EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE … · de la Salud y al Laboratorio de Control...

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS OBTENIDOS

DE BAL AISLADAS DE QUESO DOBLE CREMA Y

QUESILLO SOBRE EL CRECIMIENTO IN-VITRO

DE Salmonella spp. Y Listeria monocytogenes

Mayra Alejandra Fuentes Vanegas

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias

Área Curricular de Ingeniería Agrícola y Alimentos

Medellín, Colombia

2016

http://www.agro.unalmed.edu.co/

http://www.agro.unalmed.edu.co/facultad.php?seccion=departamentos&depto=iagricola

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA DE EXTRACTOS OBTENIDOS

DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS AISLADAS DE

QUESO DOBLE CREMA Y QUESILLO SOBRE EL

CRECIMIENTO IN-VITRO DE Salmonella spp. Y

Listeria monocytogenes

Mayra Alejandra Fuentes Vanegas

Tesis presentada como requisito para optar al título de:

Magíster en Ciencia y Tecnología de Alimentos

Director:

JOSÉ URIEL SEPÚLVEDA VALENCIA M.Sc.

Codirectoras:

MÓNICA MARÍA DURANGO ZULETA M.Sc.

MARGARITA MARÍA GUTIÉRREZ BURITICÁ M.Sc.

Línea de Investigación:

Calidad de los Alimentos

Grupo de Investigación:

GICTA (Grupo de Investigación en Ciencia y Tecnología de Alimentos)

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias

Departamento de Ingeniería Agrícola y Alimentos

Medellín, Colombia

2016

http://www.agro.unalmed.edu.co/

http://www.agro.unalmed.edu.co/facultad.php?seccion=departamentos&depto=iagricola

NOTA DE ACEPTACIÓN

DIRECTOR

_________________________

Firma del director

JURADOS

_________________________

Firma de jurado

_________________________

Firma de jurado

DEDICATORIA

A Dios, por ser mi guía en este camino.

A mis padres Orlando e Imelda, quienes

hicieron todo en la vida para que yo pudiera

lograr mis sueños, por motivarme y darme la

mano cuando sentía que el camino se

terminaba; a ustedes por siempre, mi corazón

y mi agradecimiento.

A mi familia, hermana y amigos, quienes

siempre estuvieron listos para brindarme su

apoyo incondicional.

AGRADECIMIENTOS

A la Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia, en especial, a la Facultad de Ciencias

de la Salud y al Laboratorio de Control Calidad (LACMA).

A la Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, en especial al Laboratorio de Productos

Lácteos y a la Dirección de Investigaciones (DIME).

Al M.Sc. José Uriel Sepúlveda Valencia

“Director”

Por sus valiosos aportes y asesoría en el proyecto.

A las M.Sc. Mónica María Durango Zuleta y Margarita Gutiérrez Buriticá

“Codirectoras”

Quienes influyeron con sus lecciones y experiencias en la culminación de este proyecto.

VI

RESUMEN

En los últimos años, ha existido un enfoque particular, en la aplicación de compuestos

antimicrobianos producidos por Bacterias Ácido Lácticas (BAL), como conservantes

naturales, para controlar el crecimiento de microorganismos patógenos y deteriorantes de

los alimentos. Dentro de estos compuestos se encuentran péptidos antimicrobianos

llamados bacteriocinas, que pueden añadirse a los alimentos, en forma concentrada

(aditivos) o pueden ser producidos in situ, como cultivos iniciadores o protectores. El

objetivo de esta investigación fue evaluar la capacidad antimicrobiana de BAL autóctonas

aisladas de queso doble crema y quesillo, frente al crecimiento in vitro de Salmonella

entérica subsp. entérica serovar Typhimurium ATCC 13311 y Listeria

monocytogenes ATCC 7644. Se estudiaron 32 aislados identificados previamente,

mediante el análisis de secuencias del gen 16S DNAr y caracterizados tecnológicamente,

comprobando su capacidad antimicrobiana, a través de la técnica de la mancha en agar.

Posteriormente, se obtuvieron sobrenadantes libres de células, se neutralizaron y filtraron

para detectar su actividad antimicrobiana mediante el método de difusión en gel por

perforación en placa. Se seleccionaron los ocho (8) aislados que demostraron capacidad

inhibidora frente a los dos (2) microorganismos patógenos, los cuales fueron sometidos a

diferentes condiciones de pH (4.0, 7.0, 10.0); temperatura (60°C/15 min., 60°C/30 min.,

80°C/15 min. y 80°C/30 min.) y enzimas proteolíticas (proteinasa K). Las sustancias

antimicrobianas de los aislados identificados como Lactococcus lactis subsp. lactis (Q5),

Lactobacillus fermentum (Q6), Enterococcus lactis (Q7), Leuconostoc mesenteroides

subsp. mesenteroides (Q12) y Lactobacillus casei (QDC31) fueron concentradas y

cuantificadas y se determinó su peso molecular, a través de una Electroforesis en Gel de

Poliacrilamida (SDS- PAGE). El sobrenadante libre de células del aislado identificado

como Lactococcus lactis subsp. lactis (Q5) presentó una actividad superior, equivalente a

64.000 UA/mL para L. monocytogenes y 4.000 UA/mL para S. typhimurium y su sustancia

antimicrobiana concentrada presentó una banda con un peso molecular < 3.5 KDa. Los

ocho (8) sobrenadantes libres de células exhibieron actividad antimicrobiana cuando

fueron tratados a un pH de 7 y presentaron sensibilidad a la enzima proteolítica utilizada,

al igual que a la mayoría de los tratamientos térmicos evaluados. El extracto de

Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides presentó la mayor concentración de

proteína total y las mayores Unidades de Actividad, para los dos patógenos evaluados. Se

sugiere que las BAL provenientes de quesos tradicionales colombianos tienen la capacidad

de producir sustancias antimicrobianas, con potencial bactericida y pueden ser utilizadas

en la formulación de un cultivo iniciador, con efecto bioprotector.

Palabras clave: bacteriocina, biopreservación, bacterias ácido-lácticas,

antimicrobianos naturales.

VII

ABSTRACT

In recent years, there has been a particular focus on the application of antimicrobial

compounds produced by lactic acid bacteria (LAB) as natural preservatives to control the

growth of pathogenic and / or spoilage microorganisms in food. Within these compounds

are antimicrobial peptides called bacteriocins may be added to foods in concentrated forms

(additives) or may be produced in situ as starter cultures or protectors. The objective was

to evaluate the antimicrobial capacity of native BAL isolated from Double Cream Cheese

and Quesillo against the in vitro growth of Salmonella enterica subsp. enterica

serovar Typhimurium ATCC 13311 and Listeria monocytogenes ATCC 7644. We studied

32 isolates, previously identified by analysis of 16S rDNA gene sequences and

characterized technologically. We tested antimicrobial capacity using an agar spot test.

Subsequently, cell-free supernatants were neutralized and filtered to detect their

antimicrobial activity using the gel diffusion method by drilling plate. We selected 8

isolates showing inhibitory capacity against the two pathogens microorganisms, which

were subjected to different conditions of pH (4.0, 7.0, 10.0); temperature (60 ° C/15 min,

60 ° C/30 min, 80 ° C/15 min and 80 ° C/30 min) and proteolytic enzymes (Proteinase

K). The antimicrobial substance identified as Lactococcus lactis subsp. lactis (Q5),

Lactobacillus fermentum (Q6), Enterococcus lactis (Q7), Leuconostoc mesenteroides

subsp. mesenteroides (Q12) and Lactobacillus casei (QDC31) was concentrated and

quantified and its molecular weight was determined through a Polyacrylamide Gel

Electrophoresis (SDS-PAGE). The cell-free supernatant isolated identified as Lactococcus

lactis subsp lactis (Q5) presented higher activity, equivalent to 64.000 AU/ml for L.

monocytogenes and 4,000 AU / ml for S. typhimurium. All cell-free supernatants showed

antimicrobial activity when treated at pH 7 and showed sensitivity to proteolytic enzyme,

like most of the heat treatments evaluated. The extract Leuconostoc

mesenteroides subsp mesenteroides (Q12) had the highest concentration of total protein

and higher activity units for both pathogens. Isolated identified as Lactococccus

lactis subsp. lactis showed a band with a lower molecular weight of <3.5 KDa (Q5). It is

suggested that BAL from traditional cheeses Colombian has the ability to produce

antimicrobial substances with bactericidal potential and can be used in formulating a

starter culture with bioprotective effect.

Keywords: bacteriocin, biopreservation, lactic acid bacteria, natural antimicrobials.

VIII

CONTENIDO

pág.

RESUMEN.........................................................................................................................VI

ABSTRACT......................................................................................................................VII

LISTA DE FIGURAS…................................................................................................XIII

LISTA DE TABLAS…..................................................................................................XV

LISTA DE SÍMBOLOS Y BREVIATURAS...............................................................XVI

INTRODUCCIÓN.......................................................................................................XVIII

OBJETIVOS…..................................................................................................................20

1.CAPÍTULO 1: MARCO TEÓRICO............................................................................21

1.1 QUESO DOBLE CREMA Y QUESILLO ........................................................... 21

1.2 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS ..................................................................... 22

1.2.1 Características generales...................................................................................... 22

1.2.2 Metabolismo de los carbohidratos de BAL ......................................................... 23

1.2.3 Clasificación y géneros representativos de BAL ................................................. 24

1.2.3.1 Lactococcus .................................................................................................. 25

1.2.3.2 Streptococcus ............................................................................................... 25

1.2.3.3 Leuconostoc. ................................................................................................ 26

1.2.3.4 Oenococcus .................................................................................................. 26

1.2.3.5 Pediococcus.................................................................................................. 26

1.2.3.6 Tetragenococcus .......................................................................................... 27

1.2.3.7 Lactobacillus ................................................................................................ 27

1.2.4 Importancia tecnológica de las BAL ................................................................... 27

1.2.4.1 Cultivos iniciadores ...................................................................................... 28

1. 3 BACTERIOCINAS ............................................................................ …………….29

1.3.1 Generalidades ...................................................................................................... 29

1.3.2 Clasificación. ....................................................................................................... 30

1.3.2.1 Clase I: lantibióticos ..................................................................................... 30

1.3.2.2 Clase II: no lantibióticos .............................................................................. 30

1.3.2.3 Clase III: bacteriocinas ................................................................................. 31

1.3.3 Modo de acción ................................................................................................... 33

1.3.4 Secreción y mecanismo de autoprotección .......................................................... 34

1.3.5 Bacteriocinas representativas .............................................................................. 35

IX

1.3.5.1 Nisina. .......................................................................................................... 35

1.3.5.2 Pediocina PA-1. ........................................................................................... 36

1.3.5.3 Plantaricinas EF y JK ................................................................................... 36

1.3.6 Purificación .......................................................................................................... 37

1.3.7 Aplicaciones de bacteriocinas en la industria alimentaria ................................... 38

1.4 MICROORGANISMOS PATÓGENOS DE IMPORTANCIA EN LA INDUSTRIA

ALIMENTARIA ............................................................................................................ 39

1.4.1 Listeria monocytogenes. ..................................................................................... .40

1.4.1.1 Desarrollo de resistencia de las bacterias Gram positivas a las bacteriocinas41

1.4.2 Salmonella spp ..................................................................................................... 42

1.4.2.1 Desarrollo de resistencia de las bacterias Gram negativas a las

bacteriocinas.............................................................................................................42

BIBLIOGRAFÍA…...........................................................................................................43

2 CAPITULO 2…..............................................................................................................49

2.1 CAPACIDAD ANTIMICROBIANA DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS

AISLADAS DE QUESO DOBLE CREMA Y QUESILLO

COLOMBIANO..............................................................................................................49

2.1.1 Resumen .............................................................................................................. 49

2.1.2 Introducción ......................................................................................................... 51

2.1.3 Método ................................................................................................................. 52

2.1.3.1 Aislados bacterianos y condiciones de cultivo............................................. 52

2.1.3.2 Tamizaje para la detección de la capacidad antimicrobiana ........................ 52

2.1.3.3 Obtención de extractos libres de células ...................................................... 53

2.1.3.4 Capacidad antimicrobiana de los extractos libres de células ....................... 53

2.1.3.5 Análisis estadístico ....................................................................................... 53

2.1.4 Resultados ............................................................................................................ 53

2.1.4.1 Tamizaje para la detección de la capacidad antimicrobiana ........................ 53

2.1.4.2 Capacidad antimicrobiana de los sobrenadantes libres de células ............... 56

2.1.5 Conclusiones ........................................................................................................ 58

2.1.6 Referencias .......................................................................................................... 58

2.2 INSTRUCCIONES DE AUTOR REVISTA DE BIOTECNOLOGÍA EN EL

SECTOR AGROPECUERIO Y AGROINDUSTRIAL ................................................ 62

2.2.1 Políticas editoriales .............................................................................................. 62

2.2.1.1 Compromiso de tipo formal ......................................................................... 62

2.2.1.2 Compromiso de tipo ético ............................................................................ 62

2.2.1.3 Derechos de autor ......................................................................................... 62

2.2.2 Tipos de artículos ................................................................................................ 62

2.2.2.1 Artículos de investigación científica ............................................................ 62

2.2.2.2 Artículos de reporte de caso ......................................................................... 63

2.2.2.3 Artículos de reflexión ................................................................................... 63

2.2.2.4 Artículo de revisión (Review) ...................................................................... 63

2.2.2.5 Artículo corto ............................................................................................... 63

2.2.2.6 Cartas al editor ............................................................................................. 63

X

2.2.2.7 Editorial ........................................................................................................ 63

2.2.3 Forma y preparación de manuscritos ................................................................... 64

2.2.3.1 Extensión y formato ..................................................................................... 64

2.2.3.2 Título del manuscrito ................................................................................... 65

2.2.3.3 Información del autor (es) ............................................................................ 65

2.2.3.4 Resumen ....................................................................................................... 65

2.2.3.5 Palabras Clave .............................................................................................. 65

2.2.3.6 Cuadros y figuras ......................................................................................... 66

2.2.3.7 Títulos .......................................................................................................... 66

2.2.3.8 Expresiones matemáticas ............................................................................. 66

2.2.3.9 Conclusiones ................................................................................................ 66

2.2.3.10 Agradecimientos ........................................................................................ 66

2.2.3.11 Referencias ................................................................................................. 67

2.2.4 Estructura para las referencias ............................................................................. 67

2.2.4.1 Artículo de revista ........................................................................................ 67

2.2.4.2 Libro ............................................................................................................. 67

2.2.4.3 Capítulo de libro ........................................................................................... 67

2.2.4.4 Memoria de evento ....................................................................................... 67

2.2.4.5 Normas técnicas ........................................................................................... 67

2.2.4.6 Reporte de un organismo o Gobierno .......................................................... 67

2.2.4.7 Tesis ............................................................................................................. 68

2.2.4.8 Patentes ........................................................................................................ 68

2.2.4.9 Monografías electrónicas ............................................................................. 68

2.2.4.10 Otras referencias electrónicas .................................................................... 68

3 CAPÍTULO 3…..............................................................................................................69

3.1 CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE SUSTANCIAS INHIBIDORAS

PRODUCIDAS POR BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS AUTÓCTONAS AISLADAS

DE QUESO DOBLE CREMA Y QUESILLO .............................................................. 69

3.1.1 Resumen.............................................................................................................. 69

3.1.2 Introducción ........................................................................................................ 71

3.1.3 Materiales y métodos .......................................................................................... 73

3.1.3.1 Aislados bacterianos y condiciones de cultivo............................................. 73

3.1.3.2 Tamizaje de BAL para determinar su potencial inhibitorio ........................ 73

3.1.3.3 Obtención del sobrenadante libre de células ............................................... 74

3.1.3.4 Caracterización de la sustancia inhibidora .................................................. 74

3.1.3.4.1 Efecto del pH ......................................................................................... 74

3.1.3.4.2 Efecto de la temperatura ........................................................................ 75

3.1.3.4.3 Efecto de enzimas proteolíticas ............................................................. 75

3.1.3.5 Concentración de la sustancia inhibidora .................................................... 75

3.1.3.6 Cuantificación de proteínas totales ............................................................. 76

3.1.3.7 Electroforesis de proteínas SDS-PAGE ...................................................... 76

3.1.3.8 Análisis estadístico ...................................................................................... 77

3.1.4 Resultados ........................................................................................................... 77

XI

3.1.4.1 Tamizaje de BAL para determinar su potencial inhibitorio ......................... 77

3.1.4.2 Obtención del sobrenadante libre de células ............................................... 78

3.1.4.3 Caracterización de la sustancia inhibidora .................................................. 79

3.1.4.3.1 Efecto del pH ......................................................................................... 79

3.1.4.3.2 Efecto de la temperatura ........................................................................ 81

3.1.4.3.3 Efecto de enzimas proteolíticas ............................................................. 83

3.1.4.4 Concentración de la sustancia inhibidora .................................................... 83

3.1.4.5 Cuantificación de proteínas totales ............................................................. 83

3.1.4.6 Electroforesis de proteínas SDS-PAGE ...................................................... 84

3.1.5 Discusión ............................................................................................................ 85

3.1.6 Responsabilidades éticas..................................................................................... 91

3.1.6.1 Protección de personas y animales ............................................................... 91

3.1.6.2 Confidencialidad de los datos ..................................................................... 91

3.1.6.3 Derecho a la privacidad y consentimiento informado................................. 91

3.1.6.4 Conflicto de intereses .................................................................................. 91

3.1.7 Bibliografía ......................................................................................................... 92

3.2 INSTRUCCIONES DE AUTOR REVISTA ARGENTINA DE

MICROBIOLOGÍA ..................................................................................................... 101

3.2.1 Requisitos Generales ......................................................................................... 101

3.2.1.1 Política Editorial......................................................................................... 101

3.2.1.1.1 Autoría .............................................................................................. 101

3.2.1.1.2 Conflictos de intereses ...................................................................... 101

3.2.1.1.3 Responsabilidades éticas .................................................................. 101

3.2.1.1.4 Consentimiento informado ............................................................... 102

3.2.1.2 Copyright ................................................................................................... 102

3.2.2 Representación de los originales ....................................................................... 102

3.2.3 Organización y formato ..................................................................................... 103

3.2.3.1 Artículos originales .................................................................................... 103

3.2.3.2 Informes breves .......................................................................................... 103

3.2.3.3 Artículos especiales .................................................................................... 104

3.2.3.4 Imágenes microbiológicas .......................................................................... 104

3.2.3.5 Cartas al Editor ........................................................................................... 104

3.2.3.6 Editoriales .................................................................................................. 104

3.2.3.7 Suplementos ............................................................................................... 105

3.2.4 Elaboración de los manuscritos ......................................................................... 105

3.2.4.1 Carátula ...................................................................................................... 106

3.2.4 2 Agradecimientos ........................................................................................ 106

3.2.4 3 Resúmenes ................................................................................................. 106

3.2.4 4 Introducción ............................................................................................... 106

3.2.4 5 Materiales y Métodos ................................................................................. 107

3.2.4 6 Resultados .................................................................................................. 107

3.2.4 7 Discusión .................................................................................................... 107

3.2.4 8 Bibliografía ................................................................................................ 107

3.2.4 8.1 Publicaciones periódicas ................................................................... 108

3.2.4 8.2 Capítulos de libros/módulos ............................................................. 108

3.2.4 8.3 Presentaciones en congresos u otros eventos científicos .................. 108

XII

3.2.4 8.4 Presentaciones en congresos u otros eventos científicos reproducidas

dentro de un suplemento publicado por una revista de publicación periódica 108

3.2.4 8.5 Institucionales ................................................................................... 108

3.2.4 8.6 Tesis .................................................................................................. 108

3.2.4 9 Tablas ......................................................................................................... 109

3.2.4 10 Figuras ...................................................................................................... 109

3.2.4 11 Siglas ........................................................................................................ 109

CONCLUSIONES….......................................................................................................110

RECOMENDACIONES….............................................................................................112

ANEXOS...........................................................................................................................113

XIII

LISTA DE FIGURAS

Capítulo 1. pág.

Figura 1-1. Mecanismo de acción dual de la nisina producida por Lactococcus lactis. .. 344

Figura 1-2. Estructura molecular de la nisina. ................................................................. 366

Figura 1-3. Aplicaciones de BAL en la Agro-industria y la biotecnología. ...................... 39

Capítulo 2. Pág.

Figura 2-1. Capacidad antimicrobiana de sobrenadantes de BAL en UA/mL contra L.

monocytogenes y S. typhimurium. ...................................................................................... 56

Figura 2-2. Método de difusión en gel por perforación en placa; a) L. fermentum (QDC31)

frente a L. monocytogenes; b) L. fermentum (QDC31) frente S. typhimurium. ................. 57

Capítulo 3. Pág.

Figura 3-1. (A) SDS-PAGE de las sustancias inhibidoras de los aislados de BAL (B) Gel

superpuesto con Listeria monocytogenes ATCC® 7644 como cepa indicadora que

muestra las zonas de inhibición .......................................................................................... 85

Anexos. Pág.

Figura 1. Promedios de zonas de inhibición de cada aislado de BAL a un pH 7 frente a

Listeria monocytogenes .................................................................................................... 113

Figura 2. Promedios de zonas de inhibición de cada aislado de BAL a una Temperatura

(60°C x 15min) frente a Listeria monocytogenes. ............................................................ 114

XIV

Figura 3. Promedios de zonas de inhibición de cada aislado de BAL a pH 7 frente a

Salmonella typhimurium. .................................................................................................. 115

Figura 4. Promedios de zonas de inhibición de cada aislado de BAL a una Temperatura

(60°C x 15min) frente a Salmonella typhimurium. ........................................................... 116

XV

LISTA DE TABLAS

Capítulo 1. pág.

Tabla 1-1. Clasificación de las BAL, según tipo de células y fermentación. .................. 244

Tabla 1-2. Clasificación de los cultivos iniciadores. ......................................................... 28

Tabla 1-3. Bacteriocinas producidas por bacterias ácido-lácticas y microorganismos

sensibles. ............................................................................................................................. 31

Capítulo 2. pág.

Tabla 2-1. Actividad antimicrobiana de bacterias ácido-lácticas, utilizando el método de la

mancha en agar ................................................................................................................... 54

Capítulo 3. pág.

Tabla 3-1. Actividad antimicrobiana de bacterias ácido- lácticas, utilizando el método de

la mancha en agar y el método de difusión en gel, por perforación en placa ..................... 78

Tabla 3-2. Efecto del pH en los sobrenadantes libres de células. ...................................... 80

Tabla 3-3. Efecto de la temperatura en la actividad del sobrenadante libre de células ..... 82

Tabla 3-4. Cuantificación de proteínas en los extractos concentrados de los aislados de

bacterias ácido lácticas ........................................................................................................ 83

XVI

LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS

ATCC

Anova

BAL

°C

cm

CO2

CV

DS

FDA

g

H2O2

kDa

L

mg

min

ml

Colección Americana de Cultivos Puros

Análisis de Varianza

Bacterias Ácido-Lácticas

Grados Celsius

Centímetro

Dióxido de Carbono

Coeficiente de Variación

Desviación Estándar

Agencia de Alimentos y Medicamentos

Gramos

Peróxido de Hidrógeno

Kilodalton

Litros

Miligramos

Minutos

Mililitro

XVII

MRS

S

Medio Man- Rogosa- Sharpe

Segundo

µl

UFC

Microlitro

Unidad Formadora de Colonia

XVIII

INTRODUCCIÓN

Las actuales tendencias en el consumo de alimentos, ha llevado a descubrir diferentes

métodos de conservación, tanto físicos, químicos y biológicos, que contribuyan en el

control de microorganismos patógenos. Algunos de estos métodos pueden generar cambios

indeseables en el producto final y causar riesgos adversos en la salud del consumidor; es

por ello, que la industria alimentaria demanda tecnologías alternativas naturales para la

conservación de los alimentos (Rodriguez, 2006).

La biopreservación es un método de conservación que busca extender la vida útil y la

seguridad de los alimentos, por medio del uso de una microbiota natural o controlada y de

sus productos antimicrobianos (García, Rodríguez, Rodríguez, & Martínez, 2010; Settanni

& Corsetti, 2008). En este contexto, las Bacterias Ácido-Lácticas poseen un potencial

importante, por ser bacterias seguras, que a menudo, predominan de forma natural en la

microbiota de muchos alimentos, como lácteos, cárnicos, pescados y vegetales, y pueden

actuar como potentes inhibidores/competidores de microorganismos contaminantes y/o

deteriorantes (González et al., 2007; Monroy-Dasta M.C., Castro-Barrera T., Fernández-

Perrino F.J., 2009Hwanhlem et al., 2011; Luo et al., 2011), utilizando las propiedades

antimicrobianas atribuidas a los productos finales de sus metabolitos, como ácidos

orgánicos, peróxido de hidrógeno, diacetilo, enzimas inhibidoras y bacteriocinas (Ponce,

Moreira, del Valle, & Roura, 2008; Ghanbari, Jami, Kneifel, & Domig, 2013). Las

bacteriocinas se definen como péptidos o complejos de proteínas, producidos por síntesis

ribosomal (Casaburi, Di Martino, Ferranti, Picariello, & Villani, 2016; Todorov et al.,

2010) que actúan generalmente, frente a bacterias Gram positivas y microorganismos

estrechamente relacionados entre sí (Todorov et al., 2010; Monroy-Dasta M.C., Castro-

Barrera T., Fernández-Perrino F.J., 2009; Sankar, Priyanka, & Reddy, 2012). Sin embargo,

XIX

se han reportado bacteriocinas con capacidad antimicrobiana, frente a bacterias Gram

negativas como Escherichia coli y Salmonella typhimurium.

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) (WHO, 2002), existen dos (2)

preocupaciones importantes para la industria alimentaria, como son la aparición de

nuevos agentes patógenos y no patógenos, asociados con el consumo de alimentos y la

capacidad de adaptación de los microorganismos, para cambiar los modos de producción,

conservación y envasado, dando lugar a nuevos peligros para la inocuidad alimentaria. Se

reporta que en los países industrializados, anualmente el 30% de la población sufre de

algún tipo de Enfermedad de Transmisión Alimentaria (ETA). Sólo en la Unión Europea,

se presentan 380000 casos cada año, ocasionados por patógenos como Salmonella sp.,

Campylobacter sp., Listeria monocytogenes y virus (García et al., 2010), los cuales están

asociados con el consumo de alimentos crudos o mal cocidos, como pollo, carne, mariscos,

productos lácteos, frutas y vegetales (Gutiérrez & Acosta, 2008). En nuestro país, los

principales microorganismos involucrados en ETA, son Staphylococcus aureus,

Salmonella sp. y Escherichia coli; y a pesar de la falta de reportes, debido a que no es de

notificación obligatoria, se sabe, que también, Listeria monocytogenes se halla con

frecuencia en maquinaria y superficies en la industria alimentaria, por su habilidad para

producir biopelículas (Vanegas, Martínez, & González, 2011).

En este sentido, la presente investigación tuvo como objetivo principal, evaluar la

capacidad antimicrobiana de extractos obtenidos de BAL aisladas de Queso Doble Crema

y Quesillo frente a Salmonella tiphymurium y Listeria monocytogenes. Cabe resaltar que la

propuesta es innovadora, en el contexto de la investigación de péptidos antimicrobianos

naturales, derivados de microbiota autóctona, de quesos tradicionales colombianos, que

puedan ser utilizados en la formulación de cultivos iniciadores, con efecto bioprotector

para la elaboración de productos lácteos fermentados tradicionales.

20

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos obtenidos de BAL aisladas, tipificadas y

caracterizadas a partir de Queso Doble Crema y Quesillo, sobre el crecimiento in vitro de

Salmonella spp. y Listeria monocytogenes.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtener extractos de 32 cepas de BAL productoras de sustancias antimicrobianas.

Determinar la capacidad antimicrobiana de los extractos de BAL, a través de

métodos in vitro, frente a dos (2) microorganismos indicadores; Salmonella

typhimurium y Listeria monocytogenes.

Caracterizar parcialmente las fracciones proteicas activas, mediante la

determinación del peso molecular.

Capítulo 1: Marco Teórico 21

1. CAPÍTULO 1: MARCO TEÓRICO

1.1 QUESO DOBLE CREMA Y QUESILLO

El Queso Doble Crema es un producto fresco, ácido, no madurado, de pasta semi-cocida e hilada,

de color blanco-crema, consistencia semiblanda y de sabor ligeramente ácido. Este queso es

producido de manera tradicional, en los Valles de Ubaté y Chiquinquirá, de donde se ha

difundido a muchas zonas de clima frío. En su proceso de elaboración se obtiene una leche ácida

(0,38%-0,41%), a través de la mezcla de leche fresca (0,15%-0,18%), leche acidificada (0,7%-

0,9%) y cuajo, para la obtención de una cuajada ácida, la cual es calentada hasta una temperatura

no mayor a 45°C, para continuar con el hilado, el moldeo y su posterior empaque, para la

distribución (Novoa & Lopez, 2008; Osorio, Novoa, & Gutierrez, 2012). Durante los procesos de

acidificación, que ocurren de manera natural, se desarrollan, entre otros, las bacterias ácido-

lácticas (BAL) nativas que favorecen la formación de sabores, aromas y texturas, propias del

producto final (Guarcello et al., 2016; Lazzi et al., 2016; Terzić-Vidojević et al., 2015; Bezerra et

al., 2016).

El Quesillo es un queso fresco, ácido, no madurado, elaborado con leche de vaca, categorizado

como de pasta semi-cocida e hilada, nombre que es dado a los quesos, donde el proceso de

elaboración incluye un amasado con agua caliente, dando como origen un queso de especial

plasticidad, en una cuajada de características muy ácidas (Durando, Sepúlveda, Gutiérrez, &

Londoño, 2012). Su contenido de humedad está entre el 41%-55% y tiene un porcentaje de grasa

que oscila entre el 26%-32%. Está ubicado dentro de los quesos semi-blandos; su superficie es

brillante, sin corteza o cáscara, y su color característico va del blanco crema, al ligeramente

amarillo (Ramírez-navas, Osorio-Londoño, & Rodríguez, 2010). Es producido de forma

tradicional, en la región del Tolima grande, Huila, en el valle de Alto Magdalena, Cesar, Cauca,

Cundinamarca, Risaralda y Quindío o en zonas con una humedad relativa de 75% a 79% y una

temperatura promedio de 24° a 29ºC. Su proceso de elaboración se basa en la utilización de suero


acidificado de manera natural, el cual, es cuidadosamente mezclado con leche fresca y cuajo, para

obtener una cuajada ácida, la cual es calentada a una temperatura entre 70°-80ºC, para luego,

proceder a realizar el proceso de hilado, donde se logra el estiramiento de la cuajada, con altas

características de plasticidad; para finalizar, se moldea y empaca para su distribución. Su

consumo puede ser fresco o ser utilizado como materia prima en la elaboración de productos de

panadería y pizzas (Jaramillo, Mejía, & Sepúlveda, 1995). Siendo el Quesillo un queso producido

de forma artesanal, cuenta con una gran diversidad microbiana, que le confiere unas

características especiales, donde las bacterias ácido-lácticas (BAL) juegan un papel decisivo en la

producción de acidez y el desarrollo de algunas de las propiedades físico-químicas, sensoriales y

de textura (Franciosi, Settanni, Cavazza, & Poznanski, 2009).

1.2 BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS

1.2.1 Características generales

Son un conjunto de bacterias Gram positivas, no esporuladas, no móviles, en forma de cocos o

bacilos, catalasa y oxidasa negativos, con un metabolismo estrictamente fermentativo,

produciendo ácido láctico, como producto principal o único de la fermentación de los azúcares,

por medio de la glucólisis vía Embden-Meyerhof (homofermentación) y, generando además,

etanol, acetato y dióxido de carbono por la vía colateral de las pentosas o del ácido-6-

fosfoglucónico (heterofermentación) (Madigan, Martinko, Dunlap, & Clark, 2009; Lahtinen,

Ouwehan, Salminen, & Wright, 2011). Estas bacterias son anaerobias-aerotolerantes y en

términos generales tienen complejas necesidades de factores de crecimiento, como Vitamina B,

aminoácidos, péptidos, bases púricas y pirimídicas. Son un grupo bacteriano heterogéneo que

comprende alrededor de 20 géneros de los cuales Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus,

Streptococcus, Leuconostoc, Weissella y Enterococcus, son los que tienen mayor incidencia en

alimentos (Françoise, 2010).

Las BAL pueden crecer a un amplio intervalo de temperaturas, aunque la mayoría se clasifican en

mesófilas o termófilas, con temperaturas de crecimiento entre 30°C y 42°C, respectivamente

(Morais, 2004). Toleran concentraciones relativamente altas de ácido y valores de pH más bajos

que el resto de las bacterias; algunas pueden crecer a pH 3-9, pero la mayoría crece a un pH entre


4 y 4,5, permitiéndoles eliminar la competencia de otras bacterias, en ambientes que son ricos en

nutrientes (Mora & García, 2007).

1.2.2 Metabolismo de los carbohidratos por Bacterias Ácido-Lácticas (BAL)

La fermentación es un proceso biológico en el cual, se producen uno o más moléculas de interés

por medio del metabolismo del microorganismo seleccionado. En la mayoría de los casos es un

proceso ligeramente exotérmico, por lo cual hay bajos gastos energéticos, en forma de calor. Se

ha usado ancestralmente, como un medio de conservación de alimentos, mejorando sus

propiedades microbiológicas, evitando su rápida descomposición o contaminación con agentes

patógenos (Aragón, 2015). La fermentación láctica es llevada a cabo por un amplio número de

especies; dentro de las cuáles encontramos los géneros Lactobacillus, Lactococcus,

Enterococcus, Carnobacterium Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,

Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella, los cuales metabolizan carbohidratos tales como

glucosa, fructosa, sacarosa, lactosa, almidón y maltosa, derivados de materias primas

alimenticias, sustratos con alta humedad y concentración de carbono de fácil digestión,

características que las hacen llamativas (Ghaffar et al., 2014).

Las BAL son microorganismos fermentadores obligados, que no pueden obtener la energía

mediante la oxidación o procesos respiratorios; es así, como las reacciones de fosforilación del

sustrato, que se producen durante las vías fermentativas son el principal medio a través del cual

obtienen ATP. Con base en los productos finales formados durante la fermentación de los

azúcares, las BAL pueden ser consideradas como homo o heterofermentativas (Hutkins, 2006;

Lahtinen et al., 2011; Holzapfel & Wood, 2014).

Las BAL homofermentativas son aquellas que metabolizan las hexosas, utilizando la ruta de

Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP). La aldosa es una de las enzimas claves en esta vía, la cual

compromete el azúcar por la división de la fructosa-1,6-difosfato, en los dos (2) fosfatos de

triosa, que eventualmente, sirven como sustratos para reacciones generadoras de ATP. En esta

vía se producen dos (2) moles de piruvato y dos (2) moles de ATP, por mol de glucosa. El

piruvato se reduce a L- o D-lactato, por la enzima lactato-deshidrogenasa. Más de 90% del

sustrato se convierte en ácido láctico (Lahtinen et al., 2011; Holzapfel & Wood, 2014). Las BAL

homofermentativas incluyen Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus


helveticus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus (usado en cultivos iniciadores lácteos), Pediococcus

sp (usado en cultivos para salchicha), y Tetragenococcus (usado en salsa de soya) (Parra, 2010).

Las BAL heterofermentativas son aquellas que transforman la glucosa en ácido láctico, etanol,

acetato y dióxido de carbono, por la vía colateral de las pentosas o del ácido-6-fosfoglucónico.

Estas bacterias poseen la enzima fosfocetolasa, pero carecen de la aldolasa y hexosa-isomerasa.

Producen solamente, el 50% del ácido láctico. Éstas fermentan un mol de glucosa, para formar un

mol de ácido láctico, un mol de etanol y un mol de CO2. Un mol de ATP es generada, por un mol

de glucosa (Lahtinen et al., 2011; Holzapfel & Wood, 2014). Las BAL heterofermentativas

incluyen L. mesenteroides subsp cremoris, Leuconostoc lactis (usado en fermentaciones de

lácteos), L. mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc kimchii (usados en verduras

fermentadas) y O. oeni (usado en fermentaciones de vino) (Parra, 2010).

Existe una clara diferencia entre el rendimiento energético de ambas rutas, debido a que las

bacterias homofermentativas producen mayor cantidad de ácidos y son capaces de extraer doble

cantidad de energía de la fermentación de la glucosa, que la que genera la ruta

heterofermentativa. Sin embargo, las bacterias heterolácticas son más importantes que las

homolácticas, desde el punto de vista de la producción de componentes de aroma y sabor, tales

como acetaldehído y el diacetilo (Seseña, 2007).

1.2.3 Clasificación y géneros representativos de BAL

De acuerdo con las propiedades metabólicas, el tipo de células e importancia en los alimentos, las

BAL han sido agrupadas en los siguientes géneros (Tabla 1-1).

Tabla 1-1. Clasificación de las BAL según tipo de células y fermentación.

Género Células Fermentación

Forma Agrupamiento

Lactobacillus

Lactococcus

Leuconostoc

Oenococcus

Pediococcus

Streptococcus

Tetragenococus

Bacilo

Coco

Coco

Coco

Coco

Coco

Coco

Cadenas

Cadenas

Cadenas

Cadenas

Tétradas

Cadenas

Tétradas

Homo/hetero

Homoláctica

Heteroláctica

Heteroláctica

Homoláctica

Homoláctica

Homoláctica


Aerococcus

Carnobacterium

Enterococcus

Vagococcus

Weisella

Coco

Bacilo

Coco

Coco

Cocoide

Tétradas

Pares

Pares

Homoláctica

Heteroláctica

Homoláctica

Homoláctica

Heteroláctica

Fuente: Hutkins, 2006.

1.2.3.1 Lactococcus. El género Lactococcus con células agrupadas, a menudo, en pares o cadenas

cortas, se caracteriza por ser homofermentativo obligado, no móvil, anaerobio facultativo y con

una temperatura óptima de crecimiento cerca de 30°C. Se subdivide en cinco (5) especies:

Lactococcus lactis, Lactococcus garviae, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum y

Lactococcus raffinolactis. Dentro de estas especies, una de las más importantes es Lactococcus

lactis, involucrado en la fermentación de alimentos y utilizado como cultivo iniciador, para la

mayoría de los quesos madurados y muchos productos lácteos producidos en todo el mundo.

Crece rápidamente en la leche, produciendo ácido láctico y descendiendo el pH por debajo de

4,5; superando a la mayoría de los competidores potenciales (Plumed-Ferrer, Uusikylä,

Korhonen, & von Wright, 2013; Ruggirello, Cocolin, & Dolci, 2016).

1.2.3.2 Streptococcus. El género Streptococcus se divide en dos (2) grupos distintos; en primer

lugar, se encuentran los mesófilos con una temperatura de crecimiento entre 10°C a 40°C,

organizados filogenéticamente, como Lactococcus y, los termófilos que presentan una

temperatura de crecimiento entre 40°C a 42ºC, una limitada diversidad metabólica y gran

tolerancia al NaCl; están organizados filogenéticamente, como Streptococcus thermophilus, que

está altamente adaptados a la leche, debido a su capacidad para fermentar rápidamente la lactosa,

produciendo ácido láctico, por la ruta homofermentativa. Es ampliamente utilizado como cultivo

iniciador para obtener productos lácteos fermentados, contribuyendo a la acidificación y el

enriquecimiento de las propiedades organolépticas. Sus requerimientos nutricionales son más

exigentes que los lactococos, debido a que S. thermophilus es débilmente proteolítico, por lo

tanto, necesita aminoácidos preformados (Hutkins, 2006; Rossi, Marzotto, Cremonese, Rizzotti,

& Torriani, 2013; Vendramin et al., 2017).


1.2.3.3 Leuconostoc. Este género presenta microorganismos mesófilos, con temperaturas de

crecimiento que van desde 18°C a 25°C, presentan forma de coco, o incluso, de bastoncillo,

dependiendo de la composición y la forma del medio de crecimiento. Son heterofermentativos

obligados, por lo tanto utilizan la vía de la fosfocetolasa para el metabolismo de los azúcares.

Los plásmidos son comunes en esta especie y cuando están presentes pueden codificar para

funciones importantes, incluido el metabolismo de la lactosa, el citrato y la producción de

bacteriocinas. En general, los hábitats ocupados por estas cepas se reflejan por los carbohidratos

particulares que fermentan. Cepas asociadas a plantas, tales como L. mesenteroides subsp.

mesenteroides, fermentan azúcares presentes en vegetales; es decir, fructosa, sacarosa, arabinosa,

trehalosa, mientras que las cepas asociadas a lácteos (L. mesenteroides subsp.cremoris y L. lactis)

son más afines de fermentar la lactosa, galactosa y glucosa. Tienen la capacidad de disminuir el

pH en el medio de crecimiento entre 4,5 y 5,0; sin embargo, la acidificación no es,

necesariamente, la función principal de estas bacterias durante las fermentaciones si se compara

con lactobacilos homofermentativos (Sánchez, Martínez, & Rodríguez, 2005; Hutkins, 2006).

1.2.3.4 Oenococcus. Este género contiene una sola especie, Oenococcus oeni, que se encuentra

filogenéticamente dentro de la rama Leuconostocaceae; sin embargo, es algo distante de

Leuconostoc y Weissella. La mayoría de las cepas de Oenococcus oeni presentan un crecimiento

lento y fermentan un número limitado de azúcares. Como indica la etimología de su nombre, el

uso de O. oeni, en alimentos fermentados, se restringe a la elaboración del vino (oenos es la

palabra griega para el vino), por su capacidad de acidificar este producto, a través de la

fermentación maloláctica, mediante la cual el ácido málico se descarboxila a ácido láctico.

Además, dada su capacidad para fermentar la glucosa y la fructosa, su alta tolerancia a pH ácidos

y al etanol, el jugo o el vino parece ser el hábitat natural de este microorganismo (Hutkins, 2006).

1.2.3.5 Pediococcus. El género Pediococcus con células agrupadas en tétradas, se caracteriza por

su capacidad para crecer a pH ácidos (4,2) y gran tolerancia al NaCl (6,5%). A pesar de su

incapacidad para fermentar la lactosa, P. acidilactici y P. pentosaceus se encuentran, con

frecuencia, en el queso, donde pueden participar en el proceso de maduración. Los plásmidos

comunes en esta especie presentan genes, que pueden codificar para la producción de

bacteriocinas (Hutkins, 2006).


1.2.3.6 Tetragenococcus. Este género presenta tres (3) especies: Tetragenococcus halophilus,

Tetragenococcus muriaticus y Tetragenococcus solitarius. Se caracterizan por su notable

tolerancia a la sal (hasta 25%), crecimiento entre 25°C y 30°C y pH entre 6,5 y 8,0 y baja

actividad de agua, debido a su capacidad para mantener el equilibrio osmótico, mediante la

acumulación de betaína, carnitina y otros solutos compatibles (Hutkins, 2006).

1.2.3.7 Lactobacillus. El género Lactobacillus se caracteriza por células en forma de bastoncillos,

que se agrupan, a menudo, en cadenas, no producen esporas y tienen una alta exigencia para su

crecimiento, de diversos factores nutricionales. Ocupan una amplia variedad de hábitats

incluyendo material vegetal, productos lácteos, productos cárnicos, jugos, bebidas fermentadas,

granos y cereales. Su presencia en el tracto gastrointestinal humano ha llevado a la sugerencia,

apoyado en estudios científicos, de que estas bacterias presentan una amplia actividad probiótica

(Plessas et al., 2017). El género Lactobacillus se subdivide en tres (3) grupos: el primero es,

Lactobacillus homofermentativos obligatorios, el segundo corresponde a Lactobacillus

homofermentativos facultativos, los cuales hacen una fermentación de las hexosas, mediante un

metabolismo homofermentativo, además de una fermentación de las pentosas y el gluconato, a

través de un metabolismo heterofermentativo; el tercero hace referencia a Lactobacillus

heterofermentativos obligatorios. Los procesos de acidificación de la leche con Lactobacillus son

lentos, pero intensos, gracias a que presentan una mejor resistencia a los pH ácidos y a las

concentraciones altas de ácido láctico. Para adaptarse a condiciones de crecimiento en alimentos,

los lactobacilos han conseguido duplicar los genes implicados en el transporte y el metabolismo

de los hidratos de carbono, incluyendo genes para los sistemas de las enolasas y de

fosfotransferasas, que les permite un mejor crecimiento en alimentos ricos en proteínas (Hutkins,

2006).

1.2.4 Importancia tecnológica de las BAL

Muchas cepas de BAL son empleadas en la fabricación de productos alimenticios, es así, como

en la industria de la panificación, contribuyen al aroma, sabor y textura del producto final

(Prückler et al., 2015) , en productos cárnicos y lácteos se emplean como cultivos iniciadores

(Casaburi et al., 2016) y en alimentos funcionales, como es el caso de los probióticos, ejercen una

influencia positiva en la salud humana, regulando la microflora intestinal, otorgando resistencia


contra la invasión de microorganismos patógenos y previniendo enfermedades infecciosas

(González-Martínez, Gómez-Treviño, & Jiménez-Salas, 2003).

1.2.4.1 Cultivos iniciadores. Los diversos géneros de bacterias ácido-lácticas han sido

desarrollados industrialmente, para conformar los denominados cultivos iniciadores, los cuales

son cultivos puros o cultivos mezclados, obtenidos de la leche y el suero, que se emplean en la

elaboración de productos fermentados, permitiendo un control de las características

organolépticas. Su función está centrada en la fermentación de la lactosa, acidificación,

proteólisis, formación de aroma y sabor, obtención de textura, entre otros (Terzić-Vidojević et al.,

2015; Zanirati et al., 2014).

La habilidad de producir cambios deseados (acidificación, proteólisis y lipólisis que contribuyen

en el sabor, aroma y textura de los derivados lácteos); la falta de patogenicidad o actividad tóxica

(producción de aminas biógenas); la habilidad de dominar la microbiota competitiva mediante la

acidificación y la producción de bacteriocinas; la facilidad de propagación y de preservación y la

estabilidad de las propiedades deseables, durante el almacenamiento del producto, son criterios

que se tienen en cuenta a la hora de seleccionar las BAL, para la formulación de cultivos

iniciadores, los cuales están constituidos principalmente, por especies de los géneros:

Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc y Lactobacillus (Morais, 2004; Bassi, Puglisi, &

Cocconcelli, 2015).

La Tabla 1-2 muestra una clasificación de los cultivos iniciadores utilizados en la elaboración de

productos lácteos.

Tabla 1-2. Clasificación de los cultivos iniciadores.

Clasificación Definición

Fermentación

Homofermentativo El ácido láctico es el único metabolito

producido por las BAL

Heterofermentativo Además de ácido láctico se producen otros

metabolitos como ácido acético,

propiónico, etanol y CO2

Temperatura optima de

Mesófilos Los procesos de fermentación se llevan a

cabo a temperaturas entre 20°C-30°C

Termófilos Los procesos de fermentación se llevan a



crecimiento Mixtos Los procesos de fermentación se llevan a


Número de cepas

Puro Constituido por una sola cepa de bacterias

lácticas

Mixto Compuesto por una mezcla de cepas de

bacterias lácticas bien definidas

Natural Constituido por una mezcla de cepas de

bacterias lácticas indefinidas

Fuente: Morais, 2004.

1. 3 BACTERIOCINAS

1.3.1 Generalidades. Las bacteriocinas son compuestos proteicos, biológicamente activos,

sintetizados en el ribosoma de numerosas bacterias Gram (+) y Gram (-). La primera bacteriocina

identificada como una proteína antimicrobiana fue definida como colicina, producida por

Escherichia coli. Las producidas por bacterias ácido-lácticas, usualmente, presentan bajo peso

molecular (<10 KDa), son catiónicos, termoestables, anfifílicos, se producen durante la fase

primaria de crecimiento y pueden ser, fácilmente degradadas por proteasas intestinales (García et

al., 2010; Zacharof & Lovitt, 2012). Estas sustancias actúan frente a bacterias estrechamente

relacionadas con el microorganismos que la produce, aunque también, pueden actuar frente a

otras especies de bacterias, hongos y algunos parásitos (Cotter et al., 2005; Monroy & Jos, 2009).

De esta manera, la mayoría de las bacteriocinas se pueden aplicar en la industria de alimentos,

como conservantes naturales generando una barrera natural frente a microorganismos patógenos

y deteriorantes (Settanni & Corsetti, 2008).

Según Neria (2006), para que una bacteriocina se denomine como tal, debe cumplir con los

siguientes criterios:

1. Poseer pared proteica, necesaria para su actividad.

2. Ser bactericida.

3. Para actuar se debe fijar sobre un receptor específico, localizado sobre sitios “blancos”.

4. El microorganismo productor debe sintetizar una molécula que la inmuniza contra su propia

bacteriocina.

La nisina fue la primera bacteriocina en ser aislada, caracterizada y denominada por Mattick y

Hirsch, en 1947 producida por especies de Lc. Lactis subsp. lactis. Desde 1969 fue aprobada


como conservante seguro de alimentos, por la OMS/FAO (Organización Mundial de la

Salud/Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura) inhibiendo el

desarrollo de bacterias Gram positivas, especialmente, de los géneros Clostridium,

Staphylococcus, Bacillus y Listeria. Puede ser adicionada como aditivo alimentario, en productos

lácteos, a una concentración de hasta 12,5 mg/kg (Balciunas et al., 2013).

1.3.2 Clasificación. Diversos investigadores han buscado clasificar a las bacteriocinas, de

acuerdo con sus características bioquímicas y genéticas. Según Drider, Fimland, Héchard,

McMullen, & Prévost (2006), las bacteriocinas pueden dividirse en tres (3) clases:

1.3.2.1 Clase I: lantibióticos. Son péptidos pequeños (< 5 kDa), poco estables al calor, activos a

nivel de membrana, que contienen algunos aminoácidos poco comunes, como lantionina, b-metil

lantionina y deshidroalanina que se forman debido a modificaciones posteriores al proceso de la

traducción. El principal ejemplo de esta clase es la nisina, producida por algunas cepas de

Lactococcus lactis subsp. lactis.

1.3.2.2 Clase II: no lantibióticos. Esta subclase se compone de pequeños péptidos (< 10 kDa)

termoestables, con una estructura helicoidal anfifílica, es decir; con un extremo hidrofílico y otro

hidrófobo, que permite su inserción en la membrana citoplasmática de la célula diana, de tal

modo se produce la despolarización de la membrana y la muerte celular. Se dividen en tres (3)

subclases: IIa (pediocina), IIb (lactocina G) y IIc (lactocina B).

Subclase IIa: presentan alta especificidad contra L. monocytogenes y tienen de 37-48 residuos de

aminoácidos, con una porción N-terminal (Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys) y una terminal C, que

contiene uno (1) o dos (2) a-hélices. Estas bacteriocinas se insertan en la membrana celular del

microorganismo diana, promoviendo la formación de poros y la disipación de la fuerza motriz de

protones. Por lo anterior, se produce una aceleración en el consumo de ATP y, en consecuencia la

muerte celular. Por lo general, son termoestables (121°C/15 min.) y resistentes a la liofilización y

al almacenamiento a -20°C, por largos períodos. Su representante característico es la pediocina

PA-1.


Subclase IIb: son bacteriocinas que requieren la actividad de dos (2) péptidos, mostrando una

acción sinérgica importante, es decir, una mejor actividad antimicrobiana. En este grupo se

encuentran la lactococcina G y las plantaricinas EF y JK.

Subclase IIc: son péptidos pequeños, termoestables, no modificados, que presentan un enlace

covalente entre las terminales C y N, resultando en una estructura cíclica. La enterocina AS-48, la

circularina A y la reutericina 6 son representantes de esta subclase.

1.3.2.3 Clase III: bacteriocinas. Esta categoría reúne grandes bacteriocinas termolábiles (> 30

kDa), que tienen actividad compleja y estructura de la proteína. Su mecanismo de acción es

diferente de los de otras bacteriocinas, la cual promueve la lisis de la pared celular del

microorganismo diana. Su porción N-terminal es homóloga a una endopeptidasa implicada en la

síntesis de la pared celular, mientras que la parte C-terminal es responsable del reconocimiento de

la célula diana.

La tabla 1-3 muestra algunas bacterias ácido lácticas productoras de bacteriocinas y sus

microorganismos sensibles.

Tabla 1-3. Bacteriocinas producidas por bacterias ácido lácticas y microorganismos sensibles.

Organismo productor Bacteriocina Microorganismos sensibles

Lactococcus lactis subsp. lactis

Nisina

Lacticina

Bacterias Gram positivas

Clostridium sp


Staphylococcus aureus

Streptococcus dysgalactiae

Enterococcus faecalis

Propionibacterium acne

Streptococcus mutans

Lactococcus lactis subsp. cremoris

Lactococcina B Lactobacillus

Lactobacillus acidophilus Acidocin CH5


Lactobacillus


Lactacin F

Lactacin B

Lactobacillus fermentum

Enterococcus faecalis

Lactobacillus delbrueckii

Lactobacillus helveticus

Lactobacillus debrweckii

Lactobacillus helveticus

Lactobacillus.bulgaricus.

Lactococcus lactis.

Lactobacillus casei Lactocin 705 Listeria monocytogenes

Lactobacillus plantarum

Leuconostoc mesenteroides Mesentericin Y105 Enterococcus faecalis


Pediococcus acidilactici Pediocin F

Pediocin PA-1

Pediocin AcH



Bacterias Gram positivas y

Gram negativas en condiciones

de estrés

Pediococcus pentosaceus Pediocina A Staphylococcus aureus

Clostridium botulinum


Enterococcus faecium Enterocin A Listeria monocytogenes

Lactobacillus sake Sakacin P Listeria monocytogenes

Fuente: Parada, Caron, Medeiros, & Soccol, 2007.


1.3.3 Modo de acción. Entre los mecanismos de acción reportados para las bacteriocinas se

destacan varias características esenciales para que puedan llevar a cabo su actividad

antimicrobiana, independiente del blanco celular, membrana o pared celular, así como la

interacción con algunas proteínas importantes en el metabolismo de la célula. Las bacteriocinas

poseen una carga neta positiva que favorece la interacción con la carga negativa de los

lipopolisacáridos de la membrana de las bacterias Gram negativas, o con los ácidos teicoicos y

lipoteicoicos de la pared de las bacterias Gram positivas. La hidrofobicidad es una característica

requerida para la inserción de la bacteriocina en la membrana celular, así como su flexibilidad,

que le permite realizar un cambio conformacional de un estado soluble a uno de interacción con

la membrana (López M. et al., 2008) .

El mecanismo de acción de estos compuestos incluyen: i) la formación de poros en la membrana

celular, lo que causa la pérdida del contenido celular, éste es el mecanismo descrito para la

nisina; ii) la inhibición de la síntesis de la pared celular, mecanismo de acción descrito para la

mersacidina, que involucra la unión al lípido II, principal transportador de las subunidades de

peptidoglucano (UDP- Mur-Nac-pentapéptido-GlcNAc); iii) La inhibición de la actividad de

enzimas como la fosfolipasa A2, que participa en la reparación de membranas (López M. et al.,

2008; Monroy-Dasta M.C., Castro-Barrera T., Fernández-Perrino F.J., 2009).

Existen bacteriocinas como la nisina, que poseen un mecanismo de acción dual (Figura 1-1), en

dónde se propone que, inicialmente, la bacteriocina se une a la pared celular, mediante

atracciones electrostáticas, lo cual se facilita debido a la carga positiva de este péptido y las

cargas negativas de los componentes de la pared celular. Posteriormente, la nisina se une al lípido

II, principal transportador de las subunidades de peptidoglucano y utiliza esta molécula para

anclarse a la membrana celular, para despolarizar el potencial eléctrico transmembrana e

interrumpir la organización de la bicapa lipídica. Luego, la bacteriocina cambia su orientación

con relación a la membrana y se inserta en esta última, lo que involucra la traslocación de su

extremo carboxilo terminal, a través de la membrana. Finalmente, la unión de diversos péptidos

en el sitio de inserción provoca la formación de un poro transmembranal, que permite la salida de

moléculas importantes como aminoácidos, iones y ATP, pérdida de la fuerza motriz, dando como

resultado la muerte celular (De Arauz, Jozala, Mazzola, & Vessoni Penna, 2009; Settanni &

Corsetti, 2008; Zacharof & Lovitt, 2012).


Figura 1-1. Mecanismo de acción dual de la nisina producida por Lactococcus lactis.

1.3.4 Secreción y mecanismo de autoprotección. Las bacteriocinas se sintetizan como pre-

péptidos inactivos, que contienen un péptido señal, en la región N-terminal. Esta señal la

mantiene en forma inactiva, dentro de la célula productora, facilitando su interacción con el

transportador, y en el caso de los lantibióticos, juega un papel importante en el reconocimiento

del pre-péptido, por las enzimas que realizan las modificaciones postraduccionales. El péptido

señal puede ser removido proteolíticamente, durante el transporte del pre-péptido hacia el espacio

periplásmico por las mismas proteínas transportadoras (transportadores membranales tipo ABC

dependientes de ATP), que también, pueden contener un dominio proteolítico, o por proteínas

Serina-proteasa presentes en la parte externa de la membrana celular. De esta manera, el extremo

carboxilo terminal es separado del péptido señal y es liberado al espacio extracelular,

representando al péptido biológicamente activo (Zacharof & Lovitt, 2012)

Las cepas productoras de bacteriocinas se autoprotegen de la toxicidad de estos compuestos,

mediante la expresión de proteínas de inmunidad específica, que están en estrecha proximidad

genética con el gen estructural de la bacteriocina. Para las bacteriocinas producidas por BAL, se

han descrito dos (2) tipos de sistema de inmunidad. La protección puede estar proporcionada por


una proteína específica, que secuestra e inactiva la bacteriocina o por la competencia antagonista

con el receptor, cambiando su estructura conformacional (Balciunas et al., 2013).

1.3.5 Bacteriocinas representativas

1.3.5.1 Nisina. Es un péptido catiónico producido por algunas especies de Lactococcus lactis

subsp lactis, de 34 aminoácidos y de un peso molecular de 3,5 kDa. Su síntesis es compleja,

porque requiere de procesos de transcripción, traducción, modificaciones pos-transduccionales,

secreción, procesamiento y señales de transducción. Tiene una estructura pentacíclica con un (1)

residuo de lantionina (Anillo A) y cuatro (4) residuos de β- metil-lantionina. Existen dos (2)

variantes de esta bacteriocina, la nisina A y la nisina Z, que difieren en el aminoácido de la

posición 27; la histidina en la nisina A cambia por asparagina en la nisina Z, pero tienen una

actividad similar (Sangronis & García, 2007). Es estable a pH ácidos y se puede almacenar por

un largo tiempo, a una temperatura de 2°C-7°C. Se utiliza generalmente en la industria

alimentaria, como agente antibotulínico en el queso, huevos, salsas y alimentos enlatados.

Presenta actividad antimicrobiana contra bacterias Gram positivas incluyendo microorganismos

patógenos y deteriorantes de alimentos como L. monocytogenes, Staphylococcus aureus y

Bacillus cereus, lo cual puede estar atribuido a un mecanismo de acción dual, que abarca la

interferencia con la pared celular, la síntesis y la formación de poros en la membrana celular,

dando como resultado cambios en la permeabilidad, con salida de compuestos (iones K,

aminoácidos y ATP) a través de los poros, los cuales son responsables de la muerte celular. La

nisina es la única bacteriocina reconocida como segura por la FAO/OMS desde 1969, para su

utilización en la leche y productos lácteos, a una concentración de 12,5 mg/kg. Es producida

comercialmente y se asigna bajo el número E234, en la lista de aditivos alimentarios en Europa.

Estudios toxicológicos demuestran que la ingestión de nisina a una dosis letal estimada (LD50)

de 6950 mg/kg, no causa ningún efecto tóxico en los seres humanos, cuando se administra por vía

oral. Lo anterior puede deberse a la rápida inactivación de este péptido por parte de las enzimas

digestivas, como la tripsina y la quimiotripsina(de Arauz et al., 2009).


Figura 1-2. Estructura molecular de la nisina.

1.3.5.2 Pediocina PA-1. Es una bacteriocina producida por Pediococcus acidilactici, utilizada

como conservante en productos vegetales y cárnicos, especialmente, contra especies de Listeria.

Se sintetiza como un pre-péptido de 62 aminoácidos que, al ser procesado, resulta en un péptido

maduro de 44 residuos, anfifílico, con carga positiva, regiones altamente hidrofóbicas y 2 enlaces

disulfuro. Su estructura terciaria incluye un extremo N-terminal, con 3 láminas β, que originan

una conformación de horquilla, y un extremo C-terminal. Se presenta un alto grado de libertad

conformacional, a excepción de un enlace disulfuro entre los aminoácidos 24 y 44, que es

esencial para su actividad. En su síntesis participan un grupo de genes, incluyendo el gen pedA

(gen estructural), el gen pedB (se requiere para la inmunidad) y los genes pedC y pedD

(participan en la secreción del péptido maduro). Dada su alta actividad contra especies de Listeria

esta bacteriocina tiene un alto potencial para ser utilizado como conservador en alimentos lácteos

(González-Martínez et al., 2003).

1.3.5.3 Plantaricinas EF y JK. Son bacteriocinas del grupo IIb producidas por Lactobacillus

plantarum, que presentan actividad antimicrobiana, cuando interactúan como un sistema de dos

(2) péptidos. Su síntesis compleja está regulada por la acción de cinco (5) operones, con 21 genes

diferentes. Los péptidos activos para la formación de poros en la membrana citoplasmática de las

células blanco son PlnE y PlnF, que conforman la plantaricina E/F y los péptidos PlnJ y PlnK

constituyen la plantaricina J/K. Se ha encontrado que esos cuatro (4) péptidos catiónicos poseen

de 30 a 40 aminoácidos y tienen actividad bactericida, de manera independiente, la cual se

potencia cuando interactúan en pares, formando los complejos de poración EF y JK. Los poros

formados presentan diferente selectividad iónica, ya que la plantaricina EF permite el paso de

cationes monovalentes, en contraste con la plantaricina JK, que es selectiva para compuestos


aniónicos. Esta actividad complementaria combinada de E/F y J/K garantiza una eficiente

actividad bactericida (Zacharof & Lovitt, 2012).

1.3.6 Purificación. Las bacteriocinas producidas por BAL requieren complejas necesidades de

factores de crecimiento, lo cual aumenta su costo de producción y dificulta su proceso de

purificación. Debido a que las bacteriocinas están formadas por un grupo heterogéneo de

sustancias, es necesario diseñar protocolos de purificación específica, lo cual puede explicar

porque sólo algunas de ellas se han purificado a homogeneidad. La purificación inicia desde el

crecimiento de la bacteria, en grandes proporciones de un medio líquido y bajo condiciones

óptimas de pH y temperatura (Chang, Lee, & Chang, 2007), seguido de la remoción de las células

por centrifugación. Es importante elegir un medio complejo, que contenga una fuente rica en

nitrógeno (Monroy & Jos, 2009). Se pueden distinguir tres (3) métodos principales para la

purificación, en función de la estructura bioquímica. En primer lugar, se puede realizar un

método convencional, que se basa en una serie de etapas, como son: precipitación con sulfato de

amonio; intercambio iónico; interacción hidrofóbica; filtración en gel y cromatografía líquida de

alta presión. En segundo lugar, se ha desarrollado un protocolo simple de tres (3) pasos, que

incluye i) precipitación con sulfato de amonio, ii) extracción con cloroformo, metanol,

precipitación y iii) Cromatografía líquida de alta presión, en fase reversa. En tercer lugar, las

bacteriocinas pueden ser aisladas mediante una operación de unidad única, a través de la

adsorción del lecho expandido, utilizando un gel de interacción hidrofóbica, después de

maximizar el título de la bacteriocina biodisponible, a través del ajuste del pH del medio de

fermentación. Los métodos descritos han permitido que varias bacteriocinas con un alto potencial

industrial se hayan purificado. Un claro ejemplo es la nisina, la cual ha sido purificada mediante

cromatografía de inmunoafinidad y cromatografía líquida de fase reversa. Sin embargo, estas

metodologías aumentan el costo de esta bacteriocina, que es la más consumida a nivel mundial

(Balciunas et al., 2013).


1.3.7 Aplicaciones de bacteriocinas en la industria alimentaria. En la actualidad, existe una

tendencia importante por parte de los consumidores en demandar alimentos naturales,

mínimamente procesados y sin conservantes sintéticos, considerando que muchos de ellos,

presentan una baja calidad nutricional y que los aditivos sintéticos pueden ser peligrosos para la

salud. Debido a lo anterior, se tiene un gran interés en desarrollar alimentos con agentes

antimicrobianos naturales, los cuales deben ser inocuos, deben cumplir con los parámetros de

calidad y seguridad de las normativas aplicables para agentes antimicrobianos y deben presentar

alto espectro de actividad contra microorganismos patógenos (Beristain-Bauza, Palou, & Lopez-

Malo, 2012).

La industria alimentaria ha desarrollado la aplicación de bacteriocinas, producto del metabolismo

de algunas BAL, en la conservación de lácteos, huevos, vegetales y productos cárnicos. Entre

ellas, la nisina A y su variante natural, la nisina Z, han demostrado ser altamente eficaces contra

agentes microbianos causantes de intoxicación y deterioro alimentario, siendo la única que se

emplea oficialmente (Deegan, Cotter, Hill, & Ross, 2006), y que se comercializa en forma de

Nisaplin®, la cual es una preparación que contiene nisina (2,5%), NaCl (7,5 %) y leche seca sin

grasa (12 % de proteína y 6 % de carbohidratos). Estos péptidos se pueden aplicar en los

alimentos, en tres formas diferentes: i) como concentrados semipurificados o purificados, ii)

mediante el uso de un producto fermentado previamente, con una cepa productora como un

ingrediente en la elaboración de alimentos, o iii) incorporado a través de una cepa productora

(cultivo iniciador) (Settanni & Corsetti, 2008; García et al., 2010; Zacharof & Lovitt, 2012). Sin

embargo, se ha demostrado que la utilización de una bacteriocina en un alimento, no garantiza la

seguridad completa; especialmente, para el caso de bacterias Gram (-). Por lo tanto, se hace

necesario, que la biopreservación sea combinada con otras tecnologías que tengan la capacidad

de destruir la membrana celular de bacterias patógenas.

Estos péptidos, se pueden utilizar para mejorar las propiedades sensoriales y la calidad de los

alimentos, aumentando la velocidad de proteólisis o evitando la formación de gas en los quesos.

Otra aplicación, está basada en los empaques bioactivos, los cuales pueden ser preparados por

inmovilización directa de la bacteriocina o por adición de películas de proteínas biodegradables,

en el alimento envasado, que será lanzado durante el almacenamiento del producto alimenticio,

protegiendo los alimentos de contaminantes externos (Zacharof & Lovitt, 2012).


A pesar de que sólo existe una bacteriocina que se utiliza de manera comercial, se considera que

esta tendencia comenzará a cambiar en el futuro cercano, conforme se incrementen los avances

en las capacidades biotecnológicas y se establezcan sus mecanismos de acción.

Figura 1-3. Aplicaciones de BAL en la Agroindustria y la Biotecnología.

Fuente: adaptado de (Gaspar, Carvalho, Vinga, Santos, & Neves, 2013)

1.4 MICROORGANISMOS PATÓGENOS DE IMPORTANCIA EN LA INDUSTRIA

ALIEMENTARIA

Los microorganismos de interés sanitario en los alimentos, se encuentran involucrados en dos (2)

áreas fundamentales de la Microbiología Sanitaria: como causa de deterioro de los alimentos y

como agentes etiológicos de enfermedades asociadas a su consumo.

Las toxiinfecciones causadas por patógenos transmitidos a través de los alimentos han sido

reconocidas como un problema de salud pública en todo el mundo. En 2013, en la Unión


Europea, se informaron 5196 brotes de origen alimentario, mientras que en Estados Unidos se

estima que cada año ocurren 9,4 millones de episodios de estas (Martinović, Andjelković,

Gajdošik, Rešetar, & Josić, 2016). A pesar del aumento significativo en la aparición de ETA,

debido a las nuevas tendencias nutricionales que apoyan el consumo de alimentos crudos y

frescos, productos secos e ingredientes exóticos (Rešetar, Pavelić, & Josić, 2015), en la

actualidad, se están evaluando técnicas novedosas e indispensables para el control de patógenos,

ya sea durante su producción, almacenamiento o transporte.

Con el fin de evaluar el efecto inhibitorio de las sustancias antimicrobianas ante microorganismos

con paredes celulares estructuralmente distintas, se eligieron dos patógenos de importancia en

alimentos, tales como Listeria monocytogenes (bacilo Gram Positivo) y Salmonella spp (bacilo

Gram Negativo).

1.4.1 Listeria monocytogenes. Es un bacilo Gram positivo, no esporulado, que se caracteriza por

su capacidad para crecer bajo diversas condiciones ambientales, como pH extremos (desde 4,1

hasta 9,6), temperaturas entre 0°C-45°C y en presencia de altas concentraciones de NaCl de hasta

un 20% (Zunabovic, Domig, & Kneifel, 2011). Dependiendo de la naturaleza del alimento, su

entorno de procesamiento y el tipo de obstáculos aplicados, la bacteria tiene la capacidad para

sobrevivir y crecer a bajas temperaturas y en un ambiente húmedo; está presente de forma

generalizada en la naturaleza; presenta facilidad para asociarse con alimentos, equipos y otras

superficies de contacto (Luber et al., 2011). Se cree que la principal vía de trasmisión de la

bacteria, es a través del consumo de alimentos contaminados, produciendo listeriosis (Allerberger

& Wagner, 2010). Los síntomas de la infección van desde una enfermedad similar a la gripe, con

complicaciones graves que incluyen meningitis, aborto espontáneo, septicemia o listeriosis del

recién nacido (O’ Grady, Sedano-Balbás, Maher, Smith, & Barry, 2008).

Esta bacteria sobrevive y crece en una variedad de productos alimenticios, tales como la leche,

mariscos, verduras y productos cárnicos. En consecuencia, ha sido responsable de una proporción

creciente de ETAs, especialmente, en niños, mujeres embarazadas, ancianos e individuos

inmunodeprimidos, con una tasa de mortalidad cercana al 30% (Chen et al., 2009).


Una de las principales preocupaciones de la industria alimentaria es la capacidad de Listeria

monocytogenes de formar biopelículas, estructura que protege al microorganismo de factores

físicos (lavado) y químicos (desinfectantes y detergentes) (Cruz & Fletcher, 2011), presentándose

la posibilidad de que se produzca la transferencia de la bacteria patógena, desde la superficie de

los equipos al alimento.

En los E.E.U.U; la Food and Drug Administration (FDA), el Departamento de Agricultura (US) y

el Centro de Control de Enfermedades han impuesto la política de “tolerancia cero”, para L.

monocytogenes, que determina ausencia del microorganismo en 50 g de alimento. En Europa, los

niveles establecidos por la Comisión Europea (UE) son de < 100 UFC/g, dependiendo del tipo de

producto, especialmente, en aquellos listos para el consumo (Polese, Del Torre, Venir, &

Stecchini, 2013).

1.4.1.1 Desarrollo de resistencia de las bacterias Gram positivas a las bacteriocinas. La

resistencia de una especie bacteriana a la acción de las bacteriocinas puede generarse de manera

natural o como resultado de una exposición continua, conocida como resistencia intrínseca y

adquirida (Ennahar, Sashihara, Sonomoto, & Ishizaki, 2000; Xue et al., 2005).

La mayoría de las investigaciones se han enfocado en el estudio de la resistencia hacia

bacteriocinas específicas, como la nisina y bacteriocinas de la clase II. En el primer caso, se han

detectado cepas mutantes de L. monocytogenes, L. innocua, S. pneumoniae, cuya resistencia está

relacionada con la síntesis e incorporación de diversos componentes estructurales en la pared y en

la membrana celular (Li, Chikindas, Ludescher, & Montville, 2002), favoreciendo un incremento

de las cargas positivas en las estructuras celulares y una reducción de la actividad antibacteriana

de la nisina, que posee una carga neta positiva. Además, se han observado cambios en la fluidez

de la membrana (Verheul, Russell, Hof, Rombouts, & Abee, 1997) y un aumento en el grosor de

la pared de algunas de las bacterias mutantes (Maisnier-Patin & Richard, 1996).

Los mecanismos de resistencia a las bacteriocinas de la clase II, mejor estudiados, son los

observados en cepas de L. monocytogenes, la cual está relacionada con diversos factores, como la

expresión reducida de una permeasa que actúa como posible receptor, así, como cambios en la

fluidez de la membrana y en las cargas de la superficie celular (Vadyvaloo et al., 2004). La


importancia de estudiar la resistencia radica en la posibilidad de determinar la ineficiencia de las

bacteriocinas a largo plazo y generar conocimientos que puedan servir de base, para establecer

estrategias que mejoren el potencial terapéutico de estos compuestos antimicrobianos.

1.4.2 Salmonella spp. En una bacteria Gram negativa, anaerobia facultativa, que habita en el

tracto gastrointestinal de los animales, pudiendo ser recuperada de una amplia variedad de

huéspedes, especialmente, aves y cerdos, seres humanos, alimentos y el medio ambiente (Cortez,

Carvalho, Ikuno, Bürger, & Vidal-Martins, 2006).

Salmonella es un patógeno importante para la industria alimentaria y se ha identificado, con

frecuencia, como el agente etiológico de los brotes transmitidos por alimentos contaminados en

humanos. Productos alimenticios típicos, de los cuales se ha aislado este microorganismo,

incluyen carne de cerdo, pollo, huevos, carne bovina, productos lácteos y verduras (Favier,

Lucero Estrada, Lazarte Otero, & Escudero, 2013).

1.4.2.1 Desarrollo de resistencia de las bacterias Gram Negativas a las bacteriocinas. La

resistencia de las bacterias Gram (-), especialmente de Salmonella spp. a la acción de las

bacteriocinas está relacionada con la composición de lipopolisacáridos de la membrana externa,

la cual constituye una barrera de permeabilidad para compuestos tóxicos, como antibióticos y

péptidos antimicrobianos (Chalón, Acuña, Morero, Minahk, & Bellomio, 2012).


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Capítulo 2: Capacidad antimicrobiana de bacterias ácido lácticas autóctonas aisladas de queso

doble crema y quesillo colombiano 49

2. CAPITULO 2: 2.1 CAPACIDAD ANTIMICROBIANA DE BACTERIAS ÁCIDO-LÁCTICAS AUTÓCTONAS

AISLADAS DE QUESO DOBLE CREMA Y QUESILLO COLOMBIANO

ANTIMICROBIAL CAPACITY OF NATIVE LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM DOUBLE CREAM CHEESE AND COLOMBIAN QUESILLO

CAPACIDADE ANTIMICROBIANA DE BACTÉRIAS NATIVAS ÁCIDO LÁCTICO ISOLADA

DE QUEIJO DUPLO CREME E QUESILLO COLOMBIANO

MAYRA-FUENTES VANEGAS1, ANDRÉS-LONDOÑO ZAPATA2, MÓNICA-DURANGO ZULETA3, MARGARITA-GUTIÉRREZ BURITICÁ4, SUSANA-OCHOA AGUDELO5 , JOSÉ-

SEPÚLVEDA VALENCIA6

2.1.1 RESUMEN Las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) nativas han sido reportadas como una alternativa eficiente para la biopreservación natural, la prevención de Enfermedades de Transmisión Alimentaria (ETAS) y el mejoramiento de los procesos de producción de alimentos fermentados tradicionales. El objetivo fue evaluar la capacidad antimicrobiana de BAL autóctonas, aisladas de Queso Doble Crema y Quesillo, frente al crecimiento in vitro de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 13311 y Listeria monocytogenes ATCC 7644. Se estudiaron 32 aislados, identificados previamente, mediante el análisis de secuencias del gen 16S DNAr y caracterizados tecnológicamente. Se comprobó su capacidad antimicrobiana utilizando la técnica de la mancha en agar. Posteriormente, los sobrenadantes libres de células se neutralizaron y filtraron, para detectar su actividad antimicrobiana mediante el método de difusión en gel, por perforación en placa. Se seleccionaron ocho aislados que mostraron capacidad inhibidora frente a los dos microorganismos patógenos. El aislado identificado como Lactococcus lactis subsp. lactis Q5 presentó una actividad superior, equivalente a 64.000 UA/mL para L. monocytogenes y 4.000 UA/mL para S. typhimurium. Se sugiere que las BAL provenientes de quesos tradicionales colombianos producen sustancias antimicrobianas, con potencial bactericida y pueden ser utilizadas en la formulación de un cultivo iniciador con efecto bioprotector.

1 Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Ingeniería Agrícola y

Alimentos, Grupo GICTA, Bacterióloga y Laboratorista Clínico. Medellín, Colombia. 2 Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Ingeniería Agrícola y Alimentos, Grupo

MICROBIOP, Microbiólogo Industrial y Ambiental. Medellín, Colombia. 3 Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia, Facultad Ciencias de la Salud, Grupo BIOCIENCIAS, Magíster en Ciencia y

Tecnología de los alimentos. Medellín, Colombia 4 Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia, Facultad Ciencias de la Salud, Grupo BIOCIENCIAS, Magíster en Ciencia y

Tecnología de los alimentos. Medellín, Colombia 5 Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia, Facultad Ciencias de la Salud, Grupo BIOCIENCIAS, Magíster en Ciencias

Biotecnología. Medellín, Colombia 6Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín, Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Ingeniería Agrícola y

Alimentos, Grupo GICTA, Magíster en Ciencia y Tecnología de los alimentos. Medellín, Colombia. Correspondencia: [email protected]



PALABRAS CLAVE: Antimicrobianos, Listeria monocytogenes, Preservación, Salmonella

typhimurium, Quesos colombianos.

ABSTRACT

Lactic Acid Bacteria (LAB) native to have been reported as an efficient alternative for natural biopreservation, prevention of Foodborne Diseases (ETAS) and improvement production processes of traditional fermented foods. The objective was to evaluate the antimicrobial capacity of native BAL isolated from Double Cream Cheese and Quesillo against the in vitro growth of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 13311 and Listeria monocytogenes ATCC 7644. We studied 32 isolates, previously identified by analysis of 16S rDNA gene sequences and characterized technologically. We tested antimicrobial capacity using an agar spot test. Subsequently, cell-free supernatants were neutralized and filtered to detect their antimicrobial activity using the gel diffusion method by drilling plate. We selected 8 isolates showing inhibitory capacity against the two pathogens microorganisms. Isolated identified as Lactococcus lactis subsp. lactis Q5 presented higher activity, equivalent to 64.000 AU/ml for L. monocytogenes and 4.000 AU/ml for S. typhimurium. It is suggested that BAL from traditional cheeses produce antimicrobial substances Colombian bactericidal potential and can be used in formulating a starter culture with bioprotective effect.

KEYWORDS: Antimicrobials, Listeria monocytogenes, Preservation, Salmonella typhimurium,

Colombian cheese. RESUMO Bactérias lácticas (LAB) nativas têm sido relatados como uma alternativa eficiente para biopreservação natural, prevenção de Doenças Transmitidas por Alimentos (ETA) e melhoria dos processos de produção de alimentos fermentados tradicionais. O objetivo foi avaliar a capacidade antimicrobiana de BAL nativa isolado do queijo creme de leite e quesillo contra o crescimento in vitro de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 13311y Listeria monocytogenes ATCC 7644. Foram estudados 32 isolados, previamente identificadas por análise de sequências de genes 16S rDNA e caracterizada tecnologicamente. Foi verificada o capacidade antimicrobiana por meio da

técnica da mancha em agar. Subsequentemente, os sobrenadantes livres de células foram neutralizadas e filtrou-se para detectar a sua actividade antimicrobiana usando o método de difusão por placa de gel de perfuração. Foram seleccionados isolados 8 que mostram a capacidade inibidora contra os dois agentes patogénicos. Isolado identificado como Lactococcus lactis subsp. lactis Q5 apresentou maior atividade, o equivalente a 64.000 UA/ml para L. monocytogenes e 4.000 AU/ml para S. typhimurium. Sugere-se que a LAB de queijos tradicionais produzem substâncias antimicrobianas colombiano potencial bactericida e pode ser utilizado na formulação de uma cultura de arranque com efeito bioprotector.

PALAVRAS-CHAVE: Antimicrobiana, Listeria monocytogenes, Preservação, Salmonella typhimurium, Queijos colombianos.



2.1.2 INTRODUCCIÓN

Las Bacterias Ácido Lácticas (BAL) son utilizadas en la industria alimentaria como cultivos iniciadores, para la obtención de productos fermentados y, sus metabolitos, se han empleado como bioconservantes naturales, por su capacidad para controlar el crecimiento de bacterias patógenas y deteriorantes de los alimentos. Dentro de estos metabolitos se destacan las bacteriocinas, descritas como péptidos antimicrobianos de bajo peso molecular, estables a pH bajo, sensibles a la acción de las proteasas y termoestables; propiedades que las convierte en compuestos ideales para sustituir parcialmente, el uso agentes de químicos en alimentos [1]. De acuerdo con la legislación colombiana, el proceso de elaboración de los quesos artesanales debe involucrar la pasteurización de la materia prima, proceso térmico que afecta la microbiota nativa presente, principalmente; las BAL, las cuales contribuyen a la consolidación del sabor y la textura del producto. Este hecho ha llevado a que los productores empleen ácidos orgánicos; como acético, cítrico y láctico y/o cultivos iniciadores comerciales, que pueden llegar a alterar las propiedades organolépticas del queso original. Diversos estudios plantean la necesidad de evaluar la capacidad tecnológica, probiótica y antimicrobiana de las BAL autóctonas, para ser utilizadas en el diseño de cultivos iniciadores específicos, que garanticen la estandarización de los procesos, preservando al mismo tiempo, las características que definen su identidad [2,3,4,5]. Entre los productos lácteos elaborados en Colombia, donde la microbiota nativa tiene una influencia significativa, se encuentran el Queso Doble Crema y el Quesillo, definidos como quesos frescos, no madurados, de pasta hilada, color blanco-crema, consistencia semiblanda y sabor moderadamente ácido;

estos quesos son producidos en los Valles de Ubaté y Valle Alto del Magdalena, desde donde se han difundido a otras zonas del país [6,7]. Su producción artesanal involucra el uso de leche no pasteurizada, obteniéndose un producto con características organolépticas especiales. Los microorganismos patógenos más frecuentemente asociados a la producción de quesos tradicionales, son Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes y Escherichia coli, responsables de brotes de ETAs, asociados con el uso de leche cruda y procesos de producción poco higiénicos [8,9]. Trabajos anteriores realizados en Colombia han demostrado que el queso campesino, el queso doble crema, la cuajada, el queso costeño y el queso de hoja pueden presentar patógenos como Salmonella sp. y Listeria monocytogenes, los cuales llegan a estos alimentos, por diferentes factores, como la contaminación a partir de las manos del ordeñador, por heces de animales, por contaminación del equipo de ordeño, por aguas contaminadas o por una deficiente cocción en la materia prima [10,11,12]. Listeria monocytogenes, es un bacilo Gram positivo causante de listeriosis, una grave enfermedad que puede generar desde diarrea, hasta meningitis en recién nacidos, con la capacidad de crecer a temperaturas de refrigeración, pH bajo y en altas concentraciones de sal, hecho que dificulta su control en productos lácteos, principalmente, en quesos frescos [13]. Por su parte, Salmonella sp. es un bacilo Gram negativo productor de salmonelosis, una de las principales causas de gastroenteritis en humanos y animales. Las infecciones por Salmonella enterica serovar Typhimurium y Salmonella enterica serovar Enteritidis son una causa importante de morbilidad y mortalidad, especialmente en niños y personas inmunocomprometidas [14].



El efecto de las BAL nativas y sus metabolitos, como ácidos orgánicos, dióxido de carbono, etanol, peróxido de hidrógeno, diacetilo y bacteriocinas, frente a microorganismos patógenos, se plantea como una alternativa de conservación, al tiempo que proporciona beneficios a la salud, al prevenir enfermedades gastrointestinales y mejorar la digestión [15]. El presente trabajo busca evaluar la capacidad antimicrobiana de 32 aislados de BAL, seleccionados de acuerdo con su capacidad tecnológica, provenientes de Queso Doble Crema y Quesillo, frente al crecimiento in vitro de Salmonella typhimurim y Listeria monocytogenes, para su uso potencial en la formulación de cultivos iniciadores autóctonos con efecto bioprotector. 2.1.3 MÉTODO 2.1.3.1 Aislados bacterianos y condiciones de cultivo En este estudio se utilizaron 32 aislados de BAL, obtenidos de Queso Doble Crema (QDC) y Quesillo (Q) producidos en los municipios del Valle de Ubaté y Bajo Magdalena, respectivamente, para evaluar su capacidad antimicrobiana frente S. typhimurium y L. monocytogenes. Los aislados fueron caracterizados molecularmente, mediante el análisis de secuencias del gen 16s DNAr, en un estudio previo. Así mismo, se avaluó su capacidad acidificante, proteolítica y lipolítica, para valorar su potencial para la formulación de un cultivo iniciador nativo. Las BAL se criopreservaron a -70°C, utilizando caldo De Man Rogosa y Sharpe (MRS, Difco Laboratories, Detroit, USA), para bacilos y Caldo M17 (Difco Laboratories, Detroit, USA), para cocos, adicionadas con glicerol, como agente crioprotector [16]. Para la realización de los ensayos, los aislados se reactivaron en los medios de cultivo selectivos ya mencionados, a 30°C, por 24 horas, en condiciones de anaerobiosis [17].

Las cepas de patógenos o microorganismos indicadores utilizadas fueron Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC® 1331 y Listeria monocytogenes ATCC® 7644, congeladas a -70°C, en caldo de Infusión Cerebro Corazón (BHI, Merck, Darmstadt, Alemania), con 30% de glicerol. Salmonella typhimurium fue recuperada en agar Rambach (Merck, Darmstadt, Alemania) y Listeria monocytogenes fue recuperada en agar PALCAM (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom). Después de la incubación a 37°C por 24 horas, ambas cepas fueron subcultivadas en agar tripticasa soya (Merck®), bajo las mismas condiciones [18]. 2.1.3.2 Tamizaje para la detección de la capacidad antimicrobiana Los 32 aislados de BAL nativas fueron evaluados contra las cepas de microorganismos patógenos seleccionados, a partir del método de la mancha en agar, descrito por González et al. [19]. Para ello, 5 μL del cultivo de cada BAL incubados durante una noche, se sembraron en la superficie de agar MRS o agar M17 (dependiendo del tipo de aislado) y se incubaron a 30°C, por 24 horas. Luego del período de incubación, se tomaron 7 mL de agar tripticasa soya semisólido (Merck®, caldo, más 0,7% de agar-agar) previamente inoculados con 100 μl del microorganismo indicador (1,5 x 108 UFC/mL) y se adicionaron sobre cada una de las placas de agar. Se incubaron nuevamente a 37°C, por 24 horas. Se interpretó como positiva la prueba donde se presentaron zonas de inhibición correspondientes a un halo igual o mayor a 2 mm, con el fin de seleccionar las que mostraran mayor capacidad antimicrobiana, simultáneamente, para ambos patógenos. Cada procedimiento se realizó por triplicado.



2.1.3.3 Obtención de extractos libres de células Los aislados seleccionados se incubaron en 250 mL de caldo MRS o M17, con adición del 10% del inóculo, a una concentración aproximada de 108 UFC/mL durante 48 horas, a 30°C, a 150 rpm. Transcurrido este tiempo, las células se retiraron por centrifugación a 10.000×g por 20 minutos, a 4°C [20]. Cada sobrenadante libre de células se ajustó a un pH de 6,0 con NaOH 1N, para inhibir el efecto de ácidos orgánicos y se filtraron a través de membranas de 0,22 μm [21]. Se realizaron seis diluciones sucesivas en base 2, (cada una por triplicado), para la determinación cuantitativa de la actividad de los sobrenadantes. Las Unidades de Actividad evaluadas fueron 1/2=2×103 UA/mL 1/4=4×103 UA/mL 1/8=8×103 UA/mL 1/16=16×103 UA/mL 1/32=32×103 UA/mL 1/64=64×103 UA/mL 2.1.3.4 Capacidad antimicrobiana de los extractos libres de células La capacidad antimicrobiana fue confirmada usando el método de difusión en gel, por perforación en placa [19,22]. Se tomaron 15 mL de agar tripticasa soya semisólido, fundido a 45°C y se inocularon con 100 µL de cada microorganismo patógeno, a una concentración de 1,5 x 108 UFC/Ml, en cajas independientes. Una vez solidificado el agar, se cortaron pozos de 5 mm de diámetro, con el fin de adicionar 50 μL de las diluciones sucesivas, preparadas por triplicado, para cada sobrenadante. Las placas se almacenaron de 3°-4°C, durante 2 horas, para permitir la difusión del extracto y se incubaron a 37°C, por 24 h. La actividad se expresó en Unidades Arbitrarias por mililitro (UA/mL), la cual está definida como el recíproco de la máxima dilución (base 2) a la cual se obtiene un

halo de inhibición igual o superior a 2mm [20]. La nisina, un agente antimicrobiano producido por Lactococcus lactis, que actúa frente a bacterias Gram positivas [23], se utilizó como sustancia inhibidora de referencia, por ser la única bacteriocina aprobada legalmente, por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y ha sido utilizada en algunos trabajos, a una concentración de 1g/L [24]. Como control negativo se utilizaron caldos MRS y M17, ajustados a un pH de 6. 2.1.3.5 Análisis estadístico La capacidad antimicrobiana de los 32 aislados nativos sobre los dos microorganismos patógenos fue analizada a través de un diseño completamente aleatorio, con un solo factor (Capacidad antimicrobiana) y dos variables respuestas (L. monocytogenes y S. typhimurium), para hallar las diferencias entre los tratamientos, utilizando un nivel de significancia de p <0,05. 2.1.4 RESULTADOS 2.1.4.1 Tamizaje para la detección de la capacidad antimicrobiana De los 32 aislados de BAL, sometidos al método de la mancha en agar, se observó que 18 no presentaron capacidad antimicrobiana frente a los dos patógenos evaluados, 14 mostraron actividad frente a L. monocytogenes y 8 de ellos, frente a S. typhimurium (Cuadro 1). Se encontraron diferencias significativas (p<0,05) entre las zonas de inhibición presentadas por las BAL para los dos patógenos evaluados.



Tabla 2-1. Actividad antimicrobiana de bacterias ácido lácticas utilizando el método de la mancha en agar.

Cepa

Código

Zona de inhibición (mm)*

S. typhimurium L. monocytogenes

Lactococcus sp.

Lactococcus lactis subsp. lactis Q1 ‒ ‒

Lactococcus lactis subsp. lactis (CV56) Q2 ‒ 2,4±0,53

Lactococcus lactis subsp. lactis Q5 2,9±0,17 3,5±0,50

Lactococcus lactis subsp. lactis Q8 ‒ ‒

Lactococcus lactis subsp. lactis Q10 ‒ 2,0±0,15

Lactococcus lactis subsp. lactis Q13 ‒ 2,0±0,10

Lactococcus lactis Q3 ‒ ‒

Lactococcus lactis QDC17 ‒ ‒




Lactococcus lactis subsp. cremoris Q15 ‒ ‒

Leuconostoc sp.

Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Q12 2,5±0,32 2,7±0,31

Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides QDC22 ‒ 2,7±0,46

Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides QDC29 ‒ ‒

Leuconostoc citreum QDC20 ‒ ‒

Enterococcus sp.

Enterococcus sp Q4 ‒ ‒

Enterococcus faecium QDC24 ‒ ‒

Enterococcus faecium QDC25 ‒ 2,0±0,00



Enterococcus lactis Q7 2,5±0,40 2,7±0,57

Pediococcus sp.

Pediococcus acidilactici QDC16 ‒ ‒



Pediococcus acidilactici QDC21 ‒ ‒

Pediococcus pentosaceus QDC19 ‒ ‒

Streptococcus sp.

Streptococcus infantarius Q11 2,7±0,10 2,5±0,50

Streptococcus lutetiensis Q14 ‒ 2,7±0,57

Lactobacillus sp.

Lactobacillus fermentum Q6 10,0±0,06 5,0±0,60

Lactobacillus fermentum QDC32 12,0±1,00 8,0±2,00

Lactobacillus casei QDC31 18,0±0,58 9,0±3,05

Weissella sp.

Weissella viridescens QDC28 _ _

Bacillus sp.

Bacillus amyloliquefaciens Q9 2,0±0,00 3,3±0,58

* Media ± DS de determinaciones por triplicado. (‒) Ausencia de inhibición. Halos <2 mm se consideraron inhibición negativa.

La mayor actividad inhibidora se registró para L. monocytogenes, resultado que evidencia una característica relevante descrita para los compuestos antimicrobianos producidos por BAL, los cuales presentan una fácil interacción con los lípidos aniónicos de la membrana de las bacterias Gram positivas, favoreciendo la formación de poros, que afectan el estado energético y, en consecuencia, producen la muerte celular [1]. Los resultados obtenidos concuerdan con los reportados en otros estudios realizados con BAL aisladas de alimentos fermentados [25,26]. Los aislados identificados como L. fermentum (Q6) (QDC32) y L. casei (QDC31), a diferencia de los demás, presentaron mayor efecto inhibitorio frente a S. typhimurium. Estos resultados son similares a los encontrados por otros autores, quiénes reportan algunas especies de Lactobacilos, con capacidad para inhibir el crecimiento de bacterias Gram negativas [27,28], por diversos

mecanismos, que incluyen la competencia por los nutrientes, la exclusión competitiva y la reducción del pH, por la producción de metabolitos como ácido acético y láctico, lo cual podría explicar este comportamiento [29]. Investigaciones anteriores indican que dentro de las BAL aisladas de productos lácteos tradicionales, que están generalmente asociadas con inhibición de patógenos, se encuentran Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium [19,30]. En este estudio, en particular, los géneros con mayor actividad fueron Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc y Enterococcus.



2.1.4.2 Capacidad antimicrobiana de los sobrenadantes libres de células Un paso para la purificación parcial de sustancias antimicrobianas es la obtención de sobrenadantes libres de células, con posterior neutralización del pH, que facilita la extracción de los metabolitos celulares. En este estudio, se seleccionaron los ocho aislados que presentaron capacidad antimicrobiana para ambos patógenos. Se

obtuvo el extracto de estos aislamientos, para posterior confirmación de su actividad antimicrobiana, mediante el método de difusión en gel por perforación en placa, a diferentes concentraciones. Cada uno de los sobrenadantes estudiados mostró una actividad antimicrobiana variable dependiendo del patógeno, presentando un mejor efecto inhibitorio para Listeria monocytogenes, que para Salmonella typhimurium (Figura 2-1).

Figura 0-1. Capacidad antimicrobiana de sobrenadantes de BAL en UA/ml contra L. monocytogenes y S. typhimurium

Dentro de los sobrenadantes con mayor capacidad se encuentran L. lactis subsp. lactis (Q5), el cual presentó una actividad de 64.000 UA/mL para L. monocytogenes y de 4.000 UA/mL para S. typhimurium, resultados que concuerdan con los reportados por otros autores [31,32,33], quienes observaron que el efecto antimicrobiano de esta BAL, está generalmente asociada a bacterias Gram positivas, especialmente, frente a Listeria monocytogenes. Sin embargo, existen reportes de efecto antimicrobiano de Lactococcus lactis contra Gram negativos [34]. El mecanismo de sensibilidad no ha sido bien determinado, aunque se ha descrito que pequeñas lesiones en la membrana celular externa pueden facilitar el acceso de la sustancia antimicrobiana a la membrana citoplasmática de las mismas

[35]. Entre el grupo de las BAL, Lactococcus lactis juega un papel importante en los procesos de fermentación en la industria láctea. Su papel esencial en la acidificación de la leche, contribuye considerablemente, a la formación del sabor en los quesos mediante la producción de péptidos y aminoácidos, además, impide el crecimiento de bacterias patógenas y deteriorantes y proporciona las condiciones óptimas para la maduración, razones por las cuales se utiliza en cultivos iniciadores comerciales, para la producción de quesos y leches fermentadas [36]. Por su parte, Enterococcus lactis (Q7) presentó una actividad de 64.000 UA/mL para L. monocytogenes, resultados acordes con los reportados por Favaro et al. [37] y Aran et al. [38]. La actividad frente a S.

01000020000300004000050000600007000080000

UA

/ m

l

Código de extractos

S. typhimurium

L. monocytogenes



typhimurium fue baja (2.000 UA/mL). No se encontraron estudios que asocien a los enterococos con inhibición de este patógeno Gram Negativo, debido a que estos microorganismos presentan una capa de lipopolisacáridos en su membrana externa, que actúa como una barrera de permeabilidad para la célula, inhibiendo la entrada de moléculas hacia la membrana citoplasmática [39]. Así mismo, el extracto de Lactobacillus fermentum mostró una actividad de 32.000 UA/mL para L. monocytogenes y de 4.000 UA/mL para S. typhimurium (Figura 2-2), resultados similares a los mencionados por otros autores, quienes han trabajado el efecto de este microorganismo en el control de la proliferación de bacterias patógenas, tanto Gram negativas, como Gram positivas, en productos lácteos fermentados naturalmente. Este microorganismo ha sido descrito como productor de diferentes compuestos antimicrobianos, tales como ácidos orgánicos, catabolitos de oxígeno, bacteriocinas, péptidos de más bajo peso molecular y otros compuestos, como reuterina y reutericiclina [40]. Se han reportado cepas de Leuconostoc mesenteroides, aisladas de alimentos como leche de cabra, queso y productos fermentados, con capacidad para producir sustancias antimicrobianas, con efecto antilisterial [41]. Daba et al. [42] aislaron una cepa de L. mesenteroides UL5 de queso Cheddar, productora de una bacteriocina denominada mesenterocina, que mostró actividad del extracto libre de células mayor de 11,703 UA/mL para L. monocytogenes. Otras bacterias Gram negativas como Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, Salmonella choleraesuis, S. typhimurium, Serratia marcescens, y Yersinia enterocolitica no se vieron afectadas por el sobrenadante. En este estudio, el sobrenadante evaluado de L. mesenteroides presentó una actividad frente a L. monocytogenes de 32.000 UA/mL y una

actividad baja para S. typhimurium de 2.000 UA/mL. Aunque se presentó efecto inhibitorio de los aislados para los dos (2) patógenos, principalmente frente a Listeria monocytogenes, se hace necesario la evaluación tecnológica de algunas de las características de los extractos, tales como el efecto a tratamiento térmico, la estabilidad a diferentes pH y el comportamiento frente a enzimas proteolíticas, que permitan obtener mayor información sobre el tipo de sustancia antimicrobiana presente y definir, a través de técnicas moleculares su identidad como compuesto tipo bacteriocina, descartando la actividad antimicrobiana por compuestos como ácidos orgánicos o peróxido de hidrógeno. Además, los aislados con actividad antimicrobiana pueden ser utilizados en la formulación de un cultivo iniciador autóctono, para la elaboración de productos lácteos, que contribuya a su inocuidad, sin alterarlos sensorialmente. Figura 0-2 Método de difusión en gel por perforación en placa. a. L. fermentum (QDC31) frente a L. monocytogenes;

b. L. fermentum (QDC31) frente S. typhimurium.

a b



2.1.5 CONCLUSIONES Los aislados identificados como Lactococcus lactis subsp. lactis (Q5), Lactobacillus fermentum (Q6), Enterococcus lactis (Q7), Bacillus amyloliquefaciens (Q9), Streptococcus infantarius (Q11), Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (Q12), Lactobacillus casei (QDC31) y Lactobacillus fermentum (QDC32), demostraron tener capacidad antimicrobiana contra S. typhimurium y L. monocytogenes, lo que permite sugerir que sus metabolitos inhibitorios pueden ser aplicados como una alternativa de bioconservación o bioprotección de productos fermentados, para sustituir el uso de conservantes químicos en alimentos. Los sobrenadantes libres de células obtenidos, mostraron una mayor capacidad inhibitoria frente a Listeria monocytogenes, uno de los mayores patógenos asociados a la contaminación de productos lácteos, especialmente, quesos frescos. En este sentido, estas BAL nativas y sus metabolitos antimicrobianos podrían usarse como una alternativa para el control de este patógeno. La actividad antimicrobiana presentada frente a S. typhimurium es interesante, debido a que son pocos los trabajos que reportan inhibición de BAL y sus metabolitos frente a patógenos Gram negativos. 2.1.6 REFERENCIAS [1] FAVARO, L., PENNA, ALB. and TODOROV, SD. Bacteriocinogenic LAB from cheeses–Application in biopreservation?. Trends in Food Science & Technology, 41(1), 2015, p. 37-48. [2] TERZIĆ-VIDOJEVIĆ, A., TONKOVIĆ, K., PAVUNC, AL., BEGANOVIĆ, J., STRAHINIĆ, I., KOJIĆ, M. and GREGUREK, L. Evaluation of autochthonous lactic acid bacteria as starter cultures for production of white pickled and fresh soft cheeses. LWT-Food Science and Technology, 63(1), 2015, p. 298-306.

[3] LEITE, AMO., MIGUEL, MAL., PEIXOTO, RS., RUAS-MADIEDO, P., PASCHOALIN, VMF., MAYO, B. and DELGADO, S. Probiotic potential of selected lactic acid bacteria strains isolated from Brazilian kefir grains. Journal of Dairy Science, 98(6), 2015, p. 3622-3632. [4] ZANIRATI, DF., ABATEMARCO, M., DE CICCO SANDES, SH., NICOLI, JR., NUNES, ÁC and NEUMANN, E. Selection of lactic acid bacteria from Brazilian kefir grains for potential use as starter or probiotic cultures. Anaerobe, 32, 2015, p. 70-76. [5] TERZIĆ-VIDOJEVIĆ, A., TONKOVIĆ, K., PAVUNC, AL., BEGANOVIĆ, J., STRAHINIĆ, I., KOJIĆ, M. and GREGUREK, L. Evaluation of autochthonous lactic acid bacteria as starter cultures for production of white pickled and fresh soft cheeses. LWT-Food Science and Technology, 63(1), 2015, p. 298-306. [6] DURANGO, M., SEPÚLVEDA, U., GUTIÉRREZ, M. y LONDOÑO, A. Caracterización de ácidos grasos, diacetilo y acetoina en Quesillo colombiano. Vitae, 19(1), 2012, p. 376-378. [7] NOVOA, CF. y LÓPEZ NC. Evaluación de la vida útil sensorial del Queso Doble Crema con dos niveles de grasa. Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, 55(2), 2008, p. 91-99. [8] CARRASCOSA, C., MILLÁN, R., SAAVEDRA, P., JABER, JR., RAPOSO, A. and SANJUÁN, E. Identification of the risk factors associated with cheese production to implement the hazard analysis and critical control points (HACCP) system on cheese farms. Journal of Dairy Science, 99(4), 2016, p. 2606-2616. [9] MONTEL, MC., BUCHIN, S., MALLET, A., DELBES-PAUS, C., VUITTON, DA., DESMASURES, N. and BERTHIER, F. Traditional cheeses: rich and diverse microbiota with associated



benefits. International Journal of Food Microbiology, 177, 2014, p. 136-154. [10] INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Y MINISTERIO DE PROTECCIÓN SOCIAL. Evaluación de Riesgos de Listeria monocytogenes en queso fresco en Colombia. Bogotá (Colombia): Imprenta Nacional de Colombia, 2011, 22 p. [11] GALLEGOS, JG., ARRIETA, G., MÁTTAR, S., POUTOU, R., TRESPALACIOS, A. and CARRASCAL, A. Frecuencia de Listeria spp., en quesos colombianos costeños. Revista MVZ Córdoba,12(2), 2007, p. 996-1012. [12] ALBARRACIN, FY., SARMIENTO, P., CARRASCAL, AK. and MERCADO, M. Estimación de la proporción de Listeria monocytogenes y Salmonella spp en quesos frescos (queso de hoja, cuajada) y queso Doble Crema producidos y comercializados en el Municipio de Pamplona, Norte de Santander. Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Básicas, 4(2), 2007, p.30-41. [13] COELHO, MC., SILVA, CCG., RIBEIRO, SC., DAPKEVICIUS, MLNE. and ROSA, HJD. Control of Listeria monocytogenes in fresh cheese using protective lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 191, 2014, p. 53-59. [14] MILLER, S., AMADI, V., STONE, D., JOHNSON, R., HARIHARAN, H., and ZIEGER, U. Prevalence and antimicrobial susceptibility of Salmonella spp. in small Indian mongooses (Herpestes auropunctatus) in Grenada, West Indies. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 37(4), 2014, p. 205-210. [15] MENDEZ ROJAS, María Isabel. Identificación bioquímica y evaluación de la capacidad bacteriocinogénica de las bacterias ácido lácticas aisladas de quesillos artesanales. Cuenca, 2016. 5 p. Trabajo de grado (Ingeniero de alimentos). Universidad

del Azuay. Facultad de Ciencia y Tecnología. Escuela de Ingeniería de Alimentos. [16] LIU, H., ZHANG, L., YI, H., HAN, X. and CHI, C. Identification and characterization of plantaricin Q7, a novel plantaricin produced by Lactobacillus plantarum Q7. LWT-Food Science and Technology, 71, 2016, p. 386-390. [17] OUALI, F.A., AL KASSAA, I., CUDENNEC, B., ABDALLAH, M., BENDALI, F., SADOUN, D. and DRIDER, D. Identification of lactobacilli with inhibitory effect on biofilm formation by pathogenic bacteria on stainless steel surfaces. International Journal of Food Microbiology, 191, 2014, p. 116-124. [18] RIPAMONTI, B., AGAZZI, A., BERSANI, C., DE DEA, P., PECORINI, C., PIRANI, S., ... and TIRLONI, E. Screening of species-specific lactic acid bacteria for veal calves multi-strain probiotic adjuncts. Anaerobe, 17(3), 2011, p. 97-105. [19] GONZÁLEZ, L., SANDOVAL, H., SACRISTÁN, N, CASTRO, JM, FRESNO, JM. and TORNADIJO, ME. Identification of lactic acid bacteria isolated from Genestoso cheese throughout ripening and study of their antimicrobial activity. Food Control, 18(6), 2007, p. 716-722. [20] SANKAR, NR., PRIYANKA, VD., REDDY, PS., RAJANIKANTH, P., KUMAR, VK. and INDIRA, M. Purification and characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum isolated from cow milk. International Journal of Microbiological Research, 3(2), 2012, p. 133-137. [21] IRANMANESH, M., EZZATPANAH, H. and MOJGANI, N. Antibacterial activity and cholesterol assimilation of lactic acid bacteria isolated from traditional Iranian dairy products. LWT-Food Science and Technology, 58(2), 2014, p. 355-359. [22] HERREROS, MA., SANDOVAL, H., GONZÁLEZ, L., CASTRO, JM., FRESNO,



JM. and TORNADIJO, M.E. Antimicrobial activity and antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Armada cheese (a Spanish goats’ milk cheese). Food Microbiology, 22(5), 2005, p. 455-459. [23] SIROLI, L., PATRIGNANI, F., SERRAZANETTI, DI., VANNINI, L., SALVETTI, E., TORRIANI, S.,... and LANCIOTTI, R. Use of a nisin-producing Lactococcus lactis strain, combined with natural antimicrobials, to improve the safety and shelf-life of minimally processed sliced apples. Food Microbiology, 54, 2016, p. 11-19. [24] AMADO, IR., FUCIÑOS, C., FAJARDO, P., GUERRA, NP. and PASTRANA, L. Evaluation of two bacteriocin-producing probiotic lactic acid bacteria as inoculants for controlling Listeria monocytogenes in grass and maize silages. Animal Feed Science and Technology, 175(3), 2012, p. 137-149. [25] DE ALMEIDA JÚNIOR, WLG., DA SILVA FERRARI, Í., DE SOUZA, JV., DA SILVA, CDA., DA COSTA, MM. and DIAS, FS. Characterization and evaluation of lactic acid bacteria isolated from goat milk. Food Control, 53, 2016, p. 96-103. [26] TERZIĆ-VIDOJEVIĆ, A., TONKOVIĆ, K., PAVUNC, AL., BEGANOVIĆ, J., STRAHINIĆ, I., KOJIĆ, M.,... and GREGUREK, L. Evaluation of autochthonous lactic acid bacteria as starter cultures for production of white pickled and fresh soft cheeses. LWT-Food Science and Technology, 63(1), 2015, p. 298-306. [27] ABBAS, MM. and MAHASNEH, AM. Isolation of Lactobacillus strains with probiotic potential from camel’s milk. African Journal of Microbiology Research, 8(15), 2014, p. 1645-1655. [28] MAHMOUDI, I., BEN MOUSA, O., KHALDI, T.E.M., KEBOUCHI, M., SOLIGOT, C., LE ROUX, Y. and HASSOUNA, M. Functional in vitro screening of Lactobacillus strains isolated from Tunisian camel raw milk

toward their selection as probiotic. Small Ruminant Research, 137, 2016, p. 91-98. [29] KUMAR, A. and KUMAR, D. Characterization of Lactobacillus isolated from dairy samples for probiotic properties. Anaerobe, 33, 2015, p. 117-123. [30] LEITE, AMO., MIGUEL, MAL., PEIXOTO, RS., RUAS-MADIEDO, P., PASCHOALIN, VMF., MAYO, B. and DELGADO, S. Probiotic potential of selected lactic acid bacteria strains isolated from Brazilian kefir grains. Journal of Dairy Science, 98(6), 2015, p. 3622-3632. [31] KRUGER, MF., DE SOUZA BARBOSA, M., MIRANDA, A., LANDGRAF, M., DESTRO, MT., TODOROV, SD. and DE MELO FRANCO, BDG. Isolation of bacteriocinogenic strain of Lactococcus lactis subsp. lactis from Rocket salad (Eruca sativa Mill.) and evidences of production of a variant of nisin with modification in the leader-peptide. Food control, 33(2), 2013, p. 467-476. [32] SIROLI, L., PATRIGNANI, F., SERRAZANETTI, DI., VANNINI, L., SALVETTI, E., TORRIANI, S., ... and LANCIOTTI, R. Use of a nisin-producing Lactococcus lactis strain, combined with natural antimicrobials, to improve the safety and shelf-life of minimally processed sliced apples. Food Microbiology, 54, 2016, p. 11-19. [33] LEE, NK., HAN, KJ., SON, SH., EOM, SJ., LEE, SK. and PAIK, HD. Multifunctional effect of probiotic Lactococcus lactis KC24 isolated from kimchi. LWT-Food Science and Technology, 64(2), 2015, p. 1036-1041. [34] PERIN, LM. and NERO, LA. Antagonistic lactic acid bacteria isolated from goat milk and identification of a novel nisin variant Lactococcus lactis. BMC Microbiology, 14(1), 2014, p. 36. [35] RODRIGUEZ, E., CALZADA, J., ARQUÉS, J.L., RODRIGUEZ, J.M., NUNEZ,



M. and MEDINA, M. Antimicrobial activity of pediocin-producing Lactococcus lactis on Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157: H7 in cheese. International Dairy Journal, 15(1), 2005, p. 51-57. [36] PISANO, MB., FADDA, ME., MELIS, R., CIUSA, ML., VIALE, S., DEPLANO, M. and COSENTINO, S. Molecular identification of bacteriocins produced by Lactococcus lactis dairy strains and their technological and genotypic characterization. Food Control, 51, 2015, p. 1-8. [37] FAVARO, L., BASAGLIA, M., CASELLA, S., HUE, I., DOUSSET, X., DE MELO FRANCO, BDG., and TODOROV, SD. Bacteriocinogenic potential and safety evaluation of non-starter Enterococcus faecium strains isolated from home made white brine cheese. Food Microbiology, 38, 2014, p. 228-239. [38] ARAN, H., BISCOLA, V., EL-GHAISH, S., JAFFRÈS, E., DOUSSET, X., PILLOT, G.,... and HWANHLEM, N. Bacteriocin-producing Enterococcus faecalis KT2W2G isolated from mangrove forests in southern Thailand: purification, characterization and safety evaluation. Food Control, 54, 2015, p. 126-134.

[39] SCHELEGUEDA, LI., VALLEJO, M., GLIEMMO, MF., MARGUET, ER. and CAMPOS, CA. Synergistic antimicrobial action and potential application for fish preservation of a bacteriocin produced by Enterococcus mundtii isolated from Odontesthes platensis. LWT-Food Science and Technology, 64(2), 2015, p. 794-801. [40] TULUMOĞLU, Ş., KAYA, H. İ., & ŞIMŞEK, Ö. Probiotic characteristics of Lactobacillus fermentum strains isolated from tulum cheese. Anaerobe, 30, 2014, p. 120-125. [41] XIRAPHI, N., GEORGALAKI, M., RANTSIOU, K., COCOLIN, L., TSAKALIDOU, E., & DROSINOS, E. H. Purification and characterization of a bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides E131. Meat Science, 80(2), 2008, p. 194-203. [42] DABA, H., PANDIAN, S., GOSSELIN, J.F., SIMARD, R.E., HUANG, J. AND LACROIX, C. Detection and activity of a bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides. Applied and Environmental Microbiology, 57(12), 1991, p. 3450-3455

Capítulo 2: Instrucciones de autor revista de biotecnología en el sector agropecuario y

agroindustrial 62

2.2 INSTRUCCIONES DE AUTOR REVISTA DE BIOTECNOLOGÍA EN EL SECTOR

AGROPECUARIO Y AGROINDUSTRIAL

2.2.1 Políticas editoriales

2.2.1.1 Compromiso de tipo formal. Con la remisión del manuscrito postulado para evaluación

y publicación, el (los) autor(es) acepta(n) la totalidad de las condiciones estipuladas en las

normas.

2.2.1.2 Compromiso de tipo ético. Los autores deben establecer un compromiso de tipo ético en

cuanto a la originalidad del manuscrito postulado, por medio de una carta en la que se acepta este

compromiso: ''El autor(es) firmante(s) declara que el artículo presenta resultados originales de

una investigación, que no han sido publicados ni están siendo considerados para publicación en

otra revista, ajustándose además a las normas éticas internacionales de propiedad intelectual y

autoría''. En la carta se deben incluir los datos personales de cada uno de los autores:

nacionalidad, escolaridad, correo electrónico institucional, teléfonos para su ubicación o

dirección postal y filiación institucional, o en su defecto, la dirección Web donde pueden ser

consultados.

2.2.1.3 Derechos de autor. Con el envío de los trabajos, los autores(as) conceden "Derechos de

Autor" a la revista, por lo que los trabajos no pueden tener derechos otorgados a terceros, a la

fecha de envío del artículo. La concesión de Derechos de Autor significa la autorización para que

la revista pueda hacer uso del artículo, o parte de él, con fines de divulgación y difusión de la

actividad científica-tecnológica. En ningún caso, dichos derechos afectarán la propiedad

intelectual que es propia de los(as) autores(as).

2.2.2 Tipos de artículos.

2.2.2.1 Artículos de investigación científica. Documento que presenta, de manera detallada, los

resultados originales de proyectos de investigación que han sido culminados. Está compuesto por

las siguientes secciones: 1. INTRODUCCIÓN, 2. MÉTODO, 3. RESULTADOS, 4.

CONCLUSIONES y 5. REFERENCIAS. Los agradecimientos son opcionales y se incluyen

luego de las conclusiones.


agroindustrial 63

2.2.2.2 Artículo de reporte de caso. Documento que presenta los resultados de un estudio sobre

una situación particular con el fin de dar a conocer las experiencias técnicas y metodológicas

consideradas en un caso específico. Incluye una revisión sistemática comentada de la literatura

sobre casos análogos. Sus partes son: 1. INTRODUCCIÓN, 2. MÉTODO, 3. RESULTADOS, 4.

CONCLUSIONES y 5. REFERENCIAS. Los agradecimientos son opcionales y se incluyen

luego de las conclusiones.

2.2.2.3 Artículos de reflexión. Documento que presenta resultados de investigación sobre un

tema específico bajo una óptica analítica, interpretativa y crítica del(los) autor(es) con base en

fuentes originales (por lo menos 30 referencias). La estructura es: 1. RESUMEN, 2.

INTRODUCCIÓN, 3. DESARROLLO DEL TEMA, 4. CONCLUSIONES y 5. REFERENCIAS.

2.2.2.4 Artículo de revisión (Review). Documento resultado de una revisión analítica y crítica

de literatura (mínimo 50 referencias) sobre un campo en ciencia o tecnología en el que se

analizan, sistematizan e integran los resultados de investigaciones publicadas para mostrar los

avances y las tendencias de desarrollo más los aportes de los proponentes. Está compuesto por: 1.

RESUMEN, 2. INTRODUCCIÓN, 3. DESARROLLO DEL TEMA, 4. CONCLUSIONES y 5.

REFERENCIAS.

2.2.2.5 Artículo corto. Documento breve que presenta resultados originales preliminares o

parciales de una investigación científica o tecnológica, que por lo general requieren de una pronta

difusión. La extensión es de 5 a 8 páginas y está compuesto por: 1. INTRODUCCIÓN, 2.

MÉTODO, 3. RESULTADOS, 4. CONCLUSIONES y 5. REFERENCIAS.

2.2.2.6 Cartas al editor. Posiciones críticas, analíticas o interpretativas sobre los documentos

publicados en la revista, que a juicio del Comité editorial constituyen un aporte importante a la

discusión del tema por parte de la comunidad científica de referencia.

2.2.2.7 Editorial. Documento escrito por el editor, un miembro del comité editorial o un

investigador invitado sobre orientaciones en el dominio temático de la revista, sobre aportes a los

investigadores en cuestiones de presentación y estructura de sus artículos, sobre reflexiones sobre

la presentación de documentos escritos, su normatividad, su importancia y otros.


agroindustrial 64

La INTRODUCCIÓN debe resaltar la importancia de la investigación, presentar la literatura

relacionada y entregar antecedentes necesarios para comprender la hipótesis de los autores,

terminando con un párrafo que indique claramente los objetivos de la investigación. El

MÉTODO debe tener suficiente información que permita a otro investigador replicar el ensayo y

lograr los mismos resultados, así como la inclusión del diseño experimental, el análisis

estadístico y las referencias de los métodos ya publicados. Los RESULTADOS se deben

presentar en forma clara, apoyados con cuadros y figuras, con el análisis estadístico y de los

alcances de otros investigadores. Las CONCLUSIONES deben redactarse de acuerdo con los

objetivos de la investigación explicando claramente los principales resultados de la investigación.

Las REFERENCIAS deben contener todos los documentos consultados.

2.2.3 Forma y preparación de manuscritos.

Todo documento remitido a BIOTECNOLOGÍA EN EL SECTOR AGROPECUARIO Y

AGROINDUSTRIAL debe cumplir con:

● Originalidad: el aporte debe ser totalmente inédito, no publicado en ningún otro medio,

excepto casos justificados.

● Consistencia metodológica: en donde se haga evidente el uso de métodos y técnicas de

investigación válidos.

● Significación del asunto tal que informe o ilustre situaciones relevantes en el sector

Agropecuario y Agro-industrial.

● Impacto para un amplio sector de la academia, la investigación y estudiantes.

● Avance del campo: en el cual sea claro y evidente el aporte a consideraciones y prácticas

de mejora en el campo de investigación Agropecuario y Agro-industrial.

● Consideraciones éticas.

● Estilo de redacción claro, conciso y ordenado, evitando jergas personales y expresiones

locales.

Los elementos normativos a seguir en todos los manuscritos son:

2.2.3.1 Extensión y formato. Formato tamaño carta (21,59 cm de ancho y 27,94 cm de alto) con

interlineado sencillo y contenido a doble columna (7,5 cm de ancho de columna) a partir de la

INTRODUCCIÓN, escrito en Arial recta (excepto los nombres científicos que van en cursiva) de


agroindustrial 65

11 puntos, márgenes de 3 cm en el borde superior, 2 cm en el inferior y 2,5 cm en las márgenes

laterales; las cifras decimales se separan con coma y los nombres científicos se escriben en

cursiva.

2.2.3.2 Título del manuscrito. Debe hacer referencia al contenido de una forma clara y concisa,

escrito en Arial recta (excepto los nombres científicos) 11 puntos, mayúscula, negrilla y centrado;

no debe exceder 15 palabras: si ello no es posible, deberá incluir un subtítulo luego de dos

puntos. Inmediatamente después deben ir las dos traducciones del idioma original.

2.2.3.3 Información del autor (es). Los autores se nombran de acuerdo con la importancia de su

contribución en la investigación o en la preparación del manuscrito, separados entre sí por comas

y enumerados con superíndice. Posterior a los títulos, a dos interlíneas, centrado, en mayúscula y

sin negrilla, incluir primer y segundo nombre si lo tiene, primer y segundo apellido separados por

un guión medio. En nota al pie de página (Arial 8 puntos, justificada a ambos márgenes y en la

parte inferior de la página) se indicará la filiación de cada autor: institución a la cual pertenece,

dependencia, grupo de investigación, último título académico, ciudad y país. En otra línea, luego

de la palabra Correspondencia (en negrilla) y dos puntos, debe aparecer el correo institucional del

autor elegido para el envío de correspondencia.

2.2.3.4 Resumen. Debe ser conciso, escrito en Español, Inglés (ABSTRACT) y Portugués

(RESUMO), en un solo párrafo justificado sin exceder de 200 palabras. Incluirá la justificación,

objetivos, metodología, resultados precisos y conclusiones de la investigación haciendo énfasis

en los logros alcanzados, así como los límites de la validez y las implicaciones de los resultados.

Los títulos deben justificarse al margen izquierdo, en mayúscula y negrilla, iniciando la escritura

luego de dos interlíneas.

2.2.3.5 Palabras Clave. Sirven para identificar el manuscrito en bases de datos internacionales

de manera que un potencial usuario pueda acceder en forma efectiva. Van luego de cada resumen,

mínimo tres (3) y máximo cinco (5) palabras clave que no deben hacer parte del título del

artículo, incluyendo en ellas los nombres científicos en cursiva. El título en mayúscula, negrilla,

en Español (PALABRAS CLAVE), Inglés (KEYWORDS) y Portugués (PALAVRAS-CHAVE)

seguido de dos puntos. La primera letra de cada palabra en mayúscula, separadas por coma y con

punto al final.


agroindustrial 66

2.2.3.6 Cuadros y figuras. Deberán aparecer dentro del texto y procesarse en el formato original,

con buen contraste y resolución para evitar policromías y facilitar la diagramación, en blanco y

negro, escala de grises o tono maté. El título va en la parte superior y no debe superar dos líneas,

en Arial recta normal 9, separado por una interlinea y con punto final; debe incluir la palabra

Cuadro o Figura seguido del número arábigo consecutivo (en negrilla), un punto y una breve

descripción (Ejemplo: Cuadro 1. Título descriptivo). Se deben usar líneas horizontales y

verticales para separar las entradas del cuadro y cada columna debe tener encabezado (en

negrilla, con mayúscula inicial). El tamaño de fuente al interior de un cuadro es Arial 9 puntos

normal y, en el caso de necesitarse algún pie de cuadro/figura o fuente de consulta, debe estar

escrito en Arial 8 puntos normal.

2.2.3.7 Títulos (Todos en arial recta 11 puntos). Los de primer nivel (partes principales del

manuscrito) se escriben con mayúscula sostenida y negrilla; los de segundo nivel con mayúscula

inicial, negrilla y sin punto final, separados del texto por dos interlíneas. Los de tercer nivel con

mayúscula inicial, negrilla y un punto seguido, continuando el texto en el mismo renglón luego

de un espacio.

2.2.3.8 Expresiones matemáticas. Las expresiones matemáticas deben ser escritas dejando dos

espacios sobre, debajo y entre cada una de ellas y se debe utilizar el editor de ecuaciones de MS

Word. Deben seguir un formato uniforme, justificarse al margen izquierdo y usar la expresión

(Ec.1) con números arábigos consecutivos justificada al margen derecho (para mayor facilidad,

insertarlas en un cuadro de dos columnas, sin bordes), citándolas en el sitio oportuno. El

significado de las variables y sus respectivas unidades deben aparecer luego de que se utilicen por

primera vez, usando el Sistema Internacional de Unidades (SI).

2.2.3.9 Conclusiones. Se describen de forma clara y precisa las principales CONCLUSIONES

del estudio presentado, derivado del análisis de los resultados y con base en los objetivos

planteados

2.2.3.10 Agradecimientos. Si el autor(es) lo desea (n), se podrá incluir una sección de

AGRADECIMIENTOS, redactada en forma sobria y que no supere 4 líneas, justo después de las

Conclusiones.


agroindustrial 67

2.2.3.11 Referencias. Evitar el uso de tesis, de informes locales y de poco alcance, y de trabajos

de congresos (denominada literatura gris), a menos que sea necesario. Dentro del manuscrito se

deben indicar según el orden de aparición y encerradas entre corchetes [1,2], notación que se

mantendrá en la sección de REFERENCIAS. Se deben considerar que mínimo el 70% de ellas

deben ser recientes (de los últimos tres años) y corresponder a publicaciones científicas de

corriente principal que puedan respaldar lo escrito. Si la referencia cuenta con 4 o más autores,

usar et al.

2.2.4 Estructura para las referencias.

2.2.4.1 Artículo de revista. SMITH, J.S., SORIA-WHITE, R. and WEBBER, A. Chaos in a

model offorced quasi-geostrophic flow over topography: an application of Melinkov's method.

Food Control, 2(3), 1991, p. 511-547

2.2.4 2 Libro. BILLAS, G.L. y GOSPS, J. Física cuántica. 4 ed. Madrid (España): Acribia, 1990,

450 p.

2.2.4.3 Capítulo de libro. LEWIS, P. and STEVENS, J.G. En: Time Series Prediction. Modeling

time series by using Multivariate Adaptive Regression Spiines (MARS). 1 ed. Madrid (España):

Iberoamericana, 1994, p. 297-318.

2.2.4.4 Memoria de evento. ÁLZATE, N., BOTERO, T. y CORREA, D. El arte de la escritura

de artículos. Memorias XIX Congreso Latinoamericano de Ponencias Científicas. Córdoba

(Argentina): Instituto Argentino de Investigaciones, Tomo II, 2000, p. 219-228.

2.2.4.5 Normas técnicas. AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS

(AOAC). ASTM D1434–82: Standard test method for determining gas permeability

characteristics of plastic film and sheeting. Pennsylvania (USA): 2009, 13 p.

2.2.4.6 Reporte de un organismo o Gobierno. COLOMBIA. MINISTERIO DE

AGRICULTURA Y DESARROLLO RURAL. La situación de la provisión de alimentos en un

mundo moderno. Bogotá (Colombia): 1997, 57 p.


agroindustrial 68

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Capítulo 3: Caracterización preliminar de sustancias inhibidoras producidas por Bacterias Ácido

Lácticas autóctonas aisladas de Queso Doble Crema y Quesillo 69

3. Capítulo 3

3.1 Caracterización preliminar de sustancias inhibidoras producidas por Bacterias Ácido

Lácticas autóctonas aisladas de Queso Doble Crema y Quesillo

Mayra A. Fuentes Vanegasa,*

, Mónica M. Durango Zuletab, Margarita G. Buriticá

b, José U.

Sepúlveda Valenciaa.

a Grupo de Investigación en Ciencia y Tecnología de Alimentos. Facultad de Ciencias Agrarias.

Departamento de Ingeniería Agrícola y Alimentos. Laboratorio de Productos Lácteos.

Universidad Nacional de Colombia sede Medellín

b Grupo Biociencias. Facultad de Ciencias de la Salud. Laboratorio de Control Calidad.

Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia

* Correspondencia: [email protected]

3.1.1 Resumen

Las Bacterias Acido-Lácticas (BAL) son un grupo de microorganismos benéficos, con un

potencial importante para su uso en biopreservación, porque producen compuestos tipo

bacteriocinas, que inhiben el crecimiento de patógenos transmitidos por alimentos y son

generalmente reconocidos, como seguros, para los consumidores. La capacidad antimicrobiana y

las características fisicoquímicas de las sustancias inhibidoras producidas por BAL aisladas de

queso doble crema y quesillo fueron determinadas, con el fin de evaluar su potencial inhibitorio

contra bacterias patógenas transmitidas por alimentos. En una primera serie, una colección de 32

aislados de BAL fueron evaluadas por su actividad inhibitoria contra dos (2) cepas de



microorganismos indicadores, como Listeria monocytogenes ATCC 7644 y Salmonella enterica

subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 13311. Los aislados identificados como

Lactococcus lactis subsp. lactis (Q5), Lactobacillus fermentum (Q6), Enterococcus lactis (Q7),

Bacillus amyloliquefaciens (Q9), Streptococcus infantarius (Q11), Leuconostoc mesenteroides

subsp. mesenteroides (Q12), Lactobacillus casei (QDC31) y Lactobacillus fermentum (QDC32)

mostraron las actividades más altas, por lo tanto, se sometieron a ensayos posteriores, para aclarar

la naturaleza de la sustancia inhibitoria. Se obtuvo un sobrenadante libre de células, para cada

BAL, recuperadas en medios de cultivos selectivos MRS (bacilos) y M17 (cocos), los cuales

fueron sometidos a diferentes condiciones de pH (4,0; 7,0; 10,0); temperatura (60°C/15 min.,

60°C/30 min., 80°C/15 min. y 80°C/30 min.) y enzimas proteolíticas (proteinasa K). Los

extractos fueron concentrados y cuantificados y se determinó su peso molecular, a través de una

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (SDS- PAGE). El sobrenadante libre de células del

aislado, identificado como Lactococcus lactis subsp. lactis Q5 presentó una actividad superior,

equivalente a 64000 UA/mL para L. monocytogenes y 4000 UA/mL para S. typhimurium. Todos

los sobrenadantes libre de células exhibieron actividad antimicrobiana cuando fueron tratados a

un pH de 7 y presentaron sensibilidad a la enzima proteolítica, al igual que a la mayoría de los

tratamientos térmicos evaluados. El extracto de Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides

presentó la mayor concentración de proteína total y las mayores Unidades de Actividad, para los

dos (2) patógenos. El extracto concentrado del aislado identificado como Lactococccus lactis

subsp. lactis presentó una banda con un peso molecular <3,5 KDa. Estos resultados demuestran

la promisoria utilidad de los metabolitos antimicrobianos, especialmente de las bacteriocinas,

para ser utilizados como bioconservantes naturales para el control de microorganismos patógenos

en alimentos.



PALABRAS CLAVE: bacteriocina, biopreservación, bacterias ácido lácticas, antimicrobianos

naturales.

3.1.2 Introducción

La seguridad alimentaria continúa siendo un desafío importante para los productores de alimentos

y para la legislación, tratando de brindar una protección adecuada a los consumidores. Sin

embargo, a pesar del avance en microbiología y la aplicación de procedimientos de seguridad, las

intoxicaciones alimentarias, aún continúan siendo un problema de salud pública en el mundo. La

lucha contra el problema de patógenos en alimentos se ha visto influenciado en los últimos años,

por varias tecnologías alternativas, que incluyen el uso de cultivos protectores, los cuales logran

la conservación biológica, sin cambiar las propiedades nutricionales y sensoriales del producto27

.

En este contexto, las BAL poseen un potencial importante en biopreservación, por ser bacterias

seguras, que a menudo, predominan de forma natural en la microbiota de muchos alimentos y

pueden actuar como potentes inhibidores/competidores de microorganismos contaminantes o

deteriorantes. Sus propiedades antagonistas e inhibidoras se basan en diferentes propiedades, que

incluyen, la competencia por los nutrientes y la producción de uno o más metabolitos

antimicrobianos, tales como ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, diacetilo, enzimas

inhibidoras y bacteriocinas17,34

. Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos naturales,

generalmente activos frente a un rango limitado de bacterias, que están estrechamente

relacionados con la cepa productora47,54

; además, algunas son activas frente a bacterias Gram

negativas tales como Escherichia coli y Salmonella typhimurium20

. Estos péptidos son

sintetizados en el ribosoma, aunque algunos presentan traducción modificada. Basados en sus

propiedades estructurales, fisicoquímicas y moleculares, las bacteriocinas de BAL se pueden

dividir en tres (3) clases: clase I o lantibióticos, que son péptidos pequeños, catiónicos,



hidrofóbicos, estables al calor, que contienen aminoácidos inusuales, como lantionina y 3- metil

lantionina y presentan modificación post-transduccional; clase II, péptidos pequeños, catiónicos,

hidrofóbicos, estables al calor y no presentan modificación post- transduccional. Dentro de esta

clase se pueden distinguir tres (3) subclases: La 2a, las cuales presentan un fuerte efecto

antilisterial; 2b, las cuales requieren de dos (2) cadenas polipeptídicas para su actividad; y 2c o

bacteriocinas, que no pertenecen a ninguno de los otros dos (2) grupos y la clase III que son un

grupo de proteínas grandes, hidrofílicas y sensibles al calor16,18,19

. La actividad de estos

compuestos, no es uniforme y depende de la composición química y de las condiciones físicas de

los alimentos; donde influyen, principalmente el pH, la actividad de las proteasas y otras enzima

y la temperatura. Las concentraciones de sal, pueden reducir el crecimiento de las BAL, y en

consecuencia, la producción de bacteriocinas, además de proteger a bacterias patógenas, tales

como Listeria monocytogenes de su acción3. Las bacteriocinas se encuentran entre los

bioconservantes naturales más prometedores, por su facilidad de producción, su sensibilidad a las

proteasas en el tracto gastrointestinal y su efectividad en el control de patógenos transmitidos por

alimentos, que no sólo ponen en peligro la salud humana, sino que también, generan graves

pérdidas a la industria alimentaria11,54

.

La nisina es la única bacteriocina aprobada por la FDA (Food and Drug Administration),

ampliamente usada en la preservación de quesos. Sin embargo, su espectro de actividad limitada

con respecto al pH e insolubilidad, genera la necesidad de estudiar otros péptidos, que

demuestren una mayor estabilidad para su uso en alimentos fermentados13

. El objetivo de este

estudio fue caracterizar parcialmente, sustancias inhibitorias de BAL autóctonas, aisladas de

Queso Doble Crema y Quesillo, a través de diferentes tratamientos fisicoquímicos (temperatura y

pH) y enzimáticos (Proteinasa K), para probar su actividad antimicrobiana frente a



microorganismos como Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC® 1331

y Listeria monocytogenes ATCC® 7644.

3.1.3 Materiales y métodos

3.1.3.1 Aislados bacterianos y condiciones de cultivo

Se utilizaron 32 aislados de BAL, recuperados de Queso Doble Crema (QDC) y Quesillo (Q), los

cuales se criopreservaron a -70°C, utilizando caldo De Man Rogosa y Sharpe (MRS, Difco

Laboratories, Detroit, USA) para bacilos y Caldo M17 (Difco Laboratories, Detroit, USA) para

cocos, adicionadas con glicerol al 30% (v/v), como agente crioprotector1. Para la realización de

los ensayos, los aislados se reactivaron en los medios de cultivo selectivos ya mencionados, a

30°C, por 24 horas, en condiciones de anaerobiosis40

. Los microorganismos indicadores

utilizados fueron Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC® 1331 y

Listeria monocytogenes ATCC® 7644, conservados a -70°C, en caldo de Infusión Cerebro

Corazón (BHI, Merck, Darmstadt, Alemania) con 30% de glicerol (v/v). Salmonella

typhimurium fue recuperada en agar Rambach (Merck, Darmstadt, Alemania) y Listeria

monocytogenes en agar PALCAM (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom)2. Después de la

incubación a 37 °C, por 24 horas, ambas cepas fueron subcultivadas en agar tripticasa soya

(Merck®), bajo las mismas condiciones45

.

3.1.3.2 Tamizaje de BAL para determinar su potencial inhibitorio

La capacidad inhibidora de cada aislado de BAL fue evaluada frente a Salmonella enterica subsp.

enterica serovar Typhimurium ATCC® 1331 y Listeria monocytogenes ATCC® 7644,

utilizando el método de la mancha en agar, descrito por González et al.21

. Los aislados que

presentaron zonas de inhibición iguales o mayores a 2 mm de diámetro, frente a los dos (2)



microorganismos patógenos fueron seleccionados para ensayos posteriores. Cada procedimiento

se realizó por triplicado.

3.1.3.3 Obtención del sobrenadante libre de células

Los aislados seleccionados se incubaron en 500 mL de caldo MRS o M17, con adición del 10%

del inóculo, a una concentración aproximada de 108 UFC/mL, durante 48 horas, a 30°C, a 150

rpm. El sobrenadante libre de células fue obtenido por centrifugación a 10000×g, por 20 minutos,

a 4°C y su pH fue ajustado a 6,0 con NaOH 1N (Merck®), para excluir el efecto de los ácidos

orgánicos. Posteriormente, se filtró utilizando membranas de 0,22 µm (Dorsan®)17

. La

capacidad inhibidora del sobrenadante libre de células fue evaluada frente a Salmonella enterica

subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC® 1331 y Listeria monocytogenes ® 7644, usando

el método de difusión en gel, por perforación en placa, descrito por González et al.21

y Herreros

et al.23

. Se usó Nisina (Merck®) como control positivo (1g/L) y caldo MRS o M17, neutralizados

a un pH de 6,0 como control negativo

3.1.3.4 Caracterización de la sustancia inhibidora

La sensibilidad de los sobrenadantes libres de células a enzimas proteolíticas, tratamiento térmico

y exposición a diferentes valores de pH, se realizó en ocho (8) tratamientos independientes, por

duplicado.

3.1.3.4.1 Efecto del pH. Para determinar el efecto del pH sobre la sustancia inhibidora, 2 mL del

sobrenadante libre de células, se ajustaron a tres (3) niveles de pH (4.0, 7.0, 10.0) mediante la

adición de HCl 1 N (Merck®) o NaOH 1 N (Merck®) e incubados durante 2 h, a 30°C53

.



3.1.3.4.2 Efecto de la temperatura. Para evaluar el efecto de la temperatura sobre la sustancia

inhibidora, 2 mL de cada sobrenadante, almacenados en tubos falcon, fueron calentados a

60°C/15 min., 60°C/30 min., 80°C/15 min y 80°C/30 min8.

3.1.3.4.3 Efecto de enzimas proteolíticas. La sensibilidad de los sobrenadantes libres de células,

a las enzimas proteolíticas, fue determinado por la adición Proteinasa K (Merck®), a una

concentración final de 1mg/mL al sobrenadante libre de células. Posteriormente, las muestras se

incubaron por 2 h a 37°C, para ser evaluadas contra los dos (2) microorganismos patógenos. La

ausencia de zonas de inhibición en presencia de la proteasa, confirma la naturaleza polipeptídica

de la sustancia inhibidora8.

La capacidad inhibidora de cada sobrenadante, sometido a los diferentes tratamientos, fue

evaluada para cada bacteria patógena, por el método de difusión en gel, por perforación en placa.

3.1.3.5 Concentración de la sustancia inhibidora

Para obtener la concentración adecuada de la sustancia inhibidora, para su cuantificación y

estimación del peso molecular, a través de una electroforesis de proteínas, se utilizó un método de

concentración, utilizando 1,2 g de resina absorbente XAD-16, más caldo MRS o M17, siguiendo

el método descrito por Wilson et al.56

, con algunas modificaciones. Para ello se inocularon 0,5

mL de los aislados en estudio (a una concentración de 1.2 x 108 UFC/mL) en 50 mL del medio

preparado con la resina hidrofóbica sintética y se incubaron durante 7 días, a 30°C, a 180 rpm.

Transcurrido este tiempo, la resina se recuperó por decantación, se lavó dos (2) veces en agua

destilada estéril y se eluyó en 40 mL de metanol al 100%. Finalmente, el producto fue

concentrado por evaporación a 45°C, bajo presión reducida en rotoevaporador, hasta obtener un

volumen aproximado de 1 mL, el cual fue conservado a -20°C, para su posterior evaluación. Para



verificar la capacidad antimicrobiana de la sustancia inhibidora concentrada, se realizó el método

de difusión en gel, por perforación en placa

3.1.3.6 Cuantificación de proteínas totales

La concentración de proteínas presente en el extracto fue determinada a través del método de

cuantificación de proteínas por BCA (ácido bicinconínico), descrito por Smith et al.50

, usando

albúmina sérica bovina como estándar. A 10 µL del extracto de BAL, se añadieron 200 µL del

reactivo de trabajo y se incubaron a 37°C, durante 30 min. Las muestras se dejaron atemperar

durante 10 min., y se midió la absorbancia a 562 nm (Espectrofotómetro multimodo, Thermo

Scientific, Barcelona, España).

3.1.3.7 Electroforesis de proteínas SDS-PAGE

El peso molecular de la bacteriocina en el extracto concentrado de los aislados de BAL, fue

estimado por medio de una electroforesis de proteínas, en poliacrilamida dodecil sulfato de sodio

(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS - PAGE). Para la separación

de proteínas se utilizó un sistema de gel, que estaba constituido por un gel de concentración del

4% y un gel de separación de gradiente del 15%. El marcador de peso molecular (3,5 a 45 kDa)

fue cargado con tampón de carga 4X y corrido en el gel, a 80V/25 min y, luego, a 120V/2h. El

gel se tiñó con azul de coomasie G250 (Merck®) al 0,2% (w/v) por 1 h y se destiñó con solución

decolorante, con 30% de metanol (v/v) y 10% de ácido acético (v/v), en agua destilada. La

muestra del extracto purificado fue cargada con el buffer 4X. El gel se fijó en 55% de metanol

(v/v), durante dos (2) horas, seguido por inmersión en agua destilada estéril, durante la noche, a

temperatura ambiente, para permitir la eliminación del SDS y potenciar la renaturalización de las

proteínas. Posteriormente, se recubrió con un cultivo de aproximadamente 108 UFC/mL de L.



monocytogenes incrustado en agar tripticasa soya. La posición de la bacteriocina fue visualizada

por una zona de inhibición alrededor de la banda de la proteína activa25

.

3.1.3.8 Análisis estadístico

Se evaluó la variable dependiente (zonas de inhibición) y las variables independientes (ocho

aislados de BAL) frente a dos tratamientos como pH 7 y temperatura de 60°C x 15min. El

modelo fue analizado usando análisis de varianza (ANOVA de una vía) con datos balanceados y

las medias para cada factor se analizaron usando la prueba de comparaciones múltiples de Tukey,

en el paquete estadístico SAS, fijando un nivel de significancia de p<0.01.

3.1.4 Resultados

3.1.4.1 Tamizaje de BAL para determinar su potencial inhibitorio

En la tabla 3-1, se pueden observar los resultados obtenidos para el tamizaje realizado a los 32

aislados estudiados, de los cuales ocho (8) presentaron capacidad antimicrobiana frente a

Listeria monocytogenes y Salmonella typhimurium, con halos iguales o superiores a 2 mm de

inhibición. Las BAL que presentaron mayores halos de inhibición fueron Lactobacillus casei

(QDC31) y Lactobacillus fermentum (QDC31).



Tabla 3-1 Actividad antimicrobiana de bacterias ácido lácticas utilizando el método de la mancha

en agar y el método de difusión en gel por perforación en placa.

Cepa

Código

Tamizaje

Zona de inhibición (mm)*

Sobrenadante filtrado

Actividad total (UA/ml)

S. typhimurium L. monocytogenes S. typhimurium L. monocytogenes

Lactococcus sp.

Lactococcus lactis subsp. lactis Q5 2.9±0.17 3.5±0.50 4×103 64×10

3

Leuconostoc sp.

Leuconostoc mesenteroides

subsp. mesenteroides

Q12 2.5±0.32 2.7±0.31 2×103 32×10

3

Enterococcus sp.

Enterococcus lactis Q7 2.5±0.40 2.7±0.57 2×103 64×10

3

Streptococcus sp.

Streptococcus infantarius Q11 2.7±0.10 2.5±0.50 2×103 32×10

3

Lactobacillus sp.

Lactobacillus fermentum Q6 10.0±0.06 5.0±0.60 4×103 32×10

3

Lactobacillus fermentum QDC32 12.0±1.00 8.0±2.00 4×103 16×10

3

Lactobacillus casei QDC31 18.0±0.58 9.0±3.05 4×103 16×10

3

Bacillus sp.

Bacillus amyloliquefaciens Q9 2.0±0.00 3.3±0.58 1×103 32×10

3

* Media ± DS de determinaciones por triplicado.

Control positivo Nisina (1g/L)

Control negativo Caldo MRS y M17 ajustado a un pH de 6,0.

3.1.4.2 Obtención del sobrenadante libre de células

Después de obtener los sobrenadantes libres de células y evaluar su capacidad inhibidora en

Unidades de Actividad, se observó que todos los extractos presentaron inhibición frente a ambos



patógenos. Los que exhibieron mayor efecto inhibitorio frente S. typhimurium fueron

Lactococcus lactis subsp. lactis (Q5), Lactobacillus fermentum (Q6, QDC32) y Lactobacillus

casei (QDC31), con una actividad de 4000 UA/mL y para Listeria monocytogenes fueron

Lactococcus lactis subsp. Lactis (Q5) y Enterococcus lactis (Q5), con una actividad de 64000

UA/mL como se observa en la tabla 3-1.

3.1.4.3 Caracterización de la sustancia inhibidora

3.1.4.3.1 Efecto del pH. Los sobrenadantes libre de células mostraron actividad antimicrobiana

a un pH de 7 para los dos (2) microorganismos indicadores, con excepción de B.

amyloliquefaciens (Q9) y S. infantarius (Q11), que no la presentaron frente a Salmonella

typhimurium (Tabla 3-2). El sobrenadante correspondiente a L. fermentum (Q6) presentó además

inhibición a pH de 4. Los resultados para los halos de inhibición a un pH de 7, fueron altamente

significativos (p<0.01). Las mejores medias según la Prueba de Tukey se obtuvieron para L.

fermentum (Q6).



Tabla 3-2 Efecto del pH en los sobrenadantes libres de células.

Microorganismo

productor

N

pH*

Microorganismo indicador

Zona de inhibición (mm)


L. lactis subsp. lactis (Q5) 2 4 ‒ ‒

2 7 3.1±0.14c 5.6±0.07

a

2 10 ‒ ‒

L. fermentum (Q6) 2 4 2.2±0.21 ‒

2 7 5.0±0.00a 5.1±0.14

a,b

2 10 ‒ ‒

E. lactis (Q7) 2 4 ‒ ‒

2 7 4.0±0.00b 4.2±0.21

b,c

2 10 ‒ ‒

B. amyloliquefaciens (Q9) 2 4 ‒ ‒

2 7 ‒e 3.3±0.42

c

2 10 ‒ ‒

L. mesenteroides subsp.

mesenteroides (Q12) 2 4 ‒ ‒

2 7 2.0±0.00d 2.0±0.00

d

2 10 ‒ ‒

S. infantarius (Q11) 2 4 ‒ ‒

2 7 ‒e 3.3±0.35

c

2 10 ‒ ‒

L. casei (QDC31) 2 4 ‒ ‒

2 7 3.3±0.35c 3.4±0.49

c

2 10 ‒ ‒

L. fermentum (QDC32) 2 4 ‒ ‒

2 7 3.0±0.00c 3.1±0.07

d,c

2 10 ‒ ‒

* Control: sobrenadantes libres de células sin tratamiento.

(‒) Ausencia de inhibición. Halos <2 mm se consideraron inhibición negativa.

Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.



3.1.4.3.2 Efecto de la temperatura. La actividad antagónica de L. lactis subsp. lactis (Q5) fue

destruida por los tratamientos térmicos aplicados, frente a los dos (2) microorganismos patógenos

utilizados. Los aislados identificados como L. fermentum (Q6), E. lactis (Q7) y B.

amyloliquefaciens (Q9) y L. casei (QDC31) presentaron inhibición, cuando fueron tratados a

60°C por 15 min., mostrando mayores para L. monocytogenes, con resultados altamente

significativos (p<0.01). Para el caso de L. fermentum (QDC32), la actividad inhibidora se

presentó en todos los tratamientos térmicos utilizados para L. monocytogenes.



Tabla 3-3 Efecto de la temperatura en la actividad del sobrenadante libre de células

Microorganismo

productor

N

Tiempo del

tratamiento térmico

Temperatura

(°C)

Microorganismo indicador

Zona de Inhibición (mm)


L. lactis subsp. lactis (Q5)

L. fermentum (Q6)

E. lactis (Q7)

B. amyloliquefaciens (Q9)

S. infantarius (Q11)

L. mesenteroides subsp.

mesenteroides (Q12)

L. casei (QDC31)

L. fermentum (QDC32)

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

2

15 min

30 min

15 min

30 min

15 min

30 min

15 min

30 min

15 min

30 min

15 min

30 min

15 min

30 min

15 min

30 min

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

60

80

‒ c

‒

‒

‒

2.3±0.35 a,b

‒

‒

‒

2.5±0.71 a,b

‒

‒

‒

2.0±0.00 b

‒

‒

‒

‒ c

‒

‒

‒

‒ c

‒

‒

‒

3.2±0.21a

‒

‒

‒

3.0±0.00a,b

2.1±0.014

‒

‒

‒d

‒

‒

‒

3.2±0.21b

‒

‒

‒

4.0±0.00 b

4.0±0.00 b

‒

‒

‒

2.0±0.00c

¯

2.0±0.00

‒

‒ d

‒

‒

‒

7.0±0.65 a

5.1±0.21

4.1±0.14

‒

7.3±0.14 a

3.6±0.07

4.0±0.00

4.9±0.14

Las muestras control consisten en sobrenadantes libres de células recién preparados sin

tratamiento.

(‒) Ausencia de inhibición. Halos <2 mm se consideraron inhibición negativa.

Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.



3.1.4.3.3 Efecto de enzimas proteolíticas. La actividad antimicrobiana frente a las cepas de

patógenos utilizadas fue inhibida por la acción de la proteinasa K. El control positivo

(sobrenadante sin tratamiento) mostró actividad frente a los dos patógenos utilizados.

3.1.4.4 Concentración de la sustancia inhibidora

La actividad antimicrobiana de la sustancia inhibidora obtenida de los extractos concentrados se

observa en la Tabla 3-4. La mayoría de los aislados presentaron disminución en las Unidades de

Actividad, con respecto al extracto crudo principalmente para L. monocytogenes.

La mayor concentración de proteína total se obtuvo en los extractos concentrados de L.

mesenteroides subsp. mesenteroides (Q12) y L. casei (QDC31).

3.1.4.5 Cuantificación de proteínas totales

En la tabla 3-4 se observa la cuantificación de proteínas obtenida para los extractos

concentrados.

Tabla 3-4 Cuantificación de proteínas en los extractos concentrados de los aislados de bacterias

ácido lácticas

Microorganismo productor µg/µL Sustancia Inhibidora concentrada

Actividad total (UA/ml)


L. lactis subsp. lactis (Q5)

L. fermentum (Q6)

E. lactis (Q7)

L. mesenteroides subsp. mesenteroides (Q12)

L. casei (QDC31)

L. fermentum (QDC32)

Control

19,20

15,90

20,50

22,34

20,60

20,30

28,30

2×103

4×103

4×103

8×103

4×103

4×103

2×103

4×103

4×103

8×103

2×103

4×103



3.1.4.6 Electroforesis de proteínas SDS-PAGE

En el análisis de la SDS-PAGE, todos los extractos concentrados mostraron bandas con un peso

molecular <3,5 kD, como se observa en la figura 3-1(A), demostrando que los péptidos que

generan la capacidad antimicrobiana presentan un peso por debajo del marcador, el cual es un

valor que coincide con características del tamaño de las bacteriocinas3,59

.Como control positivo

se utilizó un aislado obtenido de caracol pala (Cp19), con capacidad para producir péptidos de

bajo peso molecular con actividad antimicrobiana8

y el control negativo pertenece a proteínas

totales de Leishmania, las cuales presentan un peso molecular desde 80-90 kDa.

Se observó una zona de inhibición en el gel superpuesto con agar (0,7%) inoculado con la cepa

sensible de L. monocytogenes, evidenciando la actividad antimicrobiana de la banda molecular

del aislado identificado como L. lactis subsp lactis (Q5) como se observa en la figura 3-1(B).



A B

Figura 3-1 (A) SDS-PAGE de las sustancias inhibidoras de los aislados de BAL (B) Gel

superpuesto con Listeria monocytogenes ATCC® 7644 como cepa indicadora que muestra la

zona de inhibición.

3.1.5 Discusión

En los últimos años se han reportado un conjunto de investigaciones que demuestran el interés en

el uso de BAL y sus sustancias antimicrobianas, que permitan reducir el uso de conservantes

sintéticos, siendo las bacteriocinas uno de los grupos más importantes. Sin embargo, la

identificación de bacteriocinas con potencial para ser utilizadas en la industria de alimentos

requiere la tipificación de nuevos microorganismos productores, así como la caracterización de

las mismas3,11,13,59

.

Lactococcus lactis subsp. lactis (Q5) presentó mayor efecto inhibitorio para Listeria

monocytogenes, que para Salmonella typhimurium, resultados que concuerdan con los



presentados por otros autores29,30,35,37,55

, quienes reportan que el efecto antimicrobiano de esta

BAL, está generalmente asociado a bacterias Gram positivas. El efecto bactericida demostrado

frente a bacterias Gram negativas es interesante, debido a que existen muy pocos reportes al

respecto36

.

Aunque el sobrenadante libre de células mostró un efecto inhibitorio frente a Salmonella

typhimurium, de 4000 UA/mL, fue más eficaz contra Listeria monocytogenes, con una actividad

de 64000 UA/mL, resultados que concuerdan con los reportados por otros autores42,48

. Settanni

and Corsetti49

, describen que el mecanismo de acción de las bacteriocinas frente a bacterias Gram

positivas está relacionado con la interacción con los lípidos aniónicos, presentes en la membrana

celular, que determinan la formación de poros, con la consiguiente disipación de la fuerza motriz

de protones. Con el fin de mantener o restablecer esta fuerza, hay aceleración en el consumo de

ATP y, en consecuencia se produce la muerte celular. La actividad de la sustancia

antimicrobiana, se mantuvo estable después de la incubación, durante 2 h a un pH de 7 y se

evidenció pérdida de la actividad, después de haber sido expuesta a los diferentes tratamientos

térmicos. Resultados similares han sido reportados para una bacteriocina tipo nisina, producida

por L. lactis, la cual fue inactivada después de someterse a calentamiento a 60°C y 80°C por 30

min y a valores de pH entre 2,0-12, 06.

La bozacina 14, una bacteriocina producida por L. lactis subsp. lactis B14, fue relativamente lábil

al calor, debido a que fue inactivada, parcialmente a 80°C, durante 10 min. y completamente a

100°C durante 10 min, además presentó estabilidad a un pH de 7, pero fue inactivada cuando se

sometió a pH de 2 y 1024

.



Las bacteriocinas generadas por cepas de BAL son generalmente estables a pH neutro o a

intervalos cercanos, lo que indica que estas sustancias están bien adaptadas al ambiente en el cual

se desarrollan, sin embargo, su efecto antagónico es generalmente destruido, cuando se expone a

pH básico, debido a los cambios conformacionales 43

. La estabilidad a valores de pH neutro

constituye una ventaja sobre la bacteriocina nisina, la cual presenta su máxima actividad cuando

se usa en alimentos con valores de pH <7, para asegurar la solubilidad, estabilidad y actividad

biológica, durante el periodo de procesamiento y almacenamiento3,13

.

L. lactis subsp. lactis constituye la especie principal utilizada en la industria láctea para la

fabricación y maduración de quesos, por su buena capacidad acidificante, proteolítica y

lipolítica18. Diversas bacteriocinas (Lantibióticos y no lantibióticos) producidas por L. lactis,

aislado de diferentes fuentes han sido identificadas y caracterizadas1. Otros lantibióticos incluyen

cinco (5) variantes naturales de nisina (A, Z, Q, U y F)14

, un péptido llamado Lacticina 481 y un

sistema de dos (2) péptidos conocido como lacticina 314715

. Dentro de los no lantibióticos se

encuentran la lactococcina MMFII, la lactococcina G y H, la lactococcina B, la lactococcina A y

la lactococcina 97238

. De acuerdo con el origen lácteo de L. lactis subsp. lactis (Q5), este aislado

constituye un candidato potencial para mejorar los procesos de producción de algunos quesos

tradicionales en Colombia, sin embargo, es necesario diseñar experimentos posteriores, para

poner a prueba esta posibilidad.

Los lactobacilos han adquirido importantes propiedades antimicrobianas contra diferentes

bacterias patógenas44,46

. En este estudio, el potencial inhibitorio de los aislados identificados

como Lactobacillus fermentum (Q6) (QDC32), fueron activos frente a S. typhimurium y

L.monocytogenes, lo cual demuestra el amplio espectro antimicrobiano este. Estos resultados

están de acuerdo con los encontrados por Zhang et al60

, quienes informaron actividad



antimicrobiana de L. fermentum frente a un amplio rango de patógenos Gram positivos y Gram

negativos, que incluyen Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes,

Salmonella typhimurium y Shigella flexneri.

Resultados similares fueron obtenidos para una cepa de L. plantarum aislada de productos

fermentados4,58

. Sin embargo, Khay et al.28

reportaron compuestos tipo bacteriocinas producidos

por lactobacilos aislados de leche de camello, con actividad sólo para patógenos Gram positivos.

En los tratamientos de estabilidad térmica, Lactobacillus fermentum (QDC32) presentó actividad

residual, después de ser sometida a diferentes temperaturas y tiempos, cuando fue evaluada con

L. monocytogenes, resultados similares a los encontrados por otros autores como Zhang et al.60

.

La estabilidad al calor que presentan algunos compuestos antimicrobianos producidos por BAL,

puede deberse a la formación de pequeñas estructuras globulares y la ocurrencia de regiones

hidrofóbicas de la fuerza, enlaces estables cruzados y un alto contenido de glicina30

. Las

evaluaciones de estabilidad al pH revelaron que la actividad antimicrobiana desapareció por

completo, a un pH de 10, mientras que la actividad residual más alta se presentó a un pH de 7.

Por su parte, el compuesto activo producido por Lactobacillus fermentum (Q6), también presentó

actividad antimicrobiana a un pH de 4, lo que sugiere que se puede utilizar en la producción de

alimentos que requieren de condiciones ácidas para su elaboración26

. Pascual et al.41

reportó una

nueva bacteriocina producida por L. fermentum, con un peso molecular estimado (<7 kDa),

termoestable y activa a un rango de pH 4.0 a 7.0. Diferentes péptidos han sido aisladas y

caracterizadas a partir de cepas de Lactobacilos; entre ellas, se encuentran, la plantaricina de

Lactobacillus plantarum, la reuterina de Lactobacillus reuteri, la caseína A de Lactobacillus

casei, la helveticina de Lactobacillus helveticus, entre otros60

. Los ejemplos de agentes

antimicrobianos producidos por L. fermentum son escasos y, aún, continúan en estudio.



Leuconostoc mesenteroides es una de las principales especies de BAL aislada de una variedad de

alimentos fermentados, que ha sido reportada como productora de sustancias proteicas, con

capacidad para inhibir el crecimiento de patógenos9,33

. En este trabajo, se observó que la mayor

sensibilidad a la sustancia antimicrobiana producida por Leuconostoc mesenteroides subsp.

mesenteroides (Q12) fue exhibida por Listeria monocytogenes; resultados que son acordes a los

encontrados en otras investigaciones7,12,51

, las cuales reportan cepas de Leuconostoc spp.

productoras de mesentericina, Leucocina A y Leucocin C, con capacidad para inhibir el

crecimiento de bacterias Gram positivas y, en menor grado de bacterias Gram negativas. La

sustancia inhibidora concentrada sólo presentó estabilidad cuando fue sometida a un pH de 7 y se

vio afectada por el calentamiento a temperaturas moderadas. Estos datos no coinciden con los

reportados en la literatura, si se tiene en cuenta que dentro de las propiedades generales de las

bacteriocinas producidas por Leuconostoc, se encuentra su estabilidad a un amplio intervalo de

pH y a tratamientos térmicos39,57

. Debido a su notable actividad antimicrobiana y a su

degradación por enzimas digestivas, este aislado podría ser utilizado como un candidato para la

formulación de cultivos iniciadores. Sin embargo, es necesario realizar investigaciones más

completas, que permitan una mejor caracterización de la sustancia antimicrobiana producida por

esta cepa de BAL.

En este trabajo, se observó que el aislado identificado como Lactobacillus casei (QDC31), a

diferencia de las demás BAL evaluadas, mediante el método de la mancha en agar, presentó

mayor capacidad de inhibición frente a S. typhimurium, fenómeno que podría estar relacionado

con la producción de ácido láctico, el cual actúa como un permeabilizador de la membrana

exterior de patógenos Gram negativos, facilitando el ingreso de las sustancias antimicrobianas32

.

Adicionalmente, se han descrito sustancias antibacterianas de bajo peso molecular diferentes al



ácido láctico presente en el sobrenadante libre de células de cepas de L. casei con capacidad para

inhibir el crecimiento de patógenos Gram negativos22

. El sobrenadante libre de células

neutralizado, presentó efecto inhibitorio para los dos (2) microorganismos patógenos estudiados,

con mayores Unidades de Actividad para L. monocytogenes, que para S. typhimurium. Estos

resultados son acordes a los encontrados por Ghanbari et al.17

y Lü et al.31

, quienes describen que

la actividad antimicrobiana de BAL, contra bacterias Gram positivas, se debe, principalmente a la

acción de las bacteriocinas.

El compuesto antimicrobiano demostró estabilidad al calor, cuando fue evaluado contra L.

monocytogenes. Diferentes trabajos han demostrado la estabilidad térmica de sustancias

antimicrobianas producidas por Lactobacillus spp5,10

.

Los resultados de estabilidad a pH, no coinciden con hallazgos anteriores, que indican la

tolerancia de las bacteriocinas a pH ácidos17,31

. La pérdida de actividad antimicrobiana a pH

extremos podría estar atribuida a una degradación proteolítica, agregación o inestabilidad de la

proteína 5,52

. Teniendo en cuenta su amplio espectro inhibidor y sus propiedades fisicoquímicas,

la sustancia antimicrobiana producida por L. casei presenta un alto potencial, para ser utilizada

como agente bioconservante, para controlar el crecimiento de patógenos en alimentos.

El peso molecular mostrado por las sustancias inhibitorias, de los diferentes aislados de BAL

tiene concordancia con los reportes de otros autores, que afirman que sus compuestos

antimicrobianos pertenecen a la Clase I (lantibióticos), debido a que presenta un peso molecular

(<5 kDa) y son poco estables al calor3.



De acuerdo con los hallazgos, es posible que el efecto antibacterial se deba a la formación de

sustancias inhibidoras tipo bacteriocinas, como resultado de la inactivación de las sustancias

antimicrobianas después del tratamiento con la enzima proteolítica 15,28,59

.

El estudio de aislados de BAL y sus metabolitos ha surgido como una estrategia para la búsqueda

de nuevos agentes antimicrobianos, principalmente en la industria alimentaria, que puedan

controlar, de manera eficaz, los patógenos que puedan ser transmitidos a través de los alimentos.

Sin embargo, para que las BAL puedan ser usadas como agentes bioconservantes deben cumplir

con ciertas características tecnológicas, probióticas y antimicrobianas y determinar la presencia

de todos los factores de virulencia conocidos, con el fin de determinar qué riesgos potenciales

podrían estar involucrados en su uso.

3.1.6 Responsabilidades éticas

3.1.6.1 Protección de personas y animales. Los autores declaran que para esta investigación no

se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.

3.1.6.2 Confidencialidad de los datos. Los autores declaran que en este artículo no aparecen

datos de pacientes.

3.1.6.3 Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Los autores declaran que en este

artículo no aparecen datos de pacientes.

3.1.6.4 Conflicto de intereses. Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.



3.1.7 Bibliografía

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Capítulo 3: Instrucciones de autor revista argentina de microbiología 101

3.2 INSTRUCCIONES DE AUTOR REVISTA ARGENTINA DE MICROBIOLOGÍA

3.2.1 Requisitos Generales

Los manuscritos enviados a esta revista deben constituir informes de investigación original. El

envío de un manuscrito implica que los autores tienen las autorizaciones institucionales para

proceder a la publicación de los datos y que el mismo manuscrito (u otro de contenido similar) no

ha sido previamente publicado (salvo presentaciones parciales en reuniones científicas) ni se

encuentra en consideración por otra revista.

3.3.1.1 Política Editorial. Revista Argentina de Microbiología suscribe la política editorial

reflejada en ‘‘Uniform requeriments for manuscripts submitted to biomedical journals: Writing

and Editing for Biomedical Publication’’, disponible en: http://www.ICMJE.org

3.2.1.1.1 Autoría. En la lista de autores deben figurar únicamente aquellas personas que cumplan

cada uno de los siguientes requisitos: 1) Haber participado en la concepción y realización del

trabajo que ha dado como resultado el artículo en cuestión. 2) Haber participado en la redacción

del texto y en sus posibles revisiones. 3) Haber aprobado la versión del texto que finalmente va a

ser publicada.

3.2.1.1.2 Conflictos de intereses. Los autores deben indicar cualquier relación financiera que

pudiera dar lugar a un conflicto de intereses en relación con el artículo publicado. Incluso si los

autores consideran que no los hay, deberán indicarlo.

3.2.1.1.3 Responsabilidades éticas. Cuando se describen estudios que se han realizado en seres

humanos se debe indicar si los procedimientos seguidos se conformaron a las normas éticas del

comité de experimentación humana responsable (institucional o regional), y de acuerdo con la

Asociación Médica Mundial y la Declaración de Helsinki

(http://www.wma.net/s/ethicsunit/helsinki.htm). No se deben utilizar nombres, iniciales o

números de hospital en ninguna sección del manuscrito. Cuando se describen estudios /

experimentos en animales se debe indicar si se han seguido las pautas de una institución o

consejo de investigación internacional, o una ley nacional reguladora del cuidado y la utilización

de animales de laboratorio (CICUAE). En todo caso, deberá incluirse una declaración escrita en

tal sentido.


3.2.1.1.4 Consentimiento informado. Los autores deben mencionar en la sección “Materiales y

métodos” y en la sección “Derecho a la Privacidad y Consentimiento Informado” en el

formulario de envío de artículos que los procedimientos utilizados en los pacientes y controles

han sido realizados tras la obtención del consentimiento informado (Ley de Habeas Data). Si se

reproducen fotografías o datos de pacientes, los autores son responsables de la obtención del

consentimiento por escrito, autorizando su publicación, reproducción y divulgación en soporte

papel e Internet.

3.2.1.2 Copyright. La Revista Argentina de Microbiología está distribuida bajo una licencia de

Creative Commons de tipo Reconocimiento-No Comercial-Sin Obra Derivada 4.0 Internacional

(CC BY-NC-ND). BY: El beneficiario de la licencia tiene el derecho de copiar, distribuir, exhibir

y representar la obra y hacer obras derivadas siempre y cuando reconozca y cite la obra de la

forma especificada por el autor o el licenciante. NC: El beneficiario de la licencia tiene el derecho

de copiar, distribuir, exhibir y representar la obra y hacer obras derivadas para fines no

comerciales. ND: El beneficiario de la licencia solamente tiene el derecho de copiar, distribuir,

exhibir y representar copias literales de la obra y no tiene el derecho de producir obras derivadas.

3.2.2 Representación de los originales.

Los manuscritos deben dirigirse al Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología

acompañados de una nota de acuerdo con el siguiente modelo: “Sres. Comité Editor de la Revista

Argentina de Microbiología: en mi carácter de autor responsable declaró que el resto de los

autores han acordado que los represente frente a la RAM con respecto al envío del manuscrito

…[Título]… y son responsables junto a mí de su contenido. Este trabajo (u otro de contenido

similar) no ha sido publicado previamente ni está siendo considerado en otra revista para su

publicación. Asimismo, manifiesto mi conformidad de otorgar los derechos de copia (copyright)

a la Revista Argentina de Microbiología, una vez concretada la publicación”. Los cambios de

autores o del orden de los mismos solo serán considerados si se solicita mediante una nota

firmada por todos los autores a tal efecto. Los autores deberán especificar la existencia de

conflictos de interés que puedan afectar la evaluación del manuscrito. Estos serán confidenciales

y mantenidos en reserva por el Comité Editor. Deben especificarse en la sección agradecimientos

las fuentes de financiación para la tarea experimental descrita en el manuscrito, ya sean estas

institucionales, oficiales o privadas. El material será analizado por el Comité Editor y sometido a


la consideración de dos o más árbitros científicos designados para cada caso. Los autores deberán

sugerir al menos 3 revisores para la evaluación del manuscrito. El Comité Editor se reserva el

derecho de rechazar aquellos manuscritos cuyos contenidos se superponen total o parcialmente

con trabajos ya publicados, o cuyas temáticas no se correspondan con las de la RAM. Asimismo,

son motivos de rechazo la falta de cumplimiento de las reglas editoriales, violaciones éticas, baja

calidad científica y un uso pobre del idioma, sea este el inglés o el español. El Comité Editor se

reserva el derecho de efectuar las modificaciones gramaticales o de estilo que considere

necesarias.

3.2.3 Organización y formato.

La RAM acepta artículos originales, informes breves, artículos especiales, imágenes

microbiológicas, cartas al editor, editoriales y también edita suplementos. Se solicita leer

cuidadosamente las especificaciones de cada formato a los efectos de elegir el más apropiado y

de esta manera agilizar el proceso de evaluación. Los manuscritos podrán redactarse

indistintamente en español o en inglés, aunque el Comité Editor estimula a los autores a escribir

los trabajos en inglés para favorecer su difusión y lectura a nivel internacional. El manuscrito

deberá cargarse en el sitio web de la RAM (http://ees.elsevier.com/ram/). Deberán incluirse los

siguientes archivos por separado: Carta de presentación, Manuscrito, Tablas y Figuras.

3.2.3.1 Artículos originales. Son trabajos de investigación completos y deben redactarse

respetando las siguientes secciones: Título (en español y en inglés) y título abreviado, Resumen y

Palabras clave (en español y en inglés), Introducción, Materiales y métodos, Resultados,

Discusión, Agradecimientos y Bibliografía. El manuscrito no deberá exceder las 8000 palabras

incluyendo a todas las secciones, con hasta 6 tablas o figuras.

3.2.3.2 Informes breves. Son trabajos de menor extensión, entre los que se incluyen casuísticas,

casos clínicos y descripciones de técnicas o dispositivos nuevos, avalados por trabajos

experimentales concluyentes. Se debe omitir la división del texto en secciones y todo el

manuscrito no podrá exceder las 3000 palabras, con un máximo de 15 citas bibliográficas y de 3

tablas o figuras. Es necesario un análisis cuidadoso de la presentación de los datos para evitar su

reiteración en el texto, en las tablas y en las figuras, a fin de mantener la característica de

brevedad de este tipo de artículos.


3.2.3.3 Artículos especiales. Son actualizaciones o consensos de grupos de trabajo acerca de

temas de gran interés en el ámbito regional o internacional. Sus autores deben ser especialistas en

la materia y el texto debe incluir una revisión bibliográfica amplia y actualizada. Los artículos

especiales admiten hasta 10000 palabras, 8 tablas o figuras y no más de 100 citas bibliográficas

3.2.3.4 Imágenes microbiológicas. Pueden corresponder a fotos de bacterias, hongos, parásitos o

virus, tomadas de exámenes en fresco o con coloraciones y observadas bajo microscopía óptica,

electrónica o de fluorescencia. También se admiten otras imágenes fotográficas, por ejemplo,

microorganismos en medios de cultivo, lesiones ilustrativas en pacientes o en animales de

experimentación, imágenes radiográficas y ecográficas, de tomografías computarizadas, de

resonancia magnética nuclear, etc. Estas imágenes, de gran valor didáctico y no necesariamente

excepcional, deben estar acompañadas de un texto explicativo y de flechas indicadoras, cuando

corresponda. El texto no debe exceder las 300 palabras. Los requisitos de calidad para el envío de

las imágenes se describen bajo el ítem “Figuras”.

3.2.3.5 Cartas al Editor. Pueden corresponder a comentarios o nuevos datos. Los primeros

consisten en observaciones sobre los artículos publicados en la revista; los segundos están

destinados a comunicar hallazgos concisos que no son apropiados para su publicación como

trabajo completo o informe breve. Ambas clases de contribuciones no deben exceder las 500

palabras, deben tener título en español e inglés, no deben llevar resumen y pueden contener no

más de una figura o tabla. Los autores y sus filiaciones aparecerán al pie de la carta. Se debe

proporcionar sólo la filiación primaria de cada autor. Los comentarios deben hacer mención del

volumen y el número en que se publicó el artículo comentado, de su título completo y del

apellido del primer autor. Asimismo, deben contener referencias bibliográficas que apoyen el

argumento de quien envía la carta. Para considerar la publicación de un comentario, se solicitará

primero una respuesta al autor de correspondencia del artículo publicado; la aprobación final y

publicación de ambas quedará a criterio del editor. En el caso de una contribución presentada

como nuevos datos, ésta se asignará a un editor experto en la materia, quien junto con revisores

externos se encargará de su evaluación. Se debe tener en cuenta que algunos de los servicios de

indexación no incluyen las Cartas al Editor en sus bases de datos.

3.2.3.6 Editoriales. Abordan tópicos científicos de gran actualidad y particular relevancia para la

comunidad científica especializada en la Microbiología, o trabajos de opinión sobre política


científica. La oportunidad y autoría de los editoriales, así como sus lineamientos generales,

quedan exclusivamente a criterio del Comité Editor.

3.2.3.7 Suplementos. Corresponden a revisiones extensas de un tema específico realizadas por

una o varias sociedades científicas o universidades, o a los resúmenes de las contribuciones

efectuadas en el marco de eventos científicos organizados por la Asociación Argentina de

Microbiología o alguna de sus Divisiones o Filiales (comunicaciones orales, paneles,

conferencias, mesas redondas, etc.). Los suplementos estarán a cargo de editores invitados; sus

propuestas temáticas y lineamientos generales deberán ser aceptados por el Comité Editor. La

revisión de los manuscritos correspondientes a los suplementos estará a cargo de revisores

elegidos por el Comité Editor (revisiones extensas) y de los editores invitados (resúmenes de

eventos). El suplemento deberá ser financiado en su totalidad por la entidad que ha organizado la

reunión científica, la que tendrá en cuenta que el suplemento deberá ser accesible a todos los

participantes del evento o a todos los socios de la Asociación Argentina de Microbiología (por

suscripción y online). Con respecto a la edición, el suplemento deberá respetar exactamente el

formato y el estilo de la Revista Argentina de Microbiología en todos sus aspectos (tapa, tipo de

papel, impresión, tablas, figuras, fotos, etc.), tal como se describe en este instructivo. Los

suplementos correspondientes a los resúmenes de los eventos deben incluir en este orden: nómina

de los miembros del Comité Editor de la Revista Argentina de Microbiología, datos de

presentación del evento (título completo, lugar y fecha), índice en español y en inglés,

agradecimientos, nómina de las autoridades del evento y mensaje/s del/de los presidente/s. A

continuación se presentarán los resúmenes numerados desde el uno con números arábigos. Al

final del suplemento debe incluirse el índice alfabético de autores y las “Instrucciones para los

autores” de la Revista Argentina de Microbiología, en español y en inglés. El programa

esquemático del evento sólo se podrá incluir en forma de tríptico, suelto en el interior del

suplemento. Todos los manuscritos deberán incluir las consideraciones éticas pertinentes, cuando

corresponda.

3.2.4 Elaboración de los manuscritos.

Los manuscritos se deben escribir en hoja A4 con márgenes de 3 cm de lado. Se deberá utilizar

formato de fuente Times New Roman, estilo regular, tamaño 12 puntos, a doble espacio. Las

letras en negrita o itálica se usarán sólo cuando corresponda. Las páginas deberán numerarse


consecutivamente (en el ángulo inferior derecho) e incluir la numeración de las líneas del

manuscrito. Esto se aplicará tanto para el texto como para las tablas, figuras, leyendas y también

para la bibliografía. Para la redacción del manuscrito se sugiere la lectura de la guía de estilo para

publicaciones y anexos de la AAM disponibles en el enlace http://www.aam.org.ar/ram.php.

3.2.4.1 Carátula. En la primera página se debe indicar el título del trabajo (sólo la primera letra

en mayúscula, el resto en minúscula); los autores (primer nombre completo, iniciales de los

nombres restantes y apellidos completos de todos los autores); lugar de trabajo (nombre de la

institución y dirección postal) y título abreviado del trabajo, de hasta 50 caracteres, para la cabeza

de página. Si el trabajo incluye autores con distintos lugares de trabajo, estos se indicarán con

letras en posición de superíndice junto a los nombres. El autor responsable de la correspondencia

se indicará con un asterisco en posición de superíndice ubicado junto al nombre; se detallará su

dirección de correo electrónico. En aquellos casos en que uno o varios de los autores hayan

cambiado de filiación, se deberá consignar la filiación donde se realizó el trabajo y al pie de

página, su lugar de trabajo actual.

3.2.4.2 Agradecimientos. Esta sección se debe presentar en un solo párrafo; se deberán

mencionar las fuentes de financiación y los individuos o instituciones que hayan contribuido con

reactivos, materiales biológicos o discusión de resultados.

3.2.4.3 Resúmenes. Se incluirán sólo en los artículos originales, informes breves y artículos

especiales y podrán tener una extensión máxima de 250 palabras para los artículos originales y de

150 palabras para los informes breves. El primero de ellos estará redactado en el idioma

empleado en el trabajo; el segundo, en el otro idioma y estará encabezado por el título completo

del trabajo. Cada uno de ellos estará seguido de una lista de 3 a 6 palabras clave en el idioma

correspondiente. Se debe evitar en los resúmenes el uso de abreviaturas y de citas bibliográficas.

Dado que el resumen puede ser publicado separadamente por servicios bibliográficos, se deberá

asegurar que resulte comprensible aun en ausencia del texto completo.

3.2.4.4 Introducción. Debe suministrar suficiente y adecuada información sobre el tema en

cuestión, como para permitir su comprensión al lector no especializado. Asimismo debe incluir la

hipótesis o la base científica que guió el diseño experimental y los objetivos del trabajo definidos


con claridad. Las referencias citadas en esta sección deberán ser elegidas muy cuidadosamente y

ser las más importantes del tema.

3.2.4.5 Materiales y Métodos. Debe contener una adecuada descripción de los métodos,

aparatos, reactivos y procedimientos utilizados, con el detalle suficiente como para permitir la

reproducción de los experimentos. Los procedimientos o técnicas comunes y de utilización de

rutina pueden citarse por medio de una referencia (ej., determinación de la CIM según el CLSI,

2013). Los métodos nuevos o desarrollados especialmente para el trabajo deben ser descritos con

detalle, como así también la fuente de drogas poco comunes o materiales biológicos (cepas

bacterianas, virales, fúngicas, plásmidos, etc.). La marca y la procedencia de los reactivos, de los

medios de cultivo y de los equipos deben consignarse en el texto la primera vez que se los cita

identificando marca, ciudad/ estado (si correspondiera) y país de origen.

3.2.4.6 Resultados. Debe incluir el diseño experimental y su base científica, así como los

resultados obtenidos presentados en forma concisa como texto (preferentemente) o como tabla(s)

o figura(s). Evite el uso innecesario de tablas y figuras para mencionar datos que podrían ser

presentados en el texto. No duplique la información incluyéndola en el texto y en las tablas o

figuras. Limite el número de fotografías a las mínimas necesarias para mostrar los resultados

experimentales. Numere las tablas y figuras en el orden en el que se citan en el texto. Se deben

evitar las repeticiones y destacar sólo los datos importantes. Se debe dejar para la sección

Discusión la interpretación más extensa.

3.2.4.7 Discusión. Debe hacer énfasis sobre los aspectos más importantes y novedosos del

estudio, e interpretar los datos experimentales obtenidos en relación con los ya publicados.

Indique las conclusiones a las que se arribó y evite la reiteración de datos y conceptos ya vertidos

en secciones anteriores. Se admite la presentación de Resultados y Discusión como una sección

conjunta.

3.2.4.8 Bibliografía. En todos los manuscritos es conveniente que el 70 % de las citas

bibliográficas corresponda a los últimos 10 años y el 30 % restante se distribuya entre los trabajos

clave publicados durante los años anteriores. Las citas bibliográficas se deben escribir en hoja

aparte y presentarse en orden alfabético de autores, numeradas correlativamente empleando

números arábigos. En el texto, las citas deben aparecer con números en posición de superíndice


en correspondencia con el número con que aparecen en la bibliografía. Las referencias a

comentarios personales y a trabajos inéditos deberán mencionarse en el texto como comunicación

personal, escrito entre paréntesis.

Para las referencias, se deberán citar la totalidad de los autores y seguir los siguientes modelos:

3.2.4.8.1 Publicaciones periódicas. Héritier C, Poirel L, Lambert T, Nordmann P. Contribution

of acquired carbapenem-hydrolyzing oxacillinases to carbapenem resistance in Acinetobacter

baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49:3198-202.

Los títulos de las revistas serán abreviados según el Index Me

dicus (el listado puede obtenerse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals.

3.2.4.8.2 Capítulos de libros/módulos. Martins Teixeira L, Siqueira Carvalho M da G, Facklam

RR. Enterococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors.

Manual of Clinical Microbiology, 9th edition. Washington DC, ASM Press, 2007, p. 430-42.

3.2.4.8.3 Presentaciones en congresos u otros eventos científicos. Aguilar M, Punschke K,

Touati D, Pianzzola MJ. Estudios fisiológicos y genéticos en la bacteria sulfato reductora

Desulfoarculus baarsii. Terceras Jornadas Rioplatenses de Microbiología, 1997, Resumen J2, p.

102, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.

3.2.4.8.4 Presentaciones en congresos u otros eventos científicos reproducidas dentro de un

suplemento publicado por una revista de publicación periódica. Fellner MD, Correa RM,

Durand K, Teyssié AR, Picconi MA. Análisis del ADN circulante de virus Epstein-Barr (EBV)

en pacientes inmunosuprimidos con y sin linfomas asociados. VIII Congreso Argentino de

Virología, Resumen 10416. Rev Argent Microbiol. 2005;37 Supl 1:95.

3.2.4.8.5 Institucionales. Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk diffusion.

Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; 15th Informational Supplement,

2005; M100-S15. Wayne, PA, EE.UU.

3.2.4.8.6 Tesis. Brizzio A. Aplicación de una PCR múltiple para la identificación de cepas de

Staphylococcus aureus toxigénicas. Tesis de Maestría en Microbiología Molecular 2009. ANLIS

“Dr. Carlos G. Malbrán” y Universidad Nacional de San Martín.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=journals


3.2.4.9 Tablas. Se presentarán en archivos separados numeradas consecutivamente con números

arábigos, encabezadas con un breve título explicativo, con las leyendas y/o aclaraciones que

correspondan al pie. Las llamadas para las aclaraciones al pie se harán empleando letras en

posición superíndice. Sólo los bordes externos de la primera y la última fila y la separación entre

los títulos de las columnas y los datos se marcarán con línea continua. No se marcarán las filas ni

los bordes de las columnas.

3.2.4.10 Figuras. Se presentarán en archivos separados, con el número de la figura en el margen

superior izquierdo y en el orden que aparecen en el texto. Los dibujos deberán presentarse en

condiciones que aseguren una adecuada reproducción. Los números, letras y signos tendrán

dimensiones adecuadas para ser legibles cuando se hagan las reducciones necesarias. Las

referencias de los símbolos utilizados en las figuras deberán incluirse dentro de la misma figura y

no en el texto de la leyenda. Las fotografías podrán ser realizadas en color o en blanco y negro,

en el formato especificado por Elsevier. Las resoluciones mínimas requeridas son 300 dpi para

las imágenes y fotografías en color y escala de grises, 600 dpi para las imágenes de arte de

combinación (letras e imágenes) y 1200 dpi para las imágenes de arte de línea (gráficos y

dibujos). Nota: es muy importante que se use una adecuada resolución de archivo. Todas las

imágenes individuales que se importan en un archivo gráfico deben estar en la resolución correcta

antes de su carga. Las leyendas de las figuras se presentarán reunidas en una hoja aparte,

ordenadas consecutivamente con números arábigos. Se recomienda enviar las figuras en el

formato y tamaño final deseado, considerando un ancho máximo de 8 o 16 centímetros para 1 o 2

columnas, respectivamente.

3.2.4.11 Siglas. Las siglas y demás abreviaciones (cuando esto corresponda) deberán ser

explicitadas después de su primera mención en el texto. Las unidades de medida se expresarán

siguiendo las normas del Système International d´Unités. Las siglas de los antimicrobianos y de

los grupos taxonómicos de microorganismos deberán expresarse según la guía de estilo para

publicaciones y anexos de la AAM disponibles en http://www.aam.org.ar/ram.php.

http://www.aam.org.ar/ram.php

Conclusiones 110

CONCLUSIONES

La selección de cepas de BAL autóctonas, con capacidad para producir metabolitos

antimicrobianos y su utilización para la elaboración de quesos tradicionales, permitirá la

obtención de productos más estandarizados, en cuanto a características fisicoquímicas,

nutricionales y organolépticas. La promoción y valoración comercial de estos productos

tradicionales, puede contribuir significativamente a la mejora del ingreso de los

productores, y a salvaguardar la originalidad de recursos importantes que hacen parte de

la cultura colombiana.

Los sobrenadantes libres de células neutralizados de los aislados identificados como L.

lactis subsp. lactis (Q5), L. fermentum (Q6), E. lactis (Q7), B. amyloliquefaciens (Q9), S.

infantarius Q11), L. mesenteroides subsp. mesenteroides (Q12), L. casei (QDC31) y L.

fermentum (QDC32), demostraron capacidad de inhibición sobre los patógenos utilizados

en este estudio. Teniendo en cuenta que se evaluaron microorganismos involucrados en el

deterioro y la contaminación de quesos, como Salmonella typhimurium y Listeria

monocytogenes, estas BAL dan herramientas para desarrollar nuevas estrategias de

conservación.

El sobrenadante libre de células de Lactoccoccus lactis subsp. lactis, presentó mayores

Unidades de Actividad, para los patógenos evaluados. Su extracto concentrado mostró

una banda de aproximado entre 3-3,5 KDa, demostrando que el péptido que genera la

Conclusiones 111

capacidad antimicrobiana presenta un peso molecular con características similares al

tamaño de una bacteriocina. Esta BAL ha sido referenciada como buena productora de

metabolitos antimicrobianos; siendo un candidato potencial para la fabricación de un

cultivo iniciador, con efecto bioprotector, el cual potencializa el desarrollo de las

características organolépticas del producto tradicional.

Las actividad antimicrobiana ejercida frente a los dos (2) microorganismos patógenos

evaluados, puede deberse a la acción de péptidos antimicrobianos conocidos como

compuestos tipo bacteriocinas, como resultado de la inactivación, después del tratamiento

con la enzima proteolítica.

Los sobrenadantes libres de células neutralizados, presentaron actividad antimicrobiana

frente a los dos patógenos cuando fueron tratados a un pH de 7. Además, el extracto del

aislado identificado como L. fermentum (QDC32) presentó actividad antimicrobiana,

después de los tratamientos térmicos utilizados. Estas temperaturas son las recomendadas

en la industria para la elaboración de productos lácteos, lo cual le confiere un valor

agregado, porque puede ajustarse a los procesos térmicos, sin perder su capacidad

inhibitoria.

Recomendaciones 112

RECOMENDACIONES

La optimización y estandarización del proceso de obtención de sustancias antimicrobianas

producidas por BAL autóctonas, por métodos físicos, sería herramienta para la

conservación, que le daría un valor agregado a los productos lácteos.

Para hacer una aproximación más certera sobre el compuesto que ejerce la actividad

antimicrobiana, es necesario realizar ensayos posteriores, que permitan una purificación

total a través de técnicas que combinen precipitación, diálisis, cromatografía de exclusión

en columna, liofilización, HPLC analítico, entre otros. Así mismo, sería importante

realiza el análisis de secuencias de aminoácidos del péptido y evaluar su estabilidad a

rangos más amplios de pH y temperatura.

Sería interesante ver el comportamiento de las sustancias antimicrobianas al combinarse

con tratamientos físicos y químicos, en proceso, en empaque y evaluar su eficiencia en

diferentes matrices alimentarias como carnes, pescados, vegetales y productos

perecederos

Anexos 113

ANEXOS

Figura 1. Promedios de zonas de inhibición de cada aislado de BAL a un pH 7 frente a Listeria

monocytogenes.

Anexos 114

Figura 2. Promedios de zonas de inhibición de cada aislado de BAL a una Temperatura (60°C x

15min) frente a Listeria monocytogenes.

Anexos 115

Figura 3. Promedios de zonas de inhibición de cada aislado de BAL a pH 7 frente a Salmonella

typhimurium.

Anexos 116

Figura 4. Promedios de zonas de inhibición de cada aislado de BAL a una Temperatura (60°C x

15min) frente a Salmonella typhimurium.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE … · de la Salud y al Laboratorio de Control...

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