la carne en
refrigeracioacuten (Gould y Abee 1995 Jones 2004)
Con la finalidad de prolongar la vida uacutetil de las carnes frescas en las
ultimas deacutecadas se han popularizado los meacutetodos de empacados al vaciacuteo y
en atmoacutesferas modificadas ya que estos limitan el crecimiento de especies
microbianas relacionadas con la descomposicioacuten (Brody 1996)
Bajo estas condiciones de empaque y en refrigeracioacuten la microflora de
la carne es usualmente dominada por las bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
debido al establecimiento de un efecto modificador en la microflora de la
carne pasando del predominio de los bacilos Gram negativos putrefactivos
tales como Pseudomonas ssp y microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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aacutecido laacutecticas presentes en carnes de res picadas y empacadas al vaciacuteo (2008) Trabajo de Grado Universidad del Zulia Facultad de
Ingenieriacutea Divisioacuten de postgrado Maracaibo Venezuela 63 p
RESUMEN
El propoacutesito de esta investigacioacuten fue evaluar el tiempo de almacenamiento y
la calidad microbioloacutegica de carnes de res empacada al vaciacuteo (CREV) se compararon dos meacutetodos de determinacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
y se identificaron las BAL presentes en estas carnes Para tal fin se utilizaron diez muestras de carne de res procedente del corte Paleta obtenidas a las 48
horas posterior al sacrificio Estas fueron molidas empacadas al vaciacuteo y almacenadas durante 0 7 14 y 21 diacuteas a 5ordmC En cada tiempo de
almacenamiento fueron determinados el nuacutemero de BAL el pH recuento total de aerobios (RTA) coliformes totales (CT) y Escherichia coli (Ecoli) El
tiempo de empacado afectoacute el crecimiento de BAL pH RTA y CT (Plt005) El nuacutemero de BAL se incrementoacute al aumentar el tiempo de empacado
diminuyendo el pH Las BAL fueron el grupo microbiano dominante en las
CREV a partir del diacutea 7 Se determinoacute que la CREV requiere de aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas para lograr un nivel de BAL
adecuado para iniciar un proceso de fermentacioacuten caacuternica sin necesidad de antildeadir cultivo iniciador a la mezcla caacuternica Se identificaron 125 cepas de
BAL el 76 de los aislados correspondioacute al grupo BAL heterofermentativas facultativas seguido por las homofermentativas obligadas 12 y
heterofermentativas obligadas 80 Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y Lactobacillus sakei (256) Otros de los
aislamientos correspondieron Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei (96) Leuconostoc mesenteroides subsp
mesenteroidesdextranicum (8) La utilizacioacuten de CREV por un tiempo miacutenimo de 7 diacuteas con 10 horas es una alternativa viable en la elaboracioacuten de
productos caacuternicos fermentados sin la adicioacuten de cultivo iniciador
Palabras Claves Bacterias aacutecido laacutecticas carnes de res empaque al vaciacuteo
E-mail floresrondon30yahooes
Flores Rondoacuten Carolina Helsinski Evolution and identification of lactic
acid Bacteria en vacuum packed ground beef meat(2008) Trabajo de
Grado Universidad del Zulia Facultad de Ingenieriacutea Divisioacuten de postgrado Maracaibo Venezuela 63 p
ABSTRACT
The purpose of investigation was evaluate storage time and microbiological
quality for vacuum packed ground beef (VPGB) Were evaluated two methods of determination of lactic acid Bacteria (LAB) were compared and
subsequently LAB present in meat were identified Ten samples of beef from the top blade cut obtained to 48 h after slaughter were used These samples
were grounded vacuum packed and stored during 0 7 14 and 21 days to 5ordmC From each storages time of number of LAB pH total aerobics plate
count (APC) total coliforms (TC) and Escherichia coli were determined Storage time affected (Plt 005) number BAL APC and TC It was observed
that number of LAB increase and pH decreased as storage time was longer The LAB were the dominant bacterial group in VPGB from day 7 It was
determined that VPGB required approximately of 7 days and 10 hours to achieve and adequate level of BAL to initiate a process of meat fermentation
without need addition of a commercial starters cultures in meat mixes It was identify 125 LAB strains from which 76 of isolated LAB corresponded
to the group of facultatively heterofermentative followed by the obliged homofermentative (12 ) and obliged heterofermentative (8 ) Dominants
species were Lactobacillus curvatus (288 ) and Lactobacillus sakei (256 ) Other bacterial isolations corresponded to Lactobacillus plantarum (12
) and Lactobacillus paracasei subsp paracasei (96 ) Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroidesdextranicum (8 ) Utilization of VPGB
by a minimum time of the 7 and 10 h is feasible alternative in the elaboration of fermented meat product without addition of a commercial
starters culture
Key words lactic acid bacteria beef meat vacuum packing
E-mail floresrondon30yahooes
DEDICATORIA
A la luz de mi vida Valentina Isabel
A Finlandia Edin Joseacute Alonso
Eleazar Alonso Daniel y a mi difunto
Padre
AGRADECIMIENTOS
Ante todo a Dios todopoderoso por haber permitido la realizacioacuten y
culminacioacuten de esta investigacioacuten
A madre por su dedicacioacuten y abnegados cuidados para valentina y mi persona
A Edin Joseacute por su infinito amor y comprensioacuten
A los profesores Yasmina Barboza Jorge Ruiz y Egar Saacutenchez por sus
invalorables aportes apoyo y colaboracioacuten en la ejecucioacuten de esta investigacioacuten
Al personal del laboratorio de Microbiologiacutea de la FCV Lic Mireya Moreno
Lic Isamar Coronado y Sr Jeroacutenimo por su especial colaboracioacuten en la etapa preliminar de los anaacutelisis microbioloacutegicos realizados
Al personal del laboratorio de Ciencia y Tecnologiacutea de la Carne Lic Merlis Leal y Sr Adolfo vivas por su colaboracioacuten en la recoleccioacuten y procesamiento
de la muestra
Agradezco a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la cual formo parte al y al Consejo de Desarrollo Cientiacutefico y Humaniacutestico de la Universidad del Zulia
(CONDES LUZ) por el soporte financiero para la realizacioacuten de este proyecto sin el apoyo econoacutemico estas liacuteneas no fueran posibles
A mis compantildeeras de maestriacutea Lic Jessonica Chaciacuten y Lic Janeth Romaacuten
por su amistad y apoyo incondicional
A todos los que de alguna manera contribuyeron para que yo lograra este proyecto
A todos infinitas graciashellip
TABLA DE CONTENIDO
Paacutegina
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
Abstracthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
Dedicatoriahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6
Agradecimientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 7
Tabla de contenidohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 8
Lista de Tablas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
Lista de figuras helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
CAPIacuteTULO
I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
II MARCO TEOacuteRICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Antecedentes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Bacteacuterias Aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
Cultivos iniciadores comercialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Empacado al vaciacuteohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
Fermentaciones caacuternicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
III MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Disentildeo de la investigacioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Obtencioacuten y preparacioacuten de las muestrashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y
el tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos
coliformes totales y Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Paacutegina
Determinacioacuten del pHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Identificacioacuten de especies de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Aislamiento de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten del inoacuteculohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten e inoculacioacuten de galeriacutea API 50CHhelliphelliphelliphelliphellip 36
Anaacutelisis estadiacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Disentildeo del experimentohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Modelo matemaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH 39
Tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la
carne de reshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
Calidad microbioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 55
REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 56
LISTA DE TABLAS
Tabla Paacutegina
1 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y pH en carnes
empacadas al vaciacuteo seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphellip 40
2
Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas obtenidas por diferentes meacutetodos de determinacioacuten seguacuten el tiempo de
almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
3 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas y heterofermentativas en carnes empacadas al vaciacuteo seguacuten el
tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
43
4 Nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphellip 47
5 Distribucioacuten porcentual de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas aisladas de carnes de res empacada al vaciacuteohelliphelliphelliphellip
50
LISTA DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
40
2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas
al vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmChelliphelliphelliphelliphelliphellip
45
3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes
totales Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
47
CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
La contaminacioacuten microbiana de las carnes es consecuencia de los
procedimientos aplicados durante la preparacioacuten de la canal tales como
sangriacutea desollado eviscerado almacenamiento y transporte de la misma
los cuales influyen directamente en el tipo y cantidad de microorganismos
presentes en las carnes (Labadie 1999) Las fallas en los procedimientos
operacionales y adopcioacuten de praacutecticas higieacutenicas inadecuadas hacen posible
que una amplia gama de microorganismos conformen la flora de la carne
fresca (Guerrero y col 1995)
La carne es un medio excelente para mantener el crecimiento bacterial
las caracteriacutesticas que explican el raacutepido crecimiento microbial en la carne
son sus propiedades bioloacutegicas y composicioacuten quiacutemica entre las que se
distinguen un alto contenido de proteiacutenas pH ligeramente aacutecido y una
elevada actividad de agua (Huis y Veld 1996) Es importante mencionar que
la carga inicial de bacterias psicroacutefilas y la dinaacutemica de crecimiento de las
mismas son los factores maacutes influyentes en el deterioro de la carne en
refrigeracioacuten (Gould y Abee 1995 Jones 2004)
Con la finalidad de prolongar la vida uacutetil de las carnes frescas en las
ultimas deacutecadas se han popularizado los meacutetodos de empacados al vaciacuteo y
en atmoacutesferas modificadas ya que estos limitan el crecimiento de especies
microbianas relacionadas con la descomposicioacuten (Brody 1996)
Bajo estas condiciones de empaque y en refrigeracioacuten la microflora de
la carne es usualmente dominada por las bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
debido al establecimiento de un efecto modificador en la microflora de la
carne pasando del predominio de los bacilos Gram negativos putrefactivos
tales como Pseudomonas ssp y microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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ABSTRACT
The purpose of investigation was evaluate storage time and microbiological
quality for vacuum packed ground beef (VPGB) Were evaluated two methods of determination of lactic acid Bacteria (LAB) were compared and
subsequently LAB present in meat were identified Ten samples of beef from the top blade cut obtained to 48 h after slaughter were used These samples
were grounded vacuum packed and stored during 0 7 14 and 21 days to 5ordmC From each storages time of number of LAB pH total aerobics plate
count (APC) total coliforms (TC) and Escherichia coli were determined Storage time affected (Plt 005) number BAL APC and TC It was observed
that number of LAB increase and pH decreased as storage time was longer The LAB were the dominant bacterial group in VPGB from day 7 It was
determined that VPGB required approximately of 7 days and 10 hours to achieve and adequate level of BAL to initiate a process of meat fermentation
without need addition of a commercial starters cultures in meat mixes It was identify 125 LAB strains from which 76 of isolated LAB corresponded
to the group of facultatively heterofermentative followed by the obliged homofermentative (12 ) and obliged heterofermentative (8 ) Dominants
species were Lactobacillus curvatus (288 ) and Lactobacillus sakei (256 ) Other bacterial isolations corresponded to Lactobacillus plantarum (12
) and Lactobacillus paracasei subsp paracasei (96 ) Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroidesdextranicum (8 ) Utilization of VPGB
by a minimum time of the 7 and 10 h is feasible alternative in the elaboration of fermented meat product without addition of a commercial
starters culture
Key words lactic acid bacteria beef meat vacuum packing
E-mail floresrondon30yahooes
DEDICATORIA
A la luz de mi vida Valentina Isabel
A Finlandia Edin Joseacute Alonso
Eleazar Alonso Daniel y a mi difunto
Padre
AGRADECIMIENTOS
Ante todo a Dios todopoderoso por haber permitido la realizacioacuten y
culminacioacuten de esta investigacioacuten
A madre por su dedicacioacuten y abnegados cuidados para valentina y mi persona
A Edin Joseacute por su infinito amor y comprensioacuten
A los profesores Yasmina Barboza Jorge Ruiz y Egar Saacutenchez por sus
invalorables aportes apoyo y colaboracioacuten en la ejecucioacuten de esta investigacioacuten
Al personal del laboratorio de Microbiologiacutea de la FCV Lic Mireya Moreno
Lic Isamar Coronado y Sr Jeroacutenimo por su especial colaboracioacuten en la etapa preliminar de los anaacutelisis microbioloacutegicos realizados
Al personal del laboratorio de Ciencia y Tecnologiacutea de la Carne Lic Merlis Leal y Sr Adolfo vivas por su colaboracioacuten en la recoleccioacuten y procesamiento
de la muestra
Agradezco a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la cual formo parte al y al Consejo de Desarrollo Cientiacutefico y Humaniacutestico de la Universidad del Zulia
(CONDES LUZ) por el soporte financiero para la realizacioacuten de este proyecto sin el apoyo econoacutemico estas liacuteneas no fueran posibles
A mis compantildeeras de maestriacutea Lic Jessonica Chaciacuten y Lic Janeth Romaacuten
por su amistad y apoyo incondicional
A todos los que de alguna manera contribuyeron para que yo lograra este proyecto
A todos infinitas graciashellip
TABLA DE CONTENIDO
Paacutegina
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
Abstracthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
Dedicatoriahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6
Agradecimientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 7
Tabla de contenidohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 8
Lista de Tablas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
Lista de figuras helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
CAPIacuteTULO
I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
II MARCO TEOacuteRICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Antecedentes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Bacteacuterias Aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
Cultivos iniciadores comercialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Empacado al vaciacuteohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
Fermentaciones caacuternicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
III MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Disentildeo de la investigacioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Obtencioacuten y preparacioacuten de las muestrashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y
el tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos
coliformes totales y Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Paacutegina
Determinacioacuten del pHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Identificacioacuten de especies de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Aislamiento de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten del inoacuteculohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten e inoculacioacuten de galeriacutea API 50CHhelliphelliphelliphelliphellip 36
Anaacutelisis estadiacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Disentildeo del experimentohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Modelo matemaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH 39
Tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la
carne de reshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
Calidad microbioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 55
REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 56
LISTA DE TABLAS
Tabla Paacutegina
1 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y pH en carnes
empacadas al vaciacuteo seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphellip 40
2
Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas obtenidas por diferentes meacutetodos de determinacioacuten seguacuten el tiempo de
almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
3 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas y heterofermentativas en carnes empacadas al vaciacuteo seguacuten el
tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
43
4 Nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphellip 47
5 Distribucioacuten porcentual de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas aisladas de carnes de res empacada al vaciacuteohelliphelliphelliphellip
50
LISTA DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
40
2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas
al vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmChelliphelliphelliphelliphelliphellip
45
3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes
totales Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
47
CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
La contaminacioacuten microbiana de las carnes es consecuencia de los
procedimientos aplicados durante la preparacioacuten de la canal tales como
sangriacutea desollado eviscerado almacenamiento y transporte de la misma
los cuales influyen directamente en el tipo y cantidad de microorganismos
presentes en las carnes (Labadie 1999) Las fallas en los procedimientos
operacionales y adopcioacuten de praacutecticas higieacutenicas inadecuadas hacen posible
que una amplia gama de microorganismos conformen la flora de la carne
fresca (Guerrero y col 1995)
La carne es un medio excelente para mantener el crecimiento bacterial
las caracteriacutesticas que explican el raacutepido crecimiento microbial en la carne
son sus propiedades bioloacutegicas y composicioacuten quiacutemica entre las que se
distinguen un alto contenido de proteiacutenas pH ligeramente aacutecido y una
elevada actividad de agua (Huis y Veld 1996) Es importante mencionar que
la carga inicial de bacterias psicroacutefilas y la dinaacutemica de crecimiento de las
mismas son los factores maacutes influyentes en el deterioro de la carne en
refrigeracioacuten (Gould y Abee 1995 Jones 2004)
Con la finalidad de prolongar la vida uacutetil de las carnes frescas en las
ultimas deacutecadas se han popularizado los meacutetodos de empacados al vaciacuteo y
en atmoacutesferas modificadas ya que estos limitan el crecimiento de especies
microbianas relacionadas con la descomposicioacuten (Brody 1996)
Bajo estas condiciones de empaque y en refrigeracioacuten la microflora de
la carne es usualmente dominada por las bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
debido al establecimiento de un efecto modificador en la microflora de la
carne pasando del predominio de los bacilos Gram negativos putrefactivos
tales como Pseudomonas ssp y microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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DEDICATORIA
A la luz de mi vida Valentina Isabel
A Finlandia Edin Joseacute Alonso
Eleazar Alonso Daniel y a mi difunto
Padre
AGRADECIMIENTOS
Ante todo a Dios todopoderoso por haber permitido la realizacioacuten y
culminacioacuten de esta investigacioacuten
A madre por su dedicacioacuten y abnegados cuidados para valentina y mi persona
A Edin Joseacute por su infinito amor y comprensioacuten
A los profesores Yasmina Barboza Jorge Ruiz y Egar Saacutenchez por sus
invalorables aportes apoyo y colaboracioacuten en la ejecucioacuten de esta investigacioacuten
Al personal del laboratorio de Microbiologiacutea de la FCV Lic Mireya Moreno
Lic Isamar Coronado y Sr Jeroacutenimo por su especial colaboracioacuten en la etapa preliminar de los anaacutelisis microbioloacutegicos realizados
Al personal del laboratorio de Ciencia y Tecnologiacutea de la Carne Lic Merlis Leal y Sr Adolfo vivas por su colaboracioacuten en la recoleccioacuten y procesamiento
de la muestra
Agradezco a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la cual formo parte al y al Consejo de Desarrollo Cientiacutefico y Humaniacutestico de la Universidad del Zulia
(CONDES LUZ) por el soporte financiero para la realizacioacuten de este proyecto sin el apoyo econoacutemico estas liacuteneas no fueran posibles
A mis compantildeeras de maestriacutea Lic Jessonica Chaciacuten y Lic Janeth Romaacuten
por su amistad y apoyo incondicional
A todos los que de alguna manera contribuyeron para que yo lograra este proyecto
A todos infinitas graciashellip
TABLA DE CONTENIDO
Paacutegina
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
Abstracthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
Dedicatoriahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6
Agradecimientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 7
Tabla de contenidohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 8
Lista de Tablas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
Lista de figuras helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
CAPIacuteTULO
I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
II MARCO TEOacuteRICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Antecedentes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Bacteacuterias Aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
Cultivos iniciadores comercialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Empacado al vaciacuteohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
Fermentaciones caacuternicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
III MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Disentildeo de la investigacioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Obtencioacuten y preparacioacuten de las muestrashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y
el tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos
coliformes totales y Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Paacutegina
Determinacioacuten del pHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Identificacioacuten de especies de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Aislamiento de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten del inoacuteculohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten e inoculacioacuten de galeriacutea API 50CHhelliphelliphelliphelliphellip 36
Anaacutelisis estadiacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Disentildeo del experimentohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Modelo matemaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH 39
Tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la
carne de reshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
Calidad microbioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 55
REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 56
LISTA DE TABLAS
Tabla Paacutegina
1 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y pH en carnes
empacadas al vaciacuteo seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphellip 40
2
Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas obtenidas por diferentes meacutetodos de determinacioacuten seguacuten el tiempo de
almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
3 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas y heterofermentativas en carnes empacadas al vaciacuteo seguacuten el
tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
43
4 Nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphellip 47
5 Distribucioacuten porcentual de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas aisladas de carnes de res empacada al vaciacuteohelliphelliphelliphellip
50
LISTA DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
40
2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas
al vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmChelliphelliphelliphelliphelliphellip
45
3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes
totales Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
47
CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
La contaminacioacuten microbiana de las carnes es consecuencia de los
procedimientos aplicados durante la preparacioacuten de la canal tales como
sangriacutea desollado eviscerado almacenamiento y transporte de la misma
los cuales influyen directamente en el tipo y cantidad de microorganismos
presentes en las carnes (Labadie 1999) Las fallas en los procedimientos
operacionales y adopcioacuten de praacutecticas higieacutenicas inadecuadas hacen posible
que una amplia gama de microorganismos conformen la flora de la carne
fresca (Guerrero y col 1995)
La carne es un medio excelente para mantener el crecimiento bacterial
las caracteriacutesticas que explican el raacutepido crecimiento microbial en la carne
son sus propiedades bioloacutegicas y composicioacuten quiacutemica entre las que se
distinguen un alto contenido de proteiacutenas pH ligeramente aacutecido y una
elevada actividad de agua (Huis y Veld 1996) Es importante mencionar que
la carga inicial de bacterias psicroacutefilas y la dinaacutemica de crecimiento de las
mismas son los factores maacutes influyentes en el deterioro de la carne en
refrigeracioacuten (Gould y Abee 1995 Jones 2004)
Con la finalidad de prolongar la vida uacutetil de las carnes frescas en las
ultimas deacutecadas se han popularizado los meacutetodos de empacados al vaciacuteo y
en atmoacutesferas modificadas ya que estos limitan el crecimiento de especies
microbianas relacionadas con la descomposicioacuten (Brody 1996)
Bajo estas condiciones de empaque y en refrigeracioacuten la microflora de
la carne es usualmente dominada por las bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
debido al establecimiento de un efecto modificador en la microflora de la
carne pasando del predominio de los bacilos Gram negativos putrefactivos
tales como Pseudomonas ssp y microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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AGRADECIMIENTOS
Ante todo a Dios todopoderoso por haber permitido la realizacioacuten y
culminacioacuten de esta investigacioacuten
A madre por su dedicacioacuten y abnegados cuidados para valentina y mi persona
A Edin Joseacute por su infinito amor y comprensioacuten
A los profesores Yasmina Barboza Jorge Ruiz y Egar Saacutenchez por sus
invalorables aportes apoyo y colaboracioacuten en la ejecucioacuten de esta investigacioacuten
Al personal del laboratorio de Microbiologiacutea de la FCV Lic Mireya Moreno
Lic Isamar Coronado y Sr Jeroacutenimo por su especial colaboracioacuten en la etapa preliminar de los anaacutelisis microbioloacutegicos realizados
Al personal del laboratorio de Ciencia y Tecnologiacutea de la Carne Lic Merlis Leal y Sr Adolfo vivas por su colaboracioacuten en la recoleccioacuten y procesamiento
de la muestra
Agradezco a la Facultad de Ciencias Veterinarias de la cual formo parte al y al Consejo de Desarrollo Cientiacutefico y Humaniacutestico de la Universidad del Zulia
(CONDES LUZ) por el soporte financiero para la realizacioacuten de este proyecto sin el apoyo econoacutemico estas liacuteneas no fueran posibles
A mis compantildeeras de maestriacutea Lic Jessonica Chaciacuten y Lic Janeth Romaacuten
por su amistad y apoyo incondicional
A todos los que de alguna manera contribuyeron para que yo lograra este proyecto
A todos infinitas graciashellip
TABLA DE CONTENIDO
Paacutegina
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
Abstracthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
Dedicatoriahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6
Agradecimientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 7
Tabla de contenidohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 8
Lista de Tablas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
Lista de figuras helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
CAPIacuteTULO
I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
II MARCO TEOacuteRICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Antecedentes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Bacteacuterias Aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
Cultivos iniciadores comercialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Empacado al vaciacuteohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
Fermentaciones caacuternicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
III MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Disentildeo de la investigacioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Obtencioacuten y preparacioacuten de las muestrashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y
el tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos
coliformes totales y Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Paacutegina
Determinacioacuten del pHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Identificacioacuten de especies de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Aislamiento de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten del inoacuteculohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten e inoculacioacuten de galeriacutea API 50CHhelliphelliphelliphelliphellip 36
Anaacutelisis estadiacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Disentildeo del experimentohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Modelo matemaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH 39
Tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la
carne de reshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
Calidad microbioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 55
REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 56
LISTA DE TABLAS
Tabla Paacutegina
1 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y pH en carnes
empacadas al vaciacuteo seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphellip 40
2
Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas obtenidas por diferentes meacutetodos de determinacioacuten seguacuten el tiempo de
almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
3 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas y heterofermentativas en carnes empacadas al vaciacuteo seguacuten el
tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
43
4 Nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphellip 47
5 Distribucioacuten porcentual de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas aisladas de carnes de res empacada al vaciacuteohelliphelliphelliphellip
50
LISTA DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
40
2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas
al vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmChelliphelliphelliphelliphelliphellip
45
3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes
totales Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
47
CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
La contaminacioacuten microbiana de las carnes es consecuencia de los
procedimientos aplicados durante la preparacioacuten de la canal tales como
sangriacutea desollado eviscerado almacenamiento y transporte de la misma
los cuales influyen directamente en el tipo y cantidad de microorganismos
presentes en las carnes (Labadie 1999) Las fallas en los procedimientos
operacionales y adopcioacuten de praacutecticas higieacutenicas inadecuadas hacen posible
que una amplia gama de microorganismos conformen la flora de la carne
fresca (Guerrero y col 1995)
La carne es un medio excelente para mantener el crecimiento bacterial
las caracteriacutesticas que explican el raacutepido crecimiento microbial en la carne
son sus propiedades bioloacutegicas y composicioacuten quiacutemica entre las que se
distinguen un alto contenido de proteiacutenas pH ligeramente aacutecido y una
elevada actividad de agua (Huis y Veld 1996) Es importante mencionar que
la carga inicial de bacterias psicroacutefilas y la dinaacutemica de crecimiento de las
mismas son los factores maacutes influyentes en el deterioro de la carne en
refrigeracioacuten (Gould y Abee 1995 Jones 2004)
Con la finalidad de prolongar la vida uacutetil de las carnes frescas en las
ultimas deacutecadas se han popularizado los meacutetodos de empacados al vaciacuteo y
en atmoacutesferas modificadas ya que estos limitan el crecimiento de especies
microbianas relacionadas con la descomposicioacuten (Brody 1996)
Bajo estas condiciones de empaque y en refrigeracioacuten la microflora de
la carne es usualmente dominada por las bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
debido al establecimiento de un efecto modificador en la microflora de la
carne pasando del predominio de los bacilos Gram negativos putrefactivos
tales como Pseudomonas ssp y microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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TABLA DE CONTENIDO
Paacutegina
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
Abstracthelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 5
Dedicatoriahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 6
Agradecimientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 7
Tabla de contenidohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 8
Lista de Tablas helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
Lista de figuras helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
CAPIacuteTULO
I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
II MARCO TEOacuteRICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Antecedentes helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
Bacteacuterias Aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
Cultivos iniciadores comercialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Empacado al vaciacuteohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
Fermentaciones caacuternicashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
III MATERIALES Y MEacuteTODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Disentildeo de la investigacioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Obtencioacuten y preparacioacuten de las muestrashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 32
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y
el tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos
coliformes totales y Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Paacutegina
Determinacioacuten del pHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Identificacioacuten de especies de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Aislamiento de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten del inoacuteculohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten e inoculacioacuten de galeriacutea API 50CHhelliphelliphelliphelliphellip 36
Anaacutelisis estadiacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Disentildeo del experimentohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Modelo matemaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH 39
Tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la
carne de reshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
Calidad microbioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 55
REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 56
LISTA DE TABLAS
Tabla Paacutegina
1 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y pH en carnes
empacadas al vaciacuteo seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphellip 40
2
Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas obtenidas por diferentes meacutetodos de determinacioacuten seguacuten el tiempo de
almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
3 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas y heterofermentativas en carnes empacadas al vaciacuteo seguacuten el
tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
43
4 Nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphellip 47
5 Distribucioacuten porcentual de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas aisladas de carnes de res empacada al vaciacuteohelliphelliphelliphellip
50
LISTA DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
40
2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas
al vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmChelliphelliphelliphelliphelliphellip
45
3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes
totales Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
47
CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
La contaminacioacuten microbiana de las carnes es consecuencia de los
procedimientos aplicados durante la preparacioacuten de la canal tales como
sangriacutea desollado eviscerado almacenamiento y transporte de la misma
los cuales influyen directamente en el tipo y cantidad de microorganismos
presentes en las carnes (Labadie 1999) Las fallas en los procedimientos
operacionales y adopcioacuten de praacutecticas higieacutenicas inadecuadas hacen posible
que una amplia gama de microorganismos conformen la flora de la carne
fresca (Guerrero y col 1995)
La carne es un medio excelente para mantener el crecimiento bacterial
las caracteriacutesticas que explican el raacutepido crecimiento microbial en la carne
son sus propiedades bioloacutegicas y composicioacuten quiacutemica entre las que se
distinguen un alto contenido de proteiacutenas pH ligeramente aacutecido y una
elevada actividad de agua (Huis y Veld 1996) Es importante mencionar que
la carga inicial de bacterias psicroacutefilas y la dinaacutemica de crecimiento de las
mismas son los factores maacutes influyentes en el deterioro de la carne en
refrigeracioacuten (Gould y Abee 1995 Jones 2004)
Con la finalidad de prolongar la vida uacutetil de las carnes frescas en las
ultimas deacutecadas se han popularizado los meacutetodos de empacados al vaciacuteo y
en atmoacutesferas modificadas ya que estos limitan el crecimiento de especies
microbianas relacionadas con la descomposicioacuten (Brody 1996)
Bajo estas condiciones de empaque y en refrigeracioacuten la microflora de
la carne es usualmente dominada por las bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
debido al establecimiento de un efecto modificador en la microflora de la
carne pasando del predominio de los bacilos Gram negativos putrefactivos
tales como Pseudomonas ssp y microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Paacutegina
Determinacioacuten del pHhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Identificacioacuten de especies de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Aislamiento de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten del inoacuteculohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Preparacioacuten e inoculacioacuten de galeriacutea API 50CHhelliphelliphelliphelliphellip 36
Anaacutelisis estadiacutesticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Disentildeo del experimentohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Modelo matemaacuteticohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH 39
Tipo de fermentacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 41
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la
carne de reshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
Calidad microbioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 46
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 55
REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 56
LISTA DE TABLAS
Tabla Paacutegina
1 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y pH en carnes
empacadas al vaciacuteo seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphellip 40
2
Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas obtenidas por diferentes meacutetodos de determinacioacuten seguacuten el tiempo de
almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
3 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas y heterofermentativas en carnes empacadas al vaciacuteo seguacuten el
tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
43
4 Nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphellip 47
5 Distribucioacuten porcentual de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas aisladas de carnes de res empacada al vaciacuteohelliphelliphelliphellip
50
LISTA DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
40
2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas
al vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmChelliphelliphelliphelliphelliphellip
45
3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes
totales Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
47
CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
La contaminacioacuten microbiana de las carnes es consecuencia de los
procedimientos aplicados durante la preparacioacuten de la canal tales como
sangriacutea desollado eviscerado almacenamiento y transporte de la misma
los cuales influyen directamente en el tipo y cantidad de microorganismos
presentes en las carnes (Labadie 1999) Las fallas en los procedimientos
operacionales y adopcioacuten de praacutecticas higieacutenicas inadecuadas hacen posible
que una amplia gama de microorganismos conformen la flora de la carne
fresca (Guerrero y col 1995)
La carne es un medio excelente para mantener el crecimiento bacterial
las caracteriacutesticas que explican el raacutepido crecimiento microbial en la carne
son sus propiedades bioloacutegicas y composicioacuten quiacutemica entre las que se
distinguen un alto contenido de proteiacutenas pH ligeramente aacutecido y una
elevada actividad de agua (Huis y Veld 1996) Es importante mencionar que
la carga inicial de bacterias psicroacutefilas y la dinaacutemica de crecimiento de las
mismas son los factores maacutes influyentes en el deterioro de la carne en
refrigeracioacuten (Gould y Abee 1995 Jones 2004)
Con la finalidad de prolongar la vida uacutetil de las carnes frescas en las
ultimas deacutecadas se han popularizado los meacutetodos de empacados al vaciacuteo y
en atmoacutesferas modificadas ya que estos limitan el crecimiento de especies
microbianas relacionadas con la descomposicioacuten (Brody 1996)
Bajo estas condiciones de empaque y en refrigeracioacuten la microflora de
la carne es usualmente dominada por las bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
debido al establecimiento de un efecto modificador en la microflora de la
carne pasando del predominio de los bacilos Gram negativos putrefactivos
tales como Pseudomonas ssp y microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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LISTA DE TABLAS
Tabla Paacutegina
1 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas y pH en carnes
empacadas al vaciacuteo seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphellip 40
2
Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas obtenidas por diferentes meacutetodos de determinacioacuten seguacuten el tiempo de
almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
3 Nuacutemero de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas y heterofermentativas en carnes empacadas al vaciacuteo seguacuten el
tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
43
4 Nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli seguacuten el tiempo de almacenamientohelliphelliphelliphelliphellip 47
5 Distribucioacuten porcentual de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas aisladas de carnes de res empacada al vaciacuteohelliphelliphelliphellip
50
LISTA DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
40
2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas
al vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmChelliphelliphelliphelliphelliphellip
45
3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes
totales Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
47
CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
La contaminacioacuten microbiana de las carnes es consecuencia de los
procedimientos aplicados durante la preparacioacuten de la canal tales como
sangriacutea desollado eviscerado almacenamiento y transporte de la misma
los cuales influyen directamente en el tipo y cantidad de microorganismos
presentes en las carnes (Labadie 1999) Las fallas en los procedimientos
operacionales y adopcioacuten de praacutecticas higieacutenicas inadecuadas hacen posible
que una amplia gama de microorganismos conformen la flora de la carne
fresca (Guerrero y col 1995)
La carne es un medio excelente para mantener el crecimiento bacterial
las caracteriacutesticas que explican el raacutepido crecimiento microbial en la carne
son sus propiedades bioloacutegicas y composicioacuten quiacutemica entre las que se
distinguen un alto contenido de proteiacutenas pH ligeramente aacutecido y una
elevada actividad de agua (Huis y Veld 1996) Es importante mencionar que
la carga inicial de bacterias psicroacutefilas y la dinaacutemica de crecimiento de las
mismas son los factores maacutes influyentes en el deterioro de la carne en
refrigeracioacuten (Gould y Abee 1995 Jones 2004)
Con la finalidad de prolongar la vida uacutetil de las carnes frescas en las
ultimas deacutecadas se han popularizado los meacutetodos de empacados al vaciacuteo y
en atmoacutesferas modificadas ya que estos limitan el crecimiento de especies
microbianas relacionadas con la descomposicioacuten (Brody 1996)
Bajo estas condiciones de empaque y en refrigeracioacuten la microflora de
la carne es usualmente dominada por las bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
debido al establecimiento de un efecto modificador en la microflora de la
carne pasando del predominio de los bacilos Gram negativos putrefactivos
tales como Pseudomonas ssp y microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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LISTA DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
40
2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas
al vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmChelliphelliphelliphelliphelliphellip
45
3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes
totales Escherichia colihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
47
CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
La contaminacioacuten microbiana de las carnes es consecuencia de los
procedimientos aplicados durante la preparacioacuten de la canal tales como
sangriacutea desollado eviscerado almacenamiento y transporte de la misma
los cuales influyen directamente en el tipo y cantidad de microorganismos
presentes en las carnes (Labadie 1999) Las fallas en los procedimientos
operacionales y adopcioacuten de praacutecticas higieacutenicas inadecuadas hacen posible
que una amplia gama de microorganismos conformen la flora de la carne
fresca (Guerrero y col 1995)
La carne es un medio excelente para mantener el crecimiento bacterial
las caracteriacutesticas que explican el raacutepido crecimiento microbial en la carne
son sus propiedades bioloacutegicas y composicioacuten quiacutemica entre las que se
distinguen un alto contenido de proteiacutenas pH ligeramente aacutecido y una
elevada actividad de agua (Huis y Veld 1996) Es importante mencionar que
la carga inicial de bacterias psicroacutefilas y la dinaacutemica de crecimiento de las
mismas son los factores maacutes influyentes en el deterioro de la carne en
refrigeracioacuten (Gould y Abee 1995 Jones 2004)
Con la finalidad de prolongar la vida uacutetil de las carnes frescas en las
ultimas deacutecadas se han popularizado los meacutetodos de empacados al vaciacuteo y
en atmoacutesferas modificadas ya que estos limitan el crecimiento de especies
microbianas relacionadas con la descomposicioacuten (Brody 1996)
Bajo estas condiciones de empaque y en refrigeracioacuten la microflora de
la carne es usualmente dominada por las bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
debido al establecimiento de un efecto modificador en la microflora de la
carne pasando del predominio de los bacilos Gram negativos putrefactivos
tales como Pseudomonas ssp y microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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CAPIacuteTULO I
INTRODUCCIOacuteN
La contaminacioacuten microbiana de las carnes es consecuencia de los
procedimientos aplicados durante la preparacioacuten de la canal tales como
sangriacutea desollado eviscerado almacenamiento y transporte de la misma
los cuales influyen directamente en el tipo y cantidad de microorganismos
presentes en las carnes (Labadie 1999) Las fallas en los procedimientos
operacionales y adopcioacuten de praacutecticas higieacutenicas inadecuadas hacen posible
que una amplia gama de microorganismos conformen la flora de la carne
fresca (Guerrero y col 1995)
La carne es un medio excelente para mantener el crecimiento bacterial
las caracteriacutesticas que explican el raacutepido crecimiento microbial en la carne
son sus propiedades bioloacutegicas y composicioacuten quiacutemica entre las que se
distinguen un alto contenido de proteiacutenas pH ligeramente aacutecido y una
elevada actividad de agua (Huis y Veld 1996) Es importante mencionar que
la carga inicial de bacterias psicroacutefilas y la dinaacutemica de crecimiento de las
mismas son los factores maacutes influyentes en el deterioro de la carne en
refrigeracioacuten (Gould y Abee 1995 Jones 2004)
Con la finalidad de prolongar la vida uacutetil de las carnes frescas en las
ultimas deacutecadas se han popularizado los meacutetodos de empacados al vaciacuteo y
en atmoacutesferas modificadas ya que estos limitan el crecimiento de especies
microbianas relacionadas con la descomposicioacuten (Brody 1996)
Bajo estas condiciones de empaque y en refrigeracioacuten la microflora de
la carne es usualmente dominada por las bacterias aacutecido laacutecticas (BAL)
debido al establecimiento de un efecto modificador en la microflora de la
carne pasando del predominio de los bacilos Gram negativos putrefactivos
tales como Pseudomonas ssp y microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Enterobacteriaceae a los microorganismos Gram positivos como el caso de
las BAL (Dainty y Mackey 1992 Gill 1996 Jones 1999 Labadie 1999)
Estas desempentildean un rol importante en la preservacioacuten de las carnes debido
a la produccioacuten de compuestos antagonistas para el crecimiento de otros
grupos bacterianos (Axelsson 1993 Brody 1996 Stiles y Holpzapfel
1997)
Egan (1983) describe una gran variedad de sustancias inhibitorias
producidas por las BAL entre los que destacan los aacutecidos orgaacutenicos producto
de la fermentacioacuten de los carbohidratos como el aacutecido laacutectico asiacute como
tambieacuten el aacutecido aceacutetico que en conjunto con la acetoiacutena y diacetilo actuacutean
en asociacioacuten para disminuir el pH y lograr un ambiente desfavorable para el
crecimiento Asimismo Leistner y col (1996) y Hugas (1998) reportan la
produccioacuten de otros compuestos inhibitorios como el peroacutexido de hidroacutegeno
y bacteriocinas las cuales son compuestos activos que presentan efectos
contra agentes microbianos especiacuteficos
Por otra parte el tipo y la cantidad de productos de la fermentacioacuten
difieren entre especies de BAL en condiciones anaeroacutebicas las BAL
homofermentativas producen principalmente aacutecido laacutectico a partir de
glucosa caso contrario esta representado por las BAL heterofermentativas
las cuales producen una variedad de aacutecidos orgaacutenicos etanol y CO2 (Frazier
1993)
Muchos son los usos de las BAL en la industria caacuternica sus productos
metaboacutelicos juegan un papel importante en la preservacioacuten de las carnes y
productos caacuternicos por su accioacuten como agentes bioprotectores (Hames y
Knauf 1994) Estas representan el grupo mas importante de
microorganismos encontrados en los cultivos iniciadores comerciales
utilizados en las fermentaciones caacuternicas debido a su contribucioacuten en cada
uno de los objetivos del proceso de fermentacioacuten (Hugas 1998)
Es conocido que los productos fermentados fabricados
tradicionalmente con procesos de maduracioacuten natural presentan
caracteriacutesticas sensoriales maacutes deseables que los elaborados a escala
industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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industrial con cultivos iniciadores comerciales Esto es debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
(Greco y col 2005) Tambieacuten se ha demostrado que los cultivos iniciadores
maacutes adaptables para usar en la elaboracioacuten de productos caacuternicos
fermentados son los que provienen del mismo haacutebitat ya que estaacuten
especialmente adaptados a estas condiciones (Hugas y Monfort 1997)
Investigaciones realizadas por Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron
que carnes empacadas al vaciacuteo y refrigeradas durante catorce diacuteas a 5ordmC
eran adecuadas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado sin la necesidad de agregar cultivo iniciador Esto constituye una
alternativa interesante a desarrollar por la industria caacuternica a nivel nacional
debido a que el empleo de cultivos iniciadores acarrea altos costos de
produccioacuten en la elaboracioacuten de este tipo de producto caacuternico Por otro parte
empacar las carnes y almacenarlas en refrigeracioacuten es una praacutectica comuacuten
en nuestro medio debido a la necesidad de ablandar dichas carnes ya que
en su mayoriacutea proviene de animales de maacutes 30 meses de edad (Huerta y
col 1997)
Para obtener un adecuado proceso de fermentacioacuten de las carnes se
requiere que las cepas microbianas presenten algunas caracteriacutesticas
particulares para su utilizacioacuten entre las que se destacan una fermentacioacuten
laacutectica homofermentativa por lo que se hace necesario el aislamiento
identificacioacuten y seleccioacuten de BAL nativas encontradas en la carne Por otra
parte se necesita una carga inicial en el orden de 106 - 107 bacterias por
gramo de mezcla con lo cual se logra obtener las caracteriacutesticas
organoleacutepticas deseadas en este tipo de productos (Larpent 1995)
Por lo tanto se planificoacute una investigacioacuten que persigue los siguientes
objetivos
1 Determinar el tiempo de almacenamiento de la carne de res
empacadas al vaciacuteo (CREV) en el cual se producen niveles suficientes
de BAL para su utilizacioacuten en fermentaciones caacuternicas
2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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2 Comparar el meacutetodo de recuento de BAL tradicional con el meacutetodo de
recuento BAL en placas de peliacutecula seca rehidratable evaluando su
utilidad en la determinacioacuten del tipo de fermentacioacuten de la poblacioacuten de
BAL presentes en la carne de res empacada al vaciacuteo a traveacutes del uso
de meacutetodos raacutepidos
3 Analizar la calidad microbioloacutegica de la carne de res picada empacada
al vaciacuteo durante su almacenamiento en refrigeracioacuten
4 Identificar las especies de bacterias aacutecido laacutecticas presentes en la carne
de res picada empacada al vaciacuteo
CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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CAPIacuteTULO II
MARCO TEOacuteRICO
Antecedentes
Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) encontraron que el tiempo de empacado
afectoacute significativamente el crecimiento de los Lactobacillus Ellos
seleccionaron 14 diacuteas como tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo tiempo en
el cual la carne presento las condiciones para ser utilizadas en la elaboracioacuten
de un producto caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores
debido a que el nuacutemero de Lactobacillus en ese tiempo 618 Log ufcg no se
diferencioacute significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
Ademaacutes los productos fermentados elaborados con carne molida empacada
al vaciacuteo mostraron valores de pH maacutes bajos que los elaborados con carnes
molida previamente congelada mas cultivo iniciador Por lo cual se demostroacute
Para efectos de la investigacioacuten y debido a la necesidad de obtener
referencias claras relacionadas con el tema se realizoacute la revisioacuten de algunos
trabajos tomando en consideracioacuten su relacioacuten con la variable objeto de
estudios siendo variadas y muacuteltiples las investigaciones relacionadas con la
cuantificacioacuten e identificacioacuten de las BAL en diferentes carnes empacadas al
vaciacuteo Asiacute como tambieacuten su uso como cultivos protectores oacute su estudio como
agentes causantes de descomposicioacuten de las carnes y productos caacuternicos
Pocas son las investigaciones basadas en la utilizacioacuten de carnes empacadas
al vaciacuteo para elaborar productos caacuternicos fermentados a traveacutes de procesos
de maduracioacuten natural
A continuacioacuten se mencionan algunos estudios con la finalidad de dar
soporte teoacuterico a la investigacioacuten
que el empacado al vaciacuteo de la carne molida de res es una excelente teacutecnica
en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados
Otra investigacioacuten realizada por Greco y col (2005) revelaron que la
flora dominante durante la maduracioacuten de las carnes fueron las BAL Estas
estuvieron principalmente conformadas por bacilos mesoacutefilos
homofermentativos siendo los microorganismo principalmente aislados
Lactobacillus sakei (43) L plantarum (166) L curvatus (133)
Por otro lado el estudio de Samelis y col (1998) los resultados
indicaron mejores caracteriacutesticas sensoriales en los embutidos fermentados
elaborados mediante los procesos de fermentacioacuten natural debido a la
composicioacuten y actividad metaboacutelica de la flora nativa en la materia prima
La fermentacioacuten fue gobernada por BAL (gt108 ufcg) y estas
estuvieron representadas en un 83 por cepas de Lactobacillus sakei y L
curvatus Se observoacute que las bacterias Gram negativas y aeroacutebicas
formadoras de esporas disminuyeron en 102 y 103 ufcg respectivamente
mientras que el incremento de las levaduras no fue significativo durante toda
la maduracioacuten Los embutidos estuvieron libres de Clostridium sulfito-
reductores y Staphylococcus cuagulasa positivos Se concluyoacute que en la
conservacioacuten y mejora de los atributos sensoriales del salami griego
tradicional las cepas nativas de L sakei Staphylococcus xylosus y
posiblemente Staphylococcus saprophyticus nitrato-reductor resultaron ser
las mas adecuadas en la elaboracioacuten del salami griego tradicional
Las investigaciones relacionadas con la calidad higieacutenicas de las carnes
al vaciacuteo son variadas Naacutepravniacutekovaacute y col (2002) evaluaron carne de cerdo
empacada al vaciacuteo almacenada 25 plusmn 05 ordmC por periacuteodos de 14 21 28
35 diacuteas y determinaron que la vida uacutetil de la carne de cerdo empacada al
vaciacuteo vario entre 21 y 28 diacuteas dependiendo del pH inicial indicando que la
carne de cerdo con pH entre 580 y 595 es la mas adecuada para el
empacado al vaciacuteo Ademaacutes el recuento de BAL la estimacioacuten de la vida uacutetil
puede ser realizada por la concentracioacuten de amonio (r=09584 Plt005) el
pH (r=09317 Plt005) y concentracioacuten de forma D-lactato (r=09867
Pgt005) Ademaacutes se identificaron al Lactobacillus curvatus y el L xylosus
como los responsables de la descomposicioacuten de la carne de cerdo empacada
al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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al vaciacuteo durante 35 diacuteas
En otro estudio realizado por Jones (2004) trabajando con muestras
de lomos de toros y de novillos empacados al vaciacuteo almacenados a -15 ordmC
por un periacuteodo 16 semanas encontraron que a medida que avanzaba el
tiempo de almacenamiento aumentaba el nuacutemero de BAL lo cual guardoacute
relacioacuten con los niveles de aacutecido laacutectico y aceacutetico encontrados durante el
almacenamiento La produccioacuten de aacutecido butiacuterico fue poco detectada y
estuvo relacionada con el desarrollo particular de cepas de Leuconostoc
Estos compuestos fueron hallados en cantidades importantes posterior a las
4 semanas de almacenamiento
Al realizar la identificacioacuten de las BAL en los diferentes tiempos de
almacenamiento se observaron patrones de sucesioacuten entre cepas de
Carnobacterium Lactobacillus Leuconostoc y Pediococcus Siendo el
Carnobacterium divergen (CD) la especie dominante a la cuarta semana en
todas las muestras
En muestras de carne de toro las poblaciones de CD fueron
desplazadas por una cepa de Leuconostoc mesenteroides (LM4) Para la
semana 12 se observoacute un desplazamiento de la cepa de LM4 por otra cepas
de la misma especie LM1 las cuales fueron seguidamente desplazadas por
otra cepa de Leuconostoc aislada (LM3) Para muestras de novillo el CD
permanecioacute como cepa dominante hasta la semana 8 despueacutes de la cual fue
desplazado por la cepa LM4 para la semana 12 Para la semana 16
encontraron cepas Lactobacillus delbrueckii como microflora dominante
Otras investigaciones han reportados valores proporcionales del
nuacutemero y tipo microorganismos en las carnes res cerdos aves y pescados
Tal es el caso de Gonzaacutelez y col (2002) los cuales analizaron las
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas microbioloacutegicas y sensoriales del salmoacuten
ahumado empacado al vaciacuteo Un total de cincuenta y cuatro empaques al
vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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vaciacuteo provenientes de seis procesadoras de Espantildea fueron analizados
posterior a la tercera semana de almacenamiento
Los resultados indicaron que todas las muestras fueron consideradas
aceptables al anaacutelisis sensorial a la tercera semana de almacenamiento De
196 cepas aisladas las BAL fueron el grupo microbiano dominante (49)
con los geacuteneros Carnobacterium y Lactobacillus este geacutenero fue el maacutes
frecuentemente encontrado El segundo y tercer mayor grupo correspondioacute a
las familia Enterobacteriaceae (199) y Micrococcaceae (158)
respectivamente Patoacutegenos de intereacutes como Salmonella Escherichia coli
Listeria monocytogenes no fueron detectados en ninguna de las muestras la
aparicioacuten del S aureus en un nuacutemero limitado de lotes indicoacute buenas
practicas de fabricacioacuten y almacenamiento apropiados por partes de las
empresas procesadoras
La utilizacioacuten de cepas BAL productoras de bacteriocinas podriacutea ser de
intereacutes en la elaboracioacuten de productos caacuternicos fermentados Estas
proporcionariacutean a los embutidos una herramienta adicional para la
prevencioacuten del crecimiento de patoacutegenos asiacute como tambieacuten realzariacutean la
competitividad de los organismos iniciadores sobre los organismos saproacutefitos
Por lo tanto el estudio de los microorganismos y sus propiedades puede
contribuir en la reduccioacuten de potenciales riesgos higieacutenicos no solo en el
campo claacutesico de los cultivos iniciadores si no tambieacuten en nuevo campos
donde estos sean empleado como cultivos protectores para inhibir el
crecimiento de alimento patoacutegeno u organismos descomponedores (Hammes
y Knauf 1994 Hugas y Monfort 1997)
En el estudio realizado por Vermeiren y col (2004) evaluando las BAL
originarias de productos caacuternicos como cultivos protectores para la
biopreservacioacuten de productos caacuternicos curados cocidos Las muestras
estaban constituidas por 27 tipos de productos caacuternicos cocidos yo
fermentados de donde se aislaron 76 cepas en las cuales fueron evaluadas
sus caracteriacutesticas psicrotroacuteficas homofermentativas y de tolerancia a la sal
Seguidamente se valoroacute la capacidad antibacterial de los aislados contra
Listeria monocytogenes Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc carnosum
y Brochotrix thermosfacta El 38 de las cepas aisladas inhibieron el
crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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crecimiento de todos los microorganismos indicadores
Se seleccionaron 12 cepas por su alta capacidad antibacterial se
evaluaron comparando tasa de crecimiento caracteriacutesticas de acidificacioacuten y
produccioacuten de aacutecido laacutectico a 7ordmC con la finalidad establecer si la presencias
de estos cultivos en el producto no influyen negativamente en las
propiedades sensoriales del jamoacuten Los resultados indicaron que los
jamones inoculados con tres cepas aisladas de L sakei subsp carnosus no
fueron rechazados a la evaluacioacuten sensorial a los 34 diacuteas de empacado al
vaciacuteo y almacenado a 7ordmC por lo que estas cepas podriacutean utilizarse como
cultivos protectores en productos caacuternicos cocidos
Bases Teoacutericas
El empleo de microorganismos en la produccioacuten de alimentos se
encuentra estrechamente ligado al desarrollo de las comunidades humanas
de la cultura y la civilizacioacuten raacutepidamente la experiencia le ensentildeoacute al
hombre a sacarle ventajas a procesos como la fermentacioacuten natural lo que
permitioacute conservar por periodos de tiempo mas o menos largos mucho
alimentos a la vez que modificaba caracteriacutesticas de sabor y texturas por
otras que resultaban agradables (Schiffner 1978)
Para ese momento el antagonismo microbioloacutegico era usado
empiacutericamente en la elaboracioacuten de embutidos fermentados Las BAL
mediante la produccioacuten de aacutecido laacutectico ocasionaban inhibicioacuten de bacterias
patoacutegenas y coagulacioacuten de las proteiacutenas de la carne lo que se traduciacutea en
una disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua facilitando el secado y
estabilidad de estos productos En contraste con otros meacutetodos de
conservacioacuten la fermentacioacuten estimula la multiplicacioacuten y las actividades
metaboacutelicas de los microorganismos en los alimentos siendo importante que
los organismos estimulados pertenezcan a un grupo deseado por su actividad
metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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metaboacutelica y productos finales en el alimento (Potter 1978)
El empleo de microorganismos deseables es considerado de absoluta
necesidad en la creciente industria caacuternica debido a la variedad de
propoacutesitos en los que son utilizados Entre estos destacan la inactivacioacuten de
patoacutegenos extensioacuten de la vida uacutetil por inhibicioacuten de cambios indeseables
causados por microorganismos alterantes Asimismo son utilizados en
modificaciones de materias primas obteniendo como resultados nuevas
propiedades sensoriales o proporcionando beneficios a la salud a traveacutes del
efecto positivo de los probioacuteticos en la flora intestinal (Luumlcke 2000)
1 Bacterias Aacutecido Laacutecticas
Las especies asociadas al grupo de BAL poseen las caracteriacutesticas de
ser bacilos o cocos grandes o pequentildeos Gram positivos los cuales se
dividen en un solo plano inmoacuteviles microaeroacutefilicas generalmente
mesoacutefilas aunque algunas de las especies que la conforman pueden crecer a
temperatura inferiores a 5ordmC otras a temperaturas tan altas como 45ordmC En
la mayoriacutea de los casos son catalasa negativa y ademaacutes requieren sustratos
complejos como vitaminas del grupo B una serie de aminoaacutecidos
preformados y ciertos peacuteptidos como fuentes de nitroacutegeno (Frazier y
Westhoff 1993)
Aunque el grupo de BAL esta definido con poca exactitud y con liacutemites
imprecisos todos los representantes tienen la propiedad de producir aacutecido
laacutectico a partir de las hexosas Como organismos fermentadores carecen de
sistema de transporte de electrones funcionales ligados al hemo o de
citocromos obteniendo su energiacutea por fosforilacioacuten a nivel de sustrato a la
vez que oxidan los carbohidratos (Jay 2002)
El grupo de las BAL tradicionalmente incluye miembros del geacutenero
Lactobacillus Streptococcus Leuconostoc y Pediococcus (Reuter 1985) esta
no es una clasificacioacuten taxonoacutemica oficial siendo en realidad el estado
taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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taxonoacutemico oficial el correspondiente a cada uno de los cuatro geacuteneros
(Kandler y Weis 1986) En la actualidad este grupo esta compuesto por 12
geacuteneros de bacterias entre las que se encuentran Lactobacillus (L)
Carnobacterium Enterococcus Lactococcus Lactosphera Leuconostoc (Le)
Oenococcus Thetragenococcus Vagococcus Streptococcus Weisella y
Pediococcus (Jay 2002)
El grupo de las BAL se encuentra dividido en homofermentativas y
heterofermentativas tomando como base los productos finales del
metabolismo de la glucosa Las bacterias homofermentativas fermentan la
glucosa principalmente hasta aacutecido laacutectico produciendo ademaacutes pequentildeas
cantidades de aacutecido aceacutetico e indicios de otros productos y el grupo de las
heterofermentativas las cuales proporcionan cantidades equimolares de
lactato dioacutexido de carbono y etanol a partir de las hexosas (Frazier y
Westhoff 1993)
En la actualidad se ha llegado sentildealar a todos los representantes de
los geacuteneros Pediococcus Lactococcus Streptococcus y Vagococcus junto
con algunos Lactobacillus como homofermentativos mientras que los
geacuteneros Leuconostoc Oenococcus Carnobacterium Lactosphera Weisella y
algunos Lactobacillus como heterofermentativos siendo ademaacutes reconocida
la capacidad de las bacterias homolaacutecticas de extraer aproximadamente el
doble de energiacutea que los heterolaacutecticos de una cantidad dada de glucosa
(Jay 2002)
Cabe resaltar que el geacutenero Lactobacillus es un grupo muy
heterogeacuteneo y las especies que lo conforman se agrupan como
homofermentativas obligadas heterofermentativas obligadas y
heterofermentativas facultativas Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que
degradan las bacterias y los metabolitos producidos De tal forma que los
homofermentativas obligados degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido
laacutectico las heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las
hexosas a aacutecido laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y
aceacutetico mientras que los Lactobacillus heterofermentativos facultativos
degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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degradan la hexosas a aacutecido laacutectico pero en presencia de una cantidad de
glucosa limitada producen aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2
(Kandler y Weiss 1986)
Por otra parte entre las consideradas habitualmente como cepas BAL
nativas en las carnes y productos caacuternicos se encuentran al Carnobacterium
piscicola Carnobacterium divergens L sakei L curvatus y L plantarum
Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides Le gelidum y Le
Carnosum (Hugas 1998)
Las BAL y entre ellas los Lactobacillus son causantes de interferencia
microbioloacutegica sobre sus competidores (bacterias patoacutegenas y alterantes) a
traveacutes de distintos mecanismos tales como la competencia por nutrientes
oxiacutegeno competencia por los sitos de adhesioacuten ademaacutes de la produccioacuten de
un amplio rango de sustancia inhibidoras principalmente aacutecido laacutectico pero
tambieacuten aacutecido aceacutetico acetoiacutena diacetilo peroacutexido de hidroacutegeno reuterina y
otras bacteriocinas (Okereke y Monteville 1991 Juven y col 1992
Barefoot y Nettles 1993 Hugas 1998)
Algunos de estos metabolitos han demostrado un efecto inhibidor sobre
bacterias Gram-negativas in vitro (Helander y col 1997) pero es difiacutecil su
utilizacioacuten para garantizar la seguridad y la extensioacuten de la vida uacutetil en las
carnes ya que algunas de estas sustancias se producen en cantidades
insuficientes (reuterina) otras interfieren en las propiedades sensoriales del
producto (peroacutexido de hidroacutegeno y diacetilo) y otros como el aacutecido benzoico
promueven el intereacutes por la regulacioacuten del mismo Por otra parte las
bacterias patoacutegenas asociadas al consumo de carnes y de mayor intereacutes en
la actualidad como son la Salmonella Campylobacter Escherichia coli
enterohemorraacutegica son insensibles a las bacteriocinas de las bacterias Gram
positivas (Luumlcke 2000)
El crecimiento de poblaciones de BAL esta acompantildeado por procesos
de fermentacioacuten muy moderados los cuales en su fase inicial no inducen
alteraciones de las caracteriacutesticas sensoriales de las carnes debido a la baja
concentracioacuten de sacaacuteridos y la gran capacidad buffer de la misma (Hugas
1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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1998) Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos
estos tiende a causar deterioro de las carnes y productos caacuternicos en
condiciones anaeroacutebicas cuando se han alcanzado un nuacutemero destacado en
sus poblaciones (Leistner y col 1996)
Sin embargo algunas cepas de BAL sintetizan productos de la
fermentacioacuten mas inocuos que otras cepas tal es el caso de cepas BAL
productoras de aacutecido butiacuterico compuesto que provoca rancidez en las carnes
y caracterizado por producir un olor y sabor seboso (Kochhar 1996) algo
similar ocurre con las cepas que producen etanol sulfuros y aacutecidos orgaacutenicos
de cadenas corta como lactato y acetato los cuales mientras inhiben a otros
microorganismos pueden impartir caracteriacutesticas indeseables cuando se
presentan en altas concentraciones (Leistner y col 1996)
El crecimiento de BAL heterofermentativas en CREV y en productos
carnicos se ha relacionado con abombamiento del empaque y la presencia
de olores y sabores desagradables Lactobacillus sakei y Leuconostoc ssp se
han descritos como productores de limosidad en productos caacuternicos
procesados y se ha observado a cepas Lactobacillus sakei productoras de
sulfuros como causantes del deterioro en las carnes empacadas al vaciacuteo
(Egan y col 1989) Asimismo en investigaciones recientes fueron
identificados como responsables de descomposicioacuten de la carne de cerdo
empacada al vaciacuteo al Lactobacillus curvatus y el Lactobacillus xylosus
(Naacutepravniacutekovaacute y col 2002)
2 Los Cultivos Iniciadores
Los cultivos iniciadores o ldquocultivos startersrdquo son microorganismos que
se presentan en estado puros y mixtos seleccionados de acuerdo con sus
propiedades especiacuteficas los cuales se agregan a determinados alimentos de
origen animal especialmente productos caacuternicos y laacutecteos mejorando su
aspecto aroma y sabor asiacute como tambieacuten contribuyen a la conservacioacuten de
los mismos Estos cultivos ademaacutes de cumplir con determinados aspectos
tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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tecnoloacutegicos y funcionales deben atender una serie de requisitos de calidad
en donde se considera la pureza del cultivo desde el punto de vista
microbioloacutegico y la inocuidad para la salud (Schiffner y col 1978)
El empleo de cultivos iniciadores en la produccioacuten de alimentos tiene su
inicio en la fabricacioacuten de productos laacutecteos como leche agria cuajada
yogurt y diversos quesos Desde entonces se ha extendido su uso a una
diversidad de productos alimenticios La aplicacioacuten de cultivos iniciadores en
la fabricacioacuten de productos caacuternicos se inicioacute 1919 con la recomendacioacuten
sobre el uso de levaduras del geacutenero Debaryomyces en los embutidos
crudos (Coretti 1977)
A pesar de los reiterados intentos iniciales para el empleo de cultivos
en la elaboracioacuten de embutidos crudos solo se alcanzoacute una escala comercial
a principios de los antildeos 60 siendo apenas en las uacuteltimas deacutecadas cuando su
empleo ha aumentado La tardiacutea aceptacioacuten sobre la utilizacioacuten de los
cultivos iniciadores es atribuida a que pueden obtenerse productos caacuternicos
fermentados de excelente calidad sin la necesidad de estas siembras
(Fischer 1994)
Los microorganismos necesarios y deseados para fermentar algunos
alimentos pueden encontrarse en nuacutemeros suficientes en la materia prima
inicial (Frazier y Westhoff 1993) No obstante en los paiacuteses
tecnoloacutegicamente avanzados se asegura el control de la fermentacioacuten
mediante la utilizacioacuten de cultivos iniciadores puros o mixtos obtenidos en
laboratorios comerciales de forma concentrada congelada o deshidratada
estos cultivos se desarrollan a partir de especies bacterianas aacutecido laacutecticas
seleccionadas por la sobresaliente velocidad de produccioacuten del metabolito
deseado y una gran resistencia a antibioacuteticos (Potter 1978)
Puesto que la propiedad mas importante de las BAL es su capacidad
para fermentar los azuacutecares con la resultante raacutepida produccioacuten de aacutecidos y
diminucioacuten de pH estas se han utilizado beneficiosamente en el desarrollo y
elaboracioacuten de productos fermentados es asiacute como la mayoriacutea de los cultivos
iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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iniciadores que se emplean en la elaboracioacuten de embutidos crudos estaacuten
constituidos de cultivos puros o mixtos de BAL (Frazier y Westhoff 1993)
Ejemplo de esto lo constituyen Pediococcus acidilactici y Pediococcus
pentosaceus los cuales son los microorganismos preferidos como cultivos
iniciadores en las embutidos fermentados en Estados Unidos Mientras que
en el sur de Europa los microorganismos mas importantes los constituyen L
sakei L curvatus y L plantarum (Hugas 1998)
La cantidad de un cultivo iniciador a ser agregada en las carnes
depende del crecimiento potencial de los microorganismo en el producto por
ejemplo se observa que en la mayoriacutea de los embutidos fermentados estilo
Europeo se adicionan a un nivel sobre de BAL 106 ufcg mientras que se
requieren la adicioacuten a niveles muy altos de Lactococcus lactis (108 ufcg)
para obtener los efectos deseados en este tipo de embutido (Coffey y col
1998)
Los procesos de obtencioacuten de los cultivos iniciadores son avances
biotecnoloacutegicos costosos y complejos en donde se logran obtener
microorganismos capaces de crecer en un determinado sustrato de
fermentacioacuten presentando una actividad metaboacutelica deseada para lograr los
aspectos sensoriales de su accioacuten en la matriz de carne (Hames y Hertel
1998)
La fabricacioacuten de estos se inicia con la preparacioacuten de una solucioacuten
nutritiva que se filtra y esteriliza por un sistema de ultra alta temperatura
posteriormente ingresa a un fermentador donde se inocula con cultivos de
siembras para luego incubarlo con el objeto de alcanzar una maacutexima
concentracioacuten y actividad bioloacutegica culminada la incubacioacuten se procede al
enfriamiento de forma raacutepida y su almacenamiento en tanques refrigerados
La concentracioacuten de la solucioacuten puede realizarse por procedimientos fiacutesicos
como congelacioacuten- desecacioacuten desecacioacuten-pulverizacioacuten ultra filtracioacuten y
centrifugacioacuten A continuacioacuten los cultivos se estandarizan y distribuyen en
envases aseacutepticos para posteriormente ser almacenados la cual depende del
meacutetodo de concentracioacuten utilizado (Fischer 1994)
3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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3 Empacado al vaciacuteo
La tecnologiacutea del empacado al vaciacuteo implica la extraccioacuten del aire del
empaque sin el reemplazo de este con alguacuten gas convirtieacutendose el oxiacutegeno
residual en dioacutexido de carbono (Gill 1986) El oxiacutegeno residual dentro del
empaque se consume raacutepidamente debido al crecimiento microbiano y a la
respiracioacuten muscular alcanzaacutendose al cabo de unos dos diacuteas niveles de CO2
en el orden de 20-30 (Waites 1988) La extraccioacuten del aire es posible
gracias al uso de equipos de alto vaciacuteo y el mantenimiento de esta
condicioacuten a la utilizacioacuten de materiales de empaque especializados para cada
tipo de producto caracterizados por ser termoencogible y con baja
permeabilidad a los gases
El uso de la tecnologiacutea de empaque al vaciacuteo en la carne fresca es
utilizada por sus numerosas ventajas entre las que destacan la extensioacuten de
la vida uacutetil Esto permite la distribucioacuten de la carne a largas distancias y el
almacenaje por largos periodos en refrigeracioacuten y congelacioacuten asiacute como el
espaciado de los enviacuteos con la consiguiente disminucioacuten en los gastos de
distribucioacuten (Oreskovich y col 1986 Jeremiah y Jones 1989 Garciacutea y col
1995)
Entre estas ventajas la extensioacuten de la vida uacutetil ha sido uno de los
aspectos mas destacados ya que la vida uacutetil de la carne refrigerada en
aerobiosis es muy corta como maacuteximo una semana tiempo apenas
suficiente para el suministro local pudiendo resultar corto si se tiene en
cuenta los tipos de comercios existentes en donde se realiza el transporte a
zonas alejadas de los centros de produccioacuten existiendo incluso
comercializacioacuten a nivel internacional incurriendo en periodos de transporte
demasiado largo donde es difiacutecil asegurar la buena calidad microbioloacutegica del
producto (Ordoacutentildeez y col 1998)
Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Por otra parte el empacado al vaciacuteo se ha utilizado como una teacutecnica
que acompantildea el proceso de maduracioacuten de las carnes por su efecto
ablandador y de mejora en la jugosidad de las mismas El proceso consiste
en almacenar bajo refrigeracioacuten la carne previamente empacada al vaciacuteo por
un periodo entre 7 y 21 diacuteas Esta teacutecnica de maduracioacuten seria de gran
intereacutes para el paiacutes ya que una gran parte de la oferta de carne proviene de
animales manejados en condiciones que se encuentran asociadas con carnes
de terneza menor o altamente variable tales como la produccioacuten de
animales enteros de edad avanzada con alto mestizaje Bos indicus y
alimentados a pastoreo (Huerta y col 1997)
El efecto del CO2 dentro del empaque varia con el tipo de
microorganismo y la fase de crecimiento en que se encuentre con la
temperatura de almacenamiento la concentracioacuten de CO2 y la actividad de
agua del medio observaacutendose un efecto inhibidor selectivo siendo las
bacterias psicrotroacutefas aerobias Gram negativas y los mohos especialmente
sensibles a sus efectos mientras que las BAL enterobacterias Brochothrix
thermosphacta y las levaduras son menos sensibles (Stiles 1991)
Este efecto modificador sobre la microflora de las carnes empacada al
vaciacuteo se debe baacutesicamente a la combinacioacuten de una cantidad limitada de
oxiacutegeno con la consecuente produccioacuten de CO2 y acompantildeado de bajas
temperatura de almacenamiento causando que las BAL sean las uacutenicas
capaces de producir poblaciones destacadas de por lo menos de 107ufccm2
(Gill 1996 y Labadie 1999)
La composicioacuten microbioloacutegica de las carnes fresca empacadas al vaciacuteo
prevalecen casi invariantes las BAL en especial las pertenecientes al geacutenero
Lactobacillus debido a que estos organismos no son afectados por el pH final
de las carnes y son capaces de producir sustancias antimicrobiales como el
aacutecido laacutectico diacetilo acetoiacutena las que permiten generalmente superar a
sus competidores en condiciones de refrigeracioacuten (Gill 1983 Hugas 1998)
A pesar de estos efectos beneficiosos en la conservacioacuten de las carnes
estas sustancias le confiere a las carnes un aroma denominado ldquoolor a carne
empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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empacada al vaciacuteordquo bajo este teacutermino se incluye los aromas a aacutecido a
lecheriacutea a establo a queso que no son claramente desagradables pero los
cuales se disipan raacutepidamente al abrir el envase (Ordoacutentildeez y col 1998)
Los productos de fermentacioacuten de BAL son relativamente inocuos y no
causan el deterioro de las carnes empacadas hasta que estas han alcanzado
un nuacutemero maacuteximo tal que sus productos metaboacutelicos se encuentren en
niveles que puedan ser detectables organoleacutepticamente (Bailey y col 1992)
Sin embargo como se ha mencionado anteriormente algunas cepas de BAL
elaboran productos de fermentacioacuten maacutes deteriorantes que otras cepas
(Leistner y col 1996)
Estudios anteriores indican que el descontrol en el crecimiento de
algunas especies de BAL como ciertas especies Lactobacillus pueden causar
el deterioro de las carnes empacadas al vaciacuteo asociando el crecimiento a
olores desagradables cambios en el color sabor y produccioacuten de gas en el
empaque (Borch y col 1996)
La descomposicioacuten anaeroacutebica de las carnes es un proceso lento en
donde BAL alcanzan un nivel en el orden de 108 a 109 ufcg (Borch y col
1996) Al observar el recuento total de microorganismos viables en la carne
empacada al vaciacuteo se evidencia un aumento continuo desde el inicio del
periodo de conservacioacuten aunque despueacutes la tasa de crecimiento se estabiliza
y no sobrepasa el nivel de 108 ufccm2 Esta estabilizacioacuten en el crecimiento
de BAL en las carnes empacadas al vaciacuteo es lo que hace difiacutecil decidir
cuando estas carnes no son aptas para consumo (Ordoacutentildeez y col 1998)
Sin embargo es posible fomentar el crecimiento preferencial de cepas
de BAL menos alterantes de las carnes lo cual puede ser mejorado
probablemente por el potencial del almacenamiento al vaciacuteo de las carnes
tal promocioacuten del crecimiento selectivo pudiera ser afectada por la
inoculacioacuten de cepas benignas al momento del empacado o por la adiccioacuten
de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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de cepas antagoacutenicas o productoras de bacteriocinas que restringen el
crecimiento de la microflora indeseada (Leisner y col 1995 Zhang y Holley
1999)
4 Fermentaciones Caacuternicas
Los productos caacuternicos fermentados se pueden definir como una
mezcla de carne picada grasa sal agentes del curado azuacutecar especias y
otros aditivos que es introducida en tripas naturales o artificiales y sometida
a un proceso de fermentacioacuten llevado a cabo por microorganismos seguida
de una fase de secado del producto (Leistner 1992)
En la actualidad se conocen diversidad de productos caacuternicos
fermentados con textura y aromas especiacuteficos que dependen de la zona
geograacutefica en que se han producido Muchos de los productos conocidos hoy
en diacutea deben su nombres a sus lugares de procedencia (Rust 1994) estos
productos se podriacutean clasificar basaacutendonos en diferentes aspectos diaacutemetro
externo del producto grado de secado untuosidad ingredientes grado de
picado de los ingredientes especie animal utilizada o condimentos
adicionados (Luumlcke 1985)
En su elaboracioacuten los productos caacuternicos pueden ser fermentados
mediante dos teacutecnicas diferentes a saber
La maduracioacuten raacutepida la cual se produce al utilizar cultivos iniciadores
de bacterias y levaduras Para tal fin se han utilizado como cultivos de
bacterias puros o mixtos entre ellos los micrococos nitratos reductores
lactobacilos homofermentativos pediococos y uacuteltimamente levaduras mohos
y lactobacilos atiacutepicos Maduracioacuten lenta en la cual el producto es mantenido
bajo condiciones especiacuteficas de temperaturas y humedad relativa durante
tiempo determinado que permita el crecimiento de microorganismos
productores de aacutecidos presentes naturalmente sobre la superficie de las
carnes (Hammes y Hertel 1998)
El crecimiento de BAL en productos caacuternicos fermentados
naturalmente es estimulado despueacutes de la adiccioacuten de azuacutecar a la masa
caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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caacuternica transformando el embutido a traveacutes de la produccioacuten de aacutecido laacutectico
por las BAL la subsiguiente disminucioacuten del pH causa desnaturalizacioacuten de
las proteiacutenas de la carne favoreciendo la disminucioacuten de la aw lo cual
termina estabilizando el producto transformado (Hugas 1998)
Especies como Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum son
comuacutenmente utilizadas en los cultivos iniciadores comerciales (Montel
1999) asiacute como tambieacuten son la flora laacutectica dominantes en los procesos de
fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados producidos en el sur
de Europa (Hugas y col 1993 Samelis y col 1994 Coppola y col 1998
Samelis y col 1998)
La microflora tiacutepica existente en los embutidos fermentados de forma
natural es llamada tambieacuten flora espontaacutenea y estaacute constituida por BAL
como L plantarum L brevis L leichmannii L casei asiacute como por
estreptobacterias atiacutepicas Un segundo grupo en importancia son las especies
del geacutenero Micrococcus sin embargo dependiendo del estadio en que se halle
la maduracioacuten de los embutidos pueden evidenciarse otros microorganismos
(Fischer 1994)
Para asegurar el control en un proceso de fermentacioacuten es primordial
que las bacterias productoras de aacutecido laacutectico se impongan en la masa del
embutido y desplacen a las bacterias causante de descomposicioacuten lo que
ocurre cuando se encuentran inicialmente en una cantidad miacutenima de 104
ufcg en la masa del embutido fermentado y bajo condiciones optimas de
produccioacuten (Schiffner y col 1996)
Por otra parte existe la posibilidad de utilizar carne empacado al vaciacuteo
debido a que la cantidad limitada de oxiacutegeno y baja temperatura favorecen
a las BAL siendo las uacutenicas que producen poblaciones destacadas de por lo
menos 107 ufccm2 (Ferrer 2000 Ruiz y Col 2003) Esta carga de BAL es
importante a la hora de iniciar un proceso de fermentacioacuten natural bajo las
condiciones de bajo pH y cierta cantidad de sal en la mezcla caacuternica a
fermentar
CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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CAPIacuteTULO III
MATERIALES Y MEacuteTODOS
Disentildeo de la Investigacioacuten
La realizacioacuten de este estudio se efectuoacute en dos fases en la primera
fase del experimento se determinoacute el efecto del tiempo de empacado al vaciacuteo
de las carnes de res (diacuteas) sobre eacutel nuacutemero y tipo fermentacioacuten de las BAL
pH y su calidad microbioloacutegica En la segunda fase del experimento se
realizoacute la identificacioacuten de las especies de BAL aisladas de CREV a los 14
diacuteas de empacado al vaciacuteo y almacenamiento a 5ordmC
Obtencioacuten y preparacioacuten de la muestra
La carne de res fue obtenida de 10 canales de Novillos clasificadas con
la categoriacutea A de acuerdo con lo establecido en el decreto 1896
provenientes del Matadero el Totumo (MATOCA) ubicado en el municipio
Jesuacutes Enrique Losada estado Zulia Luego se seleccionoacute el corte de res
denominado paleta (COVENIN-792-82) el cual se obtuvo del desposte 48
horas posteriores al sacrificio en el establecimiento Carniceriacutea Unioacuten
Posteriormente la carne fue trasladada en cavas de refrigeracioacuten hasta el
laboratorio de Carnes de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
Universidad del Zulia (FCV-LUZ) donde se precedioacute a la preparacioacuten de la
muestra
La carne de paleta fue molida a traveacutes de un disco de 15 cm de
diaacutemetro utilizando un molino marca La Minerva (Di Mario Chiadini amp cns
Bologna Italia) al cual le fueron previamente esterilizadas las piezas que
entrariacutean en contacto directo con la carne Posteriormente se empaco al
vaciacuteo utilizando un equipo marca KOCH modelo Multivac tipo 040-132-
250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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250215 (Koch Kansas City EUA) de una sola campana Las carnes
empacadas al vaciacuteo fueron almacenadas en caacutemaras de refrigeracioacuten a
temperaturas entre 2 a 5ordmC durante 7 14 y 21 diacuteas momentos en los cuales
se realizaron los anaacutelisis microbioloacutegicos respectivos Para la realizacioacuten de
los anaacutelisis microbioloacutegicos se dispuso de los espacios fiacutesicos y equipos del
Laboratorio de Microbiologiacutea de los Alimentos de la FCV-LUZ
Determinacioacuten del nuacutemero de bacterias aacutecido Laacutecticas y el tipo de
fermentacioacuten
Para estas determinaciones se procedioacute al homogeneizado de la
muestra para lo cual se colocaron en frascos de vidrio esteacuteriles 11 g de la
muestra y 99 mL de caldo MRS (Himedia Mumbai India) MAN RAGOSA and
SHARPE (1960) Posteriormente se mezcloacute en una licuadora a mediana
revolucioacuten por 2 minutos constituyeacutendose la dilucioacuten 1x101 a partir de este
homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la muestra utilizando
caldo MRS hasta alcanzar la dilucioacuten 1x107 a partir de las cuales se
determinoacute el nuacutemero y tipo de fermentacioacuten de las BAL
Para la cuantificacioacuten del nuacutemero de BAL se procedioacute a utilizar dos
meacutetodos el primero consistioacute en sembrar 1 mL de cada dilucioacuten en
profundidad y por duplicado en placas de petri utilizando como medio de
cultivo agar MRS (Himedia Mumbai India) El segundo meacutetodo consistioacute en
inocular 1 mL de las diluciones antes mencionada en placas de peliacutecula seca
rehidratables para recuento de aerobios mesoacutefilos (PetrifilmTM3M St Paul
USA) Posteriormente ambas se incubaron a 37 ordmC por 48 horas en una
campana de Gas-Pack con vela encendida para proveer las condiciones de
microaerofiacutelicas (5 a 10 de CO2) transcurrido este tiempo se contaron
como BAL las placas que presentaban entre 25 y 250 colonias
seguidamente se confirmoacute realizando un Gram pruebas de catalasa y
oxidasa las cuales deberiacutean ser Gram positivas catalasa negativa y oxidasa
negativa (Reuter 1985)
Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Para la determinacioacuten raacutepida del tipo de fermentacioacuten de las bacterias
acido laacutecticas se observaron colonias en las placas de peliacuteculas secas
rehidratables (PETRIFILMTM3M) antes mencionadas y se procedioacute al contaje
de colonias cafeacute rojizas como BAL homofermentativas y heterofermentativas
diferenciaacutendose estas uacuteltimas por la presencia de burbujas de gas asociadas
a las colonias
Determinacioacuten del nuacutemero de aerobios mesoacutefilos coliformes
Escherichia coli en carnes de res empacada al vaciacuteo
Para la determinacioacuten del recuento total de aerobios mesoacutefilos (RTA)
coliformes totales (CT) Escherichia coli (Ecoli) se procedioacute al
homogeneizado de la muestra para lo cual se tomaron 11 g de la muestra y
99 mL de agua peptonada al 01 (Difco Sparks USA ) estos se colocaron
en frascos de vidrio esteacuteriles y posteriormente se mezclaron en una licuadora
a mediana revolucioacuten por 2 minutos constituyendo esta la dilucioacuten 1x101 a
partir de este homogenizado se prepararon diluciones seriadas de la
muestra utilizando como diluyente agua peptonada a igual concentracioacuten
La determinacioacuten se realizoacute utilizando el meacutetodo de recuento en placas
de peliacuteculas secas rehidratables (PetrifilmTM 3M St Paul USA) para aerobios
mesoacutefilos (COVENIN 3338) coliformes totales y E coli (COVENIN 3276) en
la cual se vierte 1 mL de las diluciones de la muestra en el centro del circulo
y luego se distribuye el inoculo usando una lamina plaacutestica difusora
seguidamente fue incubado a 35degC por 48 horas en posicioacuten horizontal
finalizada la incubacioacuten se contaron las placas que presentaban entre 15 y
150 colonias todas las muestra fueron realizadas por duplicado
Determinacioacuten del pH
La determinacioacuten del pH fue realizada a los 0 7 14 21 diacuteas de
almacenamiento con un potencioacutemetro marca ORION modelo 410ordf (Orion
research inc USA) el cual posee un electrodo de la misma marca modelo HI
1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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1131 el cual se calibroacute con soluciones buffer suministrada por la misma
marca comercial de pH 70 y 40 a temperatura de 25 degC
Identificacioacuten de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Aislamiento de las especies de bacterias aacutecido laacutecticas
Se procedioacute al aislamiento de cepas en las 10 muestras de carne
picada empacada al vaciacuteo y almacenada a 5degC durante 14 diacuteas El tiempo de
empacado fue seleccionado en base al estudio previo realizado por Ruiz-
Ramiacuterez y col (2003) quienes trabajaron con carnes de res molida
empacada al vaciacuteo encontrando un periodo de tiempo de 14 diacuteas como el
tiempo oacuteptimo de empacado al vaciacuteo En este tiempo la carne presentoacute las
condiciones optimas para ser utilizadas en la elaboracioacuten de un producto
caacuternico fermentado sin la adicioacuten de cultivos iniciadores debido a que el
nuacutemero de Lactobacillus en este tiempo 618 Log ufcg no se diferencioacute
significativamente del obtenido a los 21 diacuteas 650 Log ufcg
En este punto se eligieron al azar el 10 de las colonias
morfoloacutegicamente diferentes las cuales fueron repicadas en tubos con caldo
MRS para la obtencioacuten de cultivos puros luego se procedioacute a evaluar la
morfologiacutea celular y su correspondencia al grupo de bacterias Gram
positivas catalasa y oxidasa negativa (Reuter 1985)
Verificada la pureza del cultivo se repicaron a medio soacutelido utilizando
agar MRS y se incubaron a 37ordmC por 48 horas en una caacutemara de Gas-Pack
con vela encendida para la subsiguiente tipificacioacuten de las bacterias acido
laacutecticas a traveacutes del sistema de identificacioacuten API 50CHL (BioMeacuterieuxreg Marcy
I`Etale Francia) el cual es un sistema estandarizado de ensayos
bioquiacutemicos para el estudio del metabolismos de 49 carbohidratos por este
grupo microbiano
Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Preparacioacuten del Inoacuteculo
Se procedioacute a realizar una suspensioacuten concentradas del cultivo puro
(suspensioacuten madre) utilizando para ello una ampolla de 2 mL de medio de
suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 (API suspensioacuten meacutedium
BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) en donde se suspendieron todas las
colonias que crecieron en las placas de agar MRS Posteriormente en una
ampolla de 5 mL de suspensioacuten comercial de cloruro de sodio 085 se
realizoacute una suspensioacuten de turbidez igual al patroacuten 2 de Mcfarland a partir de
la suspensioacuten concentrada contando la cantidad de gotas utilizadas (n)
hasta lograr dicha concentracioacuten A continuacioacuten se procedioacute a colocar el
doble de las gotas contadas (2n) en la ampolla de API 50 CHL meacutedium
(BioMeacuterieuxreg Marcy I`Etale Francia) el cual fue utilizado de inmediato para
inocular la galeriacutea API 50 CH
Preparacioacuten e inoculacioacuten de la Galeriacutea API 50 CH
Se repartieron 10 mL de agua destilada y deshionizada en los alveacuteolos
del fondo de la caacutemara con la finalidad de crear una atmoacutesfera de humedad
luego se repartieron con una pipeta esteacuteril 40 microL de la suspensioacuten en API 50
CHL meacutedium sobre los tubos de la galeriacutea API 50 CH y se recubrieron los
ensayos con aceite de parafina Los ensayos fueron incubados a 35 2 ordmC
en aerobiosis por 48 horas
Anaacutelisis estadiacutesticos
Disentildeo del experimento
Se realizoacute un disentildeo experimental totalmente aleatorizado utilizando
como factor fijo el tiempo )(t en cuatro niveles ot = tiempo inicial 1t = siete
diacuteas 2t = 14 diacuteas y 3t = 21 diacuteas A cada uno de estos tiempos se le
asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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asignaran al azar 10 paquetes similares de carne de res picada envasada al
vaciacuteo
Modelo matemaacutetico
Una vez realizadas las determinaciones los datos fueron tabulados
para el procesamiento electroacutenico haciendo uso del paquete estadiacutestico
Statistical Analysis System versioacuten 801 (SAS 1999) El modelo matemaacutetico
fue el correspondiente a un disentildeo completamente al azar Las
comparaciones entre las medias de los tratamientos se efectuaron mediante
las pruebas de Tukey
Para la determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de
res la data experimental 40 observaciones en total se ajustoacute a una gran
variedad de modelos de regresioacuten no lineal pertenecientes a la familia de
modelos exponenciales potenciales y de crecimiento incluidos en el software
Curve Expert versioacuten 137 De este grupo de modelos fue seleccionado el
mejor en base al error estaacutendar ( x ) y al coeficiente de determinacioacuten ( 2r )
De acuerdo con esto fue escogido el modelo de Harris
(1)
Con 4760x y 94102 r
Donde y es el log ufcg de BAL
x = es el tiempo
a = 030892131
b = - 013469718
c = 0104527090
cbxay
1
Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Despejando de la expresioacuten (1) el tiempo x en funcioacuten de y se tiene
Considerando que 107 es el nuacutemero miacutenimo de BAL para la
fermentacioacuten de carnes se tomoacute 7 como log ufcg sustituyendo los valores
en (2) resultoacute un valor 74097
(3)
Este resultado indicoacute que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de
las carnes de res que permite lograr el crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas
suficientes para iniciar un proceso adecuado de fermentacioacuten caacuternica es
aproximadamente de 7 diacuteas 10 horas con 19 minutos
c
by
ayx
)(
)(1
cx)134697180(7
)308921310(71
(2)
CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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CAPIacuteTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Cuantificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas y niveles de pH
Las medias correspondientes al nuacutemero de BAL y valores de pH en la
carne de res durante su almacenamiento en refrigeracioacuten se presentan en la
Tabla 1 En el estudio se observoacute que los recuentos de BAL aumentan a
medida que se prolonga el tiempo de empacado al vaciacuteo En un estudio
previo Ordoacutentildeez y col (1998) reportaron que el recuento total de
microorganismos viables en la carne empacada al vaciacuteo aumentoacute desde el
inicio del periacuteodo de conservacioacuten estabilizaacutendose la tasa de crecimiento
despueacutes de 20 diacuteas No obstante los valores obtenidos en el presente
estudio el nuacutemero de BAL a los 14 diacuteas no se diferencioacute estadiacutesticamente
(Pgt005) de los obtenidos a los 21 diacuteas Resultados similares han sido
publicados a nivel regional por Ferrer (2000) y Ruiz-Ramiacuterez y col (2003)
trabajando con carne de res empacada al vaciacuteo y almacenada a 5ordmC
En la primera semana de almacenamiento de la CREV las BAL
aumentaron de 393 a 695 Log ufcg siendo estos valores diferentes
estadiacutesticamente (Plt005) el incremento en los recuentos continuaron en la
segunda semana pero en menor grado ubicaacutendose en 760 Log ufcg valor
diferente significativamente del obtenido durante la primera semana pero no
del valor correspondiente a la tercera semana de almacenamiento el cual
fue de 808 Log ufcg
En cuanto al pH se observo que este disminuyoacute gradualmente desde el
inicio del empacado al vaciacuteo (pHinicial=566) hasta el diacutea 14 ubicaacutendose en
526 para luego mantenerse estable hasta el final de la prueba Esto debido
probablemente al mayor crecimiento de las BAL en CREV lo cual se
acompantildea de la formacioacuten de aacutecidos orgaacutenicos principalmente aacutecido laacutectico
TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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TABLA 1
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS Y pH EN CARNES
EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Diacuteas BAL (Log ufcg) pH
0 393 a 566 a
7 695 b 537 b
14 760 c 526 c
21 808 c 524 c
BAL Bacterias aacutecido laacutecticas a b c Medias marcadas con letras diferentes en una misma columna difieren estadiacutesticamente (Plt005)
Figura 1 Efecto del tiempo de empacado en el crecimiento de
bacterias aacutecido laacutecticas y pH de las carnes
lo cual causa la consecuente caiacuteda del pH (Rust 1994 Molly y col 1996)
Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Resultados similares fueron reportados en investigaciones realizadas
anteriormente observaacutendose una disminucioacuten gradual del pH acompantildeada
de un incremento en el nuacutemero de BAL durante el almacenamiento a 5ordmC de
carne empacada al vaciacuteo (Minor-Peacuterez y col 2002 Naacutepravniacutekovaacute y col
2002 Jones 2004 Fadda y col 2007) Estos resultados se ilustran en la
Figura 1
La estabilidad del pH posterior a los 14 diacuteas de empacado al vaciacuteo y
almacenamiento a 5ordmC puede deberse probablemente al descenso de pH a
niveles inferiores a 55 en donde se ha sentildealado la inhibicioacuten de las enzimas
glucoliacuteticas especialmente la fosfofructoquinasa cesando de esta forma la
glucoacutelisis (Herbert 1982)
Los resultados obtenidos muestran la posibilidad de utilizar el
empacado de las carnes al vaciacuteo para la elaboracioacuten de productos caacuternicos
sin la adiccioacuten de cultivos iniciadores Las condiciones presentes en el
almacenamiento a 5ordmC de CREV favorecieron el crecimiento BAL y la caiacuteda
del pH lo cual juegan un rol primordial en la textura y el desarrollo del sabor
(Ahmet y col 1998) resultando ademaacutes en un incremento de la vida uacutetil del
producto transformado (Dainty y Mackey 1992 Hugas 1998)
Tipo de Fermentacioacuten
En la Tabla 2 se muestran los valores promedios de BAL obtenidos por
los dos meacutetodos de cuantificacioacuten utilizados conteo directo en placas de agar
MRS y conteo en placas de peliacuteculas secas rehidratable PETRIFILMTM3M Los
resultados indican que los diferentes meacutetodos no muestran medias
significativamente diferentes Por lo tanto se puede inferir que ambos
meacutetodos son bastante sensibles en la determinacioacuten de BAL
TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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TABLA 2
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS OBTENIDAS POR DIFERENTES MEacuteTODOS DE DETERMINACIOacuteN SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo(diacuteas) n Meacutetodo Log ufcg s Valor P
0 10 MRS 324 062
085 10 PSR 329 040
7 10 MRS 695 013
058 10 PSR 681 016
14 10 MRS 760 016
021 10 PSR 723 012
21 10 MRS 809 011
017 10 PSR 786 008
MRS = Conteo en placas de agar MRS
PSR = Conteo en peliacutecula seca rehidratable
TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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TABLA 3
NUacuteMERO DE BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS HOMOFERMENTATIVAS Y HETEROFERMENTATIVAS EN CARNES EMPACADAS AL VACIacuteO SEGUacuteN EL
TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Tiempo
diacuteas
n
BAL
Heterofermentativas
(ufcg)
BAL
Homofermentativas
(ufcg)
TOTAL
BAL
(ufcg)
0 10 50 x102 227 17 x102 773 22 x 102
7 10 31 x106 292 75x106 708 106 x106
14 10 10 x107 294 24x107 706 34 x 107
21 10 25 x107 238 80x107 762 105 x107
BAL= bacterias aacutecido laacutecticas
No se encontraron investigaciones en las que utilizaran las placas de
peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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peliacutecula seca rehidratable PETRIFILMTM3M como teacutecnica de cuantificacioacuten de
BAL No obstante el meacutetodo de recuento en peliacuteculas seca rehidratable
PETRIFILMTM3M permitioacute la identificacioacuten y recuento de colonias de BAL
homofermentativas y heterofermentativas de acuerdo a la metodologiacutea
establecida por 3M productos microbioloacutegicos (1994) Los valores
correspondientes se aprecian en la Tabla 3 Los resultados sentildealan que
alrededor de un 70 de las bacterias aacutecido laacutecticas correspondieron al grupo
homofermentativo y un 30 a las heterofermentativas en todos los tiempos
de almacenamiento
Esto pudiera representar un riesgo de defectos en un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de CREV sin la adicioacuten de un cultivo iniciador
El riesgo estariacutea dado por la proporcioacuten de BAL heterofermentativas
obligadas oacute facultativas en la CREV (Kandler y Weiss 1986) Tal como se ha
reportado el crecimiento de BAL heterofermentativa obligadas causan olores
desagradables y agujeros a causa de la produccioacuten de CO2 (Hugas 1998)
Por otro lado las bacterias heterofermentativas facultativas se han utilizado
ampliamente en los cultivos iniciadores comerciales oacute han sido aisladas de
productos caacuternicos fermentados elaborados a traveacutes de maduracioacuten natural
sin observarse la presencia de defectos en estos (Hammes y Knauf 1994
Hugas 1998 Hammes y Hertel 1998)
Determinacioacuten del tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res
En la Figura 2 se ilustran el desarrollo en el tiempo de las BAL en carne
de res picada empacada al vaciacuteo Las observaciones diez en total para cada
tiempo de almacenamiento a 5ordmC se ajustaron mejor al modelo de Harris
como fue mencionado con anterioridad El uso de este modelo permitioacute
predecir el tiempo necesario para alcanzar el nuacutemero miacutenimo de BAL
necesarias para la fermentacioacuten de las carnes el cual se sentildeala en la Figura
como punto (P)
81
Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Figura 2 Crecimiento de bacterias aacutecido laacutecticas en carnes empacadas al
vaciacuteo durante 21 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC El Punto (P) indica
tiempo requerido para obtener el numero de BAL para iniciar una fermentacioacuten caacuternica
x =695
x =760
x =760
x =808
x =393
De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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De acuerdo a los resultados y tomando como carga adecuada para
iniciar un proceso de fermentacioacuten un valor de BAL 7 Log ufcg en la materia
prima el modelo establecioacute como tiempo optimo en base al nuacutemero de BAL
74097 indicando que el tiempo miacutenimo de empacado al vaciacuteo de carnes de
res picada y almacenada a 5ordmC es aproximadamente de 7 diacuteas y 10 horas
con 19 minutos
En investigaciones previas Ruiz-Ramiacuterez y col (2003) establecieron
como tiempo optimo de empacado al vaciacuteo de carne de res para tal fin 14
diacuteas basaacutendose exclusivamente en los recuentos de Lactobacillus obtenidos
Los resultados alcanzados son alentadores desde el punto de vista
econoacutemico debido a que se necesitariacutea menor tiempo de almacenamiento en
refrigeracioacuten de las carnes de res para su posterior utilizacioacuten en la
elaboracioacuten de un producto caacuternico fermentado a partir de cepas tiacutepicas de la
regioacuten
Calidad microbioloacutegica
En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en el anaacutelisis
microbioloacutegico de las carnes de res empacadas al vaciacuteo durante su
almacenamiento en refrigeracioacuten El recuento total de aerobios mesoacutefilos
obtenido para el inicio del ensayo 393 Log ufcg fue inferior al recomendado
por COVENIN 2301-85 para las carnes de res molida
Los resultados indican que el recuento total de aerobios mesoacutefilos en
las carne de res empacada al vaciacuteo (393 679 740 y 786 Log ufcg)
aumentoacute con el tiempo de almacenamiento 0 7 14 y 21 diacuteas
respectivamente los cuales se diferenciaron estadiacutesticamente (Plt005)
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las investigaciones
realizadas por Gill y Badoni (2002) Jones (2004) y Fadda y col (2007) en
donde el RTA se incrementoacute gradualmente durante el almacenamiento a 5ordmC
de carnes empacadas al vaciacuteo
TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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TABLA 4 NUacuteMERO AEROBIOS MESOacuteFILOS COLIFORMES TOTALES Y
Escherichia coli SEGUacuteN EL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO
Pruebas Tiempo de almacenamiento (diacuteas)
0 7 14 21
Replicas 10 10 10 10
RTA 393a 679b 740c 786d
CT 254a 418b 486c 500c
EC lt1 lt1 lt1 lt1
Valores expresado en Log ufcg
a b c Medias con letras distintas en la misma fila difieren significativamente
(Plt005)
RTA recuento total de aerobios
CT coliformes totales
EC Escherichia coli
Figura 3 Efecto del empacado al vaciacuteo sobre las bacterias aacutecido
laacutecticas recuento total de aerobios mesoacutefilos coliformes totales
Escherichia coli
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Diacuteas
Lo
g (
ufc
g)
Coliformes
RTA
BAL
Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Esto podriacutea deberse entre otras causas a la permeabilidad del material
de empaque al oxiacutegeno oacute a una carga inicial alta de este grupo microbiano
(Ramsbottom 1976) Se ha sentildealado que conforme aumenta la
permeabilidad del oxiacutegeno aumenta proporcionalmente el crecimiento de
especies Gram negativas (Luumlcke 2000) sin embargo los valores RTA
obtenidos en el presente ensayo para en CREV por 21 son similares a los
obtenidos en 6 diacuteas de almacenamiento a 5ordmC en carnes de res sin empacar
al vaciacuteo lo cual demuestra el efecto preservador del empacado al vaciacuteo sobre
la vida uacutetil de la carne (Ferrer 2000)
Por otra parte se observoacute que los recuentos de coliformes totales
(254 418 486 500 Log ufcg) aumentaron gradualmente y se
diferenciaron significativamente (Plt005) entre los diferentes tiempo de
almacenamiento Despueacutes del diacutea 14 los recuentos se mantuvieron estables
esto puede deberse a valores de pH maacutes bajos observados a partir de este
diacutea de almacenamiento a 5ordmC de las CREV Varios son los mecanismos de
inhibicioacuten microbiana que pueden estar presentes sin embargo uno de los
principales es la reduccioacuten del pH por la produccioacuten de aacutecidos organicos
principalmente aacutecido laacutectico (Guerrero y Taylor 1994)
Las CREV no presentaron colonias de Escherichia coli a ninguacuten tiempo
de almacenamiento lo que indica una excelente calidad higieacutenica de la
carne Estos resultados son similares a los mostrados por Gill y Badoni
(2002) y Minor-Peacuterez y col (2002) En la Figura 3 se representan
graacuteficamente estos valores en conjunto con los valores obtenidos para BAL
Las BAL son el grupo microbiano que predominoacute en las CREV despueacutes
de transcurrido unos diacuteas de almacenamiento Estos resultados demuestran
el efecto modificador del empacado al vaciacuteo sobre la microflora de la carne
coincidiendo con los resultados reportados con anterioridad por Gill y Newton
(1978) Ordoacutentildeez y col (1998) y Labadie (1999) quienes encontraron que
las BAL son las que producen poblaciones destacadas cuando las carnes son
empacadas al vaciacuteo
Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Caracterizacioacuten e Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
Caracterizacioacuten morfoloacutegica
Del total de diez empaques al vaciacuteo de carne de res almacenados
durante 14 diacuteas se obtuvieron un total de 125 cepas de BAL confirmadas
estas presentaron una morfologiacutea celular variada la cual fue desde cocos
bacilos rectos y alargados Bacilos curvos y cortos hasta bacilos cortos y
gruesos La formacioacuten en cadenas y en pares fue la maacutes comuacuten
Identificacioacuten de bacterias aacutecido laacutecticas
En la Tabla 5 se presenta la distribucioacuten porcentual de las BAL
identificadas en carne de res empacada al vaciacuteo Se observoacute que despueacutes de
2 semanas de almacenamiento a 5ordmC la poblacioacuten estuvo compuesta
predominantemente por especies heterofermentativas facultativas del genero
Lactobacillus 760 seguidas por BAL homofermentativas obligadas en 12
y heterofermentativas obligadas 80
Esta clasificacioacuten obedece al sustrato que degradan las bacterias y los
metabolitos producidos De forma tal que las BAL homofermentativas
obligadas degradan las hexosas exclusivamente a aacutecido laacutectico las BAL
heterofermentativas obligadas son capaces de degradar las hexosas a aacutecido
laacutectico aceacutetico etanol CO2 y las pentosas a aacutecido laacutectico y aceacutetico mientras
que las BAL heterofermentativas facultativas degradan la hexosas a aacutecido
laacutectico pero en presencia de una cantidad de glucosa limitada producen
aacutecido aceacutetico etanol pero sin producir CO2 (Kandler y Weiss 1986)
Las especies dominantes fueron Lactobacillus curvatus (288) y
Lactobacillus fermentum (256) siendo el primero de los mencionados un
microorganismo frecuentemente reportado como flora microbiana
psicrotroacutefila en carnes empacadas al vaciacuteo (Hugas 1998) y en productos
caacuternicos
TABLA 5
DISTRIBUCIOacuteN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES BACTERIAS AacuteCIDO LAacuteCTICAS AISLADAS DE CARNES DE RES
EMPACADA AL VACIacuteO
Especies Nuacutemero de
aislados Porcentaje
Lactobacillus curvatus a 36 288
Lactobacillus fermentum a 32 256
Lactobacillus plantarum a 15 120
Lactobacillus paracasei subsp paracasei a 12 96
Leuconostoc mesenteriodes subsp
mesenteroidesdextranicum b 10 80
Lactobacillus acidophillus 1 c 8 64
Lactobacillus salivarius c 7 56
Cepas con identificacioacuten incierta 5 40
Identificacioacuten utilizando el sistema de identificacioacuten API 50CHL a Heterofermentativos facultativos
b Heterofermentativos obligados c Homofermentativos obligados
fermentados naturalmente (Hammes y Knauf 1994 Hammes y Hertel
1998)
Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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TABLA 5
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Es importante destacar que el Lactobacillus sakei no estaacute incluido en la
base de datos del sistema de identificacioacuten API50CH y se ha reportado que
cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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cepas puras de Lactobacillus sakei el cual es un microorganismo
heterofermentativo facultativo fueron identificadas por dicho sistema como
Lactobacillus fermentum (Vermeiren y col 2004) Asimismo investigaciones
anteriores sentildealaron que cepas identificadas por el sistema API50CH como
Lactobacillus fermentum fueron identificadas a traveacutes de electroforesis en
gel como miembros del grupos Lactobacillus sakeicurvatus (Devliehere y
col 1998)
Esto explica como un alto porcentaje de las cepas aisladas (256)
fueron identificadas como Lactobacillus fermentum el cual no se ha descrito
como microorganismo caracteriacutestico en las carnes empacadas al vaciacuteo yo
productos caacuternicos lo que hace pensar que corresponde a Lactobacillus
sake
Otras de las cepas de BAL aisladas fueron identificadas como
Lactobacillus plantarum (12) y Lactobacillus paracasei subsp paracasei
(96) estos microorganismos son usualmente aislados en carnes y
productos caacuternicos aunque generalmente representan una pequentildea
proporcioacuten del total de la flora laacutectica aislada en los productos caacuternicos
(Vermeiren y col 2004)
Se ha observado la aplicacioacuten de cepas de Lactobacillus paracasei
subsp paracasei en la elaboracioacuten de productos fermentados para lograr
reducir el tiempo de secado en estos embutido Esto es debido a la
produccioacuten de proteinasas por dicho microorganismo observando que la
actividad proteoliacutetica no afectoacute la flora microbial de los cultivos iniciadores oacute
de la flora nativa de las carnes (Hagen y col 1996) Especies como
Lactobacillus acidophillus (64) y Lactobacillus salivarius (56) fueron las
cepas aisladas en menor cantidad en las carnes de res empacadas al vaciacuteo
Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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Por otra parte del total de los aislados el 8 fue identificado como
Leuconostoc mesenteriodes subsp mesenteroides dextranicum Similares
resultados se han conseguido en otras investigaciones donde de un total de
70 aislamientos provenientes de carnes de cerdo empacada al vaciacuteo 18
fueron identificadas como de Leuconostoc ssp y 52 como Lactobacillus sakei
(Yost y Nattress 2000) El Leuconostoc mesenteriodes es descrito como un
coco Gram positivo microaerofiacutelico catalasa y oxidasa negativa y
heterofermentativo obligado (Ellen Garvie 1986) El cual seguacuten Egan y col
(1983) esta asociado a la descomposicioacuten de productos caacuternicos
principalmente por la formacioacuten de limosidad superficial
Otro microorganismo que ha sido reportado como causante de
descomposicioacuten es el Lactobacillus sakei el cual es productor de sulfuros y se
relaciona como la principal causa de descomposicioacuten de las CREV en
refrigeracioacuten (Egan y col 1989) Esto posiblemente es debido a las
caracteriacutesticas metaboacutelicas de este microorganismo lo cual le permite la
utilizacioacuten de la arginina como sustrato principal para la produccioacuten de ATP
cuando las concentraciones de glucosa estaacuten en el orden 005 (PP)
condiciones encontradas en la carne fresca (Labadie 1999) La degradacioacuten
de este u otros aminoaacutecidos da origen a la produccioacuten de compuestos
indeseables como sulfuro y aminas bioacutegenas los cuales pueden causar olores
y sabores desagradables (Leistner y col 1996)
No obstante Montel (1999) reporta al Lactobacillus sakei como la
especie comuacutenmente utilizada en los cultivos iniciadores comerciales
mientras Hugas y col (1993) Samelis y col (1994 1988) Coppola y col
(1998) y Kostinek y col (2007) los reportan como flora natural en los
procesos de fermentacioacuten natural de varios embutidos fermentados
producidos sin defectos en el sur de Europa
Las dominancia de BAL en las fermentaciones caacuternicas se ve
favorecida por diferentes condiciones conjuntamente con la anaerobiosis se
encuentran la adicioacuten de azuacutecar sales de curado y un pH inicial bajo en la
mezcla (Lucke 2000) Estas son condiciones muy diferentes a las halladas
cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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cuando especies BAL son reportadas en carnes y productos caacuternicos
alterados
En el presente estudio Lactobacillus sakei L curvatus L plantarum
L paracasei ssp paracasei representaron el 76 de la poblacioacuten total de
BAL aisladas en las CREV almacenada por 14 diacuteas Similares resultados se
han evidenciado en investigaciones sobre la diversidad de BAL en los
embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural Torriani y col
(1990) Hugas y col (1993) Parente y col (2001) y Kostinek y col (2007)
demostraron que embutidos fermentados a traveacutes de maduracioacuten natural la
flora estuvo dominada principalmente por cepas de BAL heterofermentivas
facultativas como es el caso de L sakei y L plantarum
CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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CONCLUSIONES
El tiempo de empacado al vaciacuteo de la carne de res en el cual se logra
tener carga de bacterias aacutecido laacutecticas adecuadas para iniciar un proceso de
fermentacioacuten es aproximadamente de 7 diacuteas con 10 horas
Las poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas en las carnes de res
empacadas al vaciacuteo durante 14 diacuteas estuvo dominada por bacterias
heterofermentativas facultativas principalmente Lactobacillus curvatus
Lactobacillus sakei y Lactobacillus plantarum Por lo cual resulta viable
seguro y asequible el uso de CREV en la elaboracioacuten de un producto caacuternico
fermentado por maduracioacuten natural
El meacutetodo PETRIFILMTM3M para determinar BAL no se diferencioacute del
meacutetodo tradicional utilizado para cuantificar este tipo de poblaciones
microbianas
La cuantificacioacuten de BAL por PETRIFILMTM3M no es uacutetil y confiable para
diferenciar poblaciones de bacterias aacutecido laacutecticas homofermentativas de
heterofermentativas
La calidad microbioloacutegica de la carne de res empacada al vaciacuteo cumplioacute
con los liacutemites normales aceptados solo para el diacutea 7 de almacenamiento
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
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RECOMENDACIONES
Realizar pruebas de evaluacioacuten sensorial de un producto caacuternico
fermentado elaborado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Determinar la cantidad y tipos de productos metaboacutelicos generados en
un producto caacuternico fermentado a partir de carnes de res empacada al vaciacuteo
almacenada a 5ordmC
Debido a que las bacterias aacutecido laacutecticas y especialmente el
Lactobacillus sakei son un grupo heterogeacuteneo seria de gran intereacutes
tecnoloacutegico determinar de forma mas precisa con la ayuda de reaccioacuten en
cadena de la Polimerasa las cepas de BAL autoacutectonas aisladas mas
favorables para el desarrollo de productos caacuternicos fermentados
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