EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE...

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EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE METABOLITOS EN EL

PROCESO DE ENSILAJE A PARTIR DE BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR

(Saccharum officinarum)

ANDREA CAROLINA MONROY SUÁREZ

FACULTAD DE INGENIERÍA

POSGRADO EN INGENIERÍA CON ÉNFASIS EN QUÍMICA

Medellín

2016

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Trabajo de investigación para optar al título de Magíster en Ingeniería

Asesor

Dr. Carlos A. Peláez J.

Co-asesora

Dra. Catalina Arroyave Q.



Medellín

2016

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Medellín

2016

2016

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“Prohibida la reproducción sin la autorización expresa del autor(a)”

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

Medellín

2016

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“Tu nivel más alto de ignorancia es cuando

rechazas algo de lo cual no sabes nada”

Wayne Dyer

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AGRADECIMIENTOS

A Dios por permitirme alcanzar este gran logro en mi vida y darme la fuerza para no

renunciar.

A la Universidad de Antioquia por el apoyo financiero entregado durante parte de la

investigación mediante la figura de ESTUDIANTE INSTRUCTOR y por facilitar las

instalaciones, equipos y materiales necesarios para el correcto desarrollo del

proyecto.

Al posgrado en Ingeniería por la oportunidad de realizar mis estudios de maestría.

Al grupo Interdisciplinario de Estudios Moleculares por el interés demostrado y por

el apoyo brindado durante el desarrollo del proyecto.

A mi asesor Dr.Carlos Alberto Peláez Jaramillopor dirigir cada una de las etapas

del proyecto, por su valiosa colaboración y asesoría.

A mi co-asesora Dra. Catalina Arroyave Quiceno por su apoyo incondicional, por su

valiosa asesoría, tiempo dedicado a la realización de este trabajo de investigación y

por siempre darme una oportunidad, mi mas sincero agradecimiento.

A mis amigos y amigas por los momentos y conocimientos compartidos.

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CONTENIDO

1. RESUMEN .............................................................................................................. 13

2. MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 14

2.1. BIOMASA LIGNOCELULÓSICA ................................................................. 14

2.1.1. Composición de biomasa lignocelulósica .................................................. 15

2.2. BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR ............................................................... 17

2.3. CONSERVACIÓN DE BIOMASA ................................................................. 18

2.3.1.Ensilaje........................................................................................................ 18

2.4. MICROBIOLOGÍA DEL PROCESO DE ENSILAJE .................................... 28

2.5. ADITIVOS ....................................................................................................... 30

2.5.1. Estimulantes de la fermentación ................................................................ 31

2.5.2. Inhibidores de la fermentación .................................................................. 33

2.5.3. Inhibidores de deterioro aeróbico .............................................................. 33

2.5.4. Nutrientes ................................................................................................... 33

2.5.5. Absorbentes ............................................................................................... 34

2.6. GALLINAZA ................................................................................................... 34

2.7. PRODUCTOS FINALES DEL METABOLISMO ENERGÉTICO DEL

PROCESO DE ENSILAJE ..................................................................................... 35

2.7.1. Ácido láctico .............................................................................................. 35

2.7.2. Ácido acético ............................................................................................. 35

2.7.3. Ácido butírico ............................................................................................ 36

2.7.4. Ácido propiónico ....................................................................................... 36

3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 37

3.1 Objetivo General ............................................................................................... 37

3.2 Objetivos específicos ......................................................................................... 37

4. METODOLOGIA ................................................................................................... 38

4.1 Revisión bibliográfica y análisis de la información existente ........................... 38

4.2 Materias primas y ensilaje ................................................................................. 38

4.3 Análisis fisicoquímicos de bagazo de caña de azúcar ....................................... 38

8

4.4 Fabricación y construcción de silos ................................................................... 39

4.5 Análisis del valor nutritivo del silaje ................................................................. 40

4.6 Análisis microbiológico del silaje ..................................................................... 41

4.7. Cuantificación y análisis de la producción de metabolitos secundarios .......... 41

4.8. Diseño experimental ......................................................................................... 41

4.9. Análisis del rendimiento del proceso de ensilaje ............................................. 42

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 43

6. CONCLUSIONES .................................................................................................. 61

7. RECOMENDACIONES ......................................................................................... 63

8. FUTURAS INVESTIGACIONES .......................................................................... 64

9. ANEXOS ................................................................................................................ 65

9

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Fuentes de biomasa ................................................................................................................ 14

Figura 2.Estructura de la lignocelulosa ................................................................................................. 15

Figura 3. Vía utilizada por las células procarióticas y eucarióticas para degradar la glucosa ............... 21

Figura 4. Fermentación alcohólica de levaduras ................................................................................... 23

Figura 5. Paso de Piruvato a lactato en bacterias acidolácticas ............................................................ 23

Figura 6. Silos construidos con tubos de pvc ........................................................................................ 39

Figura 7. Influencia de la melaza y la gallinaza en la producción de bacterias acidolácticas, mohos y

levaduras de los silos .................................................................................................................... 43

Figura 8. Influencia de la melaza y la gallinaza en la producción de bacterias acido-acéticas, mesófilos,

clostridios y enterobacterias de los silos ....................................................................................... 44

Figura 9. Matriz de correlación del ácido acético con los microorganismos asociados al proceso de

ensilaje 1 ....................................................................................................................................... 52

Figura 10. Matriz de correlación del ácido acético con los microorganismos asociados al proceso de

ensilaje 1 ....................................................................................................................................... 52

Figura 11. Evaluación organoléptica del silaje 1 ................................................................................... 54

Figura 12. Evaluación organoléptica del silaje 2 ................................................................................... 54

Figura 13. Contenido de FDN, FDA y Poder calorífico del silaje 1 .................................................... 57

Figura 14. Contenido de FDN, FDA y Poder calorífico del silaje 2 ..................................................... 59

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LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Níveles típicos de composición de biomasa 16

Tabla 2. Composición química del bagazo de caña 17

Tabla 3. Calidad del ensilado en función de los productos de fermentación 20

Tabla 4. Evolución enzimática y microbiólogica del ensilaje 30

Tabla 5. Categorías de aditivos para el ensilaje 31

Tabla 6. Composición de los silos 40

Tabla 7. Crecimiento microbiano, pH y temperatura del silaje 1 45

Tabla 8. Crecimiento microbiano, pH y temperatura del silo 2 46

Tabla 9. Metabolitos evaluados en el silaje 1 51

Tabla 10. Metabolitos evaluados en el silaje 2 51

Tabla 11. Criterios para la valoración organoléptica de los ensilajes 53

Tabla 12. Escala de valores para calificar la calidad organoléptica del ensilaje 53

Tabla 13. Composición fisicoquímica de los silajes 1 y 2 después de 21 días de fermentación 56

11

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Diseño y fabricación de los silos con relación a los días de fermentación ............. 65

Anexo 2. Hipótesis del problema con relación al efecto de los aditivos en la producción de

microorganismos ............................................................................................................. 65

Anexo 3. Balance de materia de ensilaje de bagazo de caña de azúcar sin aditivos........... 66

Anexo 4. Balance de materia realizado durante la etapa de fermentación del ensilaje de

bagazo de caña de azúcar fresco con aditivos ................................................................. 68

Anexo 5 Cromatograma de ácido láctico de la muestra del silo 1 correspondiente al día 1 ... 70

Anexo 6. Cromatograma de ácido láctico de la muesta del silo 1 correspondiente al día 3 ... 70

Anexo 7. Cromatograma de ácido láctico de la muestra del silo 1 correspondiente al día 7 .. 70

Anexo 8. Cromatograma de ácido láctico de la muestra del silo 1 correspondiente al día 14 71






Anexo 14. Cromatograma de ácido láctico de la muestra del silo 2 correspondiente al día2173

12

LISTA DE ABREVIATURAS

BAC: Bacterias ácido acéticas

BAL: Bacterias ácido lácticas

CF: Coeficiente de fermentación

MS: Materia Seca

FDN: Fibra detergente neutra

FDA: Fibra detergente ácida

13

1. RESUMEN

En la presente investigación se evaluaron los productos finales del metabolismo

producidos en el proceso de ensilaje a partir de bagazo de caña de azúcar (Saccharum

officinarum). El ensilaje es un método menos demandante en maquinaria e

infraestructura y menos dependiente de las condiciones climáticas, reduciendo los

costos de producción, por lo que se emplea más comúnmente en las actuales

explotaciones bovinas. Con este sistema, se obtiene un alimento de aceptable a buena

calidad nutricional empleando una mezcla de alimentos ricos en carbohidratos

fermentables junto con un sustrato proteico no fermentable. En muchos casos en

donde los forrajes no cumplen estas características, se pueden utilizar aditivos los

cuales cumplen con la función de acelerar el proceso fermentativo y/o disminuir las

pérdidas del producto, mejorando su calidad final. En la actualidad, el ensilaje es la

forma de preservación de forrajes para la producción ganadera, más común en el

mundo y es bien establecido que las bacterias ácido lácticas (BAL) juegan un papel

importante en la buena fermentación del silo, por lo que la flora epífita con la que

cuente el forraje al momento de ser ensilado influirá fuertemente en la calidad del

producto final, especialmente cuando no se utilizan aditivos bacterianos en la

preparación del silo (Cai et al. 1999a), ya que en general su concentración inicial es

baja con respecto a otro tipo de microorganismos, pero siempre y cuando se ofrezcan

las condiciones necesarias para su desarrollo. En este trabajo de investigación se

evaluaron variables como: pH, olor, color, análisis bromatológicos (porcentajes de

materia seca, humedad, proteína, cenizas, fibra detergente ácida, fibra detergente

neutra), sucesiones microbiológicas (bacterias acidolácticas, bacterias acidoacéticas,

enterobacterias, clostridios, mesófilos, mohos y levaduras) y la produccion de ácidos

orgánicos volátiles (metabolitos) como: ácido láctico, ácido acético, ácido butírico y

ácido propiónico durante 1, 3, 7, 14 y 21 días, siendo la relación entre ellos la que

determina la calidad de conservación y la aceptabilidad del producto final.

14

2. MARCO TEÓRICO

2.1. BIOMASA LIGNOCELULÓSICA

La biomasa lignocelulósica es toda la materia orgánica que proviene de árboles,

plantas, desechos de animales, de la agricultura (residuos de maíz, café, arroz, etc.),

del aserradero (podas, ramas, aserrín, cortezas, etc.) y de los residuos urbanos (aguas

negras, basura orgánica entre otros), que constituye una fuente abundante y segura de

recursos renovables y energía, representando la sustancia más abundante en la

naturaleza, aproximadamente el 50% de la biomasa en el mundo, cuya producción se

ha estimado en cifras que van desde 10.000 - 50.000 ton/año (Sánchez et al., 2007).

La biomasa lignocelulósica presenta aplicaciones potenciales tales como: la

generación de energía, la producción de carbón activado, la producción de biomasa

microbiana y la producción de papel. Uno de los recursos lignocelulósicos más

importantes, lo constituye el bagazo de caña de azúcar, el cual, es utilizado como

combustible sólido para la generación de energía, la producción de papel y la

manufactura de forrajes. Las fuentes más abundantes de materiales lignocelulósicos

están representadas por residuos agrícolas, forestales, agroindustriales, de industria de

alimentos y sólidos urbanos (Figura 1).

Figura 1. Fuentes de biomasa

(Quaak P et al.,1999)

15

Los residuos forestales y agrícolas son los más interesantes, estos no tienen una

disposición final específica y solo un bajo porcentaje de ellos es utilizado con fines

energéticos (incineración) tienen un bajo valor económico y son principalmente

abandonados o quemados causando problemas ambientales. (Díaz, 2012). Estos

residuos se componen principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina que son

biopolímeros muy complejos.

2.1.1. Composición de biomasa lignocelulósica

La biomasa lignocelulósica está compuesta principalmente de tres tipos de polímeros,

celulosa, hemicelulosa y lignina, compuestos estructurales claves de la pared celular

de las plantas (

Figura 2.), están fuertemente entrelazados y unidos químicamente por fuerzas no

covalente y por enlaces cruzados covalentes (Pérez et al., 2002).

Figura 2.Estructura de la lignocelulosa

16

La celulosa, la hemicelulosa y la lignina forman estructuras llamadas microfibrillas, organizadas en

microfibras que regulan la estabilidad de la pared celular de las plantas (Rubin, 2008)

La celulosa y la hemicelulosa son carbohidratos complejos formados de cadenas

largas moléculas de azúcar de 5 y 6 carbonos. La lignina es un polímero complejo no

carbohidrato con estructura aromática, que se une a la celulosa y a la hemicelulosa,

dándole a la pared celular de las plantas su rigidez. Aunque la composición y las

proporciones de estos compuestos varían entre plantas, (Prassad et al., 2007,

McKendry et al., 2002, Malherbe et al., 2002, Pérez-Díaz et al., 2005, NSF 2008) la

biomasa lignocelulósica típica seca, está compuesta de carbohidratos en un 75% y

lignina en un 25% (NSF, 2008). La composición típica de la biomasa lignocelulósica

está dada según la Tabla 1.

Tabla 1. Níveles típicos de composición de biomasa

(Coordinación BNDES y CGEE, 2008)

Componentes Porcentaje en peso

Celulosa 40-60%

Hemicelulosa 20-40%

Lignina 10-25%

2.1.1.1 Celulosa

La celulosa es el componente mayoritario de la pared celular en los materiales

vegetales, un polímero lineal que se compone de D-subunidades de glucosa unidas

por enlaces β-1,4 glicosídicos que forman el dímero celobiosa estos forman cadenas

largas (fibrillas elementales) unidas entre sí, por enlaces de hidrógeno y fuerzas de

van der Waals. La celulosa por lo general está presente como una forma cristalina y

una pequeña cantidad de cadenas no-organizadas de celulosa amorfa, siendo esta

última, la celulosa más susceptible a la degradación enzimática (Pérez et al., 2002).

2.1.1.2. Hemicelulosa

La hemicelulosa es un polisacárido con un peso molecular más bajo que la celulosa,

se forma a partir de D-xilosa, D-manosa, D-galactosa, D-glucosa, L-arabinosa,4-O-

metil-glucurónico, D-galacturónico y D-ácidos glucurónico. Los azúcares están

unidos entre sí por β-1,4 y a veces por β-1,3-glicosídicos. La principal diferencia

17

entre la celulosa y la hemicelulosa es que la hemicelulosa tiene ramificaciones con

cadenas laterales cortas que constan de diferentes azúcares y la celulosa consiste en

oligómeros fácilmente hidrolizables (Sánchez, 2009).

2.1.1.3. Lignina

La lignina está presente en la pared celular para dar soporte estructural,

impermeabilidad y resistencia contra el ataque microbiano y el estrés oxidativo. Es un

heteropolímero amorfo, no soluble en agua y ópticamente inactivo que se forma a

partir de unidades de fenilpropano unido entre sí por enlaces no hidrolizables. Este

polímero se sintetiza por la generación de radicales libres, que se liberan en la

deshidrogenación peroxidasa-mediada de tres fenilo alcoholes propiónico: el alcohol

coniferílico (guayacil propanol), alcohol cumaril (p-hidroxifenil) propanol y el

alcohol sinapílico (propanol siringil). Esta estructura heterogénea está vinculada por

C-C y los vínculos-aril éter, con aril-éter de glicerol-β aril siendo estas las estructuras

predominantes (Sánchez, 2009).

2.2. BAGAZO DE CAÑA DE AZÚCAR

El bagazo de caña de azúcar, es un residuo fibroso que queda después de la molienda

de caña de azúcar. Está formado por un conjunto de partículas de diferentes tamaños

cuyo promedio oscila alrededor de 2 a 2.5 mm, el resto consta de sólidos solubles e

insolubles. Es utilizado normalmente como combustible en las calderas que le dan

energía a los ingenios.

Tabla 2. Composición química del bagazo de caña

(Filo et al., 2006 , citado por Loaiza J.K., 2008)

Componentes Bagazo de caña

Materia seca (%) 48.16

Materia orgánica (%) 92.64

Proteína cruda (%) 1.82

Cenizas (%) 4.10

Carbohidratos solubles (%) 0.79

Fibra detergente neutra (%) 89.07

Fibra detergente ácida (%) 61.18

Celulosa (%) 44.06

Hemicelulosa (%) 32.72

Lignina (%) 13.42

NDT (%) 43. 52

18

El bagazo de caña de azúcar está constituido por tres fracciones principales: celulosa,

hemicelulosa y lignina. El contenido aproximado es de 50, 25 y 25%

respectivamente. Químicamente, contiene cerca de 50% de -celulosa, 30% de

pentosa y 2,4% de cenizas (Karp et al, 2013). Debido a su bajo contenido de cenizas,

el bagazo de caña de azúcar ofrece numerosas ventajas para su bioconversión en

comparación a otros residuos de cosecha como cascarilla de arroz y paja de trigo los

cuales tienen contenidos de cenizas de 17,5 y 11,0% respectivamente (Pandey et al.,

2000)

El bagazo de caña ofrece características que permite considerarlo como materia prima

para la elaboración del alimento para ganado, ya que, además de la disponibilidad del

mismo, permite el desarrollo de microorganismos sobre su superficie, retiene la

humedad, lo que es muy importante cuando se cultivan levaduras y es un material

poroso lo que facilita el paso del gas amoniaco. (Serpas et al., 2008). La composición

química del bagazo de caña está dada según la Tabla 2.

2.3. CONSERVACIÓN DE BIOMASA

Los residuos agroindustriales son una importante fuente de biomasa para la

alimentación animal y pueden ser suministrados a los rumiantes en forma fresca, sin

embargo, es posible transformarlos para consérvarlos y utilizarlos en el futuro durante

períodos de escasez de alimento. (Mannetje, 2001). La conservación de biomasa

puede efectuarse por medio de: secado al sol, henificación, fabricación de harinas,

adición de ácidos y por fermentación a través del ensilaje.

2.3.1.Ensilaje

El ensilaje es un método de conservación de forrajes frescos u otros alimentos con

alto contenido de humedad, se emplean reservorios denominados silos, en ausencia de

aire, luz y humedad exterior; es utilizado para alimentar a rumiantes (Church et al.,

2002). Cuando dicho material se almacena en condiciones anaerobias y si la cantidad

de carbohidratos fermentables es adecuada, se produce suficiente ácido láctico para

19

estabilizar la masa, de manera que la fermentación se detiene y el ensilado se

conserva durante un período indefinido dependiendo del tipo de forraje o subproducto

a ensilar así como las condiciones de fermentación entre otros factores (Church et al.,

2002)

La acción bacteriana sobre los carbohidratos puede ser aeróbica o anaeróbica. En

presencia de suficiente oxígeno, la descomposición de los carbohidratos puede llegar

hasta los productos finales: dióxido de carbono y agua. Esto no es deseable por que se

perdería el total de energía de los materiales en proceso de conservación. Si no hay

oxígeno libre, se desarrolla una combustión incompleta o descomposición anaeróbica.

En la descomposición anaeróbica, los microorganismos no pueden obtener la cantidad

máxima de energía existente en las sustancias fermentables dado que el sustrato

cumple un doble papel: agente oxidante y agente reductor.

Para lograr conservar los carbohidratos y las proteínas se debe buscar una rápida

fermentación láctica con una rápida disminución del pH que excluye otros tipos de

fermentaciones. Cuando se eleva la presión osmótica se restringe la fermentación,

pero los microorganismos acidolácticos son más tolerantes a los efectos osmóticos y a

pH bajos que los no acidolácticos. (Van Soest, 1994)

Para conocer si el material fue correctamente elaborado, existen determinaciones

cualitativas y cuantitativas, las primeras son evaluadas por la observación de

características físicas (textura, color, olor), son sencillas, rápidas, prácticas y ayudan a

conocer características que dan idea sobre la aceptación por el ganado, pero no

permiten determinar el valor nutritivo del producto (Jiménez, 1988), las segundas

tienen mayor precisión y se evalúan por la cuantificación de los compuestos químicos

producidos durante el proceso de fermentación (Tabla 3).

20

Tabla 3. Calidad del ensilado en función de los productos de fermentación

(Bjorge, 1996)

Parámetros Calidad del ensilado

Buena Intermedia Mala

pH (MS > 35%) < 4,8 < 5,2 > 5,2

pH (MS < 35%) < 4,2 < 4,2 > 4,8

Ácido láctico % 3 – 14 Variable Variable

Ácido butírico % < 0,2 0,2 > 0,5

Proporción s/ácidos totales

Láctico > 60 40 - 60 < 40

Acético < 25 25 - 40 > 40

Butírico < 5 5 – 10 > 10

N-NH3 (% s/N total) < 10 10 – 16 > 16

NFDA (% s/N total) < 15 15 – 30 > 30 NFDA: Nitrógeno ligado a fibra ácido detergente

2.3.1.1. Etapas del ensilaje

El proceso del ensilaje se puede dividir en 5 fases:

Fase 1: fase aeróbica o de respiración de los materiales

En esta fase el oxígeno atmosférico presente en la masa vegetal disminuye

rápidamente debido a la respiración de los materiales vegetales y a los

microorganismos aerobios y aeróbicos facultativos como las levaduras y las

enterobacterias. Además hay una actividad importante de varias enzimas vegetales,

como las proteasas. El pH se mantiene en el rango de 6,0 – 6,5 considerado normal

(Stefanie et al., 2001). En el momento de la introducción del material, entre la masa

del producto queda aire aprisionado y aunque el forraje se introduzca a presión en el

silo, inevitablemente queda retenido parte del aire.

Mientras exista algo de aire, la respiración continúa y determina una oxidación de los

azúcares con formación de anhídrido carbónico y agua, asi como desprendimiento de

calor. El calor desprendido y por tanto pérdida de energía dependerá de la cantidad de

aire disponible (Silveira et al., 2006).

Cuando el proceso de llenado no es rápido o la compactación es deficiente la

respiración de los materiales continua, la temperatura prosigue elevándose y la

21

desintegración de los carbohidratos solubles continúa, disminuyendo además las

proteínas, resultando en un producto sobrecalentado (más de 53°C, de color pardo

oscuro a negro) el cual no tiene el valor nutritivo necesario u óptimo (Silveira et al.,

2006).Todas las plantas y animales utilizan la misma ruta metabólica para extraer la

energía disponible de los carbohidratos. Esta es conocida como la Glicólisis y es

utilizada tanto por los organismos aerobios como por los anaerobios ya que no

requiere la presencia de O2

para sus reacciones y es la única fuente importante de

energía del metabolismo de carbohidratos de que pueden disponer estos últimos (

Figura 3) (Boyer, 2000)

22

Figura 3. Vía utilizada por las células procarióticas y eucarióticas para degradar la glucosa

(https://chelseaharripersad.files.wordpress.com/2013/03/glycolysis_pathway.jpg)

Fase 2: comienzo de la acidificación

Durante esta fase, se eliminan primero la mayoría de los microorganismos que

necesitan aire para desarrollarse; al morir las células vegetales por falta de oxígeno,

se producirá el desarrollo de bacterias lácticas, butíricas y un nutrido grupo de

proteolíticas, que degradan a las proteínas. Estas bacterias transforman los azúcares

de la planta en ácido fórmico, ácido acético, alcohol, anhídrido carbónico y en

ocasiones, en ácido butírico. Además del ataque de los azúcares, producen también la

degradación de las proteínas, que se descomponen con formación de amoníaco y

aminas tóxicas. Dos factores limitan su actividad: la elevación de la temperatura y la

acidez del medio. Esta fase es generalmente de corta duración debido a la

acidificación rápida que se produce simultáneamente por las bacterias lácticas. El

grupo Coli-aerógenes o falsas bacterias lácticas son las primeras en desarrollarse.

(Silveira et al., 2006)

Fase 3: inicio de la fermentación láctica

En esta fase el inicio de la fermentación láctica depende de la actividad de los

fermentos del ácido láctico de las bacterias lácticas verdaderas: lactobacilos

(anaerobias facultativas que corresponde al 10% del número total de bacterias de la

planta verde (microflora epifítica)) sobre los hidratos de carbono adecuados. De su

desarrollo y de su fermentación dependerá el éxito o el fracaso del ensilado. Su

actividad estará condicionada por el número de bacterias lácticas presentes en el

forraje fresco; la presencia de azúcares fermentables en cantidades suficientes y

23

liberados en el momento oportuno la ausencia de aire de la masa ensilada (o ausencia

casi total de aire) (Silveira et al., 2006).

El proceso glicolítico (Figura 3) es igual para estas bacterias produciendo 2 moléculas

de piruvato por cada glucosa que entra en la ruta. Durante este proceso hay una

reducción de dos moléculas de NAD+

(coenzima para la Gliceraldehido 3-P

Deshidrogenasa) hasta NADH. Sin embargo las células contienen cantidades

limitadas de NAD+

el cual se debe estar reciclando para que la oxidación de la

glucosa no se detenga. Es por esto que el piruvato finalmente se reduce hacia uno de

los diversos productos de la fermentación . En el caso de las levaduras se reduce a

etanol con la liberación de CO2, esta es conocida como fermentación alcohólica, muy

utilizada en la industria (

Figura 4). En las BAL (Bacterias acidolácticas) se reduce a lactato (Figura 5).

Figura 4. Fermentación alcohólica de levaduras

http://e-ducativa.catedu.es/44700165/aula/archivos/repositorio//3250/3379/html/3

http://e-ducativa.catedu.es/44700165/aula/archivos/repositorio/3250/3379/html/3

24

Figura 5. Paso de Piruvato a lactato en bacterias acidolácticas

http://www2.uah.es/tejedor_bio/BBM-II_2F/tema-4.htm)

Fase 4: producción máxima de ácido láctico y estabilización (fase estable)

En esta fase las bacterias acidolácticas proliferarán y se convierten en la población

predominante cuando la fermentación se desarrolla con éxito (Stefanie et al., 2001) a

causa de la producción de ácido láctico y otros ácidos. Como consecuencia, se

produce una fuerte acidez en el silo que arroja cifras de estabilización de pH entre 3,5

y 4,2. Debido a esta fuerte acidez se produce en cierto modo una esterilización en la

masa, de forma que el crecimiento de todas las demás especies de bacterias queda

paralizado, así como todo tipo de actividad enzimática y por último se inhibe también

el desarrollo de las mismas bacterias lácticas, creando un estado de estabilización o

de reposo que permite la conservación casi indefinida del alimento ensilado (Silveira

et al., 2006). Las tres primeras fases terminan aproximadamente en los tres primeros

días, si el material ha sido bien ensilado y la última o de estabilización se desarrolla

entre el día 4 hasta los días 17 a 21 días después de iniciado el proceso.

Fase 5: fase de deterioro aeróbico

Esta fase comienza con la apertura del silo y la exposición del ensilaje al aire. El

período de deterioro puede dividirse en dos etapas. La primera se debe al inicio de la

degradación de los ácidos orgánicos que conservan el ensilaje, por acción de

levaduras y ocasionalmente por bacterias que producen ácido acético. Esto induce un

aumento en el valor del pH, lo que permite el inicio de la segunda etapa de deterioro;

en ella se constata un aumento de la temperatura y la actividad de microorganismos

que deterioran el ensilaje, como algunos bacilos. La última etapa incluye la actividad

25

de otros microorganismos aeróbios facultativos como mohos y enterobacterias. El

deterioro aeróbico ocurre en casi todos los ensilajes al ser abiertos y expuestos al aire.

Sin embargo, la tasa de deterioro depende de la concentración y de la actividad de los

organismos que causan este deterioro en el ensilaje. Las pérdidas por deterioro que

oscilan entre 1,5 y 4,5% de materia seca diarias pueden ser observadas en áreas

afectadas. Estas pérdidas son similares a las que pueden ocurrir en silos

herméticamente cerrados y durante períodos de almacenaje de varios meses (Honig y

Woolford, 1980 citados por, Stefanie et al., 2001).

Al final cuando los silos son abiertos para alimentar los animales ocurre una última

pérdida aeróbica. La entrada de aire estimula la actividad de levaduras y bacterias,

metabolizando carbohidratos solubles, fermentación de ácidos e inclusive

carbohidratos estructurales. El calentamiento tan alto en la superficie del silo indica la

magnitud de las pérdidas, las cuales en condiciones extremas pueden alcanzar un 30%

en un período de 10 días (Horney Russel, 2008).

2.3.1.2. Factores que afectan al proceso de ensilado

Ligados al sustrato La ensilabilidad o calidad fermentativa en un ensilado depende

de la naturaleza del forraje de partida como contenido materia seca, carbohidratos

hidrosolubles y capacidad tampón (Argamentería et al., 1997).

Contenido de materia seca

El contenido correcto de materia seca (30-35%) de la planta antes del ensilado es un

factor importante para el éxito de la fermentación (Ashbell et al., 2001) así la

degradación del ácido láctico y la producción de amoníaco por bacterias butíricas se

ven considerablemente atenuados (Cañete et al., 1998). Forrajes con contenidos de

más del 70% de humedad son indeseables dado que el crecimiento de los Clostridium

no se inhibe aun cuando el pH baje a 4, obteniéndose ensilajes de bajo valor

nutrimental por pérdidas de efluentes y poco apreciado por los animales (Alaniz,

2008).

26

Contenido de azúcares solubles

Los microorganismos usan los carbohidratos hidrosolubles como la principal fuente

de energía para su crecimiento. Los principales son la fructosa, sacarosa y

fructosanos. El bajo contenido de carbohidratos hidrosolubles del forraje pueden

limitar las condiciones de la fermentación. Bajo esta condición el pH no baja como

para llegar al estado de conservación. Normalmente se requiere un mínimo de 6 a

12% de carbohidratos hidrosolubles sobre materia seca, para una apropiada

fermentación en el ensilaje. El contenido de carbohidratos en las plantas depende del

tipo de forraje, de las condiciones del cultivo, así como las ambientales (Alaniz,

2008). Cuando un material pese a su buena calidad, no contiene cantidades

suficientes de azúcares es necesario añadirle melaza o alguna otra fuente de azúcares

que faciliten su fermentación (Mannetje, 2001).

Capacidad tampón

La capacidad tampón en plantas forrajeras es definida como la resistencia que

presenta la planta a las variaciones de pH. La capacidad tampón depende básicamente

de la composición de la planta en cuanto a proteína bruta, iones inorgánicos (Ca, K,

Na) y la combinación de ácidos orgánicos (Jobim et al., 2007).

Al aumentar la edad de la planta se incrementa la proporción tallo/hoja, con lo cual

los procesos metabólicos disminuyen, como consecuencia, se reduce el contenido de

ácidos orgánicos, lo que conlleva un descenso de la capacidad tampón con la

maduración (De la Roza, 2005).

Ligados a la realización del ensilado

Tamaño de la partícula

27

Al momento de picar un cultivo para ensilar se presentan dos cuestiones, que en

cierto modo parecen contradictorias: 1. Lograr un tamaño de partículas lo

suficientemente pequeño como para no dificultar el correcto compactado del ensilaje

y 2.Lograr un tamaño de partículas lo suficientemente grande como para proveer al

animal de fibra detergente neutra, asegurándole una normal masticación y una

adecuada rumia cuando el animal ingiere el ensilaje (Gallardo, 2003).

Si el ensilaje tiene gruesos y grandes tallos, sino se pica, pueden quedarse bolsas de

aire con más facilidad ya que la compactación del material es más difícil y

consecuentemente. pueden producirse fermentaciones de tipo aeróbico

principalmente, aumentando la temperatura y elevándose el pH, que deteriora el

ensilaje (Vieira da Cunha, 2009). Se sugiere que la mezcla final de alimentos

procesados (mezclas de ensilajes/henos y concentrados) o un alimento fibroso en

particular (ensilaje o heno picado) debe tener entre un 5 y 10% de partículas mayores

a 2 cm., entre un 40 y 50% de partículas entre 0,8 y 2 cm. y el resto inferior a dicha

longitud (Gallardo, 2003).

Premarchitamiento

La disminución del contenido de agua del alimento a ensilarse se puede realizar

mediante el prensado, o bien mediante su exposición al aire libre durante un corto

período de tiempo (6 - 24 horas), obteniéndose contenidos de materia seca entre 30 y

40%, no es aconsejable sobrepasar estos contenidos, ya que ello inhibiría también el

desarrollo de la flora microbiana beneficiosa y además dificultaría el prensado del

silo, obligando a un picado más fino del alimento (Cañete et al., 1998).

En casos cuando el bajo valor de materia seca y carbohidratos solubles en pastos

tropicales (C4) tiene como resultado una mala fermentación del material verde recién

cortado el proceso de marchitez podría ser beneficioso pero en condiciones climáticas

inestables requerirían un período prolongado de marchitez, lo cual puede derivar en

28

una fermentación mala a causa de la proteólisis producida por enzimas endógenas; a

su vez se refleja en una proporción más baja de "proteína verdadera" en el forraje y

en consecuencia, una proporción más alta de N amoniacal en el ensilaje. El uso de

ciertos aditivos puede ser una buena alternativa para reemplazar el proceso de

marchitez, (la pulverización de ácido fórmico sobre la cosecha antes de segarla),

como es el caso de ciertos pastos con tallos gruesos y hábito erecto (Pennisetum spp.,

Panicum spp.) que producen una gran cantidad de biomasa, difícil de preacondicionar

y manipular lo que hace problemática la mecanización y eleva los costos de mano de

obra (Mühlbach, 2001).

2.4. MICROBIOLOGÍA DEL PROCESO DE ENSILAJE

Los microorganismos que se desarrollan durante el ensilaje juegan un papel clave

para el éxito del proceso de conservación. Los microorganismos pueden ser divididos

en dos grupos principales: Los microorganismos benéficos y los microorganismos

indeseables.

Los microorganismos benéficos son las bacterias ácido lácticas, éstas pertenecen a la

microflora epifita de los vegetales. Su población natural crece significativamente

entre la cosecha y el ensilaje. Esto se explica por la reactivación de células latentes y

otras no cultivadas y no por la inoculación de las máquinas cosechadoras o por el

simple crecimiento de la población original. Las características del cultivo como,

contenido de azúcares, contenido de materia seca y composición de los azúcares,

combinados con las propiedades del grupo BAL así como su tolerancia a condiciones

ácidas o de presión osmótica, y el uso del sustrato, influirán en forma decisiva sobre

la capacidad de competencia de la flora BAL durante la fermentación del ensilaje

(Woolford, 1984; McDonald et al., 1991).

29

Los componentes BAL que se asocian con el proceso de ensilaje pertenecen a los

géneros: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Lactococcus y

Streptococcus. La mayoría de ellos son mesófilos, o sea que pueden crecer en un

rango de temperaturas que oscila entre 5° y 50°C, con un óptimo entre 25° y 40°C.

Son capaces de bajar el pH del ensilaje a valores entre 4 y 5, dependiendo de las

especies y del tipo de forraje. Todos los miembros del BAL son aeróbicos

facultativos, pero muestran cierta preferencia por la condición anaeróbica (Holzapfel

y Schillinger 1992; Hammes et al., 1992; Devriese et al., 1992; Weiss, 1992; Teuber

et al., 1992).

Tomando en cuenta su metabolismo de los azúcares, los miembros BAL pueden ser

clasificados como homofermentadores obligatorios, heterofermentadores facultativos

o heterofermentadores obligatorios. Los homofermentadores obligatorios producen

más de 85 por ciento de ácido láctico a partir de hexosas (azúcares C6) como la

glucosa, pero no pueden degradar las pentosas (azúcares C5) como la xilosa. Los

heterofermentadores facultativos también producen principalmente ácido láctico a

partir de hexosas, pero además pueden degradar algunas pentosas produciendo ácido

láctico, ácido acético y/o etanol. Los heterofermentadores obligatorios degradan las

hexosas y las pentosas, pero se distinguen de los homofermentadores en que degradan

las hexosas en proporciones equimolares de ácido láctico, CO2, ácido acético y/o

etanol (Hammes et al., 1992; Schleifer y Ludwig 1995). Los homofermentadores

obligatorios reúnen especies como Pediococcus damnosus y Lactobacillus ruminis.

Los heterofermentadores facultativos incluyen a Lactobacillus plantarum, L.

pentosus, Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus y Enterococcus faecium. Los

heterofermentadores obligatorios incluyen miembros del género Leuconostoc y

algunos Lactobacillus como L. brevis y L. buchneri (Devriese et al., 1992; Weiss,

1992; Holzapfel y Schillinger, 1992; Hammes et al., 1992).

Los microorganismos indeseables son aquellos organismos que causan el deterioro

anaeróbico por ejemplo clostridium y enterobacterias o deterioro aeróbico como es el

caso de las levaduras anaeróbicas y aerobicas, bacilos, Listeria sp. y mohos. Muchos

de estos organismos indeseables no sólo reducen el valor nutritivo del ensilaje sino

30

que pueden además afectar la salud de los animales o alterar la calidad de la leche, o

ambas, como ejemplo de ello se puede citar a Listeria sp., clostridium, hongos y

bacilos (Stefanie et al., 2001).

La fermentación por ensilaje debe ser predominantemente láctica producida

principalmente por las bacterias acido lácticas encontradas en forma natural en los

recursos alimenticios que se van a conservar. Estas bacterias fermentan azúcares

hidrosolubles y los metabolizan principalmente en productos de fermentación como

ácido láctico, acético, etanol, manitol y dióxido de carbono. Lo ideal es que

predomine el ácido láctico debido a que este es el más fuerte de los ácidos producidos

por el ensilaje (tiene el menor valor de pKa con 3.08), y es extremadamente palatable

para los rumiantes. El ácido acético (pKa 4.64) realiza una menor contribución a la

acidificación y no es palatable para los rumiantes. El menos palatable de todos es el

manitol. El dióxido de carbono es un ácido débil y probablemente no contribuye

significativamente a la acidificación.

Las principales bacterias que intervienen en el proceso normal de fermentación en los

ensilajes pertenecen a la familia Lactobacillaceae; son bacilos o cocos Gram

positivos (Streptococos) y fermentan los hidratos de carbono esenciales para su

desarrollo dando ácido láctico y otros productos. En sus géneros se encuentran

especies microaerófilas, anaerobias y facultativas (Silveira et al., 2006).

Las reacciones presentadas en la evolución enzimática y microbiológica del proceso

de ensilaje se presentan en la Tabla 4.

Tabla 4. Evolución enzimática y microbiólogica del ensilaje

(Adaptado de Paragon, 2004, citado por Bianco, 2009)

Fase Substrato y producto

ENZIMÁTICA

Hidrolisis de carbohidratos Carbohidratos solubles glucosa, fructosa

Respiración Glucosa, fructosa + O2 agua+CO2+calor

Proteólisis Proteínas aminoácidos

FERMENTACIÓN

Carbohidratos solubles acido acético + alcohol + CO2 ACETICA

1. Coliformes

2. Streptococos

LÁCTICA

Homofermentativa carbohidratos solubles acido láctico

31

Heterofermentativa carbohidratos solubles acido láctico + acido acético +

alcohol + CO2

BUTIRICA

Clostridium butyricum Lactato acido butírico + H2O

Clostridium sporogenes Proteínas acido acético+ acido propiónico, NH3, CO2

POST-FERMENTACION

Hongos CHOS + acidos orgánicos CO2 + H2O + calor

Levaduras

Acidos orgánicos+ O2 acido acético + CO2 + H2O+

calor

Carbohidratos solubles alcohol + CO2

2.5. ADITIVOS

Los aditivos han sido utilizados desde el siglo pasado para mejorar la conservación

del ensilado con la idea de asegurar que las bacterias acidolácticas dominen en la fase

de fermentación, estos se pueden agrupar en cinco tipos (Tabla 5) (Helmuth, 2008).

(Stefanie et al., 2001)

Tabla 5. Categorías de aditivos para el ensilaje

Tipo de aditivo Ingrediente activo tipico Observaciones

Estimulantes de la fermentación Bacterias acidolácticas, azúcares

(melaza) y enzimas.

Puede afectar la estabilidad

aeróbica

Inhibidores de la fermentación

Acido fórmico*, acido

láctico*,sulfitos, nitritos, sulfitos

y cloruro de sodio.

Inhibición de clostridium

Inhibidores de deterioro

aerobico

Bacterias acidolácticas, acido

propiónico*, acido benzoico*,

acido sórbico*

Puede mejorar la estabilidad

aeróbica

Nutrientes Urea, amoniaco, minerales Puede mejorar la estabilidad

aeróbica

Absorbentes Pulpa seca de remolacha

azucarera, paja

* O su sal correspondiente.

2.5.1. Estimulantes de la fermentación

Este tipo de aditivos podría usarse para materiales que contienen baja cantidad de

carbohidratos solubles o una baja relación de carbohidratos/compuestos nitrogenados,

y cantidades insuficientes de sustrato para la fermentación láctica (Oude et al., 2001,

Yiannikouris et al., 2002).

La aplicación de técnicas apropiadas durante la cosecha y el ensilado no son

suficientes para impedir que la fermentación inicial del ensilaje (Fase 2) se realice en

forma inadecuada. Esto puede ocurrir por una presencia escasa de microorganismos

32

BAL apropiados o por una baja concentración de carbohidratos hidrosolubles (CHS),

o ambos.

La cantidad de carbohidratos hidrosolubles que se precisa para inducir una buena

fermentación depende del contenido de materia seca y de la capacidad tampón del

forraje. Weissbach y Honig (1996) ilustran la relación entre estos factores, como

sigue:

CF = MS (%) + 8 CHS/CT

Donde:

CF = coeficiente de fermentación

MS = contenido de materia seca

CHS = carbohidratos hidrosolubles

CT = capacidad tampón.

Los forrajes que contienen cantidades insuficientes de sustrato para fermentar o un

bajo contenido de materia seca arrojan un valor CF<35. En tales condiciones, para

inducir una buena fermentación es preciso aumentar el contenido de azúcares, ya sea

agregándolos directamente (p. ej. usando melaza) o introduciendo enzimas que

puedan liberar otro tipo de azúcares presentes en el forraje. Los forrajes con valores

de CF de 35 o más, tienen suficiente sustrato disponible para una buena fermentación.

Sin embargo, agregando ciertos BAL se puede acelerar y mejorar el proceso del

ensilaje. En casos de ensilajes con alto contenido de materia seca y poca

disponibilidad de agua, la presencia de un BAL que sea tolerante a la presión

osmótica pasa a ser el factor crítico para una buena fermentación. Debe recordarse

que este tipo de bacterias representan una porción muy pequeña de la microflora

natural de los cultivos forrajeros (Pahlow y Weissbach, 1996). Los forrajes que

contengan más de 50 por ciento de materia seca se consideran muy difíciles de ensilar

(Staudacher et al., 1999).

33

La fórmula de Weissbach y Honig (1996) no debe aplicarse a cultivos con una baja

concentración de nitritos, como es el caso de gramíneas y cereales inmaduros cuando

se cosecha la planta entera, porque estos cultivos son más propensos a fermentaciones

de clostridios que otros cultivos que tienen un contenido moderado de nitratos

(Spoelstra, 1983, 1985). Puede ser útil usar inoculantes que incrementen la

fermentación láctica para inhibir la actividad de costridios. La menor concentración

de BAL que se precisa para inhibir la actividad de clostridios es, como mínimo,

100.000 unidades formadoras de colonias por gramo de forraje fresco (Weissbach y

Honig, 1996; Kaiser y Weiss, 1997).

2.5.2. Inhibidores de la fermentación

Este tipo de aditivos podría utilizarse teóricamente en todo tipo de ensilaje, pero en la

práctica se utilizan solamente en cultivos con bajo contenido de carbohidratos

hidrosolubles y/o alta capacidad tampón. Este tipo de aditivos pueden reducir la

cantidad de esporas de clostridios, lográndose, en ensilajes de forraje premarchitado

una disminución de esporas de 5 a 20 veces (Oude et al., 2001).

2.5.3. Inhibidores de deterioro aeróbico

Algunos de estos aditivos incluyen ácidos propiónico y acético, y otros ácidos

biológicos provenientes de microorganismos como lactobacilos y bacilos.

Recientemente se ha comprobado que Lactobacillus buchneri es un eficaz inhibidor

del deterioro aeróbico, por su capacidad de degradar bajo condiciones anaeróbicas el

ácido láctico, lo que provoca una disminución significativa del número de levaduras

presentes (Mannetje, 2001).

También puede practicarse la inoculación con bacterias que producen propionatos,

pero parecería no ser una buena opción para mejorar la estabilidad aeróbica de

ensilajes; debido a que este tipo de bacterias sólo puede proliferar y producir

34

propionato siempre que el pH del medio permanezca relativamente alto (Mannetje,

2001)

2.5.4. Nutrientes

Comprende la utilización de ciertos elementos para suplementar algún déficit del

forraje o grano almacenado; por ejemplo con el agregado de urea o amoníaco para

incrementar el contenido de proteína, también podrían utilizarse minerales.

El agregado de urea puede realizarse con un agregado del orden del 2 a 4%, que

permitirá un aumento del pH, ocurriendo un proceso de conservación en medio

alcalino, pH en el entorno de 8. El amonio liberado provoca una alcalinización y con

un elevado pH se disminuye la concentración de toxinas (Chalkling, et al., 1997,

Gaggiotti, et al., 2001).

2.5.5. Absorbentes

Los absorbentes son empleados en alimentos de elevado porcentaje de agua (bajo %

MS) para evitar pérdidas de nutrientes por escurrimiento, por ejemplo la pulpa de

remolacha azucarera y la pulpa de cítricos. Aunque los absorbentes tengan un efecto

depresor sobre el valor nutritivo en el forraje, el efecto es benéfico por que reduce el

escurrimiento de componentes de alto valor nutritivo (Mcdonald, et al., 1991, Oude et

al., 2001)

2.6. GALLINAZA

La gallinaza es un producto de desecho no puede ser considerado como un aditivo

típico de ensilaje sin embargo, ha sido mezclado con forrajes fácilmente fermentables

como maíz y sorgo, siendo utilizado como un medio para aumentar el contenido de

proteína bruta y para eliminar posibles patógenos contenidos en la gallinaza a través

de la fermentación. Puede ser utilizada para aumentar el contenido de materia seca en

el ensilaje en pasto con alto contenido de humedad. Pueden tener un alto contenido de

35

proteína junto a altos valores de ceniza, lo cual aumenta la capacidad tampón y tiene

un efecto negativo sobre la fermentación. (Almeida et al.,1986) ensilaron pasto

elefante (20,3 % MS) junto con 15 % de caña de azúcar y 5 % de gallinaza

obtuvieron un ensilaje con una buena calidad de fermentación. (Mühlbach, 2001)

Se acepta el excremento de ave como un valioso elemento nutritivo siempre y cuando

sea tratada debidamente (deshidratada). Hasta el momento no se ha reportado ningún

caso en el que la alimentación con gallinaza haya estado relacionada con la

producción de enfermedades o con toxicidad en ganado bovino. En cuanto al olor,

sabor de la leche y la carne proveniente de animales alimentados con gallinaza, no se

distingue en comparación con productos similares provenientes de animales

alimentados con harina de soya y algodón. (Padilla, 1975, Bracamonte, 1977)

2.7. PRODUCTOS FINALES DEL METABOLISMO ENERGÉTICO DEL

PROCESO DE ENSILAJE

Durante el proceso de ensilaje se producen ácidos orgánicos volátiles (Wheaton et al.,

1999) como consecuencia directa de la degradación de la fuente de carbono para obtener

energía. Los ácidos orgánicos volátiles más frecuentes son: láctico, acético, butírico y

propiónico siendo la relación entre ellos la que determina la calidad de conservación y la

aceptabilidad por parte de los animales (Acosta et al., 2002, Oude et al., 2001).

2.7.1. Ácido láctico

El ácido láctico es el más fuerte (a mayor cantidad produce mayor acidez), es el más

deseado en el proceso de fermentación, para una adecuada conservación, además es el

que se produce y utiliza con mayor eficiencia energética y biológica, por conservar y

hacer disponible la energía del material original para los animales en mayor

proporción (Acosta et al., 2002, Oude et al., 2001)

2.7.2. Ácido acético

36

El ácido acético es de calidad intermedia, no produce tanta acidez y cuando se

acumula en grandes cantidades puede afectar negativamente el consumo; su

producción requiere de una decarboxilación, lo que en términos prácticos implica

pérdida de materia seca (Oude et al., 2001)

2.7.3. Ácido butírico

El ácido butírico es muy poco acidificador y su presencia aún en cantidades mínimas,

da un aspecto “baboso” y fuerte olor a “putrefacción” que limita la aceptabilidad del

ensilaje para los animales, de hecho la fermentación butírica, conjuntamente con la

oxidación por presencia de aire son los principales responsables de las pérdidas de

ensilajes.

Los valores de MS inferiores al 27% pueden favorecer la presencia de bacterias

clostridiales, que producen una fermentación predominantemente butírica, incluso

utilizando como sustrato el ácido láctico formado.

Procesos que no sólo dificultan la conservación (por incrementarse el pH), sino que

además ocasionan pérdida de valor nutritivo, al degradar el ácido butírico (Titterton et

al., 2001 ).

2.7.4. Ácido propiónico

Pocos autores reportan datos de ácido propiónico, debido a que no tiene significancia

dentro del proceso. Sin embargo, en silos altos en humedad (materia seca menor al

25%) el ácido propiónico puede alcanzar valores hasta del 0.3% de la materia seca,

pero cuando los silos alcanzan concentraciones de materia seca entre el 35 al 45% el

ácido propiónico puede ser indetectable. (Kung & Shaver, 2001).

37

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General

Evaluar productos finales del metabolismo energético producidos en el proceso de

ensilaje a partir de bagazo de caña de azúcar (saccharum officinarum)

3.2 Objetivos específicos

Determinar el efecto de la gallinaza y la melaza como aditivos en la calidad

del ensilaje y su valor nutricional.

Correlacionar la producción de metabolitos con los microorganismos

asociados al proceso de ensilaje de bagazo de caña de azúcar mediante

fermentación en estado sólido.

Determinar la calidad del proceso de ensilaje mediante pruebas

fisicoquímicas, organolépticas y microbiológicas.

Establecer el rendimiento del proceso de ensilaje por medio de un balance de

materia

38

4. METODOLOGIA

4.1 Revisión bibliográfica y análisis de la información existente

Para el desarrollo de esta investigación se tuvieron en cuenta dos fuentes de

información: fuentes primarias y fuentes secundarias.

4.1.1 Fuentes primarias: La información primaria correspondió a todos los datos

cuantitativos y cualitativos tomados y registrados durante toda la fase experimental

de la investigación.

4.1.2 Fuentes secundarias: La información secundaria correspondió a los datos

bibliográficos concernientes al tema de investigación, que se localizaron en tesis,

trabajos de investigación, libros, e internet, los cuales se analizaron y verificaron con

los obtenidos en la investigación.

4.2 Materias primas y ensilaje

La materia prima utilizada para la formulación del ensilaje, corresponde al residuo

agroindustrial de la caña de azúcar: bagazo de caña de azúcar y aditivos.

Aditivos: melaza como fuente de carbohidratos solubles (23%) y gallinaza (2,0%)

como fuente de nitrógeno.

39

Antes de iniciar el proceso de ensilaje se determinó el Coeficiente de Fermentación

(CF) del bagazo de caña de azúcar para mejorar la fermentación del ensilaje con

aditivos, según metodología descrita por Weissbach y Honig (1996)

4.3 Análisis fisicoquímicos de bagazo de caña de azúcar

Se desarrolló la cuantificación y caracterización de la composición del bagazo de

caña de azúcar para el proceso de ensilaje. Se evaluaron parámetros físicoquímicos

como humedad (A.O.A.C 7.003/84, 930.15/90 adaptado Bernal I, 1994), pH

(A.O.A.C. 10.041/84 adaptado Bernal I, 1994), materia seca (gravimetría), cenizas

(A.O.A.C. 7.009/84, 942.05/90 adaptado Bernal I, 1994), proteína (A.O.A.C.

955.04/90 adaptado Bernal I, 1994), extracto etéreo (A.O.A.C. 955.04/90 adaptado

Bernal I, 1994), fibra detergente neutra (Van Soest, et al., 1991) y fibra detergente

ácida (Van Soest, et al., 1991).

4.4 Fabricación y construcción de silos

Se utilizaron tubos de PVC, pintados de negro para unificar el color de los silos y

evitar el contacto con la luz solar, con capacidad de 0,5 kg (

40

Figura 6), los cuales fueron llenados por capas intercaladas, compactando el material

con un rodillo compactador. Después de llenados los recipientes fueron sellados

herméticamente e identificados según el tratamiento. Por último se pusieron al azar en

una superficie a temperatura ambiente con un mínimo contacto de la luz solar (Cai et

al., 1999, Ennahar et al., 2002).

Figura 6. Silos construidos con tubos de pvc

4.5 Análisis del valor nutritivo del silaje

Durante esta fase se desarrolló la valoración organoléptica al momento de la apertura

de los silos durante los días de fermentación del ensilaje (1, 3, 7, 14 y 21 días), los

días de fermentación del proceso de ensilaje (respiración y fermentación) se realizó

alrededor de 21 días, tiempo necesario para la transformación de todo el azúcar en

ácido láctico ( Schroeder JW.2004.) Para la valoración organoléptica se tuvieron en

cuenta variables como color, olor, estado de madurez y textura La caracterización

41

fisicoquímica del ensilado se desarrolló teniendo en cuenta, los siguientes parámetros:

humedad (A.O.A.C 7.003/84, 930.15/90 adaptado Bernal I, 1994), materia seca

(gravimetría), proteína bruta (A.O.A.C. 955.04/90 adaptado Bernal I, 1994), extracto

etéreo (A.O.A.C. 7.060/84, 920.39/90 adaptado Bernal I, 1994), cenizas (A.O.A.C.

7.009/84, 942.05/90 adaptado Bernal I, 1994), fibra neutro detergente (Van Soest et

al., 1991), fibra ácido detergente (Van Soest et al., 1991) y ácidos orgánicos volátiles:

acético, propiónico, láctico y butírico (Tejada, 1992). Finalizado el proceso, se

analizó la producción de gas carbónico (Ashbell et al.,1990).

Analizadas las condiciones durante este período se evalúo el efecto de aditivos en los

tratamientos silaje 1: bagazo de caña fresco y silaje 2: bagazo de caña fresco +

gallinaza + melaza, durante un tiempo de fermentación de 1, 3, 7, 14 y 21 días. Las

muestras para los análisis físico-químicos fueron envasadas en bolsas de plástico

transparentes selladas al vacío y conservadas a -20 ºC.

En la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. se establece la

composición porcentual de las materias primas utilizadas para el silaje 1 y el silaje 2.

Tabla 6. Composición de los silos

Ingrediente silos

silaje1 silaje 2

Bagazo de caña fresco 100 % 75 %

Melaza 0 % 23 %

Gallinaza 0 % 2 %

4.6 Análisis microbiológico del silaje

Durante esta etapa se realizó un análisis de sucesión microbiana por el método de

recuento en placa por siembra en profundidad (standart plate count) (Swanson et al.,

1992) y cinética de crecimiento, identificación de poblaciones microbianas por medio

de medios selectivos y diferenciales. Se tomaran tres muestras de cada tratamiento en

cada período de evaluación (1, 3, 7, 14 y 21 días de ensilaje) para determinar las

concentraciones de los géneros de bacterias ácido lácticas, ácido acéticas,

42

enterobacterias, clostridios, mesófilos, mohos y levaduras, los cuales son los grupos

más comúnmente aislados de ensilajes y los más representativos en el proceso

fermentativo (Cai, 1999, Masuko et al., 1995).

4.7. Cuantificación y análisis de la producción de metabolitos secundarios

La concentración de ácidos orgánicos volátiles (ácido láctico, ácido acético, ácido

butírico y ácido propiónico) producidos por los microorganismos asociados a cada

fase del proceso de ensilaje de bagazo de caña de azúcar, se determinó por

cromatografía de gases para cada día de evaluación (Tejada, 1992). Se tomaron 20 g

de material fresco y se colocaron en un matraz, se adicionaron 20 ml de ácido

metafosfórico al 25% peso/volumen y 80 ml de agua destilada, se agitó y se guardó

en refrigeración a 4°C durante dos dias haciendo agitaciones cada día.

4.8. Diseño experimental

Para la presentación e interpretación de resultados, se utilizaron medidas estadísticas

como la media aritmética, desviación estándar, coeficiente de variación, porcentaje de

variación y representaciones gráficas.

Por consiguiente, para la discusión de resultados obtenidos a lo largo del proyecto, se

utilizó la prueba de Tukey para la comparación de medias para establecer cual era el

efecto de los aditivos en los tratamientos durante los días de la fermentación

anaerobia. Adicionalmente, estos datos se tabularon mediante el programa estadístico

R versión 3.2.2 para observar la dispersión de los datos y así verificar la confiabilidad

del estudio.

El efecto de la melaza y la gallinaza como aditivos se evalúo mediante un diseño

factorial (2x5); los tratamientos fueron silaje 1 (bagazo de caña fresco) y silaje 2

(bagazo de caña fresco+melaza+gallinaza) durante un tiempo de fermentación de 1,

3, 7, 14 y 21 días.

43

4.9. Análisis del rendimiento del proceso de ensilaje

En esta fase se desarrolló un balance de materia relacionado con las pérdidas de CO2

para establecer el rendimiento del proceso.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Influencia de la gallinaza y la melaza como aditivos en la calidad del silaje.

Para esta investigación se realizó un recuento microbiano para el silaje 1 constituido

por bagazo de caña fresco y un recuento microbiano para el silaje 2 constituido por

bagazo de caña con aditivos (gallinaza + melaza). Los resultados indicaron que las

poblaciones microbianas más altas para el día 1 fueron para las bacterias acidolácticas

44

0 3 6 9 12 15 18 21 24

0,0

5,0x106

1,0x107

1,5x107

2,0x107

2,5x107

3,0x107

3,5x107

Cre

cim

ien

to m

icro

bia

no

(u

fc/g

)

Tiempo (días) Bacterias acidolácticas - silo 1 Bacterias acidolácticas - silo 2

Crecimiento microbiano de bacterias

acidolácticas en el silo 1 y 2

0 3 6 9 12 15 18 21 24

-5,0x104

0,0

5,0x104

1,0x105

1,5x105

2,0x105

2,5x105

3,0x105

3,5x105

4,0x105

Cre

cim

iento

mic

robia

no (

ufc

/g)

Tiempo (días)

Mohos y Levaduras - silo 1 Mohos y Levaduras - silo 2

Crecimiento microbiano de mohos

y levaduras en el silo 1 y 2

en ambos tratamientos, el silaje 1 presentó 2,1 E+07, mientras que para el silaje 2 fue

de 3,0 E+06 (Figura 7).

Figura 7. Influencia de la melaza y la gallinaza en la producción de bacterias

acidolácticas, mohos y levaduras de los silos

En este trabajo de investigación la melaza como fuente de carbohidratos altamente

solubles evidenció durante los 21 días del proceso fermentativo un importante

incremento de las poblaciones BAL en el silaje 2. mientras que para el silaje 1, cuyo

tratamiento no contiene melaza las bacterias acidolácticas presentaron un aumento

considerable durante los días 1, 3 y 21 (Figura 7).

Las bacterias acidoacéticas, mesófilos, clostridios y enterobacterias no presentaron

diferencias significativas entre el silaje 1 y el silaje 2. La interacción

tiempo*tratamiento no mostró efecto en el uso de los aditivos adicionados al bagazo.

En mesófilos se encontró que no hay diferencias significativas entre los tratamientos

a pesar de haber un importante contenido de estas entre los días 1 y 7 (

45

0 3 6 9 12 15 18 21 24

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

Cre

cim

ien

to m

icro

bia

no

(u

fc/g

)

Tiempo (días)

Bacterias acidoacéticas - silo 1 Bacterias acidoacéticas - silo 2

Crecimiento microbiano de bacterias

acidoacéticas en silo 1 y 2

0 3 6 9 12 15 18 21 24

0

1x107

2x107

3x107

4x107

5x107

6x107

Cre

cim

ien

to m

icro

bia

no

(u

fc/g

)

Tiempo (días)

Mesófilos - silo 1 Mesófilos - silo 2

Crecimiento microbiano de mesófilos

en el silo 1 y 2

0 3 6 9 12 15 18 21 24

0

200

400

600

800

1000

Crecim

ien

to m

icro

bia

no

(u

fc/g

)

Tiempo (días)

Enterobacterias silo 1 Enterobacterias silo 2

Crecimiento microbiano de

enterobacterias en el silo 1 y 2

0 3 6 9 12 15 18 21 24

0

200

400

600

800

1000

Cre

cim

ien

to m

icro

bia

no

(u

fc/g

)

Tiempo (días)

Clostridios en silo 1 Clostridios en silo 2

Crecimiento microbiano de

clostridios en el silo 1 y 2

Figura 8).

46

Figura 8. Influencia de la melaza y la gallinaza en la producción de bacterias acido-

acéticas, mesófilos, clostridios y enterobacterias de los silos

Varios investigadores han reportado el uso exitoso de la melaza para el ensilaje. En el

sistema de producción de silaje la melaza fermenta rápidamente y algunas veces, se

añade, durante el proceso de ensilado como preservador, con la ventaja de tener un

valor nutritivo y actor de apetecibilidad. La melaza a pesar de su bajo contenido de

fósforo, constituye un buen medio nutritivo para muchos microorganismos, tales

como levaduras, hongos y bacterias (Chen et al., 2014). Aditivos tales como sacarosa,

glucosa y melaza se han utilizado para aumentar la oferta de sustratos para el

crecimiento de bacterias ácido lácticas, como se observa en en este trabajo el silaje 2

que contenía melaza y gallinaza envidencia sustancialmente la influencia de estos

aditivos en la mejora del ensilaje respecto al bagazo sin aditivos (silaje 1), durante el

proceso de fermentación.

5.2. Variación del pH dentro de los silos

Las tablas 8 y 9 muestran para ambos silajes una disminución del pH en el tiempo.

Este cambio de pH se debe a un incremento de las poblaciones BAL y bacterias ácido

acéticas.

Tabla 7. Crecimiento microbiano, pH y temperatura del silaje 1

Parámetro Días de medición a partir del proceso de ensilado

1 3 7 14 21

pH 4,05 3,93 3,84 3,76 3,59

T (° C) 22,7 22,3 22,2 22,5 21,9

Concentración de microorganismos en UFC/g

Ácido lácticas 2,1E+07 4,6E+06 3,1E+05 3,6E+04 3,6E+06

Ácido acéticas 6,7E+04 3,8E+05 2,9E+03 1,2E+04 1,5E+04

Enterobacterias 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00

Clostridios 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 3,3E+00 0,0E+00

Mesófilos 1,0E+06 3,6E+06 2,3E+06 4,7E+05 1,2E+06

47

Mohos y levaduras 2,7E+04 1,0E+03 3,2E+04 6,7E+02 0,0E+00

En el silo 1, el incremento de las poblaciones BAL y bacterias ácido acéticas se

presenta los días 1, 3 y 21, los días 7 y 14 se genera una mayor producción de las

poblaciones de mesófilos los cuales son capaces de bajar el pH del ensilaje,

inhibiendo éstos el incremento de las poblaciones BAL y bacterias ácido acéticas.

Tabla 8. Crecimiento microbiano, pH y temperatura del silo 2

Ítem Días de medición a partir del proceso de ensilado

1 3 7 14 21

pH 4,30 4,04 4,02 3,40 3,80

T 22,3 22,1 23,5 23,9 22,5

Concentración de microorganismos en UFC/g

Ácido lácticas 3,0E+06 2,1E+07 2,3E+07 6,0E+06 3,2E+07

Ácido acéticas 6,7E+04 2,8E+04 4,9E+04 9,5E+04 5,9E+05

Enterobacterias 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00

Clostridios 0,0E+00 6,7E+00 3,3E+00 0,0E+00 0,0E+00

Mesófilos 1,0E+06 5,6E+07 2,4E+06 6,3E+05 1,2E+07

Mohos y

levaduras 1,1E+05 0,0E+00 3,6E+05 1,0E+03 0,0E+00

En el silo 2, la reducción del pH está correlacionada con el constante incremento de

los microorganismos acidófilos (poblaciones BAL y bacterias ácido acéticas). Esto

permite la conservación del silo, que a pesar de no presentar contenidos de ácido

láctico como catabolito conservador del silo, si se presenta ausencia de

microorganismos patógenos como salmonellas y enterobacterias. Debido a pH bajos a

lo largo del tiempo, se produce en cierto modo una esterilización en la biomasa del

ensilaje, el pH del material ensilado baja a un nivel que inhibe la presencia de

microorganismos que inducen la putrefacción, como consecuencia, el crecimiento de

las poblaciones microbianas queda inactivo, así como todo tipo de actividad

enzimática, creandose un estado de estabilización o de reposo, que permite la

conservación casi indefinida del alimento ensilado como lo reportan Silveira y Franco

(2006). Esto puede evidenciarse en el desarrollo de las bacterias ácido lácticas, en los

48

mohos y las levaduras cuando los silos arrojan cifras de pH entre 3,5 y 4,2, como las

reportadas por Weinberg y Muck, (1996) y Merry et al., (1997).

En ambos ensilajes el pH fue óptimo (Tabla 7 y Tabla 8), presentándose valores

inferiores a 4,2. Barnett, (2004) define como ensilado de buena calidad aquél que

presenta un pH menor de 4,5. En una investigación realizada por Trillos et al., 2007,

reportan que para el ensilaje ruminal con harina de sorgo, un pH de 4.2, indicando

que a medida que disminuye el pH se hace más eficiente el proceso del ensilaje ya

que la acidez de los pH bajos contribuyen a la conservación del ensilaje evitando la

descomposición del mismo.

5.3. Variación de la temperatura dentro de los silos

Los recuentos elevados de bacterias mesófilas, en alimentos fermentados constituyen

la microflora normal y pueden indicar una alteración incipiente asociada a la carga

microbiana del alimento y no un peligro potencial para la salud del consumidor. En

esta investigación los silos (Tabla 7 y Tabla 8) muestran un rango de temperatura

entre 21,9 – 23,9 °C considerado en el rango mesófilo. En la concentración de

mesófilos no se encontraron diferencias significativas (p < 0.05) para la interacción

tiempo*tratamiento. Esta temperatura es considerada por algunos autores como ideal

para que el proceso de ensilaje para que se lleve a cabo de una manera adecuada y el

material ensilado pueda conservar sus propiedades tanto organolépticas como

nutritivas, al igual que el pH.

5.4. Cinética poblacional de microorganismos asociados al proceso de ensilaje

En esta investigación se determinó la carga microbiana de dos tratamientos de

ensilaje, dónde se identificaron poblaciones de (bacterias ácido lácticas, bacterias

ácido acéticas, enterobacterias, clostridium, mesófilos, mohos y levaduras que son

grupos comúnmente asociados a la flora epifita del proceso fermentativo.

5.4.1 Microorganismos indeseables

49

Las condiciones de anaerobiosis y la reducción del pH afectaron el crecimiento de

microorganismos indeseables (mohos y levaduras) en ambos tratamientos, los cuales

están relacionados con el deterioro aeróbico. Por otro lado, las poblaciones de

clostridios fueron inhibidas en ambos tratamientos, mientras que para

enterorobacterias no se obtuvo crecimiento en ninguno de los días evaluados.

Se encontraron diferencias significativas (p<0.05) para la interacción

tiempo*tratamiento, mostrando un crecimiento diferencial de este tipo de

microorganismos en cada tratamiento a lo largo del tiempo. El bagazo en el día 1 en

el silaje 2 tuvo una concentración de hongos y levaduras significativamente mayor (p

< 0.05) respecto al silaje, posiblemente debido a la carga microbiana asociada a la

melaza (Tabla 8).

5.4.2. Microorganismos deseables

Se encontraron diferencias significativas (p < 0.1) en el recuento de BAL para la

interacción tiempo*tratamiento en el silo 1 y el silo 2. Para el día 21 el crecimiento de

BAL es mayor para el silo 2 (Tabla 8). Cabe destacar que las poblaciones de BAL en

ambos tratamientos persistieron a lo largo del tiempo, esto es un buen indicativo de la

calidad del proceso de fermentación en el silo. La calidad del silaje depende

principalmente del grado de compactación y la cantidad de oxígeno que ha quedado

en el material ensilado. Sin embargo, los niveles de materia seca y carbohidratos

solubles son determinantes en la fermentabilidad de un ensilaje, por lo que la

inclusión de un mayor contenido de carbohidratos solubles, facilita la capacidad de

fermentación y degradación de otros sustratos, por estimular el crecimiento de

bacterias ácido lácticas (Maza et al., 2011). Los microorganismos deseables como las

BAL han sido reportadas en diferentes estudios con maíz, sorgo y trigo con valores a

los 60 días de 2E+07, 7E+06 y 1E+06 UFC/g respectivamente (Filya, 2003), y en

forrajes frescos 5,7E+08 UFC/g (Ranjit y Kung, 2000), para el día 21 en este estudio

el crecimiento microbiano más alto fue de 3,2E+07 ufc/g (silaje 2).

Los componentes BAL que se asocian con el proceso de ensilaje pertenecen a los

géneros: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Lactococcus y

50

Streptococcus. La mayoría de ellos son mesófilos, o sea que pueden crecer en un

rango de temperaturas que oscila entre 5° y 50°C, con un óptimo entre 25° y 40°C.

Son capaces de bajar el pH del ensilaje a valores entre 3,5 y 4,2, dependiendo de las

especies y del tipo de forraje. Todos los miembros del BAL son aeróbicos

facultativos, pero muestran cierta preferencia por la condición anaeróbica (Silver y

Franco, 2006; Oude, 1999). En este trabajo se evidenció una persistencia de este tipo

de microorganismos en el tiempo para ambos tratamientos, relacionado con una

disminución paulatina en el pH para los días evaluados. Los rangos de temperatura

obtenidos en las evaluaciones se encontraron cercano al rango óptimo.

Los recuentos iniciales de mesófilos para el silaje 1 y 2 (Tabla 7 y Tabla 8) fueron

mayores que los reportados por Cai et al. (1998) para maíz (1E+06 UFC/g) y para

forrajes frescos de alfalfa, ryegrass italiano y sorgo de 8E+06, 8E+05 y 6E+06 UFC/g

respectivamente (Cai et al. 1999). Estos valores muestran la alta concentración de

bacterias epífitas que se pueden encontrar en materias primas con posibilidad de ser

ensiladas en ambientes tropicales, las cuales tienen un alto potencial para su uso

industrial y para mejorar los procesos fermentativos dentro del silo.

Se ha reportado en varios estudios que las poblaciones de mohos y levaduras pueden

alcanzar recuentos entre 1E+07 y 2,0E+07 ufc/g durante las primeras semanas del

proceso de ensilaje (Fase 1:Fase aeróbica y Fase 2:Fase de fermentación) (Driehuis y

van Wikselaar, 1996; Kung et al. 2000; Ranjit y Kung, 2000), más altos que los

encontrados en el presente estudio. Por otro lado Valiño et al. 2002 reportó para

ensilajes de bagazo de caña sin aditivos una carga de levaduras a los 21 días de

3,3E+10 ufc/g MS, cuando la materia seca (MS) del bagazo en este tiempo alcanzó el

70%, diferente al crecimiento microbiano obtenido en esta investigación para el

mismo día de 0,0E+00 ufc/g con un porcentaje de materia seca de 28,9%. El poco

crecimiento de mohos y levaduras está asociado a un contenido elevado de ácido

fórmico o ácido acético que reducen la supervivencia de éstos microorganismos

indeseables (Driehuis y van Wikselaar, 1996; Oude Elferink et al., 1999). En el silo 1

y en el silo 2 las poblaciones de bacterias ácido acéticas y acido lácticas persistieron

51

a lo largo del tiempo permitiendo estabilizar el sistema, y evitando el deterioro

aeróbico y anaeróbico.

Valiño et al., 2002 estudió el bagazo de caña de azúcar en fermentaciones en estado

sólido, encontrando un predominio de los géneros Aspergillus y Trichoderma

asociados a la carga microbiana en este sustrato. Los cuales pueden hacer parte de los

microorganismos no deseados en el proceso de ensilaje. Sin embargo, la presencia de

éstos podría ser benefica en la fase 1 (fase aeróbica) y fase 2 (fase de fermentación)

del proceso de ensilaje. Debido a que estos microorganismos tienen la capacidad de

hidrolizar materiales lignocelulósicos como el bagazo de caña de azúcar (celulosa:

40-50%, hemicelulosa: 25-35% y lignina 15-20% (Maity, 2015)), promoviendo la

disponibilidad de azúcares hidrosolubles como fuente de carbono, que favorecen el

crecimiento de otras poblaciones microbianas como las BAL y las BAC. Para el

bagazo de caña de azúcar en los silos 1 y 2 se encontraron dos hongos que han sido

ampliamente reportados como hongos con capacidad lignocelulolítica Aspergillus y

Fusarium. Estos organismo tinen la capacidad de degradar el polímero de celulosa, la

cual es fuente de glucosa, de acuerdo a Oude, 1999, estos azucares son aprovechados

en la vía de las hexosas (azúcares C6) por las BAL homofermentativas obligatorias

que les permite producir un 85% de ácido láctico, pero no pueden degradar las

pentosas (azúcares C5) como la xilosa. La hemicelulosa es fuente de 5 tipos de

azucares: xilosa, arabinosa, manosa, galactosa y glucosa. Los heterofermentadores

facultativos también producen principalmente ácido láctico a partir de hexosas, pero

además pueden degradar algunas pentosas produciendo ácido láctico, ácido acético

y/o etanol. En este trabajo, la mayor población de BAL que se presentan son las BAL

heterofermentativas debido a que son suceptibles a pH menores de 5 (Villa, 2008) y

los silos presentan mayor producción de etanol y ácido acético.

Para el caso de microorganismos indeseables como las enterobacterias las cuales

están relacionadas con la degradación proteica y el deterioro, los cambios de pH en

los sistemas de ensilaje no favorecieron el desarrollo de estas poblaciones a pesar de

la disponibilidad de fuentes de nitrógeno y carbohidratos. Lo cual es similar a lo

reportado por McDonald et al., (1991), quien describió que las enterobacterias no

52

proliferan en ambientes con valores bajos de pH. Las técnicas de ensilaje que

aseguren un rápido y significativo descenso del pH en el ensilaje, provocarán una

inhibición del desarrollo de las enterobacterias.

Otro tipo causante del deterioro anaeróbico son los clostridios, en esta investigación

se encontró una inhibición en el desarrollo de estas poblaciones, siendo más evidente

para el tratamiento el silaje 1. La presencia de clostridios en algunos días en ambos

tratamientos, puede estar relacionada con un porcentaje de humedad superior al 70%.

Los clostridios muestran mayor susceptibilidad a la falta de humedad y a bajos pH

(Oude, 1997).

Las condiciones de anaerobiosis, el tiempo de almacenaje y la competencia de

microorganismos de rápido crecimiento acompañado de la producción de ácidos

orgánicos de bajo peso molecular como acido láctico y acido acético controlaron las

poblaciones de mohos y levaduras en ambos tratamientos. En este estudio se

evidenció una relación inversa en el crecimiento de BAC y hongos, lo cual es

consecuente por lo reportado por Oude, (1999), un contenido elevado de ácido

fórmico o ácido acético reduce la supervivencia de levaduras (Tabla 10 y Tabla 11).

Tabla 9. Metabolitos evaluados en el silaje 1

Días de

fermentación

Ácido Láctico

(%)

Ácido acético

(%)

Ácido propiónico

(%)

Ácido butírico

(%)

1 ND 1,174 ± 0,007 ND ND

3 ND 0,73 ± 0,04 ND ND

7 ND 0,82 ± 0,03 ND ND

21 ND 0,69 ± 0,05 ND ND

Tabla 10. Metabolitos evaluados en el silaje 2

Días de

fermentación

Ácido Láctico

(%)

Ácido acético

(%)

Ácido propiónico

(%)

Ácido butírico

(%)

1 ND 1,66 ± 0,01 ND ND

3 ND 1,11 ± 0,09 ND ND

7 ND 1,21 ± 0,03 ND ND

21 ND 0,92 ± 0,05 ND ND

En las evaluaciones previas desarrolladas en los silos fue sorprendente no encontrar

concentraciones de ácido láctico por lo tanto se repitieron todas las cinéticas,

53

presentándose la misma tendencia inicial, situación que se presenta en el anexo 5

hasta el anexo 14, los cuales evidencian la presencia de etanol con concentraciones de

1, 779%(silo 1 día 21 ) a 1,791% (silo 2 día 21), valores inferiores a los reportados en

ensilaje de caña de azúcar sin inoculante (61,4%), ensilaje de caña de azúcar con

inoculante experiemental (21,1%) y ensilaje de cañade azúcar con inoculante

comercial (28,5%) (Da Silva et al., 2012).

Los contenidos de etanol presentes en los silajes 1 y 2 indican la presencia de

bacterias acidolácticas heterofermentativas las cuales por la vía del ácido-6-

fosfoglucónico producen este tipo de compuestos químicos

En el silaje 1 y el silaje 2, se evidenció que el metabolito de mayor producción

corresponde al ácido acético, siendo ésta una situación muy favorable para el proceso

de ensilaje debido a a que éste metabolito inhibe el crecimiento de mohos y

levaduras.

En el silaje 1 la producción de ácido acético se presentó en un rango de 0,69% a

1,17%, éste metabolito no presentó ninguna correlación con los microorganismos

asociados al proceso (Figura 9).

Figura 9. Matriz de correlación del ácido acético con los microorganismos asociados

al proceso de ensilaje 1

En el silaje 2 la producción de ácido acético se presentó en un rango de 0,92% a

1,66%, éste metabolito se correlaciona con las bacterias acidolácticas, lo cual indica

que las bacterias acidolácticas en el silaje 2 son heterofermentadoras y convierten

hexosas a pentosas por la vía 6-fosfogluconato-fosfocetolasa.(

Figura 10).

54

Figura 10. Matriz de correlación del ácido acético con los microorganismos asociados

al proceso de ensilaje 2

5.5. Caracterización Organoléptica

La valoración organoléptica (olor, color y textura) de los silajes se hace de acuerdo al

tipo de fermentación efectuada o al estado del producto en cuanto a su aspecto físico

(Tabla 11).

Tabla 11. Criterios para la valoración organoléptica de los ensilajes

(Gallardo, 2003).

Parámetro

organoléptico

Fermentación

láctica Calentado

Fermentación

butírica

Fermentación

pútrida Mohoso

Color Amarillo –

verdoso Marrón

Verde oscuro a

pardo

Verde oscuro

a negro

Manchas

blancas

Olor Agradable –

picante

Caramelo

atabacado

Desagradable no

picante Repulsivo

Rancio no

picante

Textura Firme

compacto Floja Blando viscoso

Blando

gelatinoso

Floja

gelatinosa

pH 3,5 – 4 Variable > 4,5 > 5 > 5

Aceptabilidad Buena Buena Muy baja Rechazo Rechazo

Valor

nutritivo Alto Bajo Regular

Muy bajo,

tóxico

Muy bajo,

tóxico

Dependiendo de estas condiciones se establece una escala de 1 a 5, siendo 1 una

calificación muy mala y 5 una calificación excelente en cuanto a la aceptabilidad del

silaje (Tabla 12).

Tabla 12. Escala de valores para calificar la calidad organoléptica del ensilaje

55

Valor Calidad del ensilaje

1 Muy malo

2 Malo

3 Regular

4 Bueno

5 Excelente

En esta investigación los resultados obtenidos respecto al color, el silaje 1 presentó

una calificación excelente (tonalidad amarillo claro) con una valoración de 5 (

Figura 11). El silaje 2 obtuvo una calificación excelente (tonalidad amarillo oscuro)

con una valoración de 5 (

Figura 12), el tono oscuro es posible que se deba a la adición de melaza y gallinaza.

Los resultados obtenidos en la

Figura 11 y

Figura 12, muestran una buena calidad del silaje, no mostrando diferencias

significativas entre los tratamientos.

Figura 11. Evaluación organoléptica del silaje 1

1

2

3

4

5

Día 21

Día 14 Día 7

Día 3

Día 1

Color Olor Textura

1

2

3

4

5

Día 21

Día 14 Día 7

Día 3

Día1

Color Olor Textura

56

Figura 12. Evaluación organoléptica del silaje 2

El olor, en el silaje 1 presenta una cualificación buena (calificación 4), presentando

un olor azucarado agradable característico del bagazo, sin embargo no fue excelente

debido a que había un ligero olor a vino. El silaje 2 presentó una cualificación

excelente (calificación 5) con un olor agradable (miel azucarado).

La textura, en los dos silajes 1 y 2, fue excelente (calificación 5) debido a que

conservan sus contornos continuos firmes y compactos.

En ninguno de los tratamientos se observó degradación del material ensilado o

putrefacción de este. Lo que indica que el reactor construido y el almacenamiento

poseen un buen nivel de conservación para ambos tratamientos. De acuerdo a lo

anterior, se puede ver (

Figura 12) que la adición de melaza y gallinaza, mejoró las características

organolépticas del ensilaje en el olor. Sin embargo, esto no indica que haya una

relación entre los aditivos y las carateristicas organolépticas.

57

La excelente calidad del ensilaje, de acuerdo a las características organolépticas,

puede ser debido a un aporte de carbohidratos solubles y materia seca por parte del

bagazo como materia prima. Estos carbohidratos solubles pudieron deberse a la

presencia de microorganismos celulolíticos. El color excelente del ensilaje en el silaje

2 donde se utilizó como aditivos la melaza-gallinaza, puede ser atribuido a la mayor

concentración de carbohidratos solubles provenientes de la melaza, que permitió una

mayor ensilabilidad y conservación del ensilaje. Tal y como se describe en el ensilaje

de alfalfa y yuca, que posiblemente en el tratamiento donde se adicionó yuca, los

carbohidratos solubles de la yuca permitieron mayor ensilabilidad (Maza et al., 2011).

En la evaluación organoléptica de los diferentes tratamientos se presentaron

características excelentes dentro de los parámetros de calidad en las características de

color, olor y textura.

5.6 Caracterización Fisicoquímica

En la Tabla 13 se establece la composición fisicoquímica de los silajes 1 y 2 de

ensilajes de bagazo de caña de azúcar después de 21 días de fermentación.

Tabla 13. Composición fisicoquímica de los silajes 1 y 2 después de 21 días de fermentación

Silos Humedad MS pH FDN FDA

Silaje 1 71,10 ± 1,36 28,88 ± 1,36 3,59 ± 0,06 68,54 ± 0,03 37,8 ± 0,02

Silaje 2 82,10 ± 3,59 17,86 ± 3,59 3,80 ± 0,08 67,24 ±0,03 38,27 ± 0,02

El contenido de humedad (Tabla 13), muestra que no hay diferencias significativas

entre los silajes 1 y 2 después de 21 días de fermentación. A pesar de no haber

diferencias significativas, la humedad que se presenta en silage 2 puede estar

58

relacionada con el aporte de la mezcla con aditivos (melaza + gallinaza.). Una

humedad mayor a 70% es considerada un problema debido a los efluentes o

lixiviados que se puedan presentar durante la fermentación. Soto et al. 2002 reportó

que estos efluentes producidos son responsables de la pérdida de nutrientes altamente

digestibles, además los ensilajes muy húmedos son indeseables desde el punto de

vista nutricional, porque el consumo de materia seca suele ser bajo (Uriarte, 2004). El

contenido de humedad óptimo en el ensilaje de forrajes debe estar entre 60 - 70%

según Bertoia, (2004). En un estudio realizado en ensilajes de contenido ruminal con

harina de sorgo, se registraron valores de humedad entre 37,08 – 43 % (Trillos et al.,

2007). Para el silaje 2 la humedad fue mayor del 70 %, debido al tipo de microsilo

(Anexo 1) utilizado no hubo pérdida por efluentes, lo que provocó una retención de

humedad, que al momento de abrir los silos y mezclar, todo el material se

homogenizó, presentado un olor y aspecto adecuados al día 21.

El mayor valor de MS (Tabla 13) se observa en el silaje 1 después de 21 días de

fermentación. En el silaje 2 con la adición de la mezcla de melaza y gallinaza el

contenido de MS fue inferior (P < 0,05), presentándose diferencias significativas

entre los tratamientos. El contenido de materia seca del silaje 1 > silaje 2, esto pudo

deberse a que el silaje 2 presentó mayor contenido y desarrollo de las poblaciones de

microorganismos, probablemente beneficiados por los aditivos que contenia,

influyendo en la disminución de la MS. El contenido de MS es inferior al 35% en

ambos tratamientos, lo que indica buena calidad del material ensilado, parámetro

establecido como adecuado en ensilajes tropicales cuando no hay producción de

efluentes (Clavero y Razz, 2008). La MS ha sido reportada en ensilajes de maíz con

valores del 15,71% ± 0,11 (Cubero et al. 2010) y para caña de azúcar sin aditivo

53,08% y con aditivo 52,23% (Aguirre et al 2010).

Los valores bajos de pH, para el silaje 1 3.59 y 3.80 para el silaje 2, evitaron el

crecimiento de microorganismos indeseables. En relación al olor y textura, no se

apreciaron olores desagradables ni degradación del material, quizás por el mismo

efecto de los valores de pH bajos.

59

0 5 10 15 20 25

3800

3900

4000

4100

4200

4300

4400

4500

PC (kcal/kg) FDN (%) FDA (%)

t (d)

Kca

l/K

g

20

30

40

50

60

70

%

5.6.1 Fibra detergente ácida (FDA), Fibra detergente Neutra (FDN) y Poder

Calorifico.

Figura 13. Contenido de FDN, FDA y Poder calorífico del silaje 1

Las figuras 13 y 14 muestran la relación entre la FDN, la FDA y el poder calorífico,

encontrándose que para el silaje 1 la FDN y la FDA son constantes durante todo el

proceso de fermentación, sin embargo, para el poder calorífico fluctúa en los

primeros días, luego tiende a aumentar a partir del día 14; mientras que para el silaje

2 este es constante y cae para el día 21 (figura 14). El bagazo de caña de azúcar posee

un poder calorífico superior alto dentro de la clasificación que se le da como biomasa.

El bagazo se compone principalmente de celulosa 50%, hemicelulosa 30% y lignina

20%. Van Soest (1991) describe que la FDN mide la fibra insoluble en los alimentos

e incluye la celulosa, hemicelulosa y lignina como parte de la matriz de la pared

celular. El medir esta fracción permite identificar los carbohidratos de lenta

degradación en el rumen. Los alimentos cuando presentan una alta proporción de

FDN llenan rapidamente el rumen y por tanto limitan el consumo de alimento. La

celulosa y hemicelulosa de los forrajes son completamente digestibles, pero la lignina

60

es casi indigerible y su presencia puede inhibir total o parcialmente la digestión de los

otros constituyentes orgánicos (Bertoia, 2004). Arreaza et al., (2004) identifican

valores promedios de FDN para los principales forrajes utilizados en la alimentación

de rumiantes en Colombia: 52 % pasto kikuyo, 53 % Brachiaria decumbens y 69%

Colosuana; para granos ha sido reportado 73.39% (Rivas et al., 2006). El bagazo de

caña de azucar presentó valores similares a los pastos, para el día 1 en el presente

trabajo tiene un 65,86% silaje 1 y el silaje 2, 59,43%. Un bajo contenido de FDN

puede garantizar un buen ensilaje, de acuerdo a Chalupa et al. (1996).

Los valores de FDA generalmente están correlacionados con la digestibilidad de los

forrajes y de los alimentos utilizados como suplementos en rumiantes, en donde a

mayor contenido de FDA regularmente son recursos alimenticios de menor

digestibilidad (Van Soest, 1994). La fibra detergente ácida (FDA) incluye celulosa y

lignina, esta última es casi indigerible y su presencia puede inhibir total o

parcialmente la digestión de los otros constituyentes orgánicos (Bertoia, 2004). Entre

algunos de los datos reportados se encuentra Archila, 1989 que obtuvo 46.01% de

FDA y Rivas et al. (2006) con 43.63% para granos. En otros estudios realizados se

han reportado valores de 25.8%, 32%, 27% y 30.3% FDA para maíz en clima frío y

valores de 35.4% y 32.9% para maíz en clima cálido, ambos realizados en Colombia

(Blaser, 1986; Laredo y Kleermann, 1990; Díaz, 1986; Knowlton et al., 1993 y

Staples et al., 1993). Los valores obtenidos de FDA en este estudio son similares al

del maíz.

La FDA se correlaciona negativamente con la disponibilidad de energía del forraje

(Di Nucci et al., 2004), por lo que puede decir que bajos valores de FDA aumentan la

digestibilidad del alimento y la energía que contenía. Los residuos agroindustriales

son en general materiales de naturaleza fibrosa, aparentemente con alta concentración

de fibra en detergente neutra FDN, los cuales podrían ser utilizadas en la

alimentación de rumiantes, tales como vacas lecheras y animales de engorde,

reconociendo la capacidad de estos animales para transformar alimentos con altos

niveles de fibra; generando la integración de dos actividades agropecuarias en la

búsqueda de mayor eficiencia para los dos modelos de producción. Desde el punto de

61

0 5 10 15 20 25

2700

3000

3300

3600

3900

4200

PC (kcal/kg) FDN (%) FDA (%)

t (d)

kca

l/kg

30

40

50

60

70

%

vista de la producción animal, los rumiantes en el mundo tienen una gran importancia

debido a su habilidad para utilizar alimentos fibrosos y transformarlos en leche,

carne, lana y otras fibras y en algunas ocasiones generar trabajo como fuerza para

labores agrícolas o pecuarias (Van Soest, 1994).

Figura 14. Contenido de FDN, FDA y Poder calorífico del silaje 2

Por otro lado, el poder calorífico nos indica el potencial de energía bruta de la

biomasa; Energía bruta (EB) energía que contienen los componentes orgánicos del

alimento y que se libera a través de su oxidación (combustión). Se mide en una

bomba calorimétrica y se expresa normalmente en calorías o en julios. Se puede

correlacionar con la energía que puede contener la biomasa y el potencial nutritivo de

los productos evaluados. Los mejores niveles enérgeticos se presentan en el silaje 1,

en especial durante los días de fermentación 3 (4.351) y 21 (4.407) Kcal/Kg; 3721

para el día 1 y 2.955 para el día 21 Kcal/Kg; es probable que la disminución del poder

calorífico en el silaje 2 se deba al aumento de BAL en el día 21, además de comenzar

agotarse la melaza como fuente de corbohidratos. En pajas la melaza se adiciona

como saborizante en niveles del 5 al 15% y estos valores pueden incrementarse a

50% para aumentar el contenido energético de la dieta. Se ha descrito que los

sistemas de engorda de ganado a base de melaza soportan niveles de ganancia,

62

comparables a las dietas básicas con granos (Preston et al., 1967Li et al. (2014). Los

forrajes de alta calidad (0,8 kg de MS por 100 kg de peso vivo) y la suplementación

con una fuente de proteína, son muy importantes en la calidad del silaje (Preston y

Leng, 1987).

5.7. Rendimiento del proceso de ensilaje

Los balances de materia se basan en la ley de la conservación de la masa, que indica

que la masa de un sistema cerrado permanece constante, sin importar los procesos

que ocurran dentro del sistema. El balance de materia para el ensilaje de bagazo de

caña de azúcar sin aditivos y con aditivos, se realizó en varias etapas de acuerdo a los

días de fermentación del proceso (día 1 - 21). Haciendo balances en cada una de ellas

el resultado fue de 99,9 % de rendimiento para ambos silajes (Anexo 3 y 4). Lo que

muestra una gran eficiencia del proceso. Las pérdidas relacionadas con el proceso de

ensilaje debidas a la producción de CO2 son del 0,02 %. Lo que nos da una idea de la

alta eficiencia no solo del sistema si no además, de los silos o reactores.

6. CONCLUSIONES

El bagazo de caña como subproducto agroindustrial presenta un alto potencial como

recurso alimenticio, para alimentación de rumiantes, por su alto valor energético,

bajos contenidos de fibra detergente ácida, alta digestibilidad, bajo contenido de

cenizas y desarrollo de bacterias acidolácticas .

La melaza y la gallinaza como aditivos ejercen un efecto de conservación en el silaje.

La adición de gallinaza al ensilaje produce aumentos considerables del pH final del

producto, mientras que la melaza tiene un ligero efecto acidificante.

63

El contenido de carbohidratos hidrosolubles (fructosa, sacarosa y fructosanos)

presentes en la melaza favorecieron las condiciones de la fermentación del ensilaje,

bajo esta condición el pH disminuyó para llegar al estado de conservación.

La nula producción de ácido láctico y la mayor producción de ácido acético, etanol y

CO2 se debe al predominio de bacterias acidolácticas de tipo heterofermentativo en el

silaje de bagazo de caña de azúcar con aditivos y sin aditivos.

La adición de gallinaza evita la fermentación alcohólica, mientras que la melaza la

favorece.

Las BAL además de contribuir en la biopreservación de los alimentos, mejoran las

características sensoriales como el sabor,olor, textura y aumentan su calidad nutritiva.

En la evaluación organoléptica todos los ensilajes presentaron características buenas

y excelentes dentro de los parámetros de calidad en las características de color, olor y

textura.

Todos los ensilajes alcanzaron temperaturas alrededor de 22º C durante el proceso de

fermentación (21 días), temperatura ideal para que el proceso se lleve a cabo de una

manera adecuada y el material ensilado pueda conservar sus propiedades tanto

organolépticas como nutritivas.

El pH estuvo dentro de los niveles establecidos y permitidos como indicador de

buena calidad, el valor más bajo de pH registrado fue el ensilaje de bagazo de caña

del tratamiento que presentaba aditivos, gallinaza + melaza.

Los tratamientos de ensilaje presentaron contenidos de fibra detergente ácida (FDA)

inferiores al 39%, lo que indica un contenido óptimo para aumentar la digestibilidad

del alimento y la energía contenida.

64

En los dos tratamientos se evidenció una persistencia de bacterias acidolácticas en el

tiempo, relacionado con una disminución paulatina en el pH para los días evaluados,

lo que indica una buena calidad del ensilaje.

Los niveles de nitrógeno amoniacal presentados en los dos tratamientos son inferiores

al 10%, parámetro favorable que indica la ausencia de bacterias butíricas ambos

ensilajes. El ácido acético estuvo presente en todo el ensilaje indicador de media

calidad del ensilaje. Se observo una relación entre los metabolitos producidos y las

bacterias identificadas.

65

7. RECOMENDACIONES

Con el fin de comprender mejor aún los efectos de la melaza y la gallinaza sobre el

ensilaje de la caña de azúcar, se recomienda continuar este trabajo con pruebas de

consumo voluntario, digestibilidad y su valor como alimento para producir leche y

carne.

Evaluar el efecto de la inclusión a diferentes niveles de materias primas de alto

contenido de carbohidratos solubles y nitrógeno, para aumentar la calidad nutritiva

del ensilaje.

Desarrollar pruebas de palatabilidad en los bovinos para identificar el consumo y el

grado de aceptación de los silajes de bagazo de caña de azúcar con aditivos y sin

aditivos.

Estimar el uso de inoculantes para silajes de bagazo de caña de azúcar teniendo en

cuenta las cepas y las condiciones del ensilado que permitan mejorar el perfil

microbiológico, aumentar el contenido de catabolitos como el ácido láctico y reducir

la producción de etanol.

66

8. FUTURAS INVESTIGACIONES

Ante las escasas investigaciones realizadas y a la luz de los resultados obtenidos, se

precisa la necesidad de implementar en el futuro una serie de estudios relacionados

con:

1. Potenciar el reconocimiento de los microorganismos presentes en el silaje de

bagazo de caña de azúcar y avanzar en el conocimiento de las rutas

metabólicas de los microorganismos evaluados

2. Evaluar la eficiencia de los microorganismos en la producción de ácido

láctico, reducción del pH, supervivencia a condiciones extremas de acidez y

temperatura, así como el aumento en la digestibilidad de la MS del silaje, con

el fin de producir inóculos comerciales específicos para cada forraje,

buscando determinar las cepas que tengan mejor comportamiento dentro de

los silos en diferentes condiciones de campo

67

9. ANEXOS

Anexo 1. Diseño y fabricación de los silos con relación a los días de fermentación

Anexo 2. Hipótesis del problema con relación al efecto de los aditivos en la

producción de microorganismos

Factor Observaciones

Tiempo

Donde para el caso tenemos que:

: No existe efecto de los aditivos con relación al factor tiempo en la


: Existe efecto de los aditivos con relación al factor tiempo en la producción

de microorganismos

Tratamiento


: No existe efecto de los aditivos con relación al factor tratamiento en la


: Existe efecto de los aditivos con relación al factor tratamiento en la


Interacción

( ) ( )


: No existe efecto con relación a los aditivos para la interacción entre todos

los niveles de tiempo y tratamiento sobre la cantidad producida de microorganismos

: Existe efecto con relación a los aditivos para la interacción entre todos los

niveles de tiempo y tratamiento sobre la cantidad producida de microorganismos.

68

Anexo 3. Balance de materia de ensilaje de bagazo de caña de azúcar sin aditivos

Balance de materia en el día 1

= +

= = ( )

(

)

Balance de materia en el día 3 +

= = ( )

(

)

69


+

= = ( )

(

)


+ = = ( )

(

)


+

=

= ( )

(

)

70

Anexo 4. Balance de materia realizado durante la etapa de fermentación del

ensilaje de bagazo de caña de azúcar fresco con aditivos


+

=

= ( )

(

)


+

=

= ( )

71

(

)


+

=

= ( )

(

)


+

=

= ( )

(

)


+

=

= ( )

(

)

72

Anexo 5 Cromatograma de ácido láctico del silo 1 correspondiente al día 1

Anexo 6. Cromatograma de ácido láctico del silo 1 correspondiente al día 3


73




74



75



76

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