EVALUACIÓN DE INDUCCIÓN DE RESISTENCIA EN TOMATE...
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EVALUACIÓN DE INDUCCIÓN DE RESISTENCIA EN TOMATE (Solanum
lycopersicum L.) CON SILICIO Y ANTAGONISMO DE Trichoderma viride CONTRA
LA MARCHITEZ VASCULAR CAUSADA POR Fusarium oxysporum f.sp
lycopersici
LUIS DEMETRIO DELGADO MORATO
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Ingeniero Agrónomo
Directora
MARIA BIANNEY BERMÚDEZ CARDONA
PhD. en Fitopatología
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE INGENIERÍA AGRONÓMICA
PROGRAMA DE INGENERÍA AGRONÓMICA
IBAGUÉ - TOLIMA
2019
3
DEDICATORIA
A Dios, por darme la fortaleza y guía para cumplir mis metas y seguir adelante en la vida.
A mi familia, especialmente a mis padres Martha Morato y Luis Delgado por darme los
regalos intangibles más valiosos de su ser, por ser los mejores padres, por guiarme,
amarme, cuidarme y brindarme el apoyo, ejemplo y amor incondicional.
A mi gran amor Daniela Ospina, por amarme, apoyarme siempre en la vida, aconsejarme,
motivarme, orientarme y hacerme sentir que todo es posible; sin tu ayuda nada hubiese
sido posible.
A mi hermosa ahijada Luciana, tesoro hermoso que llenas de vida y alegría a la familia.
A mis profesores del programa de Ingeniería Agronómica por todo el conocimiento y
apoyo impartido durante toda mi formación profesional.
A mi gran amiga Johanita, por el cariño y la fortaleza que me transmites en todos los
momentos de mi vida.
A mi gran amigo Luis Eduardo Cortés Méndez por brindarme su valiosa amistad
incondicional y apoyo en todo momento.
A mi grandes amigos, Samanda López, Daniela León, Estefany Rivera, Edwin Martínez,
William Saavedra y demás con quienes compartí esta bonita etapa de la vida.
A mi directora de tesis y amiga María Bianney por su incondicional apoyo y sus valiosos
consejos académicos y personales que siempre fueron los mejores. Inmenso
agradecimiento.
A todos los estudiantes del programa de Ingeniería Agronómica y especialmente a los
que sienten pasión por la investigación y quieren una agricultura diferente.
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AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar un especial agradecimiento a mi maestra y directora María Bianney
Bermúdez Cardona, por su orientación en el desarrollo de este trabajo. Además, quiero
agradecerle por brindarme su amistad, confianza y por compartir su tiempo y experiencia
para mi crecimiento personal y profesional.
A los profesores de la Facultad de Ingeniería Agronómica Rafael Antonio Flórez Faura,
y Jairo García Lozano, por brindarme incondicionalmente su conocimiento, sugerencias,
comentarios y apoyo técnico-científico para el desarrollo exitoso del trabajo.
A Gustavo Pacheco, colaborador del Laboratorio de Fitopatología de la Universidad del
Tolima, por su paciencia, conocimiento, colaboración, orientación y apoyo en los
procesos desarrollados en el laboratorio.
A la Universidad del Tolima, especialmente a la Oficina de Investigaciones y Desarrollo
Científico que a través de ella se generó la financiación del proyecto.
Al Ing. Michael Torres López Director del Departamento Técnico de BIOCULTIVOS S.A,
por la colaboración, comprensión, apoyo y conocimiento brindado durante parte del
desarrollo de este trabajo; por enseñarme que un resultado no es positivo ni negativo,
sólo es un resultado; por reafirmar mi ideal de que una agricultura biológica es posible.
A las empresas BIOCULTIVOS S.A. y AGROMIL S.A.S por facilitarnos el
microorganismo Trichoderma viride y la fuente de silicio respectivamente y así solidificar
la relación con la Universidad del Tolima y reafirmar su compromiso con el desarrollo
científico en el departamento.
5
A la Dra. Diana Vinchira del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de
Colombia IBUN por la colaboración en la caracterización genética de Fusarium
oxysporum f.sp. lycopersici y por sus consejos metodológicos.
A mi novia Daniela Ospina por apoyarme, aconsejarme y motivarme en todos los
momentos del proceso de este trabajo
A mis familiares, amigos y compañeros, Daniela Ospina, Paulina Neira, Indira Delgado,
y Felipe Durán quienes me apoyaron en el riego de los ensayos en los momentos en los
cuales no podía estar presente.
A mi gran amigo Luis Eduardo Cortés Méndez por compartir su conocimiento,
experiencia y brindarme su apoyo durante todo su el proceso de realización de este
trabajo.
A todos mis compañeros que me apoyaron en algún momento del proceso de
formulación y desarrollo de este proyecto.
6
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN 14
1. JUSTIFICACIÓN 16
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 18
3. OBJETIVOS 20
3.1 OBJETIVO GENERAL 20
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 20
4. MARCO TEÓRICO 21
4.1 TOMATE (Solanum lycopersicum L.) 21
4.1.1 Origen y domesticación 21
4.1.2 Genética, taxonomía y morfología 23
4.1.3 Requerimientos edafoclimáticos 28
4.1.4 Importancia, producción e investigación en tomate 30
4.2 MARCHITEZ VASCULAR DEL TOMATE CAUSADA POR Fusarium oxysporum f.sp.
lycopersici 31
4.2.1 Importancia 32
4.2.2 Etiología y ecología 34
4.2.3 Sintomatología y epidemiología 36
4.2.4 Estrategias de manejo de la enfermedad 38
4.3 CONTROL BIOLÓGICO DE FITOPATÓGENOS 40
4.3.1 Taxonomía, morfología y biología de Trichoderma 42
4.3.2 Mecanismos de acción 45
4.3.3 Trichoderma viride, uso en la agricultura actual 48
4.4 INDUCCIÓN DE RESISTENCIA 49
4.4.1 Generalidades e importancia del silicio 51
7
4.4.2 El silicio como inductor de resistencia 54
4.4.3 El silicio como inductor de resistencia para el manejo de enfermedades 55
4.4.4 Aplicaciones del silicio en la agricultura 57
5. METODOLOGÍA 60
5.1 MANEJO GENERAL DE LOS ENSAYOS 60
5.1.1 Ubicación Geográfica 60
5.1.2 Manejo agronómico 60
5.2 OBTENCIÓN DE MATERIAL VEGETAL PARA INÓCULO DE F. oxysporum f.sp.
lycopersici 61
5.3 AISLAMIENTO, CUANTIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL PATÓGENO 63
5.4 EXPERIMENTO 1 65
5.4.1 Inoculación del patógeno 65
5.4.2 Obtención del antagonista Trichoderma viride y época de aplicación 66
5.4.3 Obtención de la fuente de silicio y época de aplicación 67
5.4.4 Evaluación del efecto del silicio y T. viride sobre los parámetros epidemiológicos
de la enfermedad 67
5.4.5 Evaluación del efecto del inductor del silicio sobre las plantas afectadas por la
enfermedad 68
5.4.6 Evaluación del efecto del silicio y T. viride sobre las funciones fisiológicas de las
plantas afectadas por la enfermedad 69
5.5 EXPERIMENTO 2 69
5.5.1 Inoculación del patógeno 69
5.5.2 Obtención del antagonista Trichoderma viride y época de aplicación 70
5.5.3 Evaluación del efecto de T. viride sobre los parámetros epidemiológicos de la
enfermedad 71
5.5.4 Evaluación del efecto bioestimulante de T. viride sobre plantas de tomate en etapa
de semillero 71
5.6 DISEÑO ESTADÍSTICO Y ANÁLISIS DE DATOS 72
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 73
8
6.1 EXPERIMENTO 1 73
6.1.1 Efecto del silicio y T. viride sobre los parámetros epidemiológicos de la
enfermedad 73
6.1.2 Evaluación del efecto del inductor del silicio sobre la enzima Polifenoloxidasa
(PPO) como respuesta de defensa frente al ataque de F. oxysporum f.sp.
lycopersici 80
6.1.3 Evaluación del efecto del silicio y T. viride sobre las funciones fisiológicas de las
plantas afectadas por la enfermedad 84
6.2 EXPERIMENTO 2 87
6.2.1 Evaluación del efecto de T. viride sobre los parámetros epidemiológicos de la
enfermedad 87
6.2.2 Evaluación del efecto bioestimulante de T. viride sobre plantas de tomate en etapa
de semillero 89
7. CONCLUSIONES 95
RECOMENDACIONES 97
REFERENCIAS 98
9
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Genes que afectan la resistencia a enfermedades en la planta de tomate
(Lycopersicum sculentum Mill) 25
Tabla 2. Clasificación taxonómica del tomate cultivado 26
Tabla 3. Abundancia de silicio y otros elementos en algunos reservorios de la corteza
terrestre 52
Tabla 4. Escala de severidad foliar para marchitez vascular en tomate de mesa 67
Tabla 5. Escala para evaluar decoloración vascular 68
10
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Origen, domesticación, migración y mejoramiento del tomate (Lycopersicum
sculentum Mill) 22
Figura 2. Fusarium oxysporum 34
Figura 3. Aislamiento de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici 35
Figura 4. Trichoderma asperellum. A. colonia en el medio de cultivo PDA, después de
14 días a 25 ºC, B. Conidióforo, C.Fiálides, D.Conidios E. Clamidospora 42
Figura 5. Principio de resistencia sistémica activada o adquirida 56
Figura 6. Comparación de la reducción de la mancha parda por la aplicación de silicio y
fungicida en plantas de arroz 57
Figura 7. A. Síntomas característicos de marchitez por Fusarium en tomate. B. Raíz de
planta con síntomas de marchitez vascular 62
Figura 8. A. Cámara de incubación a 24°C. B. Segundo aislamiento a partir del cultivo
puro 63
Figura 9. Aislamiento de F. oxysporum f.sp. lycopersici visto al microscopio (40X) 64
Figura 10. Inmersión radicular en suspensión conidial de F. oxysporum 66
Figura 11. Momento de inoculación del patógeno (primer hoja verdadera totalmente
desplegada) 70
Figura 12. A, Severidad foliar; B, Severidad radicular; C, Avance del patógeno a través
de la raíz 74
Figura 13. Actividad de la Polifenoloxidasa en los tratamientos 81
Figura 14. A, Contenido de clorofila. B, Factor CFR 86
Figura 15. A, Incidencia; B, Sev. foliar; C, Sev. radicular 88
Figura 16. A, Dinámica de germinación; B, hojas cotiledonales totalmente desplegadas;
C, velocidad de germinación; D, Aparición de la primera hoja verdadera 90
Figura 17. A, Diámetro del tallo; B, Peso húmedo foliar; C, Peso seco foliar; D, Peso
húmedo radicular; E, Peso seco radicular 91
11
Figura 18. A. Plántula del T5 (Plantas no inoculadas con F. oxysporum y sin tratamiento
con T. viride. B. Plántula del T3 (Plantas inoculadas con F. oxysporum y tratadas con T.
viride en pregerminación y en sustrato 94
12
RESUMEN
El tomate de mesa (Solanum lycopersicum L.) es afectado por el hongo Fusarium
oxysporum f.sp lycopersici, agente causal de la marchitez vascular. La enfermedad
puede ocasionar pérdidas en la producción del cultivo de hasta un 60% y comprometer
el potencial económico del cultivo. Así, se han investigado múltiples alternativas para el
manejo de la enfermedad, como control cultural, biológico, genético e inducción de
resistencia.
La presente investigación tuvo como objetivo evaluar la capacidad del silicio como
inductor de resistencia sistémica y el antagonismo de T. viride frente a la marchitez
vascular del tomate causado por F. oxysporum f.sp. lycopersici. El trabajo se desarrolló
en la Universidad del Tolima en Ibagué Tolima. Se desarrollaron dos ensayos, evaluando
el efecto antagónico de T. viride y bioestimulante en etapa de semillero; y evaluando el
efecto inductor del silicio en la respuesta de defensa del tomate a través de la evaluación
de la actividad de la enzima Polifenoloxidasa (PPO).
En el primer ensayo se encontró una reducción de los parámetros epidemiológicos en
las plantas tratadas con silicio e inoculadas y no inoculadas con T. viride. y un incremento
en la actividad enzimática de la Polifenoloxidasa (PPO). Por otro lado, se encontró una
reducción en los parámetros epidemiológicos en las plantas tratadas con T. viride en
pregerminación de semilla y en sustrato respecto a las plantas que no fueron tratadas
con el microorganismo. Además, se encontró que las plantas que fueron tratadas con T.
viride en pregerminación tuvieron resultado positivo en las variables bioestimulantes.
Palabras clave: Marchitez vascular, antagonismo, inducción de resistencia,
bioestimulación
13
ABSTRACT
The tomato (Solanum lycopersicum L.) use to be seriously affected by Fusarium
oxysporum f.sp lycopersici, which is the causal fungus agent of vascular wilt. This disease
causes up to 60% of crop yield losses for the tomato crop system. Thereby, several
authors have developed the study of vascular wilt management. These disease control
strategies have included cultural, biological, and genetic management and induction of
resistance.
The objective of the present investigation was to evaluate the capacity of silicon as an
inducer of systemic resistance and the antagonism of T. viride against tomato vascular
wilt caused by F. oxysporum f.sp. lycopersici. The work was developed at the University
of Tolima in Ibagué Tolima. Two trials were developed, evaluating the antagonistic effect
of T. viride and biostimulant in the seedling stage; and evaluating the inducing effect of
silicon on the tomato defense response through the evaluation of the activity of the
enzyme Polyphenoloxidase (PPO).
In the first trial, a reduction of the epidemiological parameters was found in plants treated
with silicon and inoculated and not inoculated with T. viride. and an increase in the
enzymatic activity of Polyphenoloxidase (PPO). On the other hand, a reduction in the
epidemiological parameters was found in plants treated with T. viride in pregermination
of seed and in substrate with respect to plants that were not treated with the
microorganism. In addition, it was found that the plants that were treated with T. viride in
pregermination had a positive result in the biostimulant variables.
Keywords: Vascular wilt, antagonism, induction of resistance, bioestimulation
14
INTRODUCCIÓN
El tomate es una de las especies más importante de la familia Solanaceae, debido a su
amplia utilidad y en Colombia su cultivo es considerado promisorio como generador de
desarrollo y por ser una alternativa de competencia en mercados externos. En Colombia
la producción y rendimientos más altos del cultivo de tomate se concentran
principalmente en los departamentos de Boyacá y Cauca, considerando las pérdidas
ocasionadas por agentes bióticos, abióticos y en poscosecha especialmente por mala
manipulación, inadecuado almacenamiento, entre otros que pueden alcanzar un 20% -
50% (Ferreira et al., 2005). Sin embargo, este cultivo es altamente susceptible a
microorganismos patógenos que afectan severamente el rendimiento, especialmente los
que atacan el sistema radicular y de forma ascendente los haces vasculares como
Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici ocasionando consecuentemente una muerte
completa de la planta (Carreño, Vargas, Bernal & Restrepo, 2007).
Las alternativas que se han estudiado y aplicado para el manejo de esta enfermedad han
sido en algunos casos poco efectivas, además que se han enfocado en el uso de
moléculas químicas que afectan severamente el agroecosistema (Abdel-Monahim, Abo-
Elyousr & Morsy, 2011). Además, el uso constante de estas moléculas conduce al
desarrollo de genotipos resistentes y como resultado un incremento en la incidencia y
severidad de la enfermedad en el cultivo de tomate, por lo cual es necesario desarrollar
nuevas estrategias que se ajusten a los sistemas productivos actuales (Naeini et al.,
2006).
De las alternativas estudiadas para el manejo de F. oxysporum f.sp. lycopersici cabe
resaltar el control biológico con hongos antagonistas especialmente del género
Trichoderma y la inducción de resistencia sistémica. La acción micoparasítica del hongo
Trichoderma se ha demostrado desde 1932 por Weindling y posteriormente múltiples
estudios han evaluado los diferentes mecanismos de acción del género como: antibiosis,
competencia por espacio y nutrientes, micoparasitismo, desactivación de enzimas de los
15
patógenos, acelerador del desarrollo del sistema radicular, solubilización de nutrientes
orgánicos e inorgánicos, estimulación del crecimiento vegetal, inducción de resistencia,
entre otros (Martínez, Infante & Reyes, 2013). Por otro lado, la inducción de resistencia
sistémica permite a las plantas desarrollar diferentes estrategias para restringir el
crecimiento y reproducción del patógeno y la consecuente enfermedad que ocasiona. La
planta cuenta con un sistema de defensa pasiva o preformada que corresponde a
propiedades existentes antes del inicio de la infección y un sistema de defensa inducida
que involucra las respuestas a nivel estructural o bioquímica que se expresan ante el
ataque del patógeno (Comide et al., 1985; Veitía, 1999; Malaguti, 1997).
En esta investigación se evaluó el efecto del silicio (Si) como agente inductor de
resistencia sistémica a través de la cuantificación de la actividad enzimática de
Polifenoloxidasa (PFO) y su relación con los parámetros epidemiológicos en la
interacción tomate (Solanum lycopersicum L.) - Fusarium oxysporum f.sp lycopersici.
Además, se evaluó el efecto bioestimulante y antagónico del hongo Trichoderma viride
en la fase de semillero del cultivo como una estrategia para el manejo de la marchitez
vascular del tomate.
Lo anterior se desarrolla con el fin de presentar alternativas y/o estrategias de manejo de
la marchitez vascular, una de las enfermedades más representativas y que genera
mayores pérdidas en el cultivo de tomate de mesa mediante la activación de mecanismos
de defensa en la planta y el antagonismo-bioestimulación de T. viride frente al patógeno
F. oxysporum f.sp. lycopersici.
16
1. JUSTIFICACIÓN
El tomate es la segunda hortaliza más consumida y producida en Colombia y es
considerada uno de los cultivos promisorios para los principales países productores a
nivel mundial. Además, cobra importancia por la producción de sustancias antioxidantes
que ayudan a combatir enfermedades degenerativas. En el país, la producción de tomate
ha sido suficiente para cubrir la demanda interna, sin embargo, los problemas
fitosanitarios del cultivo generan pérdidas considerables, evento que impulsa a la
investigación en alternativas de manejo de enfermedades como el marchitamiento
vascular (Cardona et al., 2006).
Uno de los problemas fitosanitarios en el cultivo de tomate lo genera el patógeno
Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, habitante natural del suelo, agente causal de la
marchitez vascular (Carrillo et al., 2003). Este hongo se presenta principalmente como
saprófito en el suelo y como patógeno especializado, denominado forma especial (f. sp.),
según la planta hospedante que afecta (Garcés et al., 2001). La alta cantidad de inóculo
inicial en el suelo y su fácil diseminación, son condiciones que determinan la complejidad
del manejo. De esta forma, las estrategias que se han desarrollado para reducir las
pérdidas no han sido eficientes para el productor, debido a que estos patógenos
desarrollan alta resistencia a condiciones adversas, lo que hace necesario investigar en
estrategias agronómicas alternas que permitan reducir las pérdidas ocasionadas por la
enfermedad (Gonzáles et al., 2012).
De esta manera, es necesario investigar y desarrollar prácticas alternativas como la
incorporación de microorganismos antagónicos altamente eficientes en la regulación de
la población de F. oxysporum en el suelo (Zapata et al., 2002). Aunado a la alternativa
biológica, se plantean otras estrategias orientadas al fortalecimiento de la planta, es
decir, a la implementación de compuestos que actúan como potenciadores o inductores
de las respuestas de defensa que ella de forma natural posee. Así, se ha investigado en
la resistencia inducida en plantas con elementos como el silicio, clave en la funcionalidad
17
y estructura celular vegetal. Este elemento refuerza las barreras bioquímicas y
estructurales que limitan el ingreso y colonización del patógeno y protege la planta ante
estrés biótico o abiótico e induce la producción de fitoalexinas y compuestos fenólicos en
respuesta a la infección del patógeno (Ma & Yamaji, 2008).
18
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El tomate se ha consolidado como una de las hortalizas de mayor demanda a nivel
mundial, su área de cultivo se ha incrementado en los últimos años significativamente.
En 2008, a nivel mundial se tenían sembradas 5.227.883 hectáreas con una producción
de 129.649.883 toneladas mientras que en Colombia, para el mismo año, el área
cultivada fue de 14.855 hectáreas con una producción de 455.693 toneladas (FAO,
2010). El crecimiento de este cultivo en el país se debe principalmente al mejoramiento
de los circuitos comerciales aunado a la tecnificación de los cultivos, lo que ha facilitado
el incremento en área sembrada de la hortaliza (Perilla et al., 2011).
Uno de los principales problemas en la producción de tomate en Colombia y el mundo
es la marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, hongo
habitante natural del suelo (Carrillo et al., 2003). Por lo tanto, se ha fomentado la
implementación de variedades tolerantes y diferentes estrategias que reduzcan la
incidencia y severidad de la enfermedad, con el fin de disminuir las pérdidas en
rendimiento y calidad del producto que son aproximadamente del 60% (Gonzáles, 2012).
En Colombia es todavía incipiente la investigación en estrategias de manejo integrado
que articulen la utilización de prácticas culturales, control biológico, y tratamientos que
induzcan resistencia en las plantas de tomate ante el ataque de F. oxysporum f.sp.
lycopersici. Aunado a esto, la necesidad de evitar la contaminación ambiental y reducir
los costos al productor por la aplicación excesiva de fungicidas y desinfección al suelo,
son base fundamental para indagar en alternativas de manejo integrado de la
enfermedad (Camacho et al., 2006).
De acuerdo a lo anterior, dada la importancia multisectorial que tiene el tomate, es
determinante generar información desde la academia que permita ser implementada en
los cultivos comerciales encaminadas a reducir las pérdidas ocasionadas por el
marchitamiento vascular. Además, es evidente que el manejo químico de este tipo de
19
patógenos es ineficiente por las características propias del hongo y las condiciones
edafoclimáticas que se presentan en el agroecosistema. Así, todas las alternativas que
se investiguen y desarrollen para el manejo del patógeno contribuyen al desarrollo de las
regiones productoras, a la preservación del medio natural, producción de frutos inocuos
y genera un cambio de visión en la producción hortícola en Colombia.
20
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la capacidad del silicio como inductor de resistencia sistémica y el antagonismo
de Trichoderma viride frente a la marchitez vascular del tomate (Solanum lycopersicum)
causado por (Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici).
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estudiar el efecto de la inoculación de Trichoderma viride sobre componentes
epidemiológicos de la marchitez vascular en plantas de tomate de mesa (Solanum
lycopersicum).
Evaluar el efecto bioestimulante de Trichoderma viride en etapa de semillero de
plantas de tomate de mesa
Determinar por análisis bioquímicos el efecto del Si como inductor de las
respuestas de defensa de plantas de tomate frente al fitopatógeno F. oxysporum
f.sp. lycopersici.
Evaluar el efecto del Si sobre algunas funciones fisiológicas de plantas de tomate
afectadas por F. oxysporum f.sp. lycopersici.
21
4. MARCO TEÓRICO
4.1 TOMATE (Solanum lycopersicum L.)
El tomate (Solanum lycopersicum L.) es una de las especies económicamente más
importantes de la familia Solanaceae en Colombia y el mundo, debido a su elevado
consumo en fresco y como producto transformado por la agroindustria (Carreño, Vargas,
Bernal & Restrepo, 2007; Salazar et al, 2011). Este cultivo se implementa en diferentes
regiones del país como plantación comercial o como apoyo de economías familiares en
pequeños huertos. Aunque la producción de tomate en el país ha sido suficiente para
satisfacer la demanda interna, el productor se ve afectado económicamente por pérdidas
causadas por diferentes plagas y enfermedades (Amaya, Peña, Mosquera, Villada &
Villada, 2009).
La planta de tomate tiene un importante valor nutricional debido a su poder antioxidante
que permite combatir enfermedades degenerativas, posee alto contenido de vitaminas
A, C y algunas del grupo B, entre otras características. Además, contribuye en la
generación de empleo en las regiones donde se desarrolla el cultivo (Notario & Sosa,
2012; Palomo, Moore, Carrasco, Villalobos & Guzmán, 2010).
4.1.1 Origen y domesticación. El tomate es originario de América del Sur en la región
de los Andes, específicamente en Ecuador, Bolivia, Colombia y Perú, donde se
encuentra la mayor variabilidad genética de la especie. El centro de domesticación es el
sur de México y Norte de Guatemala (Figura 1), cuyo nombre nativo azteca era “tomatl”
y desde allí se dispersó a diferentes partes del mundo como Europa donde se introdujo
en el siglo XVI (Vergani, 2002; Jaramillo et al., 2013).
22
Figura 1. Origen, domesticación, migración y mejoramiento del tomate (Lycopersicum
sculentum Mill)
Fuente: Vallejo (1999)
Sitio de origen: parte occidental de América del Sur
1. Migración del tomate cereza, tipo silvestre
2. Sitio de domesticación; México, época pre-colombina
3. Introducción de cultivares mexicanos al Mediterráneo, siglo XVI
4. Mejoramiento de cultivares europeos
5. Introducción de América del Norte, Siglo XVIII
6. Mejoramiento de cultivares norteamericanos
7. Introducción de nuevo germoplasma (silvestre) siglo XX
8. Introducción al Brasil y resto de América del Sur, Siglo XIX
Existen diferentes evidencias que fortalecen el argumento del lugar de domesticación del
tomate, desde su centro de origen, Perú hasta México, pasando por Colombia, Panamá,
Ecuador y América Central. Al llegar a México la planta fue domesticada por el hombre,
especialmente la variedad de tomate tipo cereza Lycopersicon esculentum var.
cerasiforme (Jaramillo et al., 2013). De igual manera, no se encuentra información que
1
2
3
4
5
6
7
8
23
en América del norte los nativos conocieran la planta. Además, no se ha encontrado
alguna relación de la planta de tomate con la arqueología descubierta en la región andina
(Vallejo, 1999).
Desde su centro de domesticación el tomate fue introducido a otros lugares como
Europa, Inglaterra, Estados Unidos en donde se cultivaba inicialmente como planta
ornamental y cerca del siglo XIX se genera la primera variedad comercial y el en siglo
XX se desarrolla la primera variedad mejorada de tomate nombrada “Ponderosa”
(Jaramillo et al., 2013).
El tomate tuvo dos etapas en el proceso de domesticación: primero hubo una selección
de tomates tipo cherry en el centro de origen a través de autogamia o produciendo de
semilla por medio de la autofecundación y en segundo lugar, se seleccionó frutos de
mayor tamaño, los que se condujeron por los Andes hacia Centroamérica. Así, se
modificaron diferentes características del tomate, como la forma de reproducción,
pasando de la alogamia a la autogamia y otras específicas del fruto como tamaño,
variación en colores y formas, uniformidad en la maduración, entre otros (Rodriguez,
Pereira, Pratta, Zorzoli & Picardi, 2013).
4.1.2 Genética, taxonomía y morfología. El tomate presenta una constitución genética
diploide n=12, es decir, un número básico de 12 de cromosomas que junto con el corto
ciclo de cultivo permiten el desarrollo de los procesos de mejoramiento genético de la
planta (Rodríguez et al., 2013). El genoma presenta diferentes características como:
pocas alteraciones estructurales, heterocromatización en algunos loci del cromosoma,
definida distribución de los genes dentro del cromosoma, presencia de grandes bloques
de genes relacionados con el funcionamiento fisiológico de la planta, entre otras (Vallejo,
1999).
El tomate es considerado una de las especies vegetales con mayores ventajas para
realizar estudios citogenéticos debido a variabilidad genética natural, mayor velocidad de
expresión genética por la forma de polinización (autopolinización), capacidad de
24
producción de semilla para ensayos de cruzamiento y facilidad de identificación de
cromosomas (Vallejo, 1999).
Se han identificado los genes relacionados con la expresión de las características
fisiológicas y de composición del tomate, tales como el Gen a (a1) que ocasiona la
ausencia de antocianina; Gen a2b intensidad media en la pigmentación de antocianinas;
Gen aw son plantas con ausencia de antocianinas, tienden a ser amarillas; Gen br
produce entrenudos cortos, generando plantas de porte bajo; Gen H relacionado con la
ausencia de tricomas largos e intermedios; Gen hl produce ausencia total de tricomas,
entre otros. Así, como para las características vegetativas, para las reproductivas
también se ha identificado la especificidad de los genes como: Gen Cr produce
resistencia a rajadura en el fruto; Gen nor, confiere un retrasamiento en la maduración
del fruto; Gen ap produce un menor tamaño en la corola; Gen ps evitan la
autofecundación al ocasionar que las anteras no se abran durante el ciclo de vida de la
flor, entre otros (Vallejo, 1999).
Además, se han identificado los genes que afectan la resistencia a algunas
enfermedades del cultivo del tomate, principalmente las más limitantes (Tabla 1). La
familia Solanaceae tiene cerca de 2,300 especies agrupadas en 96 géneros distribuidas
principalmente en las regiones subtropicales, tropicales y templadas. Posee múltiples
formas vegetativas y reproductivas lo que permite facilidad de adaptación (Sierra,
Siqueiros, Flores, Moreno & Arredondo, 2015). El tomate cultivado se encuentra ubicado
en dos subgéneros: Eulycopersicon y Eriopersicon, en los cuáles los frutos cambian de
color de verde a rojo cuando maduran y los frutos permanecen verdes cuando maduran
respectivamente. La Tabla 2 presenta la clasificación taxonómica del tomate cultivado
(Jaramillo et al., 2013).
En la actualidad se presenta una situación en relación a la definición del nombre científico
del tomate, debido a que el botánico inglés Phillip Millar en 1881 lo denominó
Lycopersicum esculentum ubicándolo en el género Lycopersicon (Tabla 2). Empero,
Carlos Linneo para el año de 1753 había ubicado la planta en el género Solanum dándole
25
el nombre de Solanum lycopersicum L. Aunque los dos nombres son utilizados en la
actualidad, existen bases genéticas y cladísticas modernas especiales que determinan
la validez de la clasificación de Linneo (Escobar & Lee, 2009).
Tabla 1: Genes que afectan la resistencia a enfermedades en la planta de tomate
(Lycopersicum sculentum Mill)
Fuente: Vallejo (1999)
Gen Organismo
ad Alternaria en las primeras etapas de desarrollo del cultivo
Cf-1 Cf-5 Diferentes razas de Fulva fulvia (Cladosporium fulvum) que
produce la enfermedad "moho ceniciento"
I1 I2 Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici
Mi Nemátodos: Meloidogyne incognita, M javánica, M. acrita,
M. arenaria
ph Phytophthora infestans
Se Septoria lycopersici
Sm Stemphylium solani
Swa Virus Spott wild
TM1, TM2, TM3 Diferentes razas del Virus del Mosaico del Tabaco TMV
Ve Verticillium alboatrum
bw Pseudomonas solanacearum
26
Dentro del género Lycopersicon se encuentran diferentes especies: L. esculentum Mill
que corresponde al tomate cultivado, L. esculentum var. cerasiforme, L. pimpinellifolium
(Jusl) Mill, L. hirsutum Humb. and Bonpl., L. cheesmanii Riley, L. parviflorum, L.
chmielewskii, L. peruvianum (L.) Mill, L. pennelli (Sin. de Solanum pennelli Corr.), L.
chilense Dun. Una de las ventajas de estas especies es que pueden cruzarse entre sí y
producir híbridos (Vallejo, 1999).
Tabla 2. Clasificación taxonómica del tomate cultivado
Reino Plantae
Subreino Tracheobionta
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase Asteridae
Orden Solanales
Familia Solanaceae
Género Lycopersicon
Especie Esculentum
Nombre binomial Lycopersicon esculentum
Descriptor Miller (1788)
Fuente: Vallejo (1999)
El tomate es una planta de porte herbáceo, puede desarrollarse de forma rastrera, erecta
o semierecta y de acuerdo al hábito de crecimiento pueden presentarse variedades
determinadas o indeterminadas, es decir, existe o no limitación en el crecimiento
respectivamente. Además, las variedades determinadas se caracterizan por presentar
un porte bajo, son de tipo arbustivo y la producción de fruto se concentra en un periodo
corto, a diferencia de las variedades indeterminadas que presentan inflorescencias
laterales y un crecimiento permanente (Jaramillo et al., 2013).
La raíz de la planta de tomate es superficial, presenta una raíz principal corta y
numerosas raíces secundarias. Además, desarrolla raíces adventicias para mejorar el
27
anclaje al suelo o sustrato. En la parte interior se pueden describir las zonas más
importantes de la raíz: la epidermis donde se sitúan los pelos absorbentes, los cuáles
toman agua y nutrientes; el cilindro central y el córtex donde se halla el vaso xilemático
que transporta agua y nutrientes hacia los diferentes órganos de la planta (Jaramillo et
al., 2013; Escobar & Lee, 2009).
El tallo aproximadamente mide de 2 a 4 cm de diámetro en el cuello de la planta, pero
se reduce a medida que se incrementa la altura. A este órgano lo cubren pelos
glandulares y no glandulares y sobre él se desarrollan lateralmente los demás órganos
de la planta: hojas, inflorescencias y demás (Jaramillo et al., 2013; Escobar & Lee, 2009).
Las hojas de la planta del tomate son compuestas, imparipinadas, tiene un foliolo en la
parte terminal acompañado de 8 a 9 foliolos en la parte lateral. Así, el número de hojas
y la velocidad de aparición están determinadas por factores propios del hábito de
crecimiento y por las condiciones ambientales. Por ejemplo, en variedades determinadas
se presenta una tasa de crecimiento semanal de 2 ½ hojas a una temperatura de 23°C
(Jaramillo et al., 2013; Escobar & Lee, 2009).
Las flores son hermafroditas constituidas por 5 sépalos o más y 6 o más pétalos. En una
inflorescencia se producen varias flores y una planta de hábito indeterminado tiene la
capacidad de producir 20 o más inflorescencias sucesivas, desarrollando
aproximadamente cada 11 días racimos florales. Además, las condiciones ambientales
están relacionadas con la floración tardía o precoz, el número de flores y
consecuentemente el rendimiento y calidad de los órganos de almacenamiento (Jaramillo
et al., 2013; Escobar & Lee, 2009).
El fruto del tomate es una baya conformada por un 94-95% de agua, 5-6% de
compuestos orgánicos responsables del sabor de este. Presenta múltiples
características respecto a tamaño, composición, forma, consistencia entre otras. El fruto
se divide internamente en lóculos que son las cavidades donde se desarrolla la semilla
y de acuerdo al número de estos pueden ser bi, tri, tetra, o pluriloculares (Jaramillo et al.,
2013; Escobar & Lee, 2009).
28
La semilla tiene un diámetro promedio de 3-5 mm, es pequeña y puede presentar
diferentes formas: achatada, globular, ovalada, redonda, alargada, plana, triangular,
entre otras. Cada fruto puede tener entre 100 y 300 semillas de acuerdo a diferentes
factores y un gramo de semillas puede tener de 300 a 400 unidades (Jaramillo et al.,
2013; Escobar & Lee, 2009).
4.1.3 Requerimientos edafoclimáticos. El tomate es una hortaliza de estación cálida,
sensible a eventos climáticos extremos como heladas y sequía. La temperatura ideal
para el cultivo puede oscilar entre 18 y 27 °C pero de acuerdo al sistema productivo, es
decir, a campo abierto o bajo cobertura estas condiciones varían. Bajo invernadero la
temperatura es un factor determinante, debido a que afecta el desarrollo de las diferentes
etapas fisiológicas de la planta, por lo cual es importante mantener el nivel térmico ideal
requerido por el cultivo (Jaramillo et al., 2013; Holwerda, 2006). De esta manera,
Martínez (citado por Jaramillo et al., 2013) expone que una temperatura mayor a 25°C o
menor a 12 °C puede ocasionar desórdenes fisiológicas relacionadas con la fecundación
por la reducción de polen y consecuentemente pérdidas económicas por malformación
en frutos.
Para un sistema productivo bajo invernadero es recomendable conocer los siguientes
rangos de temperatura y sus posibles efectos sobre el cultivo: entre 8 y 12 °C que
corresponde a una temperatura mínima se puede producir un debilitamiento de la planta
al limitar los procesos de toma de nutrientes, crecimiento y consecuente muerte. La
temperatura óptima se encuentra en el rango de 21 a 27°C en la cual hay normalidad en
los procesos bioquímicos y fisiológicos del cultivo. Entre 32 y 36 °C se fomentan procesos
agotadores en la planta relacionados con la toma de nutrientes, desórdenes fisiológicos
y limitación en la floración, este rango corresponde a la temperatura máxima (Jaramillo
et al., 2013).
En el tomate como en la mayoría de las plantas, el crecimiento en peso por unidad de
área está determinado por la luminosidad, incrementando el rendimiento, principalmente
por el aumento de la producción de materia seca. En sistemas productivos bajo
29
invernadero la falta de luz a causa de sombreo o deterioro de los plásticos afectan la
producción y calidad, especialmente ocasionando manchado y frutos huecos (Jaramillo
et al., 2013).
El cultivo a libre exposición es altamente sensible a condiciones de baja luminosidad, ya
que bajo condiciones de luz adecuadas, la planta desarrolla la cantidad de azúcares
necesarios a través de la fotosíntesis para soportar mayor peso de los frutos. Así, la
planta de tomate, requiere 6 horas diarias mínimas de luz para desarrollarse con
normalidad, de lo contrario en exceso o déficit de este recurso, se pueden presentar
frutos partidos, golpes de sol, coloración y madurez irregular, baja fecundación, floración
deficiente, entre otros (Holwerda, 2006).
Al igual que los factores anteriores, el requerimiento hídrico varía de acuerdo al sistema
productivo, de manera que a libre exposición el tomate requiere hasta 6,000 m3 ha-1 y en
condiciones de invernadero hasta 10,000 m3 ha-1. Aunado a esto la fertirrigación es una
de las herramientas más utilizadas para evitar estrés por déficit de nutrimentos y para
hacer más eficiente el uso consuntivo de agua. Además, el suelo recurso que provee
nutrientes, anclaje y otras condiciones al cultivo, debe ser estrictamente seleccionado,
favoreciendo suelos con buen drenaje, estructura física y propiedades químicas,
partiendo de la condición de que en los primeros 0,6 m de la superficie del suelo se
encuentra la zona radicular de la planta y el 70% se concentra en los primeros 0,2 m
(Holwerda, 2006).
Algunas condiciones características de los sistemas de cultivo bajo cobertura con
condiciones controladas pueden ser manejadas para mejorar el desarrollo del cultivo e
incrementar los rendimientos. La humedad relativa en invernadero debe ser controlada
y permanecer entre 50 y 65%, debido a que si se excede el rango superior se puede
presentar mayor incidencia de enfermedades causadas por hongos como Botrytis,
agrietamiento de los frutos, baja fecundación, entre otros. Al igual si la humedad es
menor que el rango inferior se puede elevar la transpiración, estrés hídrico, cierre de
estomas y reducción del proceso fotosintético (Jaramillo et al., 2013).
30
Además de la humedad relativa, la ventilación del invernadero debe controlarse con el
fin de eliminar la humedad dentro de este, eliminar el exceso de calor, y remover los
gases tóxicos del interior, introduciendo dióxido de carbono. Claramente el porcentaje de
ventilación calculado y el cociente de las áreas de aberturas entre el área del
invernadero, varía de acuerdo a la región productora, el clima característico de la región,
el tipo de invernadero, además que se debe tener en cuenta la velocidad del viento para
definir la necesidad de establecer sistemas cortavientos para evitar complicaciones en la
producción (Jaramillo et al., 2013).
4.1.4 Importancia, producción e investigación en tomate. La demanda interna y externa
de tomate se ha incrementado debido al alto contenido de vitaminas, minerales, agua
entre el 90 – 94 % y esto ha conducido a mejorar las técnicas de cultivo para satisfacer
esta demanda (Grijalva, Macías, Grijalva & Robles 2010; Ruiz, Vicente, Montañez,
Rodríguez & Aguilar, 2012). Además, posee alto contenido de licopeno, cerca de 3000
µg/100g, antioxidante que ayuda a combatir enfermedades degenerativas en el ser
humano y de los pocos carotenoides que se encuentran de forma natural en las plantas.
Además de las propiedades nutracéuticas, el cultivo de tomate genera empleo en las
regiones productoras y cercanas (Cardona, Ríos & Restrepo, 2006).
En Colombia el consumo de esta hortaliza por la variedad de usos es enorme y en otros
países como Canadá y Estados Unidos, la demanda de estar hortaliza también es
creciente, cerca de 2,2 toneladas de tomate se requieren para satisfacer la demanda.
Además, en México la producción anual es de 200 ton ha-1, pero sólo el 60% es de tipo
exportación, por lo cual con un consumo per cápita superior a 8 kg año-1 se requiere
incrementar el área establecida bajo invernadero para cubrir la demanda (Grijalva et al.,
2010).
El incremento del cultivo de tomate bajo condiciones protegidas ha permitido el
aprovechamiento de áreas no aptas, reduciendo así las pérdidas ocasionadas por los
agentes ambientales que antes se consideraban de difícil control. Así, bajo este ideal
para el año 2013 se cultivaron 6,867 hectáreas de las cuáles se cosechó poco más del
31
60% con un promedio de rendimiento cercano a 43 toneladas/ha/semestre para un total
de 175,706 toneladas producidas. De este manera, el principal es el Departamento de
Boyacá con más de 43 toneladas, seguido por Cundinamarca, Norte de Santander,
Antioquia, Santander, Quindío, Caldas y demás (DANE-ENA, 2013).
A pesar de la importancia que tiene el cultivo de tomate por diferentes aspectos, cabe
resaltar que en el periodo 2014 – 2015 este cultivo tuvo una disminución de área
considerable de 1,875 has, es decir una reducción de más del 17%. Al igual de forma
general la producción de hortalizas en el país tuvo una disminución de más del 12% en
el periodo 2014 – 2015 (DANE-ENA, 2015).
En la actualidad, pocas son las organizaciones dedicadas exclusivamente a la
investigación en el cultivo de tomate. Las Universidades y centros de enseñanza
desarrollan trabajos encaminados a la solución de los problemas agronómicos y sociales
relacionados con el cultivo. La Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria
(Corpoica), dentro de su marco de trabajo investigativo ha incluido el tema de Agricultura
Protegida en el cual se incluye el cultivo de tomate. Así, dentro de las investigaciones
Corpoica concluye que a pesar que en Colombia el desarrollo de cultivos bajo
condiciones controladas o invernadero ha sido exitoso, esta producción se ha enfocado
a la floricultura, aunque en los últimos años se ha intensificado en el cultivo del tomate
en el cuál para el año 2013 se tenían cerca de 500 has.
El desarrollo de proyectos en Agricultura Protegida comprende una serie de
requerimientos tecnológicos, de investigación y demás que deben ser abordados por las
organizaciones competentes, para lo cual el Ministerio de Agricutura y Desarrollo Rural
(MADR) ha gestionado diferentes propuestas. Así, se han desarrollado diferentes
documentos como “Tecnología para el Cultivo de Tomate Bajo Condiciones Protegidas”
de la mano del MADR y Corpoica con el fin de brindar herramientas a los actuales y
potenciales productores bajo este sistema y en especial del cultivo de tomate (Jaramillo
et al., 2013).
32
4.2 MARCHITEZ VASCULAR DEL TOMATE CAUSADA POR Fusarium oxysporum
f.sp. lycopersici
La marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum ha sido reportada en más de
32 países alrededor del mundo afectando diferentes cultivos de importancia económica
y se han identificado tres razas fisiológicas de la forma especial lycopersici del patógeno
(do Amaral, de Andrade, Vilela & Vanusa, 2008). Así, el desarrollo de materiales
resistentes genéticamente ha sido la mejor alternativa para manejar esta enfermedad,
considerando la forma de sobrevivencia del patógeno, es decir, su permanencia en el
suelo por varios periodos de tiempo hace que otro tipo de manejo como el químico resulte
poco efectivo (Reis, Giordano, Lopes & Boiteux, 2004).
El marchitamiento vascular del tomate causado por Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici
es una de las enfermedades más importantes del cultivo de tomate en el mundo, de difícil
manejo por tratarse de un hongo habitante natural del suelo con alta capacidad de
sobrevivencia como micelio o clamidosporas en los residuos de cosecha, en materia
orgánica en descomposición y en las partículas de suelo (Jaramillo et al., 2013).
4.2.1 Importancia. Dadas las características especiales de sobrevivencia, morfología,
reproducción, variabilidad genética, distribución y demás del hongo, este tiene la
capacidad de reducir severamente el rendimiento en la producción del tomate hasta en
un 60% (González, Arias, & Peteira, 2012). De esta manera, se comprende desde una
perspectiva económico-ambiental la necesidad de investigar en alternativas de manejo
de esta enfermedad, considerando la importancia del cultivo, la intensidad de la patología
y el beneficio de la producción sostenible y sustentable.
Esta enfermedad se presenta con mayor incidencia en suelos con pH ácido, pesados o
con mal drenaje, ya que facilita el ingreso del hongo por las raíces a través de heridas o
aberturas naturales que se generan por la formación de raíces secundarias (Jaramillo et
al., 2013).
33
Después de ingresar por las raíces el patógeno coloniza los vasos conductores y produce
un taponamiento interviniendo en el flujo de agua y nutrientes. Sin embargo, esta
colonización puede limitarse en cultivares tolerantes, pero estos no representan una
solución definitiva para la enfermedad, debido a la constante evolución del
microrganismo. Así, el uso de diferentes alternativas como productos naturales se ha
utilizado para contrarrestar los efectos negativos de este patógeno en los cultivos,
especialmente en tomate de mesa (Rodríguez & Montilla, 2002).
La dificultad de manejo del patógeno radica en la capacidad de sobrevivencia en el suelo
por largos periodos de tiempo, afectar diferentes cultivos, generar daños irreversibles,
condición cosmopolita, entre otros. Por lo tanto, se ha fomentado el uso de agroquímicos
que faciliten el manejo, pero estos afectan severamente el medio ambiente y al ser
humano, además que inducen resistencia en las razas del patógeno generando mayor
incidencia de las enfermedades y consecuentemente mayores pérdidas económicas en
los cultivos (García, Shagarodsky, Fresneda, Fundora & González, 2007; Abdel-
Monahim, Abo-Elyousr & Morsy, 2011).
Además de los agroquímicos, la producción de micotoxinas ocasiona graves afecciones
en seres humanos, como en Colombia que se ha reportado algunas cepas de Fusarium
que producen la micotoxina zearalelona que contamina diferentes granos como el maíz,
trigo y sorgo ocasionando diferentes alteraciones en la fertilidad, malformación en
animales y desórdenes reproductivos (Diaz & Céspedes, 1997; Duffus, 1983).
Fernández et al. (2013) encontraron que la agresividad de F. oxysporum f.sp. lycopersici
se incrementó en la variedad Rio Grande comparada con el híbrido Yaqui, lo que
demuestra que el manejo también debe ser varietal, conociendo los materiales que
presenten una resistencia genética mayor. Además, demostraron la agresividad del
patógeno, ya que las plantas de la variedad murieron a los 30 días después de la
inoculación y las del híbrido a los 50. Aunado a esto, este hongo desarrolla
clamidosporas, esporas que le permiten sobrevivir en condiciones ambientales adversas
34
y en el suelo como saprófito en ausencia de hospederos, es decir, puede estar en latencia
esperando plantas hospedantes (Garret, 1977).
Una práctica que se realizaba con la forma especial Fusarium oxysporum f.sp. eythroxyli
era la destrucción de cultivos de coca (Erythroxylum coca LAM., 1786) en Colombia
generando polémica el potencial de afectación a la salud humana y animal. Aunque no
existe suficiente información acerca de esa forma especial, se ha reportado que puede
inducir complicaciones en pacientes inmunosuprimidos (Rabodonirina et al., 1994;
Garcés et al., 2001).
4.2.2 Etiología y ecología. Fusarium oxysporum pertenece al Phyllum Ascomycota,
orden Hypocreales, familia Nectriaceae, género Fusarium y especie Fusarium
oxysporum (Figura 2). Presenta formas especiales (f. sp.) que son taxones que
corresponden a cepas con características morfológicas especiales, además de una
capacidad para afectar hospedantes específicos, ejemplo de ello es Fusarium oxysporum
f. sp. lycopersici (Garcés et al., 2001; Booth, 1971; Seifert & Lévesque, 2004).
Figura 2. Fusarium oxysporum
Fuente: Pârvu et al (2010).
35
Además de las formas especiales, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici se subdivide en
razas patogénicas específicas de una variedad de cultivo. La determinación o
clasificación de las razas se realiza a través de pruebas de patogenicidad y análisis de
las características de virulencia del aislamiento y de forma general la clasificación
taxonómica del género se realiza por su morfología, la formación y características de las
estructura reproductivas (Bosland, 1988).
El patógeno F. oxysporum es un hongo imperfecto que se reproduce por esporas
asexuales conocidas como conidias formadas en el extremo por una hifa. El micelio es
profuso, aéreo, algodonoso y presenta diferente coloración como blanca, salmón,
durazno, además de un tinte violeta o púrpura en la superficie del medio de cultivo (Figura
3) (Agrios, 2005).
Figura 3. Aislamiento de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici
Fuente: Autores
36
El patógeno se caracteriza por ser una especie cosmopolita con capacidad de afectar a
más de 100 especies de plantas Gimnospermas y Angiospermas debido a las
características que ha desarrollado para romper las barreras de defensa en las plantas.
Además tiene la capacidad de producir tres tipos de esporas: microconidias que son
unicelulares, sin septas y pueden ser rectas o curvadas; macroconidias que son largas y
moderadamente curvas; clamidosporas que son el resultado del agrupamiento del
contenido de hifas y conidios. Estas últimas permiten al hongo una sobrevivencia en
largos periodos de tiempo estableciéndose como saprófito (Bosland, 1988; Nelson, 1981;
Garret, 1977).
El hongo Fusarium oxysporum tiene la capacidad de sobrevivir en residuos de cosecha,
en suelos con una estructura de resistencia llamadas clamidosporas o propiamente con
su micelio. Esta condición determina la dificultad del manejo de la enfermedad, aunado
a la mala nutrición de los cultivos, algunas características especiales de los suelos que
la favorecen como el pH ácido, mal drenaje , textura liviana entre otros (Jaramillo et al.,
2013.)
4.2.3 Sintomatología y epidemiología. La forma de infección en las especies de
Fusarium es similar, penetran por la raíz y colonizan el tallo causando la afectación en
las diferentes especies de plantas. De modo general, el primer síntoma es un
decaimiento general de la planta, amarillamiento, caída de las hojas, seguido de un
encrespamiento de las hojas y consecuentemente una caída de las mismas. El follaje de
la planta presenta un marchitamiento alterno entre la noche y el día, siendo más evidente
y severo en las horas más cálidas, con una leve recuperación en la noche, pero luego la
planta muere completamente. Al realizar un corte transversal en el tallo de una planta
afectada se puede observar el oscurecimiento del mismo e igualmente las raíces de color
marrón oscuro (Cerkauskas, 2005).
Los síntomas causados por F. oxysporum f.sp. lycopersici corresponden a
marchitamiento, clorosis y consecuentemente muerte total de la planta, debido a que
obstruye los vasos conductores y elimina la posibilidad de transporte de agua y nutrientes
37
reduciendo las posibilidades de recuperación. De esta manera, realizar un diagnóstico
oportuno de la enfermedad y aplicando las herramientas apropiadas para el manejo
preventivo del patógeno se pueden reducir las pérdidas económicas en el cultivo
(Fernández et al., 2013).
De acuerdo a la etapa fisiológica en la cual se encuentre la planta, la expresión y la forma
de afectación a causa de este patógeno varía en el tomate. En plantas adultas, entre la
floración y la maduración se presenta la mayor afectación por Fusarium; igualmente se
desarrolla un marchitamiento y decoloración en las hojas más viejas y posteriormente se
presenta un secamiento generalizado de la planta (Tamayo & Jaramillo, 2006).
Internamente en el tejido vascular se puede apreciar una coloración café rojizo, que
corresponde a una de las características visuales más utilizadas para el diagnóstico de
la enfermedad (Jaramillo et al., 2013). Algunos estudios han mostrado que después de
24 horas de la inoculación se observa un crecimiento intra a intercelular en las raíces y
a las 72 horas un crecimiento amplio del micelio sobre la zona radicular, al sexto día una
invasión completa del hongo en el tejido y al noveno día se presenta un crecimiento total
del patógeno en algunas zonas del tallo (Jaramillo et al., 2013).
El patógeno se puede diseminar de diferentes formas de acuerdo al sistema productivo
establecido, ejemplo de esto es en cultivos de clavel donde la principal fuente de inóculo
son los esquejes infectados por el hongo. Así también, el agua y el suelo contaminado
pueden ser fuente importante de inóculo en cultivos de flores y otros (Nelson, 1964;
Garibaldi, 1978). En el cultivo de tomate la principal fuente de diseminación es el agua
cuando se tiene riego por gravedad, además las plantas afectadas, residuos de cosecha
y problemas en semillero comprenden otras formas importantes de desplazamiento del
patógeno (Jaramillo et al., 2013).
La nutrición de la planta y las condiciones ambientales determinan las características
epidemiológicas de la enfermedad, la temperatura ideal para el desarrollo de la
enfermedad puede oscilar entre 25 y 30°C. En tanto, que una temperatura en el suelo
38
superior a 57,5°C durante 30 minutos ocasiona la muerte de las estructuras de
resistencia. La esporulación también se ve favorecida por la temperatura y la
luminosidad, siendo el rango óptimo entre 20-25°C y 12 horas luz/oscuridad
respectivamente (Fletcher & Martín, 1972; Baker, 1988). Así, en Colombia en sistemas
productivos bajo invernadero la incidencia de la enfermedad ha sido elevada por lo que
se ha recurrido a prácticas como el embolsado de plantas individuales y desinfección
previa del suelo para reducir las pérdidas ocasionadas por el patógeno (Jaramillo et al.,
2013).
4.2.4 Estrategias de manejo de la enfermedad. Las múltiples estrategias de infección
que ha desarrollado Fusarium oxysporum, su especificidad y capacidad de sobrevivir en
ausencia de sus hospederos ha fomentado el desarrollo de diferentes formas para
manejar la enfermedad. Además, conociendo las diversas fuentes de inóculo del
patógeno, la investigación para el manejo de la enfermedad debe ser orientada en torno
a evitar la llegada del microorganismo a la especie vegetal (Ma et al., 2013).
Las prácticas culturales son la estrategias iniciales que se deben implementar para evitar
el contacto inicial de F. oxysporum con la especie vegetal. Particularmente en el cultivo
de tomate, la selección del sitio de siembra, es decir, evitar suelos con pH ácidos, mal
drenaje, textura liviana es una forma de manejo debido a que se restringe el ambiente
óptimo para desarrollo del microorganismo. Aunado a la adecuada selección del sitio de
siembra, el uso de semilla certificada también es una práctica utilizada para evitar
pérdidas severas en el cultivo a causa de la enfermedad. Además, técnicas como la
solarización del suelo para destruir estructuras de resistencia del patógeno como
clamidosporas y desinfección de herramientas permiten disminuir la incidencia de la
enfermedad (Jaramillo et al., 2013).
Por otro lado, el control químico resulta ser el más asequible en los sistemas productivos,
utilizando fungicidas sistémicos como el benomil, carbendazim, tiabendazol y tiofanato
aunque este puede tener diferentes efectos sobre las plantas como acción mutagénica y
sobre los patógenos incrementar el grado de resistencia al efecto de estos fungicidas
39
(Agrios, 2005). Además, el uso intensivo de agroquímicos representa un grave riesgo
para la salud humana, animal y para la contaminación del medioambiente (Abdel-
Monahim et al., 2011).
En investigaciones se han desarrollado variedades tolerantes al marchitamiento vascular
y otras enfermedades, lo que comprende otra alternativa de manejo. Entendiendo la
importancia de la variabilidad genética de las especies vegetales para potenciar la
producción de los cultivos, es necesario implementar programas de mejoramiento
genético especiales para cada especie cultivada (Krarup, 1984). De esta manera,
especialmente en tomate tipo Chonto existen algunos híbridos tolerantes a F. oxysporum
f.sp. lycopersici como el Calima, Tinto, Comunero, Cumanday, Atala, entre otros y tipo
Milano como Granitio, B-52, Astona, Esmeralda, Rubí, Aurora, entre otros (Jaramillo et
al., 2013).
Otras alternativas de manejo como la aplicación de extractos y aceites vegetales han
surgido como herramientas para evitar la dependencia a plaguicidas sintéticos
preservando el medio ambiente, los recursos naturales, así como la salud humana y
animal (Villa et al., 2015). Contra el patógeno Fusarium oxysporum se han evaluado
diferentes extractos etanólicos de tres especies de la planta Flourensia spp.
determinando una inhibición de más del 90% en el desarrollo del micelio (Jasso et al.,
2007). Además, se han desarrollado múltiples investigaciones para evaluar el efecto de
aceites vegetales de especies como canela (Cinnamomum zeylanicum), toronjil (Melissa
officinalis), Cilantro (Coriandrum sativum), tomillo (Thymus vulgaris) para controlar
patógenos como Fusarium y disminuir la contaminación por micotoxinas en cereales
(Pawar & Thaker, 2007; Necha & Barrera, 2009).
Las plantas pueden desarrollar diferentes extractos y aceites esenciales que pueden
presentar cerca de sesenta componentes, de los cuales pueden existir algunos con
propiedades antifúngicas que pueden afectar a los patógenos de forma individual que es
como generalmente se presentan o en mezclas muy variadas (Montes, 2009). Algunos
metabolitos secundarios han sido extraídos de plantas y evaluados para el manejo de
40
enfermedades ocasionadas por el género Fusarium encontrando resultados
interesantes. Por ejemplo para el control de marchitez en pepino flavonoides producidos
por Sophora flavescens inhibe la acción del patógeno en un 90%; en tomate metabolitos
como flavonoides, taninos, saponinas, fenoles, azúcares, reductores y triterpenos
producidos por Acacia farnesiana han demostrado un efecto biocida mayor del 95%;
(Rodriguez, Ramírez, Bautista, Cruz & Rivero, 2012; Zhou, Yao, Zhang & Ye, 2009).
El control biológico también es considerado una alternativa eficiente en un manejo
integrado de la marchitez vascular causada por F. oxysporum f.sp. lycopersici.
Microorganismos como Trichoderma harzianum, T. viride, Penicillium fumiculosum,
Aspergillus ocharaceus, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, P. putida, entre
otros son ampliamente utilizados en diferentes momentos del cultivo de tomate para
reducir las pérdidas económicas a causa del patógeno (Jaramillo et al., 2013).
Aunque existen múltiples alternativas para el manejo de la marchitez vascular del tomate,
en Colombia y el mundo las pérdidas económicas aún son severas. El uso intensivo de
agroquímicos se incrementa aún con resultados poco favorables por resistencia
adquirida por los patógenos a estas moléculas. El control biológico aunque toma fuerza
y se fomenta su aplicación no es suficiente para reducir completamente las pérdidas en
el cultivo. Por otro lado, las prácticas culturales siendo sencillas de aplicar, no son
ampliamente realizadas y cuando las condiciones ambientales son favorables para el
patógeno estas prácticas resultan poco efectivas. Así, se comprende la dificultad de
manejo de la marchitez vascular en tomate causada por F. oxysporum f.sp. lycopersici y
la necesidad de investigar en otras prácticas que en conjunto disminuyan las pérdidas
ocasionadas en esta hortaliza (Jaramillo et al., 2013).
4.3 CONTROL BIOLÓGICO DE FITOPATÓGENOS
En el desarrollo de la producción de alimentos libres de residuos de agroquímicos se ha
incrementado la búsqueda de alternativas para el manejo de plagas y enfermedades. El
uso de microorganismos o sus metabolitos para el control de patógenos en la agricultura
41
ha sido ampliamente estudiado y desarrollado para reducir los efectos en las plantas. De
esta manera, el potencial del medio natural aplicado a la agricultura tiene un impacto
positivo y será en el futuro generalizado para la producción de cultivos (Serrano &
Galindo, 2007).
El control biológico de fitopatógenos depende no sólo del microorganismo, sino de las
condiciones ambientales en las cuales este estará expuesto, es decir, la humedad
relativa, temperatura, acidez, exposición a luz ultravioleta son determinantes para la
acción efectiva del mismo. Además, la aplicación y manejo de microorganismos para el
control biológico es diferente respecto a los agroquímicos, lo que conduce a un mayor
tiempo de respuesta y consecuentemente representa problemas para la comercialización
y uso masivo. Por esta razón el desarrollo de productos para el control biológico abarca
a un grupo de trabajo multidisciplinario y una serie de rigurosas evaluaciones para su
efectividad exitosa (Serrano & Galindo, 2007).
Los microorganismos más utilizados para el control biológico de enfermedades
pertenecen a los géneros Streptomyces, Coniothyrium, Candida, Gliocladium,
Pseudomonas, Bacillus, Agrobacterium y especialmente el género Trichoderma. Este
último es considerado como uno de los antagonistas más efectivos para el control
biológico de un amplio espectro de fitopatógenos por la producción de enzimas líticas
que degradan las paredes celulares provocando la muerte del patógeno. Además,
Trichoderma cuenta con diferentes mecanismos de acción que pueden actuar de manera
conjunta y lo convierten en un excelente antagonista. De esta manera, diferentes
especies del gènero Trichoderma han sido reportadas en el control de patógenos en
varios cultivos, particularmente la especie T. harzianum en el cultivo de tomate
controlando F. oxysporum f.sp. lycopersici. Esto permite comprender el potencial de esta
especie para el manejo de fitopatógenos y la necesidad de investigar en esta área con
el fin de eliminar la producción de cultivos bajo el sistema tradicional de uso intensivo de
agroquímicos (Serrano & Galindo, 2007).
42
4.3.1 Taxonomía, morfología y biología de Trichoderma. El género Trichoderma (Figura
4) se ubica dentro del Reino Mycetae (fungi), en la División Eumycota, subdivisión
Ascomycotina, en la clase Euascomycetes, Orden Hypocreales, en la Familia
Hypocreaceae con dos géneros: Trichoderma e Hypocrea (Kuhls et al., 1997; Lieckfeldt,
Samuels, Nirenberg & Petrini, 1999; Samuels & Chaverri, 2003; Samuels, 2005; Jaklitsch
et al., 2006). Este género comprende los hongos filamentosos más utilizados en el control
biológico para la agricultura y su clasificación está determinada por diferentes autores
(Argumedo, Alarcón, Ferrera & Peña, 2009).
El hongo Trichoderma se puede reconocer en aislamientos de forma rápida debido a que
presenta un crecimiento rápido y una coloración característica blanco-verde, amarillo-
verdosas. Microscópicamente Trichoderma tiene unas características especiales: los
conidióforos son erectos, hialinos y generalmente ramificados, no verticilados y pueden
estar agrupados o solitarios. Las fiálides que desarrolla el hongo en forma de botella
pueden estar en grupo o unidas, hiálinas y dispuestas en ángulo recto respecto al
conidióforo, la célula conidiógena se hinchan en el centro y delgadas en el ápice. Las
conidias son de 3 a 5 µm de diámetro de forma ovalada, generalmente verdes,
unicelulares globosas o subglobosas. Además cultivos sumergidos varias especies del
hongo desarrollan clamidosporas que son unicelulares pero se pueden unir varias, las
cuales ayudan al hongo como medio de sobrevivencia cuando se presentan condiciones
ecosistémicas adversas (Howell, 2003; Barnett & Hunter, 1972; Garisto & Harman, 2001).
43
Figura 4. Trichoderma asperellum. a. colonia en el medio de cultivo PDA, después de 14
días a 25 ºC, b. conidióforo, c. fiálides, d. conidios, e. clamidospora.
Fuente: Lieckfeldt et al. (1999)
Trichoderma fue descrito por el padre de la micología sistemática C. H. Persoon en el
año 1794 y Rifai realizó el agrupamiento en especies agregadas aunque ese método
presenta dificultades para la identificación debido a la cercanía morfológica y evolución
de las especies (Martínez, Infante & Reyes, 2013). Después de ser introducido el género
por Persoon, Rifai propuso nueve especies agregadas: Trichoderma piluliferum Webster
& Rifai, Trichoderma polysporum (Link ex Pers) Rifai, Trichoderma hamatum (Bon) Bain,
Trichoderma koningii Rifai, Trichoderma aureoviride Rifai, Trichoderma harzianum Rifai,
Trichoderma longibrachiatum Rifai, Trichoderma pseudokoningii Rifai y Trichoderma
viride Pers ex S. F Gray, las cuales se identificaron de acuerdo a diferencias
morfológicas, como forma del conidio, crecimiento y coloración de la colonia, ramificación
del conidióforo entre otras (Rifai, 1969).
En la actualidad, la clasificación taxonómica se apoya en herramientas moleculares como
la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) específica de las regiones ITS1 e ITS2
A B
C D
E
44
y del factor de elongación y la secuenciación de estas para compararlos con las
secuencias que se encuentran en GenBank TrichoBlast, dejando así de lado la
clasificación mediante caracteres morfológicos (Martínez et al., 2013).
Con el desarrollo de las técnicas moleculares se han confirmado y determinado especies
por la variación intraespecífica. Estudios en Trichoderma viride, una de las especies que
inicialmente se caracterizó por la rugosidad de la pared del conidio encontraron dos tipos
diferentes morfológicamente (I y II) debido a que cada uno tiene un diseño de ADN
mitocondrial diferente. Después estudios fisiológicos, morfológicos y especialmente
moleculares descubrieron que el tipo I es verdadero T. viride, anamorfo de Hypocrea rufa
(Pers.: Fr) y se descubrió una especie denominada Trichoderma asperellum Samuels
que molecularmente es cercana al neotipo de T. hamatum (Martínez et al., 2013).
Es uno de los hongos antagonistas más estudiados y aplicados para el control biológico
de fitopatógenos en diferentes cultivos en el mundo debido a características especiales
como la versatilidad metabólica, adaptabilidad, fácil manipulación, múltiples mecanismos
de acción, capacidad para degradar sustratos y resistencia a inhibidores microbianos
(Guédez, Castillo, Cañizales & Olivar, 2008; Bernal, Andréu, Moya & González, 2000).
Además, Trichoderma está presente dominando los suelos por su agresividad y una
capacidad metabólica que le permite competir con otros microorganismos o parasitarlos
en forma de hiperparasitismo o micoparasitismo además de que sus características le
permiten sobrevivir en varios agroecosistemas como un antagonista de fitopatógenos
(Rosero, 2008; Elosegui, 2006; Riegel & Nielsen, 1996).
La aplicación del hongo Trichoderma para el manejo de patógenos de suelo
principalmente ha sido ampliamente estudiada en diferentes especies cultivadas como
en tomate, arveja, pasifloras, especialmente en aquellas donde el control químico es
ineficiente (González, Maruri & González, 2005). Esto se ha logrado considerando las
características de adaptabilidad del hongo como la capacidad de resistir altas
temperaturas, por ejemplo cepas aisladas de Alaska creciendo a 4°C toleran cerca de
33°C (McBeath & Adelman, 1991).
45
Es claro que el uso de especies del género Trichoderma es una alternativa para el
manejo de enfermedades en los cultivos, aunque se debe comprender que es un proceso
efectivo a largo plazo. Esto se debe a que el microorganismo debe superar una etapa de
adaptación en el agroecosistema, es decir, a las condiciones edáficas, climáticas,
ambientales para colonizar y poder desarrollar sus mecanismos de acción (Bale, Van
Lenteren & Bigler, 2008).
4.3.2 Mecanismos de acción. El género Trichoderma ha desarrollado múltiples
mecanismos de acción, considerando esencial el conocimiento de estos, aunado a la
interacción con la planta hospedera, el ambiente y el conocimiento del patógeno (Fravel,
2005). Dentro de los mecanismos de acción descritos para el género Trichoderma se
encuentran: competencia, micoparasitismo, producción de compuestos volátiles y no
volátiles, desactivación de factores de patogenicidad e inducción de resistencia sistémica
en plantas.
La competencia es determinada por la condición de escasez de espacio, nutrientes u
otro requerimiento, definida como el comportamiento desigual de dos o más organismos
frente un mismo requerimiento, cuando la utilización por uno de ellos reduce la cantidad
del otro organismo (Martínez et al., 2013). El hongo compite principalmente por nutrientes
como carbono, nitrato y hierro, competencia que se ve favorecida por la velocidad de
crecimiento, secreción de metabolitos y se evidencia por la presencia del antagonista en
suelos de todo el mundo (Hjeljord & Tronsmo, 1998; Infante, Martínez, González &
Reyes, 2009; Sivan & Chet, 1989). Claramente debido a la condición de la competencia,
en suelos ricos en materia orgánica o con fertilización balanceada de acuerdo a la
especie cultivada, este mecanismo de acción de Trichoderma tiene menor valor para el
control de fitopatógenos (Martínez et al., 2013).
El micoparasitismo, otro mecanismo de acción de Trichoderma se desarrolla en cuatro
etapas como un proceso complejo de interacción entre el antagonista y el patógeno.
Inicialmente se presenta un crecimiento quimiotrófico donde el hongo detecta a
distancias el fitopatógeno hospedante potencial; luego en el reconocimiento hay una alta
especificidad del antagonista por su sustrato; posteriormente se da la adhesión y
46
enrollamiento que se presenta por la asociación de un azúcar del antagonista con una
lectina ubicada en la pared del patógeno; finalmente la actividad lítica produce enzimas
líticas extracelulares como proteasas, glucanasas, quitinasas y degradan la pared celular
del patógeno para facilidad en la penetración del antagonista (Howell, 2003; Woo, Scala,
Ruocco & Lorito, 2006; Chet & Benhamou, 1998; Küçük & Kivanç, 2004; Harman, 2000;
Vinale et al., 2008; Hoyos, Chaparro, Abramsky, Chet & Orduz, 2008).
La producción de compuestos volátiles y no volátiles que producen diferentes cepas de
Trichoderma, diversos respecto a estructura y función conocidos como metabolitos
secundarios con actividad antifúngica, son capaces de inhibir otros microorganismos sin
tener contacto con ellos se consideran antibióticos. Se han identificado compuestos del
tipo de las alquilpironas (6apentilpirona), isonitrilos (isonitrina), poliquétidos
(harzianolida), peptabioles trichodermina, atroviridina, alameticina, suzucacilina y
trichozianina), dicetopiperacinas (gliovirina y gliotoxina), sesquiterpenos (ácido
heptelídico) y esteroides (viridina). Los antibióticos actúan como degradadores de hifas
e inhibiendo la germinación de las esporas y debido a que una cepa puede producir
múltiples compuestos no se corre el riesgo de que los patógenos desarrollen resistencia,
aspecto determinante en la actividad antagónica de Trichoderma (Hjeljord & Tronsmo,
1998; Dennis & Webster, 1971; Howell, 2003; Sivasithamparam & Ghisalberti, 1998;
Cook & Baker, 1989; Lorito, Peterbauer, Hayes & Harman, 1994; Martínez, 2013).
La desactivación de factores de patogenicidad es hasta ahora un mecanismo de acción
de Trichoderma poco estudiado. De esta manera, se encontró que T. harzianum (T39)
secreta una proteasa para degradar enzimas que utiliza Botrytis cinerea para atacar la
pared celular de las plantas y que T. viride produce a-glucosidasa para degradar una
fitotoxina de Rhizoctonia solani (Harman, 2000; Howell, 2003). Además, se ha
identificado claramente la capacidad del hongo como estimulador del crecimiento y
desarrollo vegetal. Se ha observado incremento en peso de cerca del 60% en plantas de
fríjol (Phaseolus vulgaris), estimulación en germinación y altura con aislamientos de
Trichoderma (Harman, 2000).
47
Además de los mecanismos anteriores, se ha estudiado y demostrado la acción de
Trichoderma como inductor de resistencia sistémica en plantas (IRS). Investigadores han
determinado que el hongo tiene la capacidad de activar un mecanismo nativo de las
plantas conocido como IRS que permite controlar patógenos distantes al lugar donde se
encuentra el antagonista. Estudios en pepino demostraron que T. asperellum indujo
resistencia a Pseudomonas syringae pv. lachrymans (E. F. Smith & Bryan) Young, Dye
& Wilkie en el follaje (Shoresh et al., 2010). Los compuestos liberados por Trichoderma
relacionados con IRS corresponden a proteínas con actividad enzimática, oligosacáridos
y compuestos de bajo peso molecular que generan defensa como genes de avirulencia
(Woo & Lorito, 2007).
Jaimes, Moreno & Cotes, (2009) demostraron la acción de Trichoderma koningiopsis
Th003 en la inducción de resistencia sistémica para el control de Fusarium oxysporum
agente causal de la marchitez vascular en tomate (Solanum lycopersicum Mill).
Determinaron que cuando se inoculó el antagonista antes de inocular el patógeno se
presentó un retraso en la colonización del fitopatógeno en el sistema radicular, a
diferencia de las plantas que no se inocularon con Trichoderma.
Recientemente se han descubierto mecanismos de acción del género como: aceleración
del desarrollo radicular para efecto de resistencia a estrés, solubilización y absorción de
nutrientes inorgánicos, estimulación del crecimiento vegetal e inducción de resistencia
(Harman, 2006; Vinale et al., 2008).
4.3.3 Trichoderma viride, uso en la agricultura actual. La aplicación de la especie T.
viride para el control de fitopatógenos en la agricultura ha sido ampliamente estudiada
en los últimos años debido a la capacidad antagónica y efecto estimulante que tiene
sobre las plantas (Martínez, 2013). Se ha demostrado que tratamientos a los frutos con
T. viride reduce significativamente el moho verde de los cítricos causado por Penicillium
digitatum y con el mismo hongo en aplicaciones pulverizadas antes y después de la
cosecha de fresa, redujo la pudrición de esta hortaliza (Agrios, 2005).
48
En el cultivo de tomate (Solanum lycopersicum L.) se ha demostrado que T. viride tiene
alta capacidad de controlar el patógeno Rhizoctonia solani Khun. en condiciones de
campo e invernadero (Lewis et al., 1990). Además, se ha demostrado que T. viride tiene
la capacidad de producir α–glucosidasa, enzima que degrada una fitotoxina de R. solani,
agente causal del añublo de la vaina del arroz (Howell, 2003).
El uso de T. viride en la agricultura también se ha desarrollado para potenciar el
crecimiento y desarrollo de las especies cultivadas, generando información valiosa para
incrementar los rendimientos en los cultivos. Estudios realizados por Malusa, Sas-paszt,
Popinska & Zurawicz, (2007) demostraron el efecto positivo del antagonista en asocio
con diferentes especies de micorrizas y bacterias en el crecimiento radicular de plantas
de fresas, efecto asociado a la actividad de los microorganismos en la rizósfera y la
respuesta genotípica de los cultivares. Además, se ha encontrado que T. viride
incrementa el desarrollo radicular en plantas de maíz y pastos lo que genera resistencia
a estrés hídrico y también se ha obtenido resultados positivos en el incremento de
crecimiento y floración en plantas de arroz con el antagonista (Mathivanan, Prabavathy
& Vijayanandraj, 2006; Páez, Bernaza & Acosta, 2006).
En el cultivo de café (Coffea arabica L.) en Colombia se ha reportado la acción
antagónica de T. viride sobre la eclosión de huevos, movilidad de larvas y población de
nematodos reduciendo significativamente en concentraciones mayores a 108
conidias/gramo. Además, se reportó un incremento de la eficacia del antagonista a
medida que se establecía en el agroecosistema. También en plantas de soya (Glicine
max L.) se reportó el efecto antagónico y bioestimulante de T. viride contra Fusarium
oxysporum y Pythium arrhenomanes incrementando el peso seco del tallo, raíz, frutos y
una mayor producción, atribuyendo este efecto a metabolitos secundarios como las
auxinas (Castro & Rivillas, 2012).
Además de los efectos antagónicos y bioestimulantes que puede generar la especie T.
viride, también se ha demostrado una estrecha relación con la con contaminantes
orgánicos e inorgánicos. Se ha estudiado la capacidad de este hongo para la
49
degradación del herbicida triflurina en más del 90% con una concentración inicial de 1
mg L-1 en 10 días (Zayed et al., 1983). Por otra parte, se ha demostrado que T. viride
puede transformar al trinitrotolueno (TNT) en un 16% en compuestos solubles como: 2,2’,
6,6’-tetranitro-4,4’-azoxitolueno, 4-amino-2,6-dinitrotolueno y 2-hidroxilamino-4,6-
dinitrotolueno (Bayman & Radka, 1997).
4.4 INDUCCIÓN DE RESISTENCIA
Las plantas responden ante el ataque de patógenos a través de mecanismos físicos y
bioquímicos evitando la colonización de estos. Las plantas presentan dos tipos de
mecanismos de defensa: constitutivas o preformadas e inducibles (Durrant & Dong,
2004). La defensa constitutiva corresponde a mecanismos desarrollados por la planta
antes de la presencia del patógeno tales como lignificación, suberización, formación de
callosa entre otras que incluyan barreras físicas. Además, de otras formas como la
formación de pequeñas capas de cera en la cutícula foliar para evitar la germinación de
esporas a causa del desarrollo de una película de agua en la superficie de las hojas
(Montes, 2009; Agrios, 2005). Aunado a lo anterior, las plantas producen sustancias
químicas con acción tóxica o inhibidora como fenoles, lignina, taninos, saponinas,
antocianinas, flavonoides, glucocianato, lectinas, quitinasas, entre otros que surgen
previamente al reconocimiento del patógeno (Kliebeinstein, 2004).
La inducción de resistencia en plantas puede ser de dos tipos, resistencia adquirida
sistémica (RSA) y resistencia inducida sistémica (RIS). La RSA es una respuesta no
específica que se desarrolla local o sistémicamente y está determinada por el ataque de
un patógeno o por el efecto de un agente inductor. Además, la RSA involucra la
activación de un sistema de señales a través de los tejidos y reacciones bioquímicas que
tienden a aislar al patógeno, lo que genera inicialmente una reacción de hipersensibilidad
(RH) (Walters et al., 2005; Agrios, 2005; Rodriguez et al., 2006). Por otro lado, la RIS se
desarrolla como resultado de la colonización de las rizobacterias promotoras de
crecimiento de las plantas RPCP en las raíces de las plantas. Este tipo de resistencia
utiliza las vías reguladas por el ácido jasmónico y el etileno y además no involucra
50
acumulación de proteínas relacionadas con la patogénesis, ni está asociada a la reacción
de hipersensiblidad (Vallad & Goodman, 2004; Pieterse et al., 1998).
La defensa inducida se presenta sólo durante el ataque del patógeno como respuesta a
la infección, a través de señales que surgen por efecto del medio o del propio patógeno
(Durrant & Dong, 2004). En primer lugar a través de elicitores las plantas responden con
una reacción de hipersensiblidad (HR) aislando el inóculo inicial ocasionando una muerte
celular localizada, que se genera como consecuencia de un estrés oxidativo causado por
el aumento en las especies reactivas de oxígeno (ROS por sus siglas en inglés) como el
peróxido de hidrógeno (H2O2) y al radical súper óxido (O2-) (Laloi, Apel & Danon, 2004).
La respuesta sistémica de defensa constituye también una forma de defesa de las
plantas ante el ataque de patógenos que corresponde a una diseminación de resistencia
a través de los tejidos de la planta. El concepto de Resistencia Sistémica Adquirida (SAR)
se apropió al determinar la resistencia secundaria en tejidos de plantas de tabaco
infectadas con TMV (Tobacco Mosaic Virus) en hojas distales al lugar de infección
patógeno (Durrant & Dong, 2004; Salgado, 2012).
La defensa inducida en plantas puede ser activada por medio del uso de inductores como
el ácido salicílico, fosfito de potasio, Acibenzolar-S-metil, Propiconazol, silicio, entre
otros. Los efectos de este último se han demostrado en diferentes especies de plantas
actuando como un inductor de resistencia a través de su deposición generando una
barrera mecánica e incrementando la producción de enzimas de defensa (Mogollón &
Castaño, 2012; Castellanos et al., 2015).
51
4.4.1 Generalidades e importancia del silicio. El silicio (Si) después del oxígeno es el
segundo elemento más abundante en la corteza terrestre (Tabla 3) ya que constituye
cerca del 28% de ésta (Brandstadt, 2005; Grachev, Annenkov, & Likhoshway, 2008;
Jaroniec, 2006). Este elemento se puede encontrar sólo en formas combinadas, es decir,
como sílice y minerales silicatados. Además, en el suelo el Si se encuentra como ácido
monosilicico (Si (OH)4) que la mayor parte corresponde a formas no disociadas, forma
en la que las plantas pueden asimilarlo. Sin embargo, debido a procesos de
intemperización y lixiviación en suelos tropicales, se produce silicatización y genera Si
en formas no disponibles para las plantas como cuarzo, ópalo (SiO2 nH2O) (Brandstadt,
2005).
El Si pertenece a la familia de los carbonoideos, al grupo 14 (IV-A) de la tabla periódica
de los elementos. En las plantas superiores, este elemento está presente en cantidades
equivalentes a los macronutrientes como Ca, Mg y P. Aunque el Si se acumula en
especies como el arroz más que otro nutriente inorgánico, éste no es considerado un
elemento esencial para las plantas debido a que no encaja con los criterios directos e
indirectos de la esencialidad (Malavolta, 2006).
La absorción del Si en las plantas se da por difusión pasiva, es decir, que llega al xilema
y acompañando al flujo de transpiración alcanza la parte aérea. Sin embargo, en algunas
especies de plantas de la familia Poaceae, Equisetaceae y Cyperaceae la absorción del
elemento se realiza de forma activa a través de proteínas específicas de membranas lo,
que asegura la acumulación del Si sin depender de la concentración de este (Currie &
Perry, 2007; De Oliveira, Korndörfer, & Pereira, 2007).
El Si se deposita en la mayoría de las plantas de forma intra o extracelular en los tejidos
en la forma de sílice amorfa hidratada (SiO2 nH2O), especialmente en gramíneas se
deposita en células epidérmicas, estomas y tricomas foliares en la forma de cuerpos
silicosos (Currie & Perry, 2007). Esa acumulación en muchas especies proporciona una
condición de resistencia a estrés abiótico, debido a que se deposita el Si debajo de la
cutícula creando una capa y evita pérdidas considerables de agua por transpiración.
52
Además esta capa de cutícula limita la penetración de los patógenos e insectos plaga
masticadores (Epstein, 1999; Savant, Korndörfer, Datnoff, & Snyder, 1999).
Tabla 3: Abundancia de silicio y otros elementos en algunos reservorios de la corteza
terrestre
Elemento
Litósfera (%)
Biota (%)
Cultivos (%)
Si 27,7 0,03 0,1 - 10
O 47,4 24,9 45 - 47
H 1,5 49,8 -
C 0,48 24,9 48 - 50
N 0,03 0,27 0,5 - 6
Ca 4,1 0,07 0,1 - 6
K 2,1 0,05 0,8 - 8
Mg 2,3 0,03 0,05 - 1
P 1 0,03 0,15 - 0,5
S 0,26 0,17 0,1- 1,5
Al 8,2 0,02 0,00001 -
0,05
Fuente: Raya & Aguirre (2012)
En relación al peso seco de las plantas el Si constituye entre el 0,1 – 10% del peso seco,
valores altos comparados con otros elementos como el Ca que constituye entre el 0,1 –
0,6 % o el S que constituye entre 0,1 – 1,5% del peso seco. El Si es acumulado con
mayor eficiencia de acuerdo a la especie vegetal, es decir, las monocotiledóneas
acumulan en mayor proporción en comparación que las dicotiledóneas. Así, de forma
general, se ha definido que la concentración de Si está determinada e influenciada por
la ubicación filogenética de las plantas a nivel de género y especie. Por otra parte, se
descarta la influencia que tienen las condiciones ambientales como temperatura,
53
disponibilidad de recurso hídrico y del mismo elemento (Malavolta, 2006; Epstein, 1999;
Castellanos et al., 2015).
El silicio evidentemente es uno de los elementos más abundantes en la litósfera y en los
tejidos vegetales, partiendo que el dióxido de silicio comprende entre el 50 – 70% de la
masa del suelo, lo que deduce que las plantas contienen el elemento. Sin embargo,
técnicas desarrolladas en los años 80 determinaron que no era necesario incluir el Si
dentro de los planes nutricionales, debido a que no tenía efecto en el crecimiento y
desarrollo vegetal. Así, el Si no se considera un elemento esencial para las plantas por
no adoptar las condiciones o criterios establecidos por Arnon & Stout (1939).
Estudios recientes desarrollados por Epstein & Bloom (2003) propusieron una definición
de esencialidad en la cual un elemento se considera esencial si cumple con uno o los
dos criterios. El primero es que el elemento sea parte de una molécula que es
componente intrínseco de la estructura o metabolismo de la planta. El segundo es que
la planta puede ser tan severamente deficiente en el elemento que presenta
anormalidades en el crecimiento, desarrollo o reproducción, es decir, “rendimiento”, en
comparación con las plantas con deficiencias más leve. De esta manera y con esta nueva
definición de esencialidad se ha determinado que el Si corresponde a un elemento
“cuasi-esencial” para las plantas debido a que la deficiencia de este ocasiona
irregularidades en el desarrollo de diferentes especies de plantas (Ma & Yamaji, 2008;
Ma & Yamaji, 2006).
54
4.4.2 El silicio como inductor de resistencia. La adecuada nutrición mineral como
herramienta en la resistencia de las plantas a patógenos y plagas ha sido ampliamente
estudiada. Con la nutrición se puede incrementar la resistencia a través de la fortificación
de estructuras anatómicas como cutículas más gruesas, células epidérmicas más
rígidas, lignificación de tejidos, entre otros. Además, la nutrición puede inducir defensa
sistémica a través de la producción de compuestos fenólicos que ayudan a combatir a
patógenos y plagas. El silicio, es un elemento que favorece la resistencia de las plantas
a plagas y enfermedades a través de los mecanismos mencionados (Marschner &
Rimmington, 1988).
En el mundo se han desarrollado múltiples estudios para demostrar el efecto del silicio
en las plantas. Por ejemplo, se ha determinado que en plantas de Arabidopsis fertilizadas
con silicio e inoculadas con patógenos se retrasaba y reducía la enfermedad. De esta
manera se demostró el efecto inductor y la formación de barreras físicas para evitar la
capacidad de penetración de los patógenos. Además se evidencia que en ausencia del
elemento se desarrollan plantas débiles, susceptibles a diferentes tipos de estrés y
toxicidad por metales pesados (Raya & Aguirre, 2012).
El Si tiene una función especial en las plantas: proteger ante estrés biótico o abiótico, por
lo cual se ha determinado que el efecto del Si es evidente en condiciones de estrés, no
bajo condiciones no estresadas. Por lo tanto, ha sido ampliamente demostrado el efecto
del Si para aumentar la resistencia de las plantas a enfermedades causadas por hongos
y bacterias, además de suprimir el daño de insectos plagas como barrenadores,
saltamontes, ácaros, entre otros (Savant, Snyder & Datnoff, 1997).
Después del desarrollo de múltiples investigaciones se ha propuesto dos mecanismos
de acción que produce el Si para la resistencia a enfermedades. La primera explica que
el Si se comporta como una barrera física depositándose debajo de la cutícula creando
una doble capa que impide de forma mecánica la penetración de los hongos obstruyendo
la posibilidad del inicio de la infección. Además, la acumulación de Si en la célula vegetal
contribuye en propiedades mecánicas de la raíz como rigidez y elasticidad. El elemento
55
se deposita principalmente en el retículo endoplasmático, espacios intercelulares, pared
celular y de forma intracelular en células silíceas (células epidérmicas especializadas
(Liang, Sun, Zhu & Christie, 2006; Taiz & Zeiger, 2005; Ma & Yamaji, 2008).
El segundo mecanismo es que el Si actúa como inductor de resistencia sistémica en las
plantas a través de la producción de compuestos fenólicos, fitoalexinas y la activación de
genes relacionados con la patogénesis (Rodrigues, Jurick, Datnoff, Jones & Rollins,
2005; Rodrigues et al., 2004). Además, se ha demostrado que el Si potencia la actividad
de enzimas como quitinasas, peroxidasas, polifenoloxidasas en la resistencia de plantas
de pepino afectadas por Pythium. Esto ha evidenciado que el Si interacciona activamente
con componentes relacionados con los sistemas de señalización de estrés de las plantas,
además de incrementar la síntesis de compuestos de defensa (Fauteux, Remus-Borel,
Menzies, & Belanger, 2005).
4.4.3 El silicio como inductor de resistencia para el manejo de enfermedades. Dentro de
los compuestos antimicrobianos producidos como resultado de la inducción por el Si
están las fitoalexinas que se acumulan en diferentes especies vegetales para limitar la
dispersión de los patógenos. La producción de este compuesto está determinada por la
información genética que codifica la expresión de su formación y no por la presencia o
ausencia de información involucrada con su biosíntesis (Kuc & Rush, 1985).
La relación existente entre la acumulación de fitoalexinas y la resistencia hipersensible
es clara, de manera que la mayoría de estos compuestos están ausentes en plantas
sanas. Por lo tanto, se ha evidenciado experimentalmente en trabajos realizados con
hongos y bacterias que la velocidad, magnitud y sitio de acumulación de las fitoalexinas
determina la resistencia a la enfermedad después que se presenta el proceso de
penetración del microorganismo (Bailey & Mansfield, 1982; Bell, 1981; Bailey, 1974;
Hahn, Bonhoff & Grisebach, 1985; Rosall, Mansfield & Hutson, 1980; Sato, Kitazawa &
Tomiyama, 1971; Yoshikawa, Yamauchi & Masago, 1978; Lyon & Wood, 1975; Webster
& Sequeira, 1977).
56
La resistencia sistémica adquirida (SAR) además de la producción de fitoalexinas,
conduce a la producción de peroxidasa y lipoxigenasa que consecuentemente producen
derivados de ácidos grasos que emiten diferentes compuestos con actividad
antimicrobiana capaces de defender la planta al ataque de microorganismos, teniendo
en cuenta que la resistencia se produce después de la expresión de hipersensibilidad
(Figura 5). Así, la SAR actúa inespecíficamente en toda la planta independientemente de
la especie o grupo, pero los estudios más fuertes en la materia se han desarrollado en
especies de la familia cucurbitaceae (Agrios, 2005). En los estudios que han demostrado
el efecto del Si, las células epidérmicas de las plantas tratadas con el elemento crean
una respuesta de defensa después de la inoculación del patógeno, además de la
formación de callosa y liberación de fenólicos que afectan la vida del patógeno. En la
(Figura 6) se puede observar el efecto del silicio en el control de la mancha parda en el
arroz comparado con la aplicación de un fungicida atribuido a los mecanismos
anteriormente descritos (Agrios, 2005)
Figura 5. Principio de resistencia sistémica activada o adquirida
Fuente: Agrios (2005).
57
Figura 6. Comparación de la reducción de la mancha parda por la aplicación de silicio y
fungicida en plantas de arroz. Si: plantas no tratadas con silicio, P: plantas tratadas con
fungicida, P+Si plantas tratadas con silicio y fungicida, Control tratamiento control y Si
plantas tratadas con silicio.
Fuente: Agrios (2005)
4.4.4 Aplicaciones del silicio en la agricultura. Durante muchos años se ha estudiado los
beneficios que tiene el silicio en la producción agrícola, especialmente en la supresión
de patógenos habitantes naturales del suelo y otros agentes causales de diferentes
enfermedades en las plantas. En un estudio realizado en cultivares de banano Grand
Nain y Maçã resistente y susceptible a Fusarium oxysporum f.sp. cubense
respectivamente se demostró el comportamiento fisiológico y bioquímico que potencia el
Si bajo condiciones de invernadero. Esta investigación determinó una disminución en el
cultivar Gran Nain del 40,0% y en Maçã del 57,2% en la longitud relativa de la lesión
causada por el patógeno en el tratamiento con Silicio. Además, se evidenció claramente
la disminución de la enfermedad debido principalmente al incremento en las
concentraciones de peróxido de hidrógeno, fenoles solubles totales y a una actividad
enzimática de fenilalanina amoniolasas, peroxidasas, polifenoloxidasas, quitanasas y
glucanasas (Fortunato, Rodrigues & Teles, 2012).
58
En el control de insectos plaga en caña de azúcar (Saccharum officinarum L.) también
se ha propendido el uso del Si como inductor de resistencia. Se encontró en un estudio
desarrollado en dos cultivares RB72454 (moderada resistencia) y SP801842
(susceptible) infestados con Diatraea saccharalis tratadas y no tratadas con Si una
acumulación del elemento sin diferencia significativa entre los cultivares evaluados.
Además, no hubo diferencia significativa en el número de orificios entre el cultivar
susceptible y resistente. Sin embargo, el mayor número de agujeros se encontró en el
cultivar SP801842 susceptible no tratado y el menor en el cultivar RB72454 resistente
tratado con silicio (Vilela, Morales, Alves, Santos & Santos, 2014).
En relación con la resistencia a enfermedades bajo el concepto de trofobiosis se han
realizado diferentes estudios para evaluar el efecto del Si en asocio con otros elementos.
En un estudio se evaluó el efecto del Ca y el Si en la incidencia de Bremia lactucae
(Regel) agente causal del mildiu en la Lechuga (Lactuca sativa L.) demostrando una
menor absorción del Si (35%) en las plantas inoculadas con el patógeno. Además, se
determinó que altas concentraciones del Si genera antagonismos con el Ca y
consecuentemente se disminuye el área foliar y el peso fresco (De Dios, Sandoval,
Rodríguez & Cárdenas, 2005).
Otros estudios han sido fundamentales para demostrar el efecto del silicio en el control
de enfermedades en cultivos de flores en Colombia. Se evaluó en una investigación el
efecto del silicio en la severidad del mildeo causado por el hongo Sphaerotheca pannosa
var. rosae en tres variedades de rosa: Vendela, Reed Unique y Miracle con tres dosis de
silicio: 3 ppm, 6 ppm y 9 ppm de SiO2 en dos tipos de fertirriego: 3 mmdía-1 y 5 mmdía-1
bajo condiciones de invernadero. Se demostró que las aplicaciones de SiO2 en 9 ppm
redujeron en un 20% el porcentaje de severidad del hongo concluyendo que el los
tratamientos en las variedades Miracle y Reed Unique con la lámina de fertirriego 3 mm
día-1 y dosis de 9 ppm de SiO2 puede ser una alternativa para el manejo del mildeo
polvoso en las zonas floricultoras de Colombia (Albornoz, Silva & Torres, 2016).
59
Respecto al uso del silicio para reducir los efectos negativos de metales pesados en
plantas se ha investigado en la reducción de la toxicidad por zinc (Zn) en plántulas del
género Eucalytus urophylla. Se determinó la producción de materia seca y la
modificación en la anatomía radicular de las plántulas cuando se incrementaba la
concentración de Zn en ausencia y presencia del Si. Se evidenció que el Si tiene un
efecto positivo en la anatomía radicular, lo que reduce las alteraciones causadas por el
efecto de Zn (Junio et al., 2009).
En combinación con miel de abeja también se evaluó el efecto del Si en fertilización foliar
para manejar la marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum (SHELD) en
tomate de cáscara. Se trabajaron dos fertilizantes (NV3 y NV5), miel de abeja al 2% y el
Si soluble (0.1 y 0,2%). Se demostró que la severidad de la enfermedad se redujo en un
80% en las plantas que se aplicó el tratamiento con Si y miel de abeja al follaje. Además,
se confirmó mediante análisis microscópico de las hojas por la presencia de cristales de
silicio acumulados en las paredes del xilema en aquellas plantas que recibieron nutrición
foliar. También se registró un incremento de producción en un 98% respecto a lo que se
obtiene con el manejo tradicional del cultivo (Gómez, Rodríguez, Cárdenas, Sandoval &
Colinas, 2006).
En condiciones de invernadero se ha evaluado los efectos que tiene la fertilización foliar
sobre el crecimiento y la acumulación de masa seca en plantas de papaya (Carica
papaya L.) genotipo Tainung-1 bajo 5 concentraciones de silicio (tratamientos): 0, 1, 2, 3
y 4 mlLt-1. Se demostró que aplicaciones foliares a los 45, 60 y 75 días después de la
siembra promovió un crecimiento y acumulación de materia seca en la zona radicular de
la planta y especialmente hubo un incremento en la altura del 16,8% en plantas tratadas
respecto al tratamiento control (Vanies et al., 2015).
60
5. METODOLOGÍA
5.1 MANEJO GENERAL DE LOS ENSAYOS
5.1.1 Ubicación Geográfica. El experimento se desarrolló en la sede central de la
Universidad del Tolima en la casa de mallas adscrita al programa de Ingeniería
Agronómica localizada en Ibagué Tolima, Colombia. La ciudad de Ibagué se encuentra
ubicada en el flanco oriental de la Cordillera Central (4°26’16”N 75°12’02”O) a 1.285
msnm. De acuerdo a la clasificación de Holdrideg el municipio tiene diferentes zonas de
vida: bosque seco tropical, bosque húmedo premontano, bosque muy húmedo
premontano, bosque muy húmedo montano bajo, bosque muy húmedo montano, bosque
húmedo montano bajo, bosque pluvial montano y zona de vida de páramo pluvial
subandino (andino y nival) y en la clasificación de Köpen en Ecuatorial Af y la
temperatura media anual de la ciudad de Ibagué es de 24,1°C y una humedad relativa
del 74% (Pomar & Vargas, 1985).
5.1.2 Manejo Agronómico. Se utilizó el material Tomate Chonto Santa Clara obtenido
por la Importadora de Semillas S.A.S IS. El material de acuerdo a la etiqueta del
productor tiene las siguientes características: adaptación de 0 a 2.600 msnm, suelo
Franco o Franco arenosos, siembra en invernadero o campo abierto, crecimiento
indeterminado, ciclo de cultivo de 180 días, días de cosecha 80 después del trasplante y
días de trasplante 30, además tiene un 85% de germinación con 99,9% de pureza del
material.
El semillero se realizó en bandejas germinativas de 50 alvéolos con el objetivo de mejorar
la emergencia durante las primeras etapas de desarrollo fenológico hasta el trasplante
(Palacios, 1992; Jaramillo et al., 2006). Para los semilleros se utilizó turba, un sustrato
orgánico que es el resultado de la completa descomposición de árboles del género
Sphagnum. Dentro de las propiedades que ofrece la turba se resalta que genera mejores
condiciones para la germinación y enraizamiento, no aportan nutrientes pero tiene alta
61
capacidad de intercambio de cationes, retención de humedad y alto grado de porosidad
(Jaramillo et al., 2013). Para el ensayo se utilizó la turba Pindstrub Plus Negro, un
sustrato con contenido medio de fertilizante 100% turba oscura.
La siembra se realizó depositando las semillas a una profundidad de 2 - 3 mm y
posteriormente cubriéndola con sustrato. Previamente el sustrato se saturo y después
de sembrada la semilla se realizó un riego suave para evitar déficit de humedad y
favorecer la germinación. Durante la etapa de semillero se realizaban dos riegos en el
día, de acuerdo a las condiciones ambientales y contenido de humedad en el sustrato se
adicionaba o eliminaba un riego en el día. Los semilleros en promedio requirieron de 5 –
6 días para la germinación y emergencia plena.
La nutrición en semillero y el trasplante se realizó de modo general de acuerdo a los
parámetros propuestos por Jaramillo et al. (2013). Se utilizó la siguiente fórmula de
fertirriego en ppm: 40 N, 120 P, 40 K, 20 Ca y 7 de Mg con un uso consuntivo de 1500
cm3/bandeja/día. Las fuentes utilizadas para la fertirrigación en la etapa vegetativa de 0-
30 días fueron: Krista KP, Sulfato de Mg, Ácido fosfórico, Calcinit y Nitrax.
El manejo agronómico de las plantas se realizó de acuerdo a las observaciones
establecidas por Jaramillo et al. (2013). Se realizaron las podas respectivas de formación
y de yemas o chupones. Se utilizó la siguiente fórmula de fertirriego en ppm: 40 N, 80 P,
80 K, 30 Ca y 10 Mg con un uso consuntivo de 1000 cm3/planta/día en la etapa de los 31
a 90 días y 40 N, 60 P, 120 K, 30 Ca y 10 Mg en la etapa de los 90 días en adelante. Las
fuentes de fertilizantes fueron las mismas que se utilizaron en la etapa de semillero.
5.2 OBTENCIÓN DE MATERIAL VEGETAL PARA INÓCULO DE F. oxysporum f.sp.
lycopersici
El material vegetal de tomate con síntomas característicos de la enfermedad (Figura 7A)
se recolectó de la zona de Cajamarca Tolima en la finca El Jardín a una altura de 1.852
msnm y temperatura promedio de 13 °C. El híbrido Aslam, del cual se obtuvo el
62
aislamiento tenía aproximadamente 80 días de trasplantado. La toma de muestras se
realizó el día 16 de junio del año 2017.
Se tomaron en total 10 muestras siguiendo el siguiente procedimiento: primero,
seleccionar la planta con síntomas característicos de la enfermedad, es decir,
marchitamiento general de la planta, pérdida de turgencia y adormecimiento de las hojas.
Luego, desinfectar con alcohol al 70% un palín y proceder a arrancar la planta con todo
el sistema radicular y corroborar la sintomatología en la raíz. Posteriormente, depositar
en papel kraft la raíz con un poco de suelo para evitar la deshidratación del tejido (Figura
7B). Las muestras fueron llevadas al Laboratorio de Fitopatología de la Universidad del
Tolima para el aislamiento posterior del patógeno.
Figura 7: A. Síntomas característicos de marchitez por Fusarium en tomate. B. Raíz de
planta con síntomas de marchitez vascular
Fuente: Autores
A B
63
5.3 AISLAMIENTO, CUANTIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL PATÓGENO
Los trozos de tejido vegetal (raíces) afectados seleccionados de las plantas con síntomas
de marchitamiento fueron examinadas en el estereoscopio y posteriormente procesadas.
En condiciones asépticas, bajo cámara de flujo laminar se realizaron cortes del tejido
afectado, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1,5% durante tres minutos, luego
se sumergieron en agua destilada estéril durante tres minutos para eliminar exceso del
hipoclorito. Después se tomaron los trozos con una pinza estéril se transfirieron a cajas
Petri con PDA (papa dextrosa agar) y se incubaron durante 7 días a una temperatura de
24°C (Figura 8A) de acuerdo a la metodología propuesta por (Quilambaqui, 2005).
Pasados siete días de incubación se obtuvo el aislamiento del hongo, el cuál fue re
aislado para efectos de multiplicación (Figura 8B). Posteriormente para inocular el
patógeno en los ensayos se preparó una suspensión de 106 conidios ml-1 utilizando la
cámara de Neubauer (French & Teddy, 1986).
Figura 8: A. Cámara de incubación a 24°C. B. Segundo aislamiento a partir del cultivo
puro.
Fuente: Autores
A B
64
La identificación del patógeno se realizó mediante la observación al microscopio óptico
(40X) (Figura 9). con tinción de azul de lactofenol, analizando a través de claves
taxonómicas para el género Fusarium las características macroscópicas como tipo de
colonia, morfología y color del micelio, producción de pigmento, tipo de esporas, conidias,
monofiálides. Además, para corroborar que los aislamientos crecidos en caja Petri
correspondían a F. oxysporum f.sp. lycopersici se realizó caracterización molecular en el
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia IBUN concluyendo
que a través de la metodología propuesta por Hirano & Arie (2006) el aislamiento enviado
pertenece a la forma especial lycopersici, raza fisiológica 1. Además, realizaron análisis
adicionales de PCR con los set de primers Uni (UniF/UniR), Sp13 (Sp13F/Sp13R), Sp23
(Sp23F/Sp23R) y Sprl (SprlF/SprlR) de los cuales sólo se obtuvieron amplimeros con el
set de primers Uni y Sp13. Por otro lado, la secuencia ITS se construyó con base en las
secuencias obtenidas con el set de primers ITS1 e ITS4 usando el programa Serial
Cloner. El análisis de la región ITS permitió identificar el aislamiento como Fusarium
oxysporum y la forma especial se identificó con el análisis de PCR anteriormente
descrito.
Figura 9: Aislamiento de F. oxysporum f.sp. lycopersici visto al microscopio (40X)
Fuente: Autores
65
Para alcanzar los objetivos de esta investigación se desarrollaron dos experimentos. El
primero se estableció para determinar el efecto del silicio como inductor y de Trichoderma
viride como antagonista de la marchitez vascular causada por F. oxysporum f.sp.
lycopersici. En este primer experimento se aplicaron ocho tratamientos: T1 (silicio + T.
viride + patógeno), T2 (silicio – T. viride + patógeno), T3 (-silicio + T. viride + patógeno),
T4 (-silicio – T. viride + patógeno), T5 (silicio + T. viride – patógeno), T6 (silicio – T. viride
– patógeno), T7 (-silicio + T. viride – patógeno) y T8 (-silicio – T. viride – patógeno). El
segundo experimento se estableció para determinar el efecto de Trichoderma viride
como inductor de resistencia sistémica y antagonista frente al patógeno F. oxysporum
f.sp. lycopersici agente causal de la marchitez vascular en etapa de semillero del tomate
de mesa. En este segundo experimento se aplicaron cinco tratamientos: T1 (T. viride en
pregerminación de semilla + patógeno), T2 (T. viride aplicado al sustrato + patógeno), T3
(T. viride en pregerminación y aplicado al sustrato + patógeno), T4 (Testigo inoculado
con el patógeno) y T5 (Testigo no inoculado con el patógeno).
5.4 EXPERIMENTO 1
5.4.1 Inoculación del patógeno. Las plantas se inocularon con la suspensión conidial
después de 25 días del tratamiento con silicio, es decir, en el momento del trasplante
mediante la metodología de inmersión radicular. Las plantas fueron retiradas del sustrato
(turba) donde desarrollaron la etapa de semillero después de 25 días después de la
germinación, las raíces se limpiaron y se retiró la mayor cantidad de sustrato en la zona
radicular para introducirlas en la suspensión fúngica durante 30 minutos (Figura 10).
Después se trasplantaron a bolsas de polietileno negro en sustrato turba de acuerdo a la
metodología propuesta por Boix et al. (2014).
66
Figura 10: Inmersión radicular en suspensión conidial de F. oxysporum f.sp. lycopersici
Fuente: Autores
5.4.2 Obtención del antagonista Trichoderma viride y época de aplicación. El
antagonista T. viride fue proporcionado por la empresa BIOCULTIVOS S.A. El
microorganismo es un antagonista regulador de fitopatógenos causantes de pudriciones
radiculares y bajos rendimientos en los cultivos. Además, es biorregulador del
crecimiento vegetal y tiene acción celulolítica que ayuda a degradar la celulosa de los
residuos de cosecha. El bioinsumo tiene una composición de 1*107 conidias ml-1. Se
preparó una solución de 5 ml del bioinsumo (Trichoderma viride) por litro de agua y de
ésta se aplicaron 15 ml a cada bolsa en las siguientes épocas: 8 días antes de trasplante,
en el momento de trasplante y 8 días después de trasplante.
67
5.4.3 Obtención de la fuente de silicio y época de aplicación. La fuente de silicio fue
proporcionada por la empresa AGROMIL S.A BIOEST S.A.S. El producto tiene una
composición de silicio soluble en agua de 0.97 g lt-1, silicio total de 360 g lt-1 y densidad
de 1,22 g lt-1. La aplicación de silicio se realizó durante 25 días en la etapa de semillero.
Se utilizó una solución de 1 ml lt-1 de agua recomendada por el fabricante. Diariamente
se aplicó 10 ml de la solución por alvéolo, es decir, por planta hasta el momento del
trasplante.
5.4.4 Evaluación del efecto del silicio y T. viride sobre los parámetros epidemiológicos
de la enfermedad. La incidencia y severidad de la marchitez vascular causada por el
patógeno F. oxysporum f.sp. lycopersici se evaluó 25, 33 y 41 días después de la
inoculación (DDI). Para la evaluación se utilizó la escala desarrollada por el CIAT (1987)
(Tabla 4).
Tabla 4: Escala de severidad foliar para marchitez vascular en tomate de mesa
Severidad Porcentaje Características
1 0 No manifestación de síntomas
3 10 No más del 10% del follaje total está marchito
y/o clorótico
5 25 Hojas están marchitas o cloróticas
7 50 Hojas están marchitas y/o cloróticas
9 100 Plantas muertas o severamente infectadas que
muestras prácticamente todo su follaje marchito,
con clorosis, necrosis y/o defoliación prematura
Fuente: CIAT (1987)
Además, se evaluó la coloración radicular, retirando las plantas por medio de un
muestreo destructivo realizando un corte trasversal de los haces vasculares y de acuerdo
a la escala desarrollada por Corrales et al. (1987) y CIAT, (1987) se determinó el grado
de coloración vascular (Tabla 5). Además, para evaluar el avance del patógeno en el
68
tallo se midió la longitud necrosada realizando un corte trasversal del tallo y del sistema
radicular de acuerdo a la metodología propuesta por Estupiñán & Ossa (2007).
Tabla 5: Escala para evaluar decoloración vascular
Grado de
coloración
vascular
Descripción Características
0 Ninguno
1 Ligera
2 Intermedia
3 Severa
Fuente: Corrales et al. (1987) y CIAT (1987)
5.4.5 Evaluación del efecto del inductor del silicio sobre las plantas afectadas por la
enfermedad. El efecto del silicio como inductor de resistencia se evaluó a través de la
actividad de la enzima Polifenoloxidasa (PPO). Se tomaron aleatoriamente 3 muestras
por cada tratamiento para un total de 24 muestras, las cuales fueron rotuladas (M1 –
M24). Cada muestra correspondía a 50 g de material vegetal, el cual fue tomado
cuidadosamente en una pequeña cámara de frío, posteriormente tratadas con nitrógeno
líquido y transportado en termo hasta el laboratorio.
El análisis bioquímico de la actividad de la enzima Polifenol – oxidasa (PPO) se realizó
en el laboratorio del Grupo de Investigación en Productos Naturales de la Universidad
del Tolima. Las muestras fueron conservadas a -80°C hasta el desarrollo del análisis.
Posteriormente, se realizó una maceración del tejido con nitrógeno (N2) líquido y
posteriormente se sometió a extracción con buffer fosfato de sodio 100 mM (pH 7,4).
Finalmente, las muestras se centrifugaron a 11000 rpm por 15 min y se recuperó el
sobrenadante. El contenido de proteína se cuantificó con el método de Bradford (1976).
69
La actividad de enzima Polifenol oxidasa (PPO) se determinó espectrofotométricamente
de acuerdo a la metodología descrita por Jiang et al. (2005). En la reacción se emplearon
8 µL del extracto enzimático y 200 µL de una solución de buffer fosfato de sodio 100mM
(pH 7,4) que contenía Catecol 100mM. El ensayo se llevó a cabo en un espectrofotómetro
lector de microplacas MultiSkan GOTM marca Thermo Fisher Scientific a una longitud de
onda de 412 nm, se empleó un coeficiente de extinción de 1260 y la actividad se
cuantificó en U/mg de proteína.
5.4.6 Evaluación del efecto del silicio y T. viride sobre las funciones fisiológicas de las
plantas afectadas por la enfermedad. Se realizaron evaluaciones a los 25, 33 y 41 días
después de trasplante con el fluorómetro OptiSciences CCM 300 el cual determina el
contenido relativo de clorofila.
5.5 EXPERIMENO 2
5.5.1 Inoculación del patógeno. Se inocularon las plantas en el estadío 11 en la escala
BBCH para solanáceas (La 1ª hoja verdadera del tallo principal, desplegada
completamente (Figura 11). Se inoculó 10 ml de suspensión fúngica por planta, es decir,
en cada alvéolo de acuerdo a la metodología propuesta por Robles et al. (2014).
5.5.2 Obtención del antagonista Trichoderma viride y época de aplicación. El
microorganismo fue proporcionado por la empresa BIOCULTIVOS S.A. Las semillas
fueron tratadas con T. viride en dosis de 5 ml / lt de agua, asperjando la solución sobre
la semilla, dejando secar en un ambiente libre de exposición a luminosidad,
posteriormente se realizó la siembra. Para la inoculación en sustrato se preparó una
solución de 10 ml lt-1 de agua y a cada alvéolo se aplicó 10 ml de la solución 3 días antes
de la siembra.
70
Figura 11: Momento de inoculación del patógeno (primer hoja verdadera totalmente
desplegada)
Fuente: Autores
5.5.3 Evaluación del efecto de T. viride sobre los parámetros epidemiológicos de la
enfermedad. Los parámetros epidemiológicos se evaluaron 30 días después de la
germinación, tomando 5 plantas por réplica en cada tratamiento (excepto el tratamiento
5 no inoculado con el patógeno), es decir, 15 plantas evaluadas por tratamiento para un
total de 60 plantas evaluadas. Se evaluó la incidencia y la severidad de acuerdo a la
escala desarrollada por el CIAT (1987) descrita y utilizada para el experimento 1.
5.5.4 Evaluación del efecto bioestimulante de T. viride sobre plantas de tomate en etapa
de semillero. Se determinó evaluando las siguientes variables: germinación, masa fresca
y seca (aérea y radicular), longitud del tallo, diámetro del tallo y número de hojas
verdaderas.
La germinación se evaluó a partir del 4 día después de la siembra hasta el octavo día,
se cuantificó diariamente el número de plantas con los cotiledones por encima de la
superficie, es decir con el hipocótilo visible (PHV) y las que tuvieran las dos hojas
71
cotiledonales totalmente desplegadas, que corresponde al código 09 y 10 en la escala
BBCH. Se aplicaron las siguientes fórmulas para determinar el porcentaje de
germinación y la tasa de germinación:
PG= (PHCD) 100/NSS, donde PG: porcentaje de germinación, PHCD: plántulas con las
dos hojas cotiledonales totalmente desplegadas, NSS: Número de semillas sembradas.
TG= (N1T1 + N2T2…+ NxTx)/NGS, donde: TG: tasa de germinación calculada a partir de
la variable PHCD, N: número de semillas que germinaron (PHCD) en cada intervalo de
tiempo y T: tiempo transcurrido entre el inicio de la prueba y el fin de cada intervalo de
acuerdo a la metodología propuesta por Fernández, Urdaneta, Silva, Poliszuk & Marín,
(2006).
La masa fresca se evaluó 30 días después de la germinación (DDG), se tomaron 20
plantas, de las cuales se separó la parte aérea y radicular y se pesaron en una balanza
de precisión FX-300i distribuida por la empresa AND Company Limited. La masa seca
se evaluó después de secar las plantas (parte aérea y radicular separadas) en estufa a
75°C durante 4 h, luego se pesaron en la misma balanza de acuerdo a la metodología
propuesta por Santana et al. (2016).
La longitud del tallo se evaluó 30 DDG utilizando una cinta métrica, tomando 20 plantas
por tratamiento. El diámetro del tallo también se evaluó en la misma época utilizando un
Pie de Rey metálico electrónico con precisión de (REFERENCIA) de acuerdo a la
metodología propuesta por Santana et al. (2016). Además, el número de hojas
verdaderas se evaluó a los 25 días DDG.
72
5.6 DISEÑO ESTADÍSTICO Y ANÁLISIS DE DATOS.
Para el experimento 1 se empleó un diseño factorial con 8 tratamientos y 12 réplicas que
correspondían a una planta; la unidad experimental era una planta. Para el experimento
2 se empleó un diseño completamente al azar con cinco tratamientos y tres réplicas que
correspondieron a una bandeja de 50 alvéolos. Cada unidad experimental era una
bandeja de germinación. Todas las variables fueron sujetas a análisis de varianza
(ANAVA) y las medias de los tratamientos serán comparadas por test Tukey (p ≤ 0.05)
usando el software estadístico InfoStat.
73
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 EXPERIMENTO 1
6.1.1 Efecto del silicio y Trichoderma viride sobre los parámetros epidemiológicos
severidad de la enfermedad y avance del patógeno. La severidad de la marchitez
vascular en plantas de tomate tratadas con silicio e inoculadas y no inoculadas con T.
viride fue menor a la severidad de la enfermedad en plantas que no tuvieron silicio y que
fueron inoculadas y no inoculadas con T. viride siendo que el área bajo la curva del
progreso de la enfermedad (ABCPE) para las las plantas tratadas con silicio e inoculadas
y no inoculadas con T. viride fue significativamente menor (p ≤ 0,05) (Figura 12AB). Es
probable que estos hallazgos estén asociados a los mecanismos de acción de T. viride
como microorganismo antagónico y las alteraciones físicas y bioquímicas que induce el
silicio en plantas cuando son afectadas por un patógeno, en el caso particular Fusarium
oxysporum f.sp. lycopersici.
La menor severidad de marchitez en el tratamiento T1 (silicio + T. viride Inoculado con el
patógeno) y tratamiento T2 (silicio – T. viride Inoculado con el patógeno) en comparación
con el tratamiento T3 (- silicio + T. viride Inoculado con el patógeno) y tratamiento T4 (-
silicio – T. viride Inoculado con el patógeno) probablemente está relacionada con los
diferentes mecanismos de acción de T. viride frente a agentes patógenos como F.
oxysporum f.sp lycopersici. Estos mecanismos como micoparasitismo, capacidad
antagónica y bioestimuladora, competencia, antibiosis, desactivación de enzimas de
patógenos e inducción de resistencia probablemente actuaron para reducir la severidad
en las plantas evaluadas (Martínez et al., 2013; Chávez, 2006).
Con relación al avance del patógeno evaluado en las épocas 25, 33 y 41 días después
de trasplante presentó diferencia significativa (p ≤ 0,05) en la primer época entre el
tratamiento T4 con los demás; para la segunda época hubo diferencia significativa (p ≤
0,05) entre el tratamiento T4 con el tratamiento T3 (Figura 12C). El tratamiento T2
74
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
1 2 3 4
AB
CP
E
Tratamientos
8,0
13,0
18,0
23,0
28,0
33,0
38,0
43,0
25 33 41
Milí
me
tro
s (
mm
)
Época de evaluación (Días Después de Inoculación)
T1 T2 T3 T4
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 2 3 4
AB
CP
E
Tratamientos
presentó un comportamiento interesante, debido a que el patógeno avanzó 3,95 mm
entre la primera y segunda época de evaluación, comparado con el tratamiento T4 que
presentó mayor avance entre las mismas épocas, siendo de 24,15 mm. Los datos
obtenidos concuerdan con los encontrados por Estupiñan & Ossa, (2007), quienes
reportan avance de F. oxysporum f.sp lycopersici considerable afectando el desarrollo
normal de plantas de uchuva.
Figura 12. A, Severidad foliar; B, Severidad radicular; C, Avance del patógeno a través
de la raíz. Medias con una letra común no son significativamente diferentes de acuerdo
a la prueba de Tukey (P ≤ 0,05).
Fuente: Autores
a
ab
b b a
a a
a
A B
C
*
*
*
*
*
75
En investigaciones realizadas por Durman et al. (1999) reportaron la disminución de la
incidencia de diferentes enfermedades en más del 60% y un retraso en el periodo de
incubación (aparición de primeros síntomas) además de reducir el crecimiento de
esclerocios de Rhizoctonia solani en plantas de tomate de mesa tratadas con cepas de
Trichoderma spp.. Por otro lado Haran et al. (1996) encontraron que Trichoderma tiene
capacidad de producir enzimas como polisacáridos, proteasas y lipasas, involucradas en
la degradación de la pared celular de F. oxysporum f.sp. radicis-lycopersici. Al igual John
et al. (2010) demostraron la capacidad de T. viride como agente de biocontrol de F.
oxysporum f.sp adzuki y Pythium arrhenomanes y promotor de crecimiento vegetal en
ensayos in vitro y de campo en plantas de soja. Adicionalmente encontraron una
reducción de la severidad de la enfermedad asociada a la destrucción de testa de los
patógenos por T. viride y una promoción del crecimiento vegetal en las plantas que fueron
tratadas con el microorganismo. Por otro lado, en las plantas que no fueron tratadas con
T. viride se produjo una afección en el sistema radicular, afectando la nodulación y su
desarrollo normal, en comparación con las plantas tratadas con el microorganismo.
Además, en otro estudio realizado por García et al. (2006), se evaluó el efecto de T.
harzianum en diferentes cultivos simultáneamente. Los autores encontraron reducción
de la enfermedad en los tratamientos con T. harzianum cepa T12 respecto a los
tratamientos testigo en las interacciones: Rhizoctonia solani-papa (29% en reducción de
la enfermedad respecto al testigo), R. solani-café (25%), Sclerotiun cepivorum-ajo (45%),
Fusarium oxysporum y Fusarium sp.-tomate (30%), Sclerotium rolfsii-tomate (45%),
Phytopthora sp.-tomate (45%), Sclerotinia sclerotiorum-fríjol (25%) y Erwinia carotovora-
plátano (48%).
En otros ensayos Harman et al. (2004) encontraron una reducción del 80% en la
severidad del tizón tardío en plantas de tomate tratadas con Trichoderma harzianum
cepa T22. Estos resultados muestran la capacidad del género Trichoderma para reducir
los efectos de patógenos que afectan las plantas en su zona aérea y radicular. Además,
los resultados se relacionan con los presentados en este trabajo, debido a que se
encontró una reducción de la severidad de la marchitez vascular en tomate causada por
76
F. oxysporum f.sp. lycopersici y estadísticamente (p ≤ 0,05) se encontró diferencia
significativa entre los tratamientos con T. viride respecto a los que no se aplicó el
microorganismo.
La menor severidad de la marchitez vascular ocasionada por F. oxysporum f.sp
lycopersici en los tratamientos T1 y T2 comparado con los tratamientos T3 y T4 también
está relacionada con las alteraciones físicas y bioquímicas que el silicio induce en las
plantas de tomate como activación de mecanismos de defensa. En ensayos Gómez et
al. (2006) demostraron una diferencia significativa en la severidad entre plantas de
tomate tratadas con silicio en combinación con miel de abejas respecto a plantas no
tratadas, siendo mucho mayor en estas últimas. Estos resultados pueden estar
asociados al efecto inductor y regulador del silicio en la defensa de las plantas además
a la capacidad del elemento para formar enlaces oxidrilos de las proteínas e interferir con
cofactores de enzimas involucradas en la patogenicidad (Fauteux et al., 2005).
Así mismo, diferentes investigaciones han demostrado el efecto del silicio en la reducción
de la severidad de la enfermedad en las interacciones algodón-Fusarium oxysporum f.sp.
vasinfectum, mango-Colletotrichum gloeosporioides, melón-Fusarium oxysporum f.sp.
cucumerinum, banano-Fusarium oxysporum f.sp cubense, tomate-Fusarium oxysporum
f.sp. radices lycopersici; lechuga-Fusarium oxysporum f.sp. lactucae (Smith et al., 2005;
Zainuri et al., 2005, Fortunato et al., 2012; Miyaki & Takahashi, 1983; Chitarra et al., 2013;
Huang et al., 2011). Además, Datnoff et al. (1991) registraron después de aplicaciones
de silicato de calcio una reducción del 15% en la severidad de la mancha marrón del
arroz causada por Cochliobolus miyabeanus respecto a las plantas que se desarrollaron
en ausencia de silicio. Por otro lado, se ha reportado que el silicio puede aumentar la
densidad de células buliformes, largas y cortas silicatadas las cuales actúan como una
barrera física para la penetración y avance del patógeno. En estudios pioneros realizados
por Yoshida et al. (1962) se evidenció una capa de sílice de aproximadamente 2 µm de
espesor bajo la cutícula de las hojas y vainas en plantas de arroz y Volk et al. (1958)
demostraron que una capa de cutícula-silicio en plantas de arroz puede impedir la
penetración de Magnoporthe grisea y reducir la severidad de la enfermedad, atribuido a
77
la capacidad del silicio para formar complejos con compuestos orgánicos en la pared
celular de células epidérmicas y aumentar la resistencia a la degradación por enzimas
producidas por el patógeno.
De esta manera, el silicio promueve alteraciones físicas en las plantas para disminuir la
severidad de las enfermedades, tales como en las interacciones antes mencionadas. En
ensayos Huang et al. (2011) hallaron una correlación entre el aumento de la
concentración de silicio en la raíz de plantas de tomate a las que se les proporcionó el
elemento con la reducción en la severidad de la enfermedad en las raíces, la corona y
los tallos. Esta disminución en la severidad se atribuyó al endurecimiento de las paredes
celulares, lo que condujo a un retraso en el inicio de la infección fúngica en las raíces.
Todos los hallazgos presentados de investigaciones anteriores se relacionan con los
encontrados en el presente estudio y pueden estar fundamentados en diferentes factores
que actúan de manera conjunta o individual para disminuir la severidad de la
enfermedad. La evidencia a nivel microscópico para demostrar que el silicio puede
impactar positivamente en la disminución de la severidad de las plantas es el desarrollo
de barreras preformadas como la cutícula y pared celular y barreras de defensa
posformadas como deposición de papilas y un refuerzo de la pared celular en los puntos
de infección del patógeno (Freeman & Beattie, 2008). Por otro lado, Hayasaka et al.
(2008) los autores encontraron que la acumulación de silicio en la cutícula foliar puede
disminuir el número de apresorios con penetración exitosa en plantas de arroz afectadas
por Pyricularia oryzae, lo que permite concluir que una capa de silicio densa en la cutícula
foliar puede contribuir a un periodo de incubación más largo, es decir, prevenir o retrasar
la penetración del patógeno y así disminuir la severidad de la enfermedad.
Además de los mecanismos físicos que probablemente proporcionó el silicio a las plantas
de los tratamientos T1 y T2, la reducción de la severidad de la marchitez en estos
tratamientos se puede relacionar con las alteraciones bioquímicas que induce el
elemento en las plantas. En investigaciones se ha demostrado el papel del silicio en el
aumento de la actividad de enzimas como la polifenol oxidasa, peroxidasa y fenilalanina
amoniliasa, las cuales participan en la biosíntesis de compuestos fenólicos, fitoalexinas,
78
y otros compuestos con propiedades antifúngicas, activando diferentes mecanismos de
defensa en las plantas frente al ataque de patógenos (Rodrigues & Datnoff, 2017;
Castellanos et al., 2015; Jukanti, 2017). Así, se atribuye al silicio el incremento en la
concentración de flavonoides y compuestos fenólicos antimicrobianos además de un
efecto sinérgico en el aprovechamiento de algunos elementos como el fósforo y nitrógeno
lo que da como resultado plantas más vigorosas (Shetty et al., 2012).
En estudios realizados por Shetty et al. (2012) demostraron que aplicaciones de silicio
reduce en un 48% la severidad del mildeo polvoso causado por Podosphaera pannosa
en rosas, atribuido a una deposición de callosa, acumulación de silicio en la pared celular
y producción de diferentes enzimas y compuestos de defensa en la planta. Por otro lado,
Fortunato et al. (2012) también demostraron el efecto del silicio en la reducción en la
severidad de la marchitez causada por F. oxysporum f.sp. cubense en plantas de
banano, los autores encontraron un aumento en la concentración de compuestos
fenólicos, lo cual está relacionado con el retraso en la colonización del patógeno.
También Castillo et al. (2010) reportaron que concentraciones de 100 y 150 ppm de silicio
reducen la severidad de la enfermedad causada por Peronospora sparsa en rosa. Así,
los diferentes mecanismos físicos y bioquímicos que potencia el silicio en las plantas
para el manejo de enfermedades han sido ampliamente demostrados y registrados en
diferentes investigaciones.
En otros estudios desarrollados por Fauteux et al. (2005) se evaluó en la interacción
trigo-Blumeria graminis f.sp. tritici el efecto del silicio para reducir la severidad de la
enfermedad. Los autores encontraron después de someter fracciones foliares a análisis
de cromatografía líquida de alta resolución cantidades superiores de al menos tres
compuestos en las plantas inoculadas con el patógeno a las cuales se les había
proporcionado silicio. Los autores concluyen que es probable que la presencia de
compuestos fenólicos como efecto de la aplicación de silicio contribuyó al colapso de las
cadenas de conidios en los sitios de infección evaluados y consecuentemente con la
disminución de la enfermedad. Además, en otro estudio realizado por Rodrigues et al.
(2004) contribuyeron con pruebas al encontrar niveles más altos de fitoalexinas de
79
momilactona (agente alelopático producido por la raíz del arroz) en extracto de hojas de
arroz inoculadas con P. oryzae y tratadas con silicio respecto a las que no fueron tratadas
con silicio e inoculadas con el patógeno.
En otros trabajos realizados por Fortunato et al. (2014) observaron la actividad de
enzimas relacionadas con la defensa en la interacción banano-Fusarium oxysporum f.sp.
cubense. Encontraron después de 24 horas de inoculación del patógeno en plantas a las
que se les suministró silicio una fluorescencia intensa de color amarillo-naranja en el
floema y amarillo limón en los vasos del esclerénquima y metaxilema como resultado de
la acumulación de lignina y dopamina. Por otro lado, Da silva et al. (2015) trabajó en la
interacción trigo-Pyricularia oryzae observando que el silicio a nivel histoquímico puede
incrementar la producción de flavonoides y este evento estaría correlacionado con el
reducido crecimiento fúngico dentro de las células epidérmicas de la planta.
Por otro lado, el silicio puede formar complejos con compuestos orgánicos en las paredes
celulares de la epidermis lo que conduce a un incremento en la resistencia a la
degradación por las enzimas hidrolíticas y toxinas que libera el patógeno. Además, se ha
reportado el efecto del silicio en la inducción de resistencia de plantas contra
enfermedades asociado a un incremento en la actividad de enzimas y la concentración
de compuestos fenólicos que restringen el flujo de materiales a la célula madre haustorial
y conforman una barrera física para evitar la penetración de la pared celular del
hospedero (Volk et al., 1958; Inanaga et al., 1995). Estos eventos reportados pueden
estar relacionados con los resultados presentados en este trabajo, debido que se
observó una disminución de la enfermedad en las plantas a las cuales se suministró
silicio respecto a las que se desarrollaron en ausencia del elemento.
Los resultados obtenidos en este estudio se podrían relacionar con la capacidad que
tiene el silicio para formar complejos con compuestos orgánicos en la pared celular y
crear una barrera física que probablemente impidió la penetración y avance de F.
oxysporum f.sp lycopersici a través del tallo. Además, el silicio puede crear una capa
externa protectora en las células epidérmicas y retrasar la enfermedad en las plantas
80
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
U / m
g d
e p
rote
ína
Tratamientos
b
b
bb b
b b
a
(Rodrigues & Datnoff, 2017; Epstein & Bloom, 2005; Ma & Takahashi, 2002; Bélanger et
al., 2003). Estos eventos pudieron presentarse para disminuir el avance del patógeno en
los tratamientos suministrados con silicio y así reducir la severidad foliar en las plantas.
6.1.2 Evaluación del efecto del inductor del silicio sobre la enzima Polifenoloxidasa
(PPO) como respuesta de defensa frente al ataque de F. oxysporum f.sp. lycopersici. La
actividad enzimática evaluada a los 60 días después de la inoculación (ddi) fue mayor en
los tratamientos T1 (silicio + T. viride Inoculadas con el patógeno) y T2 (silicio – T. viride
Inoculadas) en comparación con los demás tratamientos: T3 (- silicio + T. viride
Inoculadas), T4 (- silicio – T. viride Inoculadas), T5 (silicio + T. viride No inoculadas con
el patógeno), T6 (silicio – T. viride No inoculadas), T7 (- silicio + T. viride No inoculadas)
y T8 (- silicio – T. viride No inoculadas). Así, el T2 presentó una diferencia significativa (p
≤ 0,05) respecto a los demás tratamientos (Figura 13).
Figura 13. Actividad de la Polifenoloxidasa en los tratamientos. Los tratamientos que
presentan diferencias significativas (p ≤ 0,05) aparecen con letras diferentes de acuerdo
a la prueba de Tukey.
Fuente: Autores
81
La mayor actividad en los tratamientos con silicio e inoculados con el patógeno (T1 y T2)
puede ser atribuida a la capacidad del agente inductor para activar los mecanismos de
defensa en la planta incluida la actividad de la Polifenoloxidasa (PPO). De acuerdo con
Beckman (2000) y Jukanti (2017) la PPO juega un papel importante en la síntesis de
compuestos fenólicos como lo evidenciado por Fortunato et al. (2012) en la interacción
banana-Fusarium oxysporum f.sp. cubense donde el incremento de la actividad de la
PPO estuvo directamente relacionado con el aumento en compuestos fenólicos en
plantas tratadas con silicio y que presentaron menor severidad de marchitez. Ardila &
Higuera (2005) observaron inducción de la actividad de la PPO y aumento en la
concentración de compuestos fenólicos en variedades tolerantes a la marchitez por
Fusarium y correlacionó esta respuesta metabólica con la resistencia del clavel ante el
patógeno Fusarium oxysporum f.sp. dianthi R2.
En diferentes investigaciones se ha demostrado la correlación entre el aumento en la
actividad de la PPO, aumento en la concentración de compuestos fenólicos con la
disminución en la severidad de la enfermedad, siendo reportados en la interacción papa-
Fusarium sambucinum y trigo-Fusarium graminearum Ray & Hammerschmidt (1998);
Mohammadi & Kazemi (2002) respectivamente. Estos resultados también estuvieron
relacionados con una menor severidad de la enfermedad lo que concuerda con previos
hallazgos en los cuales el silicio aumenta la resistencia de la planta contra patógenos
habitantes naturales del suelo.
Por otro lado, los resultados encontrados se relacionan con los encontrados por Mayer
& Harel (1979) al observar actividad de la enzima PPO después de infección por
diferentes microorganismos. Por otro lado Hernández et al. (2002) observaron un
incremento significativo de actividad enzimática después de inocular plantas de
duraznero con Sphaerotheca pannosa agente causal de la cenicilla. De esta manera, se
logró determinar que en las primeras 24 horas después de la inoculación la planta
construye la defensa y se produce la formación de quinonas que reducen la proteína que
puede digerir el patógeno.
82
De acuerdo a trabajos realizados anteriormente es probable que el aumento de la
actividad de la PPO está relacionado con la estimulación del metabolismo secundario y
consecuentemente con el incremento en los niveles de compuestos fenólicos. Así, se ha
determinado que la PPO participa en rutas metabólicas que derivan en el aumento de la
concentración de compuestos fenólicos en células parenquimáticas del xilema, en la
biosíntesis de lignina y en el fortalecimiento de la pared celular (Beckman, 2000). El papel
del silicio y la correlación entre la actividad enzimática y el contenido de compuestos
fenólicos permiten crear una hipótesis del incremento de la PPO y la reducción de la
severidad en los resultados presentados.
Otros estudios realizados por Niranjan et al. (2006) mediante pruebas moleculares,
tisulares hallaron una participación positiva de la PPO en la defensa de plantas de mijo
perla (Pennisetum glaucum L.) afectadas por Sclerospora graminícola. Esto se atribuye
a las reacciones en las cuales actúa la PPO y da como resultado el incremento en
compuestos fenólicos los cuales pueden desempeñar un papel directo en la defensa de
las plantas. Así mismo, en ensayos realizados por Balakumar et al. (1997) hallaron una
reducción en los niveles de PPO en plantas de tomate tratadas con radiación ultravioleta
B probablemente para reducir el daño oxidativo; pero además encontraron un incremento
significativo de compuestos fenólicos y antocianinas.
Aunque los patógenos han evolucionado para romper la defensa que las plantas también
por evolución han conseguido desarrollar, en los estudios realizados en relación al tema
se ha encontrado efectos positivos y negativos de la actividad de la PPO sobre la defensa
de las plantas. Por ejemplo, en un trabajo realizado por Richter et al. (2012) evaluaron la
asociación potencial de la PPO con cinco isoenzimas a través de la tecnología RNAi para
determinar la defensa potencial que puede inducir para reducir la severidad en plantas
de diente de león afectadas por Botrytis cinerea y Pseudomonas syringae pv. tomate.
Como resultado encontraron inducción de una enzima ppo-2 especialmente alrededor de
las lesiones producidas por B. cinerea asociado a una reducción de la severidad de la
enfermedad.
83
Los estudios que demuestran la capacidad de la PPO para inducir defensa en las plantas
en contra del ataque de patógenos son limitados, sin embargo, se han reportado los
mecanismos más posibles a través de los cuales las PPO puede afectar la defensa.
Principalmente se relaciona la aparición de los productos de reacción de la PPO que
afectan directamente el desarrollo de los patógenos. También se relaciona con el
incremento en la producción de quinonas, que poseen propiedades antibióticas y
favorecen lignificación en los tejidos y como consecuencia se obstruye el paso de los
patógenos. Por otro lado la resistencia física inducida por la PPO se genera con la
acumulación de agregados insolubles de silicio conocidos como fitolitos bajo la cutícula
y agregados solubles como el ácido ortosilísico los cuales se entrelazan con la celulosa
para proporcionar resistencia y flexibilidad a la pared celular (Taranto et al., 2017;
Jukanti, 2017).
Los resultados encontrados en este trabajo concuerdan con otros presentados al
relacionar un incremento en la actividad de la PPO cuando las plantas son tratadas con
un agente inductor. En este caso el silicio incrementó la actividad en más de 2,0 U mg-1
de proteína en el tratamiento T2 (silicio – T. viride Inoculadas) que presentó mayor
actividad respecto a los demás. Además, se presentó una relación en este tratamiento
entre la actividad enzimática y la reducción de la severidad foliar de la enfermedad. Así,
se atribuyen las alteraciones provocadas por el silicio en la inducción de la actividad de
la PPO como alternativa para el manejo de la marchitez vascular del tomate frente al
ataque de F. oxysporum f.sp. lycopersici.
6.1.3 Evaluación del efecto del silicio y T. viride sobre las funciones fisiológicas de las
plantas afectadas por la enfermedad.
Los resultados obtenidos del contenido de clorofila en el presente estudio no presentaron
un patrón especial de comportamiento (Figura 14AB). Los tratamientos con silicio y T.
viride e inoculados con el patógeno F. oxysporum f.sp lycopersici no muestran un
comportamiento distintivo frente a los tratamientos sin silicio y sin T. viride e inoculados
con el patógeno.
84
El crecimiento y desarrollo del patógeno obstruye el sistema hidráulico de la planta donde
fluye el agua y los nutrientes necesarios para el normal funcionamiento fisiológico
incluyendo los requeridos para la formación de clorofila y otros pigmentos (Roncero et
al., 2003). Sin embargo, entre los tratamientos no hubo un patrón de comportamiento
diferencial para analizar un posible efecto directo del patógeno sobre la formación de
pigmentos.
Por otro lado, el patógeno afecta la toma de agua y nutrientes en las plantas y ocasiona
consecuentemente un estrés hídrico reflejado en la parte aérea de la planta y además
afecta el proceso fotosintético en diferentes formas como en el aumento en la resistencia
estomática, disfunción en los fotosistemas, alteraciones en la fosforilación, sobre
diferentes enzimas relacionadas con la fijación del carbono (Gonzales, Pastenes &
Horton, 2001).
En un estudio realizado por Villareal (2013) sometió plantas de uchuva frente a dos tipos
de estrés, biótico (inoculación de Fusarium oxysporum) y abiótico (inundación) para
determinar la respuesta fisiológica, bioquímica, morfológica y anatómica. En el análisis
de las variables fisiológicas encontró que cuando las plantas son sometidas a los dos
tipos de estrés los procesos fotosintéticos se ven afectados. Al someter las plantas a
inundación se presenta un efecto sobre la tasa de asimilación neta, conductancia
estomática y transpiración, eventos atribuidos al déficit de oxígeno en la raíz que genera
un aumento en la transpiración y consecuentemente induce a procesos fermentativos.
Por otro lado, en las plantas inoculadas con F. oxysporum se genera un descenso en el
contenido de agua a nivel celular y disminuye las tasas fotosintéticas por déficit de agua
y nutrientes. También se encontró que en las plantas inoculadas con el patógeno la
tendencia de respuesta ante la PAR (radiación fotosintéticamente activa) fue decreciente
debido a que en la etapa final del ensayo la asimilación fue reducida 10% respecto a las
plantas control.
85
A pesar de la formas en que puede F. oxysporum f.sp. lycopersici afectar el contenido de
clorofila, en el presente estudio no hubo diferencia estadística ni hubo un patrón
diferencial de las plantas tratadas con silicio y T. viride respecto a las que no fueron
tratadas.
Figura 14. A, Contenido de clorofila en los diferentes tratamientos. B, Factor CFR
Fuente: Autores
170
180
190
200
210
220
230
240
250
25 33 41
CH
L
Época de evaluación
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
0,88
0,90
0,92
0,94
0,96
0,98
1,00
1,02
25 33 41
CF
R
Época de evaluación
A
B
86
6.2 EXPERIMENTO 2
6.2.1 Evaluación del efecto de T. viride sobre los parámetros epidemiológicos de la
enfermedad. En relación al efecto antagónico de Trichoderma viride en etapa de
semillero de plantas de tomate de mesa frente al ataque de F. oxysporum f.sp lycopersici,
se encontró que la incidencia fue mayor en el tratamiento T4 (Plantas inoculadas con F.
oxysporum f.sp lycopersici no tratadas con T. viride) y tuvo una diferencia significativa (p
≤ 0,05) con respecto a los demás tratamientos T1 (Plantas inoculadas con F. oxysporum
y tratadas con T. viride en pre germinación), T2 (Plantas inoculadas con F. oxysporum y
tratadas con T. viride aplicado al sustrato) y T3 (Plantas inoculadas con F. oxysporum y
tratadas con T. viride aplicado en pre germinación y al sustrato) (Figura 15A). Igualmente
la severidad radicular fue mayor en el T4 respecto a los demás tratamientos mostrando
una diferencia significativa (p ≤ 0,05) entre ellos (Figura 15B). De la misma forma, la
severidad foliar fue significativamente mayor (p ≤ 0,05) en el tratamiento T4 respecto a
los demás tratamientos (Figura 15C).
La menor severidad en los tratamientos con T. viride en sustrato o en pregerminación se
atribuye a los diferentes modos de acción del microorganismo para reducir los efectos
negativos de los patógenos en las plantas. Es probable que el micoparasitismo,
antibiosis, competencia por espacio y nutrientes o la inducción de resistencia actuaron
de forma conjunta o individual para la reducción de la incidencia y severidad de la
enfermedad (Harman, 2004; Martínez, Infante & Reyes, 2013; Lieckfeldt et al., 1999;
Torres et al., 2015, Eraso et al., 2014).
Estos resultados se asemejan a los encontrados por Cherif & Benhamou (1990) y
Martínez et al., (2013) quienes demostraron que Trichoderma produjo diferentes
compuestos como polisacáridos, lipasas y proteasas que pueden degradar la pared
celular de F. oxysporum f.sp radicis-lycopersici y reducir la marchitez vascular en el
tomate. Además, los resultados encontrados pueden relacionarse con un mecanismo
especial de Trichoderma para inhibir la actividad de enzimas liberadas por los patógenos
para penetrar la superficie de las plantas, evento que puede explicar la menor severidad
87
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Se
ve
rid
ad
Fo
liar
e incidencia en el T3 donde se combinó la aplicación de Trichoderma en sustrato y en
pregerminación de semillas (Zimand et al., 1994).
Los resultados obtenidos en la investigación mostraron menor incidencia en el T3 lo que
permite determinar el uso en diferentes momentos de Trichoderma para potenciar la
acción antagónica contra F. oxysporum. Existe diferencia significativa entre el tratamiento
T4 y el T3, lo que define la capacidad de Trichoderma viride en el control de patógenos
de suelo (Figura 6A).
Figura 15. A, Incidencia de la enfermedad; B, Severidad foliar; C, Severidad radicular.
Los tratamientos que presentan diferencias significativas (p ≤ 0,05) aparecen con letras
diferentes de acuerdo a la prueba de Tukey.
Fuente: Autores
abc
ab
bc
a
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
Se
ve
rid
ad
Rad
icu
lar
bc
b
bc
a B
z
D
C
0,0
0,3
0,6
0,9
Incid
en
cia
abc
ab
bc
a
A
88
6.2.2 Evaluación del efecto bioestimulante de T. viride sobre plantas de tomate en etapa
de semillero. Con relación al efecto bioestimulante se encontró que la dinámica de
germinación expresada en el número de semillas germinadas cada día fue mayor en el
tratamiento T3 (Plantas inoculadas con F. oxysporum y tratadas con T. viride aplicado en
pre germinación y sustrato) mostrando diferencia significativa (p ≤ 0,05) con el T5
(Testigo absoluto no inoculado con el patógeno ni tratadas con T. viride) (Figura 16A).
Además las medias de los demás tratamientos T1 (T. viride aplicado en pre germinación),
T2 (T. viride aplicado en sustrato) y T4 (Testigo inoculado con F. oxysporum f.sp.
lycopersici) fueron menor a la media del tratamiento T3. Estos resultados se pueden
relacionar con la producción de hormonas reguladoras de crecimiento como auxinas,
giberelinas y citoquininas producidas por el género Trichoderma que al entrar en contacto
con el medio son liberadas y estimulan la germinación de las semillas (Altomare et al.,
1999; Valencia et al., 2005); además, se ha reportado la capacidad del género
Trichoderma para promover el crecimiento y vigor de las plantas, especialmente en las
raíces para lograr una absorción de agua y nutrientes (Donoso et al., 2008).
Los datos encontrados en la dinámica de germinación asociados a la variable hojas
cotiledonales totalmente desplegadas (hctd) presentaron un comportamiento similar a la
variable semillas germinadas, siendo que el tratamiento T3 (T. viride aplicado en
pregerminación y sustrato) mostró diferencia significativa (p ≤ 0,05) con el T5 (Testigo
absoluto No inoculado con el patógeno) (Figura 16B). Fernández et al. (2006) al evaluar
la germinación y otras variables en semilleros de tomate con diferentes sustratos
incluidos la turba encontraron que para el 8 día después de siembra, el 96,25% de las
plántulas estaban con las hojas cotiledonales totalmente desplegadas con una diferencia
de 54,29% respecto al testigo que correspondió a un almácigo tradicional compuesto de
la mezcla 3:1 de capa vegetal y materia orgánica.
Además, estos resultados son semejantes a los evidenciados por Santana et al. (2016),
quienes reportaron un porcentaje de germinación superior al 90% al día 4 después de
emergencia en semillas de tomate tratadas con Trichoderma harzianum respecto al
tratamiento control que alcanzó poco más del 80% de germinación. Por otro lado, Castro
89
& Rivillas (2005) registraron en un 90% la germinación de semillas de café tratadas con
T. harzianum respecto al testigo que obtuvo un 70%; de igual manera Cubillos et al.
(2009) demostraron el efecto positivo de T. harzianum para incrementar la germinación
en semillas de maracuyá a partir del 4 día después de la inoculación. Además, Camargo
& Ávila (2014) encontraron diferencia en 15% de germinación en semillas tratadas con
cepas nativas y comerciales de Trichoderma comparadas con el tratamiento testigo en
platas de arveja (Pisum sativum L.).
Figura 16. A, Dinámica de la germinación (semillas germinadas); B, hojas cotiledonales
totalmente desplegadas; C, velocidad de germinación; D, Aparición de la primera hoja
verdadera. Medias seguidas por (*) en cada evaluación son significativamente diferentes
(p ≤ 0,05) por la prueba de Tukey.
Fuente: Autores
0
10
20
30
40
50
5 7 9 11
Hoja
s C
otile
do
na
les
Desp
leg
ad
as
0
10
20
30
40
50
3 5 7 9
Se
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T1 T2 T3
T4 T5
0
10
20
30
1 3 5
Se
mill
as g
erm
ina
da
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15
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45
5 7 9 11
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A B
C
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* *
*
*
90
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Milí
me
tro
s (
mm
)
Figura 17. A, Diámetro del tallo; B, Peso húmedo foliar; C, Peso seco foliar; D, Peso
húmedo radicular; E, Peso seco radicular. Los tratamientos que presentan diferencias
significativas (p ≤ 0,05) aparecen con letras diferentes.
Fuente: Autores
ab
bc
a
bc
c
0,5
2,5
4,5
6,5
Pe
so
(g
ram
os)
a ab abc
bc
c
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Pe
so
(g
ram
os)
ab
b
a
b b
0,5
1,5
2,5
Pe
so
(g
ram
os)
bc b
a
bc
c
0,0
0,2
0,4
Pe
so
(g
ram
os) a
b
ab
b b
A B
C D
E TRATAMIENTOS
T1
T2
T3
T4
T5
91
La velocidad de germinación evaluada desde el día de siembra presentada como número
de semillas germinadas por día fue mayor en el tratamiento T3 mostrando diferencia
significativa (p ≤ 0,05) con el T4 y una ventaja considerable con las medias de los demás
tratamientos (Figura 16C). El efecto en esta variable se relaciona con las mismas
características de Trichoderma expuestas para la variable germinación, es decir, el
efecto del microorganismo sobre las variables de bioestimulación es probable que esté
relacionado igualmente a la producción de hormonas reguladoras de crecimiento como
auxinas, giberelinas y citoquininas producidas por el género Trichoderma que al entrar
en contacto con el medio son liberadas y estimulan la germinación de las semillas
(Altomare et al., 1999; Valencia et al., 2005).
Los datos obtenidos se relacionan con los obtenidos por Fernández et al. (2006) que
determinaron incremento en la velocidad de germinación en semillas de tomate tratadas
con Trichoderma harzianum respecto al testigo. Además, Besnard & Davet (1993)
demostraron una disminución del tiempo de germinación de dos días en semillas de
pepino tratadas con Trichoderma harzianum, lo que claramente determina una mayor
velocidad de germinación, que puede estar explicado con el efecto positivo del
tratamiento con el microorganismo en la etapa de semillero para acelerar el proceso de
germinación. Este resultado además permite identificar la efectividad de Trichoderma
para acelerar el proceso de germinación que determina uniformidad, mayor vigor y
sanidad en el material dispuesto a ser trasplantado.
La variable plantas con primera hoja verdadera evaluada a partir del 7 día fue mayor en
el tratamiento T3 mostrando diferencia significativa (p ≤ 0,05) con el T5 (Figura 4d).
Además las medias de los demás tratamientos T1, T2 y T4 fueron menor a la media del
tratamiento T3 (Figura 16D). Estos datos se pueden relacionar con los encontrados por
Fernández et al. (2006) quienes demostraron que la turba como sustrato en semilleros
de tomate puede incrementar significativamente el desarrollo de la primera hoja
verdadera. Aunque no incluyen en su investigación el efecto bioestimulante de
Trichoderma, los resultados son interesantes debido a que el mejor tratamiento (turba)
92
presentó diferencias significativas con los tratamientos mezcla 1:1 de compost y aserrín
de coco, mezcla 1:2 compost y aserrín de coco y el almácigo tradicional.
El comportamiento de los tratamientos T3 y T1 es importante para el productor, debido
a que se demuestra que bajo las condiciones evaluadas a los 12 días después de
germinación se desarrolla la primer hoja verdadera, lo que resulta favorable para
disminuir el tiempo en semillero y poder obtener plántulas de mejor vigor.
La variable diámetro de tallo medido en mm evaluada en el día 30 después del trasplante
fue mayor en el tratamiento T3 mostrando diferencia significativa (p ≤ 0,05) con todos los
tratamientos a excepción del tratamiento 1 (Figura 17A). Por otra parte, Fernández et al.
(2006) encontraron diferencias significativas del grosor del tallo entre diferentes
tratamientos (sustratos) en plántulas de tomate de 10 días después de siembra. El mejor
tratamiento (turba) presentó un promedio de diámetro de tallo de 1,305 cm, mostrando
diferencia estadística con los demás tratamientos Fernández et al. (2006).
El grosor o diámetro del tallo es una variable de crecimiento importante para la
producción hortícola, debido a que determina la viabilidad de la plántula después de
trasplante. Es decir, un grosor de tallo adecuado evita que la plántula se doble después
de trasplante, además de ser menos susceptible a plagas, enfermedades y estrés hídrico
y el ocasionado por el cambio de ambiente. Así, los resultados obtenidos pueden explicar
la efectividad de T. viride para estimular el engrosamiento del tallo en plántulas de tomate
antes de ser llevadas al campo.
La variable peso húmedo foliar evaluada en el día 30 después del trasplante fue mayor
en el tratamiento T3 (Figura 18) mostrando diferencia significativa (p ≤ 0,05) con los
tratamientos T4 y T5 (Figura 17B). La variable peso seco foliar fue mayor en el T3 y
presentó diferencia significativa (p ≤ 0,05) con todos los tratamientos a excepción del T1
(Figura 17C). La variable peso húmedo radicular fue mayor en el T3 mostrando diferencia
significativa (p ≤ 0,05) con todos los tratamientos (Figura 17D). La variable peso seco
93
radicular fue mayor en el tratamiento T1 y mostró diferencia significativa (p ≤ 0,05) con
los tratamientos T2, T4 y T5 (Figura 17E).
Los resultados anteriores se corroboran con los obtenidos por Camargo & Ávila (2014),
quienes encontraron un incremento del 77% en el peso fresco de la parte aérea de
plántulas de arveja tratadas con Trichoderma harzianum respecto al testigo. Por otro
lado, estudios realizados en cultivos de papa (Solanum tuberosum), melón (Cucumis
melo) y aguacate (Persea americana) en los cuales se encontró incremento significativo
en el peso de la masa fresca cuando son tratadas con Trichoderma (Hoyos, Villegas &
Peralta, 2008; Martínez et al., 2008). Además, los resultados obtenidos en el presente
estudio, concuerdan con los reportados por Galeano, Méndez & Urbaneja (2009) quienes
estudiaron el efecto de Trichoderma harzianum sobre plantas de tomate (Lycopersicum
esculentum L.), pepino (Cucumis sativus Mill.) y pimiento (Capsicum mannumm L.) y en
tomate por ejemplo encontraron incrementos de cerca del 60% de peso fresco aéreo y
30% de peso fresco radicular en plantas tratadas con Trichoderma harzianum en relación
al testigo.
Además, se relaciona el incremento en peso seco y fresco de las plantas tratadas con T.
viride con la capacidad del microorganismo para mejorar la absorción de nutrientes y
puede explicarse en la relación fuente/vertedero. Es decir, es posible que T. viride haya
influido en la translocación de la fuente (raíces) hacia la parte aérea de la planta (tallos y
hojas) (Dogliotti, 2002; Villalobos, 2001). Esto representa un aporte al agricultor, debido
a que es probable que el uso de microorganismos como T. viride mejoren la relación
fuente/vertedero y se genere mayor acumulación de fotoasimilados en los órganos de
recolección como en el caso del tomate los frutos.
94
Figura 18. A. Plántula del T5 (Plantas no inoculadas con F. oxysporum y sin tratamiento
con T. viride. B. Plántula del T3 (Plantas inoculadas con F. oxysporum y tratadas con T.
viride en pregerminación y en sustrato.
Fuente: Autores
A
B
95
7 CONCLUSIONES
Las alternativas utilizadas para el manejo de la marchitez vascular en tomate de mesa
causada por Fusarium oxysporum f.sp lycopersici como uso de inductores de resistencia
(silicio) y microorganismos antagonistas (Trichoderma viride) como agente
bioestimulador presentaron resultados positivos en la investigación.
Bajo las condiciones evaluadas el suministro de silicio en etapa de semillero y
aplicaciones de Trichoderma viride redujeron la severidad de la marchitez vascular en
las plantas de tomate observándose diferencia significativa (p ≤ 0,05) entre los
tratamientos T1 (silicio + T. viride Inoculadas con el patógeno) y T2 (silicio – T. viride
Inoculadas) frente a los tratamientos T3 (-silicio + T. viride Inoculadas) y T4 (-silicio – T.
viride Inoculadas). Estos resultados evidencian el potencial del silicio como inductor de
resistencia y de Trichoderma viride como hongo antagónico, ambas como estrategias
alternativas para el manejo integrado de la enfermedad marchitez vascular en tomate de
mesa causada por Fusarium oxysporum f.sp lycopersici.
El efecto del silicio como agente inductor de la actividad de la enzima polifenoloxidasa
PPO evaluada a los 60 días después de trasplante presentó diferencias estadísticas (p
≤ 0,05) entre el T2 (silicio – T. viride Inoculadas) con los demás. Así, puede considerarse
que el suministro de silicio durante la etapa de semillero incrementa la actividad de
enzimas de defensa como la PPO y consecuentemente promueve la producción de
compuestos fenólicos, eventos relacionados con la disminución de la severidad de la
enfermedad.
El efecto bioestimulante de forma general fue positivo en todas las variables evaluadas.
En la dinámica de germinación se presentó diferencia estadística (p ≤ 0,05) entre los
tratamientos T3 y T5 y las medias de los demás tratamientos fueron menor al mejor
tratamiento. Igualmente en las evaluaciones de las variables velocidad de germinación,
plantas con primer hoja verdadera, diámetro del tallo, peso húmedo foliar y radicular, y
96
peso seco foliar y radicular el tratamiento que presentó mejor resultado fue el T3. De esta
manera se puede considerar que la aplicación conjunta de Trichoderma viride en sustrato
y en pregerminación de semilla promueve el crecimiento vegetal en plantas de tomate
de mesa.
El efecto antagónico de Trichoderma viride en la etapa de semillero en plántulas de
tomate de mesa fue mejor en el T3 (T. viride aplicado en pregerminación de semilla y en
sustrato). Así, puede considerarse que la aplicación combinada de T. viride en
pregerminación de semilla y en sustrato en etapa de semillero en tomate de mesa reduce
significativamente la incidencia y severidad (foliar y radicular) de la enfermedad.
Los resultados obtenidos en la presente investigación sugieren que el uso de silicio y
Trichoderma viride en etapa de semillero y trasplante para el control de la marchitez
vascular causada por F. oxysporum f.sp. lycopersici son estrategias promisorias para
reducir los efectos negativos de este patógeno. Estas sugerencias se soportan por los
resultados que demuestran que la menor incidencia y severidad de la enfermedad fue
menor y la actividad enzimática de la PPO fue mayor en los tratamientos en los cuales
se proporcionó silicio y se utilizó Trichoderma viride.
97
RECOMENDACIONES
Es importante determinar la efectividad de diferentes fuentes de silicio presentes en el
mercado, es decir, evaluar el efecto inductor en ensayos contrastando dosis y fuentes de
ácido monosilicico.
Es importante desarrollar ensayos de campo a nivel comercial y semicomercial de la
mano de empresas e instituciones interesadas en el desarrollo del cultivo de tomate y
así validar los resultados en la presente investigación.
Debido al espacio y tiempo disponible para realizar los ensayos, estos no se pudieron
llevar hasta la etapa productiva. Es recomendable realizar ensayos de invernadero y a
campo abierto para evaluar el efecto del silicio y de Trichoderma viride para el control de
Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici en el cultivo de tomate.
A partir de los resultados en las variables de bioestimulación, sería importante investigar
en la relación que se puede presentar entre tratamientos con T. viride y la absorción,
asimilación y trasporte de fotoasimilados, estudiando el concepto de la relación
fuente/vertedero.
Es importante junto con las empresas Biocultivos, Bioest y Agromil se extiendan los
resultados de la investigación a todo el público que pueda ser útil a través de
comunicados, publicaciones científicas y técnicas, presentaciones en congresos y
demás medios.
98
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ANEXOS
125
Anexo A. Análisis de identificación molecular de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici
RESULTADOS DEL ANÁLISIS
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127
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