ESTUDIO MOLECULAR DE LOS FACTORES DE VIRULENCIA Y DE LA RESISTENCIA A CLARITROMICINA EN LA...
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
TESIS DOCTORAL
ESTUDIO MOLECULAR DE LOS FACTORES DE VIRULENCIA Y DE LA RESISTENCIA A
CLARITROMICINA EN LA INFECCIN POR Helicobacter pylori.
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
SONIA AGUDO PENA
Madrid, 2010
ISBN: 978-84-693-7739-0
Sonia Agudo Pena, 2010
-
Universidad Complutense de Madrid
Facultad de Medicina
Departamento de Microbiologa
ESTUDIO MOLECULAR DE LOS FACTORES DE
VIRULENCIA Y DE LA RESISTENCIA A
CLARITROMICINA EN LA INFECCIN POR
Helicobacter pylori.
TESIS DOCTORAL
SONIA AGUDO PENA
Madrid 2010
-
Agradecimientos
A mis padres
A Carlos
A lvaro
-
Agradecimientos
Al Dr. M. Lpez-Brea por la confianza que ha depositado en mis ideas y en mi trabajo.
Por haberme inculcado la mentalidad de que se puede ser cada vez mejor en lo que uno
hace. Gracias por el ejemplo, la confianza y el apoyo que me ha brindado desde el
primer da.
A la Dra. Teresa Alarcn porque sin su ayuda este trabajo nunca hubiera llegado a su
fin. Su apoyo y confianza en mi trabajo y su capacidad para guiar mis ideas ha supuesto
una ayuda imprescindible, no slo en la realizacin de esta tesis, sino tambin en mi
formacin como investigadora. Gracias por haberme facilitado siempre los medios para
llevar a cabo todas las actividades propuestas en el desarrollo de esta tesis. No puedo
olvidar tu paciencia, tu optimismo y tu absoluta disponibilidad para ayudarme tanto
profesional como personalmente todos los das del ao.
Al Dr. Diego Domingo por su valiosa colaboracin en este trabajo, por sus palabras de
aliento. Deseo algn da poder ser tan buen profesional como t, pero sobre todo tan
buena persona.
Al Dr. Guillermo Prez-Prez por convertir Nueva York en una ciudad pequea y
acogedora, pero sobre todo por saberme transmitir la pasin por el mundo de la
investigacin.
A todos los facultativos y residentes del Servicio de Microbiologa del Hospital
Universitario de la Princesa por todo lo que he aprendido de cada uno de ellos, por su
apoyo, cario y comprensin.
-
ndice.
1. INTRODUCCIN 1
1.1 CARACTERSTICAS MICROBIOLGICAS DE Helicobacter
pylori.
2
1.1.1 Historia. 2
1.1.2 Utraestructura. 4
1.1.3 Cultivo de Helicobacter pylori.
6
1.2 FACTORES DE PATOGENICIDAD DE H. pylori. 7
1.2.1 Factores de patogenicidad que contribuyen a la colonizacin de la
mucosa gstrica.
8
1.2.2 Factores de patogenicidad que contribuyen a la colonizacin de la
mucosa gstrica.
13
1.2.3 Otros factores.
20
1.3 CLNICA DE LA INFECCIN CAUSADA POR H. pylori. 22
1.3.1 Manifestaciones digestivas. 22
1.3.2 Manifestaciones extradigestivas.
25
1.4 EPIDEMIOLOGA DE LA INFECCIN POR H. pylori.
27
1.5 MTODOS DIAGNSTICOS PARA LA DETECCIN DE LA
INFECCIN POR H. pylori.
30
1.5.1 Mtodos invasivos. 31
1.5.2 Mtodos no invasivos.
34
-
ndice.
1.6 TRATAMIENTO DE LA INFECCIN POR H. pylori. 37
1.6.1 Pautas de tratamiento. 38
1.6.2 Anticidos utilizados para erradicar H. pylori 39
1.6.3 Antimicrobianos utilizados para erradicar H. pylori. 40
1.6.4 Causas de fracaso del tratamiento. 46
1.6.5. Mtodos de deteccin de resistencia.
47
1.7 VARIACIN GEOGRAFICA DE LAS CEPAS.
49
2. OBJETIVOS. 52
3. MTODOS. 53
3.1 PROCEDENCIA DE LAS MUESTRAS ESTUDIADAS. 54
3.1.1 Estudio de biopsia gstrica mediante PCR a tiempo real. 54
3.1.2 Estudio de biopsia gstrica mediante PCR e hibridacin en tiras
de nitrocelulosa.
54
3.1.3 Estudio de resistencia a claritromicina y su asociacin con los
factores de virulencia en aislamientos clnicos de Helicobacter pylori en el
ao 2008.
54
3.1.4 Estudio de factores de virulencia de aislamientos clnicos de
Helicobacter pylori en el ao 1994.
55
3.2 TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS.
56
-
ndice.
3.3 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS.
3.3.1 Cultivo de la biopsia gstrica. 56
3.3.2 Extraccin de DNA cromosmico a partir de la biopsia gstrica o a
partir de cepas del ao 2008.
57
3.3.3 Extraccin de DNA cromosmico a partir de cepas en el ao 1994.
59
3.4 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD in vitro. 60
3.4.1 Difusin en placa con disco y E-test. 60
3.4.2 Puntos de corte utilizados. 60
3.4.3 Mtodo genotpico para la deteccin de resistencia a claritromicina
mediante PCR en tiempo real (Light Cycler) a partir de biopsia gstrica.
61
3.4.4 Mtodo genotpico para deteccin de resistencia a la claritromicina
mediante PCR e hibridacin con sondas especficas a partir de biopsia
gstrica.
62
3.4.5 Mtodo genotpico para deteccin de resistencia a la claritromicina
mediante secuenciacin.
65
3.4.6 Mtodo genotpico para deteccin de resistencia a la claritromicina
mediante PCR convencional con un producto amplificado mayor.
67
3.4.7 Mtodo genotpico para deteccin de resistencia a la claritromicina
mediante RFLP-PCR con enzimas de restriccin.
68
3.4.7.1 Digestin con la enzima de restriccin BsaI. 69
3.5. ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE GENES ASOCIADOS A
VIRULENCIA.
70
3.5.1 Deteccin del gen vacA de Helicobacter pylori. 70
-
ndice.
3.5.1.1 Regin s y m. 70
3.5.1.2 Regin i. 71
3.5.2 Deteccin del gen cagA de Helicobacter pylori.
72
3.6 ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE GENES INFORMATIVOS DE
Helicobacter pylori Y SU RELACIN CON LA PROCEDENCIA
GEOGRFICA.
75
3.6.1 Deteccin del gen HspA de Helicobacter pylori. 75
3.6.2 Deteccin de la presencia de ins180 pb.
76
3.7 MLST (Multi Locus Sequence Typing) 78
3.8 DETECCIN DE LOS RESULTADOS.
80
3.9 ANLISIS DE LOS RESULTADOS.
80
4. RESULTADOS. 81
4.1 PCR A TIEMPO REAL EN MUESTRAS DE BIOPSIAS
GSTRICAS.
82
4.1.1 Deteccin de resistencia a claritromicina mediante PCR a tiempo
real.
83
-
ndice.
4.2 TCNICA DE AMPLIFICACIN E HIBRIDACIN CON SONDAS
ESPECFICAS A PARTIR DE BIOPSIA GSTRICA.
88
4.2.1 Deteccin de resistencia a claritromicina mediante PCR
convencional y posterior hibridacin.
90
4.3 ESTUDIO DE AISLAMIENTOS DE CEPAS DE Helicobacter pylori
EN MADRID 2008.
93
4.3.1 Datos de sensibilidad a claritromicina. 93
4.3.2 Sensibilidad a claritromicina. 96
4.3.2.1 Deteccin de la mutacin responsable de la resistencia a
claritromicina.
97
4.3.2.2 Secuenciacin de 695 pares de bases de la regin 23S RNA para
detectar resistencia a claritromicina en las cepas que hubo discrepancia
entre el mtodo fenotpico y el genotpico.
98
4.3.2.3 RFLP (restriction fragment length polymorphism technique). 99
4.3.2.4 Relacin de la resistencia a claritromicina con factores del
paciente.
101
4.3.2.4.1 Relacin entre la edad y la sensibilidad a claritromicina. 101
4.3.2.4.2 Relacin entre el lugar de nacimiento y la sensibilidad a
claritromicina.
101
4.3.2.4.3 Relacin entre el tratamiento previo frente a H. pylori y la
sensibilidad a claritromicina.
102
4.3.2.4.4 Relacin entre el gnero y la sensibilidad a claritromicina. 102
4.3.3 Datos globales de la deteccin de genes asociados a la virulencia. 104
-
ndice.
4.3.3.1 Deteccin del gen cagA. 107
4.3.3.1.1 Deteccin del nmero y tipos de fosforilacin EPIYA motifs. 109
4.3.3.2 Deteccin de los alelos del gen vacA. 112
4.3.3.2.1 Deteccin de la regin m y s. 112
4.3.3.2.2 Relacin entre los alelos del gen vacA y el lugar de
nacimiento del paciente.
114
4.3.3.2.3 Relacin entre los alelos del gen vacA y la edad del paciente. 114
4.3.3.2.4 Deteccin de la regin intermedia del gen vacA. 115
4.3.3.3 Relacin entre el gen cagA y vacA. 117
4.3.3.4 Relacin entre los genes cagA y vacA y la resistencia a
claritromicina.
117
4.3.4 Estudio de la presencia de genes informativos con la procedencia
geogrfica de las cepas de Helicobacter pylori.
119
4.3.4.1 Deteccin de la presencia ins180 bp. 119
4.3.5 MLST (Multi Locus Sequence Typing).
120
4.4 ESTUDIO DE AISLAMIENTOS DE CEPAS DE Helicobacter pylori
EN ESPAA 1994.
121
4.4.1 Datos de los pacientes. 121
4.4.2 Sensibilidad a claritromicina. 123
4.4.2.1 Deteccin de la mutacin responsable de la resistencia a
claritromicina.
125
4.4.3 Datos globales de la deteccin de genes asociados a la virulencia. 126
4.4.3.1 Deteccin del gen cagA. 128
-
ndice.
4.4.3.2 Deteccin de las distintas combinaciones allicas del gen vacA. 130
4.4.3.3 Determinacin de la regin intermedia del gen vacA. 131
4.4.3.4 Relacin entre el gen vacA y gen cagA. 132
4.4.4 Estudio de la presencia de genes informativos con la procedencia
geogrfica de las cepas de Helicobacter pylori.
134
4.4.4.1 Deteccin de la presencia ins180 pb. 134
4.4.4.2 HspA (Heat Shock Protein).
135
4.5 RELACIN ENTRE LAS CEPAS AISLADAS EN 2008 Y EN 1994. 137
4.5.1 Cambio de sensibilidad a claritromicina en los dos perodos de
tiempo.
138
4.5.2.1 Cambios en el gen vacA. 138
4.5.2.2 Cambios en el gen cagA. 138
4.5.2.2.1 Comparacin de los motivos de fosforilacin EPIYA. 139
5. DISCUSIN.
5.1 Diagnstico de la infeccin por Helicobacter pylori y su sensibilidad a
claritromicina mediante tcnicas de biologa molecular: PCR a tiempo
real y PCR convencional con hibridacin reversa.
141
5.2 Estudio de la sensibilidad a claritromicina. 148
5.3 Estudio del gen cagA. 154
5.4 Estudio del gen vacA. 159
5.5 Relacin del gen cagA/vacA. 162
-
ndice.
5.6 Estudio de la insercin de 180 pares de bases. 163
5.7 Estudio del gen hspA. 164
5.8 Estudio MLST. 165
6. CONCLUSIONES. 166
7. BIBLIOGRAFA. 169
-
Agradecimientos
Al personal tcnico y administrativo del Servicio de Microbiologa del Hospital
Universitario la Princesa por su constante inters.
A mis amigos porque me han enseado el verdadero significado de la amistad, valor
muy importante en mi vida.
A lvaro por su apoyo incondicional y sus dosis de paciencia. Gracias por tus consejos
y por haberme permitido compartir risas y llantos todo este tiempo.
A Carlos por su ayuda, paciencia y generosidad. Gracias por hacerme rer.
Finalmente quiero agradecer a mis padres por estar conmigo incondicionalmente, por
ayudarme en todo lo que necesito; por ser un ejemplo de lucha y honestidad. Gracias
porque sin vosotros y vuestras palabras de aliento no estara aqu hoy ni sera quien soy
ahora.
-
Introduccin.
1
INTRODUCCIN
-
Introduccin.
2
1.1 CARACTERSTICAS MICROBIOLGICAS DE Helicobacter
pylori.
1.1.1 Historia
La mayora de las infecciones bacterianas del hombre se describieron a comienzos
del siglo XX, por ello es extraordinario que el descubrimiento de Helicobacter como
bacteria de gran importancia en medicina, se retrasara hasta los aos ochenta. Cuando en
el ao 1981 Marshall y Warren inician un estudio prospectivo en pacientes que acuden a
consulta para ser sometidos a endoscopia oral, seguramente no eran conscientes de la
revolucin que iban a originar en el mundo de la Medicina. Hasta entonces si a alguien se
le hubiera ocurrido decir que las lceras gastroduodenales podan ser curadas con
tratamiento antibitico, le habran tachado de loco. En ese trabajo, realizado en el Royal
Perth Hospital de Australia, lograron visualizar bacterias helicoidales en la superficie de
la mucosa gstrica en el 98 % de las gastritis crnicas y en el 80 % de los pacientes con
lcera gstrica, utilizando la tincin de plata de Warthin-Starry (Warren 1983, Marshall
1984a).
Pero la visualizacin de las bacterias espirales en el estmago no era algo nuevo.
Las primeras descripciones se remontan a finales del siglo XIX, habiendo sido descritas
en estmagos de perros y gatos (Rappin 1881, Bizzozero 1893). Tras confirmar dichos
hallazgos en animales, Salomon busc las bacterias helicoidales en estmagos humanos
donde tambin las observ (Salomon 1896). Aunque fue Jaworski el primero que sugiri
un posible papel patgeno en la enfermedad gstrica (Jaworski 1899). Resulta curioso
que, a pesar de que en 1906 Krienitz encontrara estos organismos en pacientes con cncer
gstrico (Krienitz 1906), sea difcil encontrar referencias bibliogrficas hasta 1938,
-
Introduccin.
3
siendo un estudio que podra haber despertado una gran curiosidad cientfica al apoyar la
hiptesis patgena. Ese ao, Doenges realiza el primer estudio sistemtico en busca de
las bacterias helicoidales en estmagos humanos (Doenges 1938). Un ao ms tarde,
Freedberg y Berron consiguen relacionar estos microorganismos con las lceras gstricas,
habiendo observado este tipo de bacterias helicoidales en un porcentaje similar de
muestras que posean patologa gstrica (Freedberg 1940). Pero esta controversia
existente sobre la teora infecciosa de la patologa gastroduodenal pareci quedar
supuestamente zanjada cuando en el ao 1954 Palmer realiza un meticuloso estudi en
ms de 1100 biopsias gstricas y no encontr evidencia de bacterias espirales en ninguna
de ella (Palmer 1954). Desde entonces qued asumida la idea de que el estmago era un
rgano estril y que las bacterias vistas en biopsias eran fruto de la contaminacin
microbiana de la boca.
Tuvieron que pasar ms de 20 aos para que se volviera a sugerir la posibilidad de
que la infiltracin leucocitaria en la enfermedad ulcerosa se deba a una bacteria. Steer y
Colin Jones en 1975, al estudiar muestras de pacientes con lcera gstrica, observaron
con microscopa electrnica la existencia de microorganismos espirales en la mucosa
gstrica asociados a respuesta inflamatoria (Steer 1975).
Y es aqu donde volvemos a encontrarnos con Marshall, Warren y Goodwin.
Como hemos podido comprobar, el hecho de observar bacterias curvadas en secciones
histolgicas de biopsias gstricas de enfermos de gastritis no era algo nuevo. Lo que s
marcara un hito en la historia de la Microbiologa es que por primera vez y tras varios
intentos fallidos lograron cultivar la bacteria helicoidal de biopsias de antro gstrico
siguiendo la metodologa descrita por Skirrow para el aislamiento de Campylobacter spp
-
Introduccin.
4
(Skirrow 1977). Pero en vez de incubar las placas las 48 horas propuestas por Skirrow
permanecieron siete das incubndose al coincidir con el periodo vacacional de Semana
Santa. En un principio Marshall sugiere que podran pertenecer al gnero Spirillum
proponiendo posteriormente el nombre formal de Campylobacter pyloridis siendo
revisado en 1987 para adaptarse a las formas gramaticales latinas correctas y apareciendo
en las publicaciones cientficas como Campylobacter pylori (Marshall 1987).
Posteriormente estudios de secuenciacin de la regin 16S del RNA ribosmico
demostraron que la especie denominada Campylobacter pylori era distinta de las especies
de Campylobacter descritas hasta entonces. En 1989 se adopt la nueva denominacin de
Helicobacter, pasando a denominarse Helicobacter pylori (Goodwin 1989).
En Espaa el primer trabajo donde se describe el aislamiento de Helicobacter
pylori en pacientes con patologa gastroduodenal se public en 1985 (Lpez-Brea 1985).
Ese mismo ao Marshall demuestra que dicho microorganismo cumple los postulados de
Koch al ingerir el microorganismo inducindose una gastritis hecho repetido por Morris
(Morris 1987).
1.1.2 Utraestructura.
El genero Helicobacter junto con Campylobacter, Arcobacter, Sulfurospirillum y
Wollinella forma parte de la clase Epsilobacteria en la subdivisin Thiobacteria de la
divisin Proteobacteria (Cavalier-Smith 2002).
El gnero fue propuesto por primera vez en 1989 e incluy a las especies
Helicobacter pylori y Helicobacter mustelae, primeras bacterias aisladas de la mucosa
-
Introduccin.
5
gstrica humana y de los hurones, respectivamente (Goodwin 1989). La consecuente
revisin de gneros prximos llev a la inclusin de Helicobacter cinaedi y Helicobacter
fennelliae, que haban estado incluidas tambin en Campylobacter.
H. pylori es un bacilo gramnegativo, curvado y microaeroflico que se encuentra
en la mucosa gstrica del estmago humano. H. pylori tiene una morfologa espiral en
forma de sacacorchos cuando se encuentra en la mucosa gstrica y menos espiral cuando
crece en medios artificiales, esta forma se puede perder en los cultivos ms viejos o
sometidos a situaciones no favorables para su crecimiento adoptando forma cocoide.
Presenta un tamao de 0,5 a 1,0 micras de ancho y de 3 micras de largo. Tiene de 2 a 6
flagelos monopolares, fundamentales para su movilidad, y que estn recubiertos por una
vaina de estructura lipdica, igual que la membrana externa, que parece tener la misin de
proteger a los flagelos de su degradacin del medio cido (Amieva 2008).
Su temperatura ptima de crecimiento se produce a 37 C, aunque puede
desarrollarse en un rango de 35 a 39 C en microaerofilia, y para su cultivo se requieren
medios suplementados con suero o sangre entre el 5% y 10%, los cuales pueden actuar
como fuentes adicionales de nutrientes y la protegen de efectos txicos de los cidos
grasos de cadena larga. El efecto de estos cidos grasos tambin puede ser evitado por la
adicin de suplementos como -ciclodextrinas, IsoVitaleX o por la adicin de carbn
activado en el medio de cultivo (Mgraud 1995).
Las especies de Helicobacter son quimioorganotrofas y tienen un metabolismo
respiratorio. Son asacarolticas (no hay fermentacin ni oxidacin de azucares) aunque si
-
Introduccin.
6
ocurre la oxidacin de glucosa. Tienen, al menos parcialmente, las vas metablicas
Entner-Doudoroff, de pentosas fosfato, y el ciclo de cidos tricarboxlicos, pero la va del
glioxilato est ausente. No hidrolizan gelatina, almidn, casena o tirosina, son rojo de
metilo y Voges-Proskauer negativos. La actividad de oxidasa, ureasa y catalasa est
presente en Helicobacter pylori, enzimas muy tiles para su identificacin.
Aunque H. pylori es muy homogneo en cuanto a sus caractersticas bioqumicas,
presenta una importantsima variabilidad antignica. Esto es debido a que existen
muchos genes que codifican protenas de membrana y adems entre ellas pueden darse
distintos procesos de recombinacin.
1.1.3 Cultivo de Helicobacter pylori.
Helicobacter pylori es un microorganismo capaz de crecer en distintos medios de
cultivo si bien requiere diferentes factores de crecimiento. Los medios de cultivo slidos
ms frecuentes son Agar Mueller-Hinton y Agar Columbia y los suplementos ms
comnmente empleados son la sangre o derivados de ella. Es difcil de cultivar en medio
lquido aunque se logra con menor dificultad a partir de caldo de Brucella, infusin
cerebro-corazn, Mueller-Hinton y tripticasa soja, todos ellos suplementados con
nutrientes (Mgraud 1997).
Para el aislamiento primario, con el objetivo de evitar el sobrecrecimiento de
contaminantes que pueden acompaar a H. pylori en la biopsia es necesaria la utilizacin
de inhibidores que no afecten su viabilidad. Es recomendable aadir mezclas de
-
Introduccin.
7
antibiticos como el suplemento de Dent, que contiene vancomicina, trimetoprim,
cefsoludina y anfotericina B.
H. pylori es un microorganismo microaeroflico que requiere para su crecimiento
una atmsfera con las siguientes caractersticas: 5-10% de O2, 5-10% de CO2 y 80-90% de
N2 a 35-37C, una humedad del 90-95% y una incubacin de hasta 10 das antes de
considerar negativo el cultivo.
1.2 FACTORES DE PATOGENICIDAD DE H. pylori.
La infeccin por Helicobacter pylori origina prcticamente siempre gastritis
crnica. Sin embargo, las complicaciones principales (lcera pptica, adenocarcinoma y
linfoma gstrico) se desarrollan solo en una minora de personas infectadas,
predominantemente en hospedadores adultos.
Uno de los retos de la investigacin de H. pylori es la identificacin de los
factores de virulencia predictivos de la progresin de la infeccin. Se han propuesto
varios factores de virulencia como cagA, vacA y babA, entre otros. Aunque se han
asociado con un mayor riesgo de enfermedad ulcerosa pptica, adenocarcinoma gstrico
o linfoma tipo MALT, ninguno de ellos implica por si mismo el desarrollo de una
enfermedad en concreto. Esta asociacin aumenta cuantos ms factores de virulencia
acumula una bacteria (Wen 2009).
-
Introduccin.
8
Los factores de virulencia son productos bacterianos o estrategias que
contribuyen a la patogenicidad. Las bacterias necesitan penetrar en el organismo hasta
llegar a la zona donde van a persistir y producir su efecto patgeno.
H. pylori origina una fuerte respuesta inmune, humoral y celular en la mucosa
gstrica; aunque con esto no consigue eliminar la infeccin y se producen daos en el
epitelio gstrico. Tras la colonizacin, H. pylori libera sustancias toxicas que estimulan la
respuesta inmunolgica local en la que fundamentalmente participan los neutrfilos.
Despus se produce una amplificacin de la respuesta inflamatoria por la interaccin de
linfocitos, neutrfilos, macrfagos, clulas mastoides y clulas no inmunes que liberan
gran cantidad de mediadores qumicos. La ulcera pptica, el adenocarcinoma y el linfoma
gstrico son complicaciones de esta inflamacin crnica (Allen 2008).
1.2.1 Factores de patogenicidad que contribuyen a la colonizacin de la mucosa
gstrica.
H. pylori posee factores de virulencia que ayudan a la colonizacin del epitelio
superficial, la profundidad de las criptas y el espacio entre las clulas epiteliales.
- UREASA: la ureasa es la enzima mas abundante producida por H. pylori y
su actividad depende del pH alrededor de la bacteria. El hbitat natural de H. pylori se
encuentra por debajo de la capa mucosa, donde el pH se aproxima a la neutralidad
(Bauerfeind 1997). El mecanismo que utiliza para protegerse de ese pH cido durante
-
Introduccin.
9
la colonizacin o de las bajadas de pH que pueden ocurrir por daos mecnicos en la
mucosa, se basa en acumular una gran cantidad de ureasa en el citoplasma, en el
espacio periplsmico y en la superficie de la bacteria. La ureasa es una metaloenzima
que cataboliza la hidrlisis de la urea presente en el estmago en amonio y dixido de
carbono. El amonio producido aumenta el pH, elevndolo hasta 6 7 en su entorno.
De este modo puede alcanzar la superficie de las clulas de la mucosa, donde el pH es
prcticamente neutro.
La ureasa se regula puesto que un aumento excesivo de la alcalinidad debida
al NH4+ producido matara a la bacteria. La regulacin se produce mediante un
transportador dependiente de pH. El transportador UreI permite la entrada de urea
pero una vez que el pH alcanza el valor de 6-7, se inactiva.
El NH4+ liberado va a producir una serie de daos que afectan a la
microcirculacin y a las clulas epiteliales superficiales. Origina una necrotizacin del
tejido profundo; colabora en el desarrollo de gastritis atrfica crnica humana y
facilita el incremento de infecciones virales y la carcinognesis.
- SISTEMAS ANTIOXIDANTES: H. pylori es una bacteria microaeroflica
vulnerable a la toxicidad de O2. Durante el proceso de colonizacin H. pylori
promueve una fuerte respuesta inflamatoria mediada por neutrfilos y macrfagos, que
generan una cantidad de metabolitos reactivos del oxgeno. H. pylori cuenta con
mecanismos para la detoxificacin de estos metabolitos, as como para la reparacin
de los daos sufridos que favorecen su supervivencia en el tejido inflamado. Entre los
sistemas enzimticos de detoxificacin de los metabolitos reactivos del oxgeno estn
-
Introduccin.
10
la enzima superxido dismutasa, que cataliza la transformacin del superxido en
perxido de hidrogeno; la catalasa o peroxidasa, que cataliza la descomposicin del
perxido de hidrgeno en agua y oxigeno; las peroxirredoxinas, que catalizan la
reduccin de perxido de hidrgeno, peroxinitrito y otros hidroperxidos orgnicos a
sus correspondientes alcoholes y la flavo protena MdaB, una NADPH quinona
reductasa, que H. pylori expresa cuando debe compensar la perdida de los principales
componentes antioxidantes. Adems, el sistema tiorredoxina cataliza los procesos de
oxidacin-reduccin, tiol dependientes, de un gran nmero de enzimas
detoxificadoras. La actividad enzimtica de la catalasa, superxido dismutasa y las
peroxirredoxinas est incrementada en las cepas cagA positivas.
A veces los sistemas de detoxificacin no son suficientes y puede existir
oxidacin. Para ello H. pylori cuenta con un mecanismo para reparar el DNA daado,
como las protenas RecA, UvrABC, endonucleasa III, MutS y RuvC.
La protena NAP (Neutrophil activating protein), codificada por el gen napA,
fue identificada primeramente como una protena que participa en la activacin de los
neutrfilos. Tiene funcin de bacterioferritina para captar los iones ferrosos libres
intracelulares que pueden daar el DNA de H. pylori y protege a H. pylori del estrs
oxidativo. Puede actuar como adhesina cuando se secreta o se expresa en la superficie
bacteriana pues tiene afinidad por las ceramidas presentes en las membranas
plasmticas celulares y por el grupo antignico sanguneo de Lewis (Long 2009).
-
Introduccin.
11
- FLAGELOS: la gran movilidad de estas bacterias es fundamental para
colonizar la mucosa gstrica, segn se ha deducido de la infeccin experimental de
animales con variantes de H. pylori aflageladas y por tanto no mviles. H. pylori
posee alrededor de 2 a 6 flagelos monopolares, caracterstica inusual que es distinta
del resto de protenas flagelares, las cuales son homo polimricas. Cada flagelo est
compuesto por dos flagelinas, FlaA y FlaB. FlaB se localiza en la base del flagelo,
mientras que la ms abundante FlaA, se encuentra en el exterior. La eliminacin de
ambas flagelinas d como resultado la prdida de la movilidad, que sin embargo
conservan una capacidad de adherencia similar a la de tipo silvestre. Adems la
morfologa espiral o helicoidal facilita la movilidad en la viscosidad del moco
gstrico, y la bacteria produce una proteasa que digiere el moco facilitando su avance.
- ADHESINAS: H. pylori se une a las clulas receptoras del husped, estas
son clulas epiteliales gstricas, a las que se une de una forma especfica mediante un
elevado nmero de adhesinas utilizando mltiples receptores. Entre ellos hay
glicerofosfolpidos, sulftidos, componentes de la matriz extracelular y secuencias
repetidas de N-acetil-lactosamina o de glicoconjugados. Una sola clase de anticuerpos
no inhibe por completo la adhesin de la bacteria a las clulas, por lo que se considera
que la adherencia de H. pylori se realiza a travs de mltiples adhesinas y receptores al
mismo tiempo (Beswick 2006).
x HpaA (Helicobacter pylori adhesin A): la protena HpaA es una
de las principales protenas de la membrana externa de H. pylori y, al igual que
-
Introduccin.
12
muchas de ellas acta como adhesina. HpaA media la unin a glicoconjugados con
acido silido (N-acetil-neuraminil-lactosa) presentes en la superficie de las clulas
epiteliales gstricas y en la de los neutrfilos. Est codificada por el gen hpaA. Es un
antgeno de membrana que es reconocido por los anticuerpos humanos por lo que
puede ser usado en los ensayos serolgicos y para las vacunas. Se ha visto que es
reconocida por las clulas presentadoras de antgeno humanas estimulando la
proliferacin de los linfocitos T y B (Nvstrm 2007).
x BabA (blood antigen binding adhesion): los antgenos de Lewis
son antgenos fucosilados de grupo sanguneo (Wirth 1999). Son expresados, adems
de por los eritrocitos, por clulas epiteliales humanas. H. pylori se une con la adhesina
BabA a las clulas epiteliales gstricas a travs de los antgenos de Lewis (Wirth
2006). Esta codificada por los genes babA1 y babA2, aunque solo el gen babA2 es
funcionalmente activo. La sntesis de BabA puede ser regulada para adaptarse a las
condiciones medioambientales.
Se ha comprobado cmo la unin de H. pylori al receptor gstrico de Lewis
promueve una respuesta inmune no especfica y el desarrollo de autoanticuerpos
frente a las clulas productoras de cido, lo que contribuye a la gastritis crnica y a la
prdida de clulas parietales. Adems, la adherencia mediada por BabA participa en
la distribucin de los factores de virulencia que daan al tejido del hospedador,
pudiendo llevar al desarrollo de ulcera y cncer gstrico (Olfat 2005).
-
Introduccin.
13
x SabA (sialic acid binding adhesion): se une a los receptores con el
cido silico de los neutrfilos y origina la activacin de su respuesta oxidativa
(Unemo 2005).
x OipA (outer membrane inflammatory protein): todas las cepas
poseen el gen que codifica para esta adhesina, pero slo algunas la expresan. Su
expresin est asociada a una mayor produccin de IL-8, aunque no se sabe cual es su
contribucin real a la inflamacin gstrica puesto que suele estar asociada a las cepas
cagA + (Yamoka 2008).
1.2.2 Factores de patogenicidad que contribuyen al dao de la mucosa gstrica.
- VacA (vacuolating citotoxin): la protena VacA es una toxina codificada por el
gen vacA, que induce vacuolizacin en las clulas epiteliales, la muerte celular y la
destruccin de la integridad epitelial. Posee una estructura hexamrica y se ensambla
en la bicapa lipdica celular del hospedador formando un canal selectivo de aniones.
Produce un gradiente de pH que atrae sustancias alcalinas al interior haciendo que se
capte agua por smosis, lo que origina una vacuolizacin alrededor del ncleo y ms
tarde el estallido y muerte celular. En el citosol interfiere con el trfico vesicular de
los lisosomas. Es producida por aproximadamente el 50% de las cepas de H. pylori.
La infeccin por cepas que producen la toxina es ms frecuente en pacientes con
lcera peptdica y cncer gstrico que en pacientes que slo padecen gastritis
(Yamazadi 2005). Otros estudios no encuentran esta relacin, y una posible
-
Introduccin.
14
explicacin es que el gen vacA tiene una estructura mosaico con varias formas
posibles de presentacin. Cuatro en la secuencia seal, que son s1a, s1b, s1c y s2 y
tres en la regin media, m1, m2a y m2b. De la combinacin de stos podran
generarse distintos genotipos que podran tener comportamientos ms o menos
agresivos (Yang 1998, Rudi 1998). As las cepas s1/m1 son ms citotxicas que las
s1/m2. VacA se une a receptores tioprotenas tirosin-fosfatasa (RPTP) y la
glicosidacin postraslacional de los dominios RPTP pueden implicar diferentes
respuestas celulares a las cepas m1 vacA o m2 vacA. Recientemente ha sido descrita
una nueva regin en el gen vacA que es la regin intermedia, como se puede ver en la
figura adjunta (Rhead 2007). Tiene varias posibles formas de presentacin, i1 e i2.
Las cepas con la presentacin i1 son ms citotxicas y se encuentran ms asociadas
con la estructura allica s1m1. Mientras que las cepas i2 se encuentran ms
relacionadas con las cepas con la combinacin allica s2m2 y que suelen presentar un
mejor pronstico.
Figura 1. Presentacin esquemtica del gen vacA de Helicobacter pylori.
-
Introduccin.
15
VacA puede llevar a la muerte programada, de forma independiente a la
vacuolizacin, pues induce la liberacin de citocromo C de las mitocondrias a travs
de la activacin de protenas proapoptticas Bax y Bak. Tambin puede participar en
el proceso de la apoptsis a travs de la activacin del receptor Fas/CD95, a travs de
diversas caspasas y de la ruptura de la membrana mitocondrial que, al afectar a la
concentracin de ATP celular, altera el ciclo celular.
La presencia de vacA puede inducir la expresin de factor de crecimiento
vascular endotelial (VEGF) y provocar el desarrollo de procesos tumorgnicos. El
VEGF est implicado en la neoangiognesis va el sistema TLR2/TLR9 y se
encuentra sobreexpresado en distinto grado en carcinomas humanos dependiendo del
tipo de cepa bacteriana, lo que podra explicar en parte el distinto potencial
patognico. Adems, VacA amplifica la respuesta inflamatoria de la mucosa gstrica
aumentando la expresin de ciclooxigenasa 2, en las clulas T, neutrfilos y
macrfagos, que a su vez pueden activar la produccin del factor de crecimiento
vascular endotelial y provocar el desarrollo de procesos tumorgnicos. Aunque no
estn perfectamente definidos los mecanismos por los que la respuesta inmune
inducida por H. pylori contribuye a la carcinognesis gstrica, la sobreexpresin de
COX-2 y VEGF, la activacin de NF- y el aumento de citoquinas proinflamatorias
originan alteraciones morfolgicas que llevan al desarrollo de gastritis atrficas y
metaplasia gastrointestinal (Rudnicka 2004). Tambin est implicada en la alteracin
de las funciones mediadas por integrinas al interactuar con la fibronectina y la
modulacin de la respuesta inmunitaria de granulocitos, monocitos y clulas B y T,
ya que inhibe la presentacin de antgenos y la proliferacin de clulas T. Por otro
-
Introduccin.
16
lado interrumpe la maduracin de los fagosomas en los macrfagos, por lo que la
bacteria sobrevive dentro de los mismos (Atherton 1997).
- CagA (cytotoxin-associated gene A): la presencia del gen cagA se asocia ms con
sntomas graves, como la gastritis severa, la atrofia de la mucosa, alto riesgo de lcera
y cncer gstrico (Chromvarin 2008). De hecho las cepas procedentes de pacientes
con lcera, son cagA positivas en un porcentaje mayor que las cepas procedentes de
pacientes con gastritis (Erzin 2006, Chiarini 2009). Pero, igual que ocurre con el resto
de factores de virulencia, en muchas ocasiones no hay asociacin entre el genotipo de
cagA y el estado clnico. Forma parte de la isla de patogenicidad Cag (cagPAI). Las
islas de patogenicidad son segmentos de DNA que contienen mas de un gen de
virulencia con la peculiaridad de que una simple deleccin lleva a la prdida de al
menos dos genes de virulencia con segmentos de DNA de ms de 30 Kb. Tienen un
papel fundamental en la contribucin a la virulencia de las bacterias patgenas que
los contienen y en el desarrollo de la enfermedad. En el caso de la isla de
patogenicidad de H. pylori (CagPAI), tiene un tamao de 37 a 40 kb y est
flanqueada por secuencias repetidas directas (direct repeats) de 31 pb. Su contenido
G + C es del 35% en contraste con el 39% del cuerpo del genoma. Como muchos
genes de virulencia los genes de la cagPAI no se expresan constitutivamente, sino que
responden a seales ambientales. Estn reguladas por complejos mecanismos que
pueden activarse o no dependiendo de condiciones microambientales como el nivel
de oxgeno, la osmoralidad, la fase de crecimiento bacteriano, el pH, presencia o no
de cidos grasos voltiles de cadena corta, etc (Blaser 1995).
-
Introduccin.
17
La cagPAI H. pylori codifica un sistema de secrecin de protenas tipo IV que
inyecta CagA y peptidoglicanos en las clulas epiteliales del hospedador. La
translocacin de cagA depende de la presencia de un canal de urea protn
dependiente UreI. Ante un descenso de pH, cagA se mueve del centro a la porcin
perifrica del citoplasma. La protena inyectada interacta con un nmero elevado de
molculas de la clula hospedadora.
La diana molecular de CagA ms estudiada es una fosfatasa SHP-2 (protena
tyrosine phospatase). En el gen que codifica esta protena se han encontrado
mutaciones y polimorfismos que estn relacionadas con la carcinognesis gstrica.
La propia activacin de SHP-2 por CagA puede contribuir a la proliferacin celular
excesiva. Adems, los cambios que se producen en la expresin gnica en las clulas
epiteliales tras la infeccin por H. pylori suelen ser dependientes de este sistema de
secrecin codificado por la cagPAI.
CagA puede variar de tamao entre las distintas cepas de H. pylori. Esta
variacin proviene de la presencia de un nmero de repeticiones de una secuencia
aminoacdica del extremo carboxilo-terminal y puede influir en la patogenicidad de
las distintas cepas cagA+ debido a que la variacin en el numero de sitios de
fosforilacin implica una distinta efectividad en su unin a SHP-2, y por tanto una
distinta activacin. La secuencia aminoacdica que se repite es GLU-PRO-ILE-TYR-
ALA denominada EPIYA motif. De acuerdo con la secuencia de aminocidos que
flanquea esta secuencia de GLU-PRO-ILE-TYR-ALA, los EPIYA reciben diferente
nomenclatura: EPIYA-A, EPIYA-B, EPIYA-C y EPIYA-D. Hay estudios en los que
se encuentra que la protena CagA que contiene EPIYA-A y EPIYA-B, seguidas por
-
Introduccin.
18
repeticiones de EPIYA-C es ms frecuente en cepas de H. pylori aisladas de pacientes
occidentales, mientras que el EPIYA-D lo es en cepas aisladas en pacientes asiticos
(Panayotopoulou 2006).
Hay una correlacin entre la integridad de cagPAI y la gravedad de la
enfermedad, ya que mutaciones puntuales llevan a la prdida del sistema de secrecin
tipo IV por lo que no se puede translocar la protena CagA. La protena CagA
translocada aumenta la produccin de IL-8. As mismo, los productos de la cagPAI
estn asociados con un aumento de la produccin de otras citoquinas como la IL-1b,
TNF- y del factor nuclear de transcripcin NF. Varios estudios han revelado que
el cagPAI puede presentarse como una nica unidad no interrumpida, separndose en
dos regiones por una secuencia o un fragmento cromosmico o bien presentarse
parcialmente deleccionado. Tambin se ha visto que la variabilidad de los EPIYA
motifs juega un papel importante en la patognesis producida por H. pylori. Las cepas
cagA positivas y con nmero elevado de EPIYA motifs han sido relacionadas con un
aumento de gastritis crnica y atrofia (Doyle 2001).
La deteccin del estado cagA se puede realizar de forma directa mediante la
realizacin de una PCR al DNA de la cepa a estudiar o de forma indirecta, mediante
serologa. Mediante la PCR se puede detectar el gen cagA, que es un marcador de la
isla de patogenicidad (Cerezo 2006). La mayora de estudios moleculares han
determinado el estatus cagA mediante la presencia o ausencia con primers especficos
o sondas para este gen. As pues, en realidad, la identificacin de cepas cagA
-
Introduccin.
19
negativas se ha realizado de forma indirecta (la ausencia de amplificacin) (Sicinschi
2003).
Esto tiene el riesgo de que se produzcan falsos negativos. Adems las cepas cagA
negativas no se detectaran en caso de que existan infecciones mixtas.
Por esto se han desarrollado detecciones directas para identificar las cepas de
Helicobacter pylori que poseen la cagPAI. En las cepas cagA positivas, la cagPAI
est flanqueada por dos secuencias de 31 bp. Sin embargo en las cepas cagA
negativas esta misma secuencia slo se encuentra presente en una copia. Usando
primers de los sitios de insercin que flanquean la cagPAI se amplificar un
fragmento de las cepas que no poseen la isla de patogenicidad.
Figura 2:
A. La figura muestra la isla de patogenicidad (PAI) en las cepas cagA positivas. La
isla de patogenicidad est flanqueada por dos unidades repetidas de 31 pares de bases,
y solamente se presenta una de estas unidades repetidas en las cepas cagA negativas.
B. Se muestra la regin empty-site en todas las cepas cagA negativas (Sicinschi
2003).
-
Introduccin.
20
Mediante mtodos serolgicos se intentan detectar en el suero del paciente los
anticuerpos especficos anti-CagA, puesto que la protena CagA es altamente
inmunognica. Se ha observado que ms del 95 % de los pacientes infectados con
cepas cagA positivas desarrollan respuesta inmunolgica detectable frente a cagA.
Los estudios se llevan a cabo mediante la realizacin de un ELISA o Western Blot
(Lpez-Brea 1998). Pero es un mtodo que actualmente presenta resultados con
muchas discrepancias. stas se han intentado explicar por distintos motivos:
posibilidad de infecciones mixtas; falsos positivos; que la protena CagA no se
expone lo suficiente al sistema inmune del paciente porque la cepa que le infecta
desarrolla un sistema secretor defectuoso; variabilidad de la protena CagA o que la
respuesta inmunolgica no se produzca de forma detectable por estar obstaculizada
por factores del hospedador.
1.2.3 Otros factores:
-LPS (lipopolisacrido): el LPS de H. pylori como el de otras especies
bacterianas, presenta una estructura de tres dominios principales: la capa
polisacrida externa o cadena especfica O, el ncleo oligosacrido y el lpido A.
La estructura qumica del LPS de H. pylori, en concreto la cadena especfica O,
puede mimetizar los antgenos de grupo sanguneo de Lewis. Cuando esto sucede,
se dice que son cepas que expresan los antgenos de Lewis. La expresin est
asociada a patologas ms severas. Algunos estudios muestran que cepas de H.
pylori cagA+ los expresan ms frecuentemente.
-
Introduccin.
21
El LPS de H. pylori es bastante inerte comparado con el de otras bacterias gram-
negativas, y puede explicar la capacidad que tiene el microorganismo para evitar
provocar una respuesta inmunolgica eficaz del husped. No estimula la
produccin de IL-8 en cultivos celulares epiteliales sino slo y ligeramente en
monocitos. Al inducir una baja respuesta inmunolgica, la infeccin por H. pylori
puede persistir durante ms tiempo que aqullas causadas por bacterias ms
agresivas, produciendo una infeccin crnica. Un caso similar se observa con
Bacteroides fragilis que produce un LPS con una estructura parecida al de H.
pylori y tambin baja inmunogenicidad. El LPS de H. pylori puede afectar a la
integridad de la mucosa mediante la modulacin de la actividad del pepsingeno I
en el estmago. La pepsina, enzima proteoltica, posee una alta capacidad
mucoltica y puede ayudar a inducir ulceracin duodenal. Se ha comprobado que
los niveles de pepsingeno gstrico se correlacionan con los niveles de
pepsingeno I srico (componente endocrino del pepsingeno secretado por las
clulas principales). Adems los niveles de pepsingeno I caen tras la
erradicacin de H. pylori (Salaun 2006).
- Tip (TNF- inducing protein): Las protenas Tip tienen una potente actividad
carcinognica a travs de la induccin de TNF- y la activacin de NF-k.
Promueven la inflamacin del cncer (Suganuma 2006).
-
Introduccin.
22
1. 3 CLNICA DE LA INFECCIN CAUSADA POR H. pylori.
Cuando H. pylori coloniza la mucosa gstrica humana produce una gastritis
superficial que puede permanecer as durante el resto de la vida o bien, al cabo de aos o
dcadas desarrollar una lcera pptica o una gastritis atrfica que podra ser el primer
paso para la evolucin a cncer gstrico (Marshall 1984, Figueiredo 2005). Todava no se
conoce claramente por qu en unos pacientes la enfermedad es casi asintomtica mientras
que en otros se producen enfermedades digestivas de diferente gravedad (Doorn 1997).
Parece que algunos factores genticos, ambientales o los factores de patogenicidad de la
propia bacteria pueden tener su efecto en el desarrollo de la enfermedad (Hcker 2003).
1.3.1 Manifestaciones digestivas.
- GASTRITIS: la gastritis que se origina despus de la infeccin por H.
pylori puede desarrollarse sin manifestaciones o bien originar la expresin clnica
propia de gastritis aguda (dolor epigstrico, nuseas y vmitos). La gastritis crnica se
caracteriza por infiltracin inflamatoria crnica, constituida por linfocitos y clulas
plasmticas, con presencia de folculos linfoides y un grado variable de actividad. La
gastritis crnica por H. pylori es un proceso dinmico que evoluciona hacia la atrofia
que afecta al antro y se extiende en direccin al cuerpo (Suerbaum 2002).
La colonizacin permanente de la mucosa gastroduodenal por H. pylori va a
causar una inflamacin con un infiltrado mixto en el que predominan los leucocitos
polimorfonucleares, pero tambin con linfocitos y clulas plasmticas, dando lugar a
-
Introduccin.
23
lo que se denomina gastritis crnica activa, como ya hemos dicho. Una de las
caractersticas de este infiltrado en la edad peditrica es la mayor presencia de
linfocitos y clulas plasmticas y una afectacin ms leve que la que tiene lugar en el
adulto, por lo que se denomina gastritis crnica superficial activa. La bacteria puede
ser identificada en biopsias gstricas mediante tincin de Giemsa y en presencia de
mucha cantidad de bacterias incluso con hematoxilina-eosina. Despus de la
erradicacin del microorganismo, la gastritis histolgica mejora lentamente pero no
desaparece totalmente hasta seis meses o un ao despus de la finalizacin del
tratamiento.
La sintomatologa asociada a la gastritis por H. pylori es muy variable. Puede
expresarse con un cuadro compatible con lo que se llama dispepsia no ulcerosa, que
se interpreta con sntomas como dolor en epigastrio o hemiabdomen superior,
sensacin de plenitud, nuseas y vmitos (Di Lorenzo 2005).
- LCERA PPTICA: la asociacin de H. pylori con la lcera duodenal
es clara, ya que un 90 - 95% de los pacientes presentan el microorganismo y se curan
en su gran mayora al erradicar la bacteria. Con respecto a la lcera gstrica, tambin
existe una clara relacin, aunque slo un 70% de este tipo de lceras est asociada a
la presencia de H. pylori, el resto se asocian al consumo de antiinflamatorios no
esteroideos. La lcera gstrica o duodenal relacionada con la infeccin por H. pylori
es muy poco frecuente en la edad peditrica respecto a lo que ocurre en el adulto.
Los pacientes con ulcus pueden expresar unos sntomas compatibles con lo que
se llama dispepsia ulcerosa tpica de la enfermedad ulcerosa pptica: epigastralga o
-
Introduccin.
24
dolor en hemiabodmen superior, que disminuye con la ingesta de alimentos y
anticidos. Es un dolor discontinuo que alterna con periodos de disminucin de
molestias, y que aumenta antes de las comidas. La sintomatologa ulcerosa puede
acompaarse de vmitos, anorexia, adelgazamiento y aunque con menos frecuencia la
lcera puede dar lugar a hemorragia digestiva.
- CNCER GSTRICO: la infeccin por H. pylori origina una gastritis
superficial y si se cronifica puede aparecer atrofia, que es una condicin
precancerosa. En 1994 la Agencia Internacional para la Investigacin en Cncer de la
Organizacin Mundial de la Salud incluy a H. pylori como agente biolgico
carcinognico para el hombre (categora 1) basndose en evidencias epidemiolgicas
que le asocian con cncer gstrico (Trajkow 2007).
- LINFOMA GSTRICO TIPO MALT: el 90% de los pacientes con
linfoma MALT son positivos para H. pylori. Este tipo de linfoma se localiza
preferentemente en el antro del estmago, dado que es la zona donde existe ms
tejido linfoide. Adems, varios estudios apoyan la asociacin de H. pylori con esta
enfermedad puesto que tras la erradicacin de la bacteria se ha observado la regresin
del linfoma de bajo grado (Toshiro 2004).
-
Introduccin.
25
1.3.2 Manifestaciones extradigestivas.
Muchas publicaciones han relacionado la infeccin por H. pylori con una
variedad de manifestaciones clnicas extradigestivas (sndrome de muerte sbita del
lactante, enfermedad coronaria, colangitis esclerosante primaria) sin que se haya
podido demostrar la causa (Prelipcean 2007). Sin embargo si se han demostrado
diferentes grados de evidencia que sustentan la relacin de la infeccin por H. pylori,
como:
- anemia ferropnica refractaria: diversos trabajos han demostrado una
asociacin entre la infeccin por H. pylori y la anemia ferropnica refractaria, en
especial en pacientes peditricos por poseer unos depsitos de hierro bajos
(Marignani 1997, Yakota 2008). No est claro si se trata de un incremento en las
prdidas de hierro o de una disminucin de la absorcin, pero lo que si es cierto es
que la erradicacin del germen permite la normalizacin de las cifras de sideremia y
de los valores de ferritina en determinados pacientes con anemia ferropnica
refractaria portadores de una gastritis por H. pylori.
Hay diferentes hiptesis para explicar la asociacin de H. pylori con la anemia. La
anemia podra estar en relacin con prdidas microscpicas de sangre debidas a la
gastritis crnica superficial activa o a una absorcin duodenal de hierro disminuida
que podra explicar el menor aporte de hierro y por tanto, una mayor demanda del
mismo. La hipo acidez secundaria a la gastritis y el bajo nivel de cido ascrbico en
el estmago de estos nios sera la causa de la disminucin de la absorcin. Otra
posible explicacin podra ser el incremento del secuestro del hierro por la
lactoferrina (protena ligadora de hierro) cuyos niveles en la mucosa gstrica de los
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Introduccin.
26
pacientes infectados por H. pylori estn elevados. Dado que H. pylori posee mltiples
sistemas de adquisicin de hierro, que le permite tomarlo del hierro disponible en el
microambiente de la luz gstrica, otra de las teoras de la ferropenia es la propia
competencia por el hierro entre la bacteria y el husped infectado.
- Prpura trombocitopnica idioptica: recientemente se ha observado que
algunos pacientes con prpura trombocitopnica idioptica crnica han respondido a
la erradicacin de H. pylori con un incremento del nmero de plaquetas (Emilia 2007).
La explicacin biolgica de esta posible asociacin es la similitud de los anticuerpos
plaquetarios del suero con la citosina asociada al gen cagA del H. pylori.
- Retraso en el crecimiento: en la segunda mitad de la dcada de los 90 se
publicaron varios trabajos en los que se encontraron una relacin significativa entre la
infeccin y el retraso de la talla de nios y adolescentes, postulndose que la infeccin
podra afectar al crecimiento (Cohem 1991). Estudios posteriores prospectivos, bien
diseados, no han encontrado ninguna evidencia del papel de H. pylori en relacin con
la talla y s con el status socioeconmico. Teniendo en cuenta que la prevalencia de la
enfermedad es mayor en nios de los pases en vas de desarrollo sometidos a un
mayor riesgo de episodios diarreicos e hiponutricin, la causa del retraso estructural de
estos nios infectados est ms en relacin con los frecuentes episodios diarreicos y el
dficit nutricional que con la colonizacin por H. pylori (Bruce 2008).
Otra de las posibles explicaciones podra ser la afectacin de la hormona
del crecimiento en los nios infectados. Es decir el efecto de la gastritis sobre las
-
Introduccin.
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hormonas que controlan el crecimiento. Recientemente se ha demostrado que el
estmago es una fuente de grelina y leptina, la colonizacin por H. pylori y la gastritis
producira un aumento de los niveles de leptina y una disminucin de los niveles de
grelina, lo que repercutira en el apetito, disminuyendo el aporte calrico y afectando
secundariamente a su ndice de masa corporal (Osawa 2008, Weigt 2009).
-Otras manifestaciones extradigestivas: se ha asociado la infeccin por H.
pylori con la aparacin de urticarias, al encontrarse ttulos elevados de anticuerpos
especficos tipo IgG frente a H. pylori en algunos casos de pacientes con urticaria
crnica (Cuevas 2006), pero tambin en otras situaciones como el asma o la
enfermedad inflamatoria intestinal.
1.4 EPIDEMIOLOGA DE LA INFECCIN POR H. pylori.
Aunque se estima que la infeccin por esta bacteria afecta aproximadamente al
50% de la poblacin mundial. Slo entre un 10% y un 15% de los individuos infectados
sufrirn ulcus peptdico y hasta un 1-3% desarrollarn cncer gstrico. Estas cifras
revelan la importancia de esta infeccin y justifican el inters despertado por el
conocimiento de su epidemiologa, factores ambientales de riesgo y forma de
transmisin.
Aunque no se conoce el modo definitivo de transmisin de la infeccin, se ha
postulado que sta puede ocurrir por la va gastro-oral, oral-oral y fecal-oral (Mladenova
2006). H. pylori se encuentra con frecuencia en el vmito de las personas infectadas. La
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Introduccin.
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saliva y las heces tambin pueden contener bacilos. Algunos autores apuntan a que la
transmisin persona a persona, especialmente en el ncleo familiar, constituye el
principal mecanismo de propagacin de la bacteria (Kivi 2006). Por otra parte pueden
existir diferencias entre pases desarrollados y en vas de desarrollo (Poddar 2007). En los
primeros el mecanismo de contagio ms frecuente podra ser por contacto interpersonal
directo va oral-oral, mientras que en los segundos predominara la ruta oral-fecal. La
falta de infraestructuras sanitarias, el hacinamiento, los bajos estndares socioeconmicos
y educativos se asocian con tasas ms elevadas de prevalencia y de reinfecciones (Ahuja
2002).
Existen dos patrones de seroprevalencia frente a H. pylori: el primero de ellos
incluye aquellas poblaciones con una elevada tasa de infeccin durante la infancia y el
segundo se caracteriza por un bajo nivel de seroprevalencia en la niez junto con un
incremento gradual en funcin de la edad. Estos patrones parecen reflejar una correlacin
inversa entre la situacin socioeconmica y el riesgo de infeccin. El primer patrn es
tpico de regiones del tercer mundo, mientras que el segundo corresponde a naciones
industrializadas (Bruce 2008).
En nuestro medio, la prevalencia en individuos sanos es alta, se sita en torno al
60 % (Snchez Ceballos 2006). En un estudio realizado en 2006 en una muestra de la
poblacin general residente en la Comunidad de Madrid, con edades comprendidas entre
los 4 y 82 aos, se comprob que los porcentajes de seroprevalencia se elevaron con la
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Introduccin.
29
edad, de forma que las personas mayores de 60 aos registraron un incremento de
prevalencia de H. pylori.
Ciertos factores dependientes tanto del microorganismo como del husped pueden
influir en la evolucin de esta infeccin hacia un estado crnico asintomtico o hacia el
desarrollo de manifestaciones clnicas. Por este motivo, los datos obtenidos a partir de los
trabajos de seroprevalencia, aunque sirven para clarificar la extensin de la infeccin,
deben interpretarse con cautela. En ocasiones se dan aparentes contradicciones entre los
niveles de prevalencia y la incidencia real de la enfermedad. ste es el caso de los
denominados enigmas africano y asitico.
En frica, pese a los elevados niveles de la infeccin en individuos de todas las
edades, las tasas de cncer gstrico permanecen muy bajas. Para explicar esta cuestin se
han postulados factores relacionados con la virulencia variable de diferentes cepas, el
polimorfismo gentico humano y el tipo de dieta (Graham 2009).
En Asia la infeccin es ms frecuente y se contrae ms tempranamente en pases
poco desarrollados como la India, Bangladesh, Pakistn o Tailandia (con niveles de
seroprevalencia en adultos entre el 55 y el 92%). Sin embargo otras naciones como China
o Japn, con cifras inferiores de serologa en adultos, presenta mayores tasas de cncer
gstrico. Una posible justificacin para estos hechos vendra dada por diferencias en la
virulencia de las cepas. Mientras que en Japn casi la totalidad de los pacientes
infectados lo estn por cepas cagA positivas, en naciones occidentales una considerable
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Introduccin.
30
proporcin de casos estn originados por cepas cagA negativas. Los pacientes que sufren
cuadros menos graves (gastritis, lcera duodenal o gstrica) como los que presentan
cuadros malignos pueden albergar cepas cagA positivas. Sin embargo esto tambin ha
sido cuestionado. En Asia se ha documentado la existencia de dos subtipos de cepas cagA
positivas denominado variante asitica Este y variante asitica Oeste. La variante cagA
positiva asitica Este (circula mayoritariamente de forma endmica en pases con
mayores tasas de cncer gstrico) se asocia con mayores grados de inflamacin y atrofia
de la mucosa gstrica y por tanto con el desarrollo de formas clnicas de peor pronstico.
1.5 MTODOS DIAGNSTICOS PARA LA DETECCIN DE LA
INFECCIN POR H. pylori.
La infeccin por H. pylori puede diagnosticarse mediante mtodos invasivos (que
requieren la realizacin de endoscopia con toma de biopsia gstrica) o no invasivos
(mtodos para los que no se requiere realizacin de endoscopia). Un mtodo diagnstico
ideal sera uno no invasivo o mnimamente invasivo, no caro, seguro, disponible en todos
los centros y que sea capaz de diferenciar infeccin activa de pasada. Ninguno de los
mtodos que existen en la actualidad cumple todas estas caractersticas. Todos los
mtodos presentan ventajas e inconvenientes. A la hora de elegir uno hay que tener en
cuenta el fin (epidemiolgico, diagnstico o de seguimiento), el centro sanitario dnde se
realice el diagnstico y las caractersticas del paciente (Lpez-Brea 2004, Steven 2005).
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Introduccin.
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1.5.1 Mtodos invasivos.
La endoscopia con toma de biopsia para el estudio histolgico permitir no slo
diagnosticar la infeccin mediante el cultivo de dicha biopsia, sino que tambin el cultivo
es imprescindible para poder conocer la sensibilidad a los antimicrobianos, con el fin de
aplicar el tratamiento ms efectivo en cada paciente y para conocer los porcentajes de
sensibilidad en cada poblacin.
- CULTIVO: durante el transporte la biopsia debe protegerse de la deshidratacin
y mantenerse a baja temperatura. Se recomienda guardar las muestras a 4 C si se
van a procesar dentro de las primeras 4 horas o congelar a -70 C en caso de que
se demore ms tiempo. Los medios de transporte ms utilizados son: solucin de
glucosa al 20 % y suero fisiolgico. Algn estudio indica que mejor que el
transporte en medio salino es sembrar directamente la biopsia en agar chocolate o
en el sistema de transporte Portagerm pylori. El cultivo es considerado el mtodo
de referencia (patrn oro) para el diagnstico de la infeccin por H. pylori. La
principal ventaja que posee este mtodo es que puede estudiar la sensibilidad de
las cepas a los distintos agentes antimicrobianos. El hecho de tener la cepa nos
permitir la realizacin de distintos estudios como puede ser el conocer los
factores de virulencia o el poder tipar las cepas. Como desventaja cabe destacar
que es un mtodo lento de diagnstico que puede demorarse varios das y que la
sensibilidad de la tcnica depende de la experiencia en su cultivo y de que la toma
y el transporte se realicen en las condiciones adecuadas. La identificacin se
realiza mediante visin en fresco con un microscopio de contraste de fases para
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Introduccin.
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ver la morfologa o bien mediante tincin de Gram. Las pruebas positivas de
catalasa, ureasa y oxidasa confirman la identificacin. La muestra ms habitual
para el cultivo es una biopsia a partir de mucosa gstrica.
- HISTOLOGA: el estudio histolgico de la biopsia permite conocer las lesiones
de la mucosa adems de detectar la infeccin por H. pylori. La confirmacin
histolgica de la inflamacin de la mucosa es fundamental para el diagnstico de
la gastritis y su clasificacin. Adems permite detectar zonas de metaplasia
intestinal. La tcnica de tincin es fcil, rpida, de bajo coste y de alta utilidad. Se
han utilizado diferentes tinciones como la de Gram, Giemsa, Carbolfuchina,
Genta o tinciones inmunohistoqumicas. La visin microscpica tiene una
sensibilidad y especificidad menor que la del cultivo.
- UREASA: la prueba de la ureasa permite detectar la presencia de la
descomposicin de la urea en anhdrido carbnico y amoniaco, que se demuestra
mediante un cambio de color en el medio que contiene un indicador de pH. La
prueba de la ureasa rpida se puede realizar directamente con la muestra de
biopsia gstrica. Existen diferentes reactivos comerciales que contienen urea a
diferentes concentraciones y un indicador de pH. Los resultados de sensibilidad y
especificidad son en general superiores al 80% y 90%. La seguridad diagnstica
de la prueba depender de la localizacin de la biopsia utilizada, de la carga
bacteriana y del tratamiento previo con antibiticos o con inhibidores de la bomba
de protones.
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Introduccin.
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- PCR: una de las ventajas que tiene es que no requiere condiciones de transporte
tan estrictas. Permite utilizar el DNA para distintos estudios aparte del diagnstico
de la infeccin. Algunos estudios la encuentran igual de sensible que el cultivo a
partir de biopsia gstrica. Actualmente se est utilizando la PCR a tiempo real que
adems permite la deteccin de cepas resistentes a antibiticos. En los ltimos
aos se han desarrollado numerosas tcnicas que permiten detectar la presencia
del DNA de H. pylori directamente de la biopsia gstrica pero tambin de otras
muestras como heces, saliva o agua (Simala-Grant 2004). La mayora de las
tcnicas se basan en la PCR, tanto clsica como a tiempo real. El objetivo ha sido
el siguiente:
- deteccin de genes especficos de la bacteria: se han utilizado diversos
protocolos como el estudio del gen de la ureasa, el gen de la glutamato racemasa
(glmA) o el gen 16S RNAr, entre otros (Woo 2009).
- deteccin de factores de virulencia: se pueden detectar la presencia de
diferentes factores de virulencia, como los tipos del gen vacA (Chisholm 2002,
Yamazaki 2005).
- deteccin de mecanismos de resistencia: la PCR, tanto clsica como en
tiempo real, se ha utilizado con xito para detectar la resistencia a claritromicina,
puesto que son capaces de detectar mutaciones puntuales en el gen 23S RNAr,
que confieren resistencia a este antimicrobiano. Tambin se ha aplicado la PCR
en tiempo real para detectar la resistencia a tetraciclina debida a mutaciones en el
16S DNAr en biopsias gstricas (Stone 1997, Doorn 2001, Owen 2002, Alarcn
2003).
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Introduccin.
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- como mtodos de tipado: para comparar aislamientos de H. pylori
cultivados del mismo paciente o de familiares (Achtman 1999).
- HIBRIDACIN IN SITU: la infeccin puede ser diagnosticada mediante sondas
de hibridacin fluorescentes (FISH: fluorescent in situ hybrizazion) utilizadas en
biopsia gstrica (in situ) que se unen al 16S RNAr de H. pylori. Tambin se puede
detectar la resistencia a claritromicina si estas sondas se unen al 23S RNAr. Esta
tcnica se puede realizar en aproximadamente tres horas (Caristo 2008).
1.5.2 Mtodos no invasivos.
El mtodo ideal para diagnosticar la infeccin sera uno no invasivo o
mnimamente invasivo, capaz de diferenciar infeccin activa de infeccin pasada. Los
mtodos desarrollados hasta ahora pueden tener utilidad en determinadas
circunstancias, como la evaluacin del seguimiento del tratamiento o estudios
epidemiolgicos.
- SEROLOGA: los mtodos serolgicos se basan en la deteccin de anticuerpos
especficos frente a H. pylori en suero. La serologa es til en los estudios de
poblaciones seleccionadas, sin embargo, su principal problema radica en que no
puede diferenciar la infeccin activa de la exposicin previa al microorganismo.
H. pylori provoca una respuesta inmunitaria, tanto local como sistmica. El
sistema inmune responde con un aumento transitorio de IgM, seguido de un
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Introduccin.
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aumento de anticuerpos de los tipos IgG e IgA que persisten durante la infeccin.
Puesto que los anticuerpos IgM se detectan slo transitoriamente, tienen poco
valor para el diagnstico. La principal respuesta sistmica es de tipo IgG por lo
que la deteccin de estos anticuerpos es la ms utilizada para el diagnstico. La
deteccin de anticuerpos especficos contra algunas protenas del
microorganismo, como CagA y VacA puede tener especial inters en estudios
sobre virulencia. Puesto que la deteccin de anticuerpos depende del antgeno
utilizado, considerando la heterogeneidad gentica de H. pylori, algunos autores
recomiendan el uso de mezclas de antgenos procedentes de varias cepas para
mejorar la sensibilidad de estas tcnicas as como su valoracin en cada medio. Se
han utilizado varias clases de antgenos, que van desde antgenos parcial o
altamente purificados (ureasa, etc.). La tcnica ms utilizada es EIA cuantitativo,
que permite, adems del diagnstico primario, la monitorizacin del tratamiento.
Los mtodos basados en la tcnica del Western Blot se utilizan para el estudio de
la respuesta frente a antgenos concretos, como CagA y VacA (Lpez-Brea 1998).
- TEST DE SANGRE COMPLETA: es un inmunoensayo indirecto realizado en
fase slida. Existen tiras comercializadas de fcil uso (Pyoriset, AccuStat)
Se detectan anticuerpos IgG frente a Helicobacter pylori presentes en la sangre.
En la misma consulta se puede obtener una gota de sangre del paciente. Se ha
visto que al aumentar el tiempo de lectura 10 minutos a 6 horas aumenta la
sensibilidad de la prueba. Este test no se recomienda actualmente.
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Introduccin.
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- DETECCIN DE ANTICUERPOS EN ORINA: es una inmunocromatografa
en fase slida que tambin detecta IgG frente a H. pylori. Diversos estudios
informan de una buena sensibilidad y especificidad. Aunque habra que tener
cuidado con aqullas orinas con sedimentos anormales. Este test, al igual que el
anterior, tampoco est recomendado.
- DETECCIN DE ANTICUERPOS EN SALIVA: aunque debido a la
comodidad de la obtencin de la muestra se ha esperado mucho de esta tcnica,
los datos de sensibilidad obtenidos, que rondan el 80 %, no permiten ser
optimistas respecto a su implantacin.
- PRUEBA DEL ALIENTO (Urea Breath Test: UBT): es el mtodo indirecto
para detectar la ureasa de H. pylori. Si H. pylori se encuentra en el estmago va a
hidrolizar la urea ingerida previamente y se va a liberar CO2 marcado que se
absorbe, difunde a sangre, es transportado a los pulmones y es liberado con el
aliento. Se considera uno de los mtodos no invasivos ms seguros para detectar
H. pylori. La prueba del aliento indica una infeccin actual por la bacteria, ya que
en una infeccin pasada el resultado sera negativo. Por esto es til como
seguimiento del tratamiento realizado 4 a 6 semanas despus de finalizado.
- ANTGENO EN HECES: es un mtodo directo no invasivo que permite la
deteccin de antgeno de H. pylori en muestras de heces. Existen varios sistemas
comerciales que permiten detectar la presencia de antgeno en heces con
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Introduccin.
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anticuerpos policlonales o monoclonales. Pueden existir pequeas diferencias
entre ellos, habindose obtenido mejores resultados con los anticuerpos
monoclonales. Se ha descrito como vlida para establecer el diagnstico inicial,
verificar la eficacia del tratamiento en las cuatro o seis semanas posteriores a su
realizacin y comprobar la reaparicin de una infeccin. Se trata de un ensayo
cualitativo. La tcnica aporta una informacin muy valiosa por la fcil obtencin
y la conservacin de la muestras, se puede realizar en cualquier laboratorio de
microbiologa y no necesita la colaboracin del paciente. Es muy til para nios
pequeos (Andrews 2001, Falsafi 2005, Raguza 2005, Shaikh 2005).
1.6 TRATAMIENTO DE LA INFECCIN POR H. pylori.
En los ltimos aos se han realizado diferentes reuniones de consenso sobre la
infeccin por H. pylori. Entre ellas destacan la del Instituto Nacional de Salud de EE.UU.
por ser el primero que recomend el tratamiento erradicador en pacientes infectados por
H. pylori y lcera duodenal, pero tambin las que se realizaron en Canad en 1997 y
1999, el Consenso Asitico (Asia Pacific Consensus Conference, 1999), el Consenso
Latino-americano (2000), el Consenso Europeo (Europeo: Maastrich Consensus, 1997 y
2005) y el Consenso Espaol (1999).
El Consenso de Maastrich del ao 2005 considera que existe una indicacin clara
de tratamiento en caso de:
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Introduccin.
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enfermedad ulcerosa pptidica: duodenal activa o cicatrizada,
gstrica o complicada.
linfoma MALT de bajo grado.
gastritis atrfica.
reseccin despus de cncer gstrico.
El consenso Espaol realizado en 1999 recomienda tambin tratamiento en la
duodenitis erosiva y el de Maastrich considera una indicacin clara para diagnosticar y
tratar:
x los familiares de primer grado de pacientes con cncer gstrico.
x por deseo del paciente.
x sera una posible indicacin: dispepsia funcional, enfermedad por reflujo
gastroesofgico o los pacientes que toman AINEs.
1.6.1 Pautas de tratamiento.
Las pautas de tratamiento para erradicar H. pylori combinan 2 3
antimicrobianos junto con un compuesto anti-ulceroso, que permite modificar el pH para
que acte el antibitico. La duracin de la terapia habitual ha sido de 7 a 10 das, aunque
algunos autores han probado pautas cortas, de 3 a 5 das que incluyen 3 antibiticos y
otros recomiendan pautas largas, de ms de 10 das. Antes de iniciar una pauta de
tratamiento se debe considerar el porcentaje de resistencia a los antimicrobianos en esa
poblacin o rea geogrfica (Oderda 2007). Se recomienda la pauta de tratamiento triple
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Introduccin.
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con un inhibidor de la bomba de protones y dos antimicrobianos como primera opcin. Si
este tratamiento falla, se debe evitar repetir dos veces el mismo tratamiento y se
recomienda realizar estudios microbiolgicos (Alarcn 2000, Mgraud 2004).
El consenso de Maastricht III recomienda una bomba inhibidora de protones o
ranitidina con dos antibiticos de los siguientes: claritromicina, metronidazol o
amoxicilina (Malfertheiner 2007).
1.6.2 Anticidos utilizados para erradicar H. pylori.
COMPUESTOS DE BISMUTO: citrato de bismuto coloidal y salicilato de
bismuto. Actan como citoprotectores. Aumentan la produccin de moco y
prostaglandinas por la mucosa gstrica. Adems, evitan la unin de H. pylori a la
superficie de la mucosa gstrica y destruyen la integridad de la pared bacteriana. Pero se
desconoce con certeza el mecanismo de accin de estos compuestos (McColl 1998)..
FRMACOS ANTAGONISTAS DE LOS RECEPTORES DE
HISTAMINA: cimetidina, famotidina, nizatidina, roxatidina, ebrotidina, ranitidina y
ranitidina citrato de bismuto. Actan en la membrana basolateral de la clula parietal
gstrica como antagonistas competitivos de la histidina sobre los receptores de histamina.
Reducen por tanto la secrecin cida tanto basal como la estimulada por gastrina,
histidina y agonistas muscarnicos.
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INHIBIDORES DE LA BOMBA DE PROTONES: omeprazol, lansoprazol,
pantoprazol, esomeprazol y rabeprazol. Actan en la clula parietal (membrana
subapical). Inhiben de forma reversible la enzima H-K ATPasa, bloqueando toda
secrecin de cido (Lins 1999, Laine 2000).
1.6.3 Antimicrobianos utilizados para erradicar H. pylori.
H. pylori es sensible a un gran nmero de antibiticos in vitro pero no todos
presentan eficacia in vivo. Los antimicrobianos que muestran eficacia clnica y que se
utilizan o se pueden utilizar en los tratamientos para erradicar la infeccin son los
siguientes:
AMOXICILINA: entre todos los betalactmicos ensayados in vitro slo
amoxicilina ha demostrado ser til en el tratamiento de la infeccin por H. pylori y se
utiliza en diferentes pautas de tratamiento asociado a metronidazol, tetraciclina o
claritromicina. Es el betalactmico ms estable en el medio cido y el que alcanza
mayores concentraciones en tejidos despus de una dosis oral. Los antibiticos
betalactmicos actan inhibiendo la formacin de la pared bacteriana de los
microorganismos. Se han descrito alteraciones de las PBPs, concretamente en el gen
pbp-1 A que se asocian con resistencia a este antimicrobiano. Adems de las
alteraciones en las PBPs, se ha sugerido que la reduccin de la permeabilidad o la
expulsin activa pueden contribuir a producir niveles ms altos de resistencia
(Rimbara 2007). En Europa, la resistencia a amoxicilina es muy baja, menor del 1%,
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Introduccin.
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han aparecido algunas cepas resistentes en Italia, Grecia, Dinamarca e Inglaterra. Pero
en otros pases, como en un estudio realizado en Irn, la resistencia a amoxicilina fue
del 56% (Raffeey 2007).
CLARITROMICINA: es el macrlido ms utilizado, que presenta una
excelente actividad in vitro frente a H. pylori y tiene modificaciones qumicas con
respecto a los macrlidos ms antiguos, que le confieren mayor estabilidad en medio
cido (Goldman 1994). Los macrlidos inhiben la sntesis de protenas mediante su
accin a nivel de los ribosomas bacterianos (Schlnzen 2001). Inhiben la sntesis
proteica mediante su unin reversible a la subunidad 50 S del ribosoma, lo cual
provoca un bloqueo en la transpeptidacin, un bloqueo en la translocacin y as se
impide la elongacin de la cadena peptdica. Emplea el mismo punto de unin que la
lincomicina y el cloranfenicol (Pfister 2005). El mecanismo de resistencia a
macrlidos observado en H. pylori y otras bacterias, como Mycoplasma pneumoniae y
micobacterias atpicas, es debido a una mutacin en la secuencia de la regin
peptidiltransferasa del RNA ribosmico 23S en la subunidad 50S (Verlasovic 1997,
Tait-Kamradt 2000, Garrido 2007). Las mutaciones ms frecuentemente encontradas
se producen en las posiciones 2058 y 2059 de E. coli que coinciden en H. pylori con
2142 y 2143, respectivamente. La mutacin ms frecuente en aislamientos clnicos es
la A2143G (prevalencia 53% a 95% segn los estudios), seguida de la mutacin
A2142G y en menor proporcin la mutacin A2142C. Otra mutacin que produce
resistencia a claritromicina y que ha sido descrita es en la posicin T2182C (Khan
2004, Burucoa 2005). Tambin se han descrito otras mutaciones, T2717C y A2515G,
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Introduccin.
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G2224A, C2245T, T2289C y C2611A que se asocian con resistencia a claritromicina
(Kim 2002, Hao 2004, Fontana 2002, Rimbara 2008, Kim 2008, Francesco 2009). En
los ltimos aos se ha observado un incremento de resistencia a claritromicina en
pases europeos como: Francia, Portugal, Turqua o Espaa, entre otros. En contraste,
en los pases nrdicos no se ha observado este incremento. Esta diferencia se debe
principalmente al consumo de los macrlidos. Claritromicina fue comercializada en
Espaa a principio de los aos 90, y ha sido muy utilizado para tratar enfermedades
del tracto respiratorio superior.
METRONIDAZOL: es un antimicrobiano ampliamente utilizado en el
tratamiento de la infeccin por H. pylori por conseguirse, junto con amoxicilina y
sales de bismuto, tasas muy altas de erradicacin (Lpez-Brea 1999). Metronidazol y
otros antibiticos nitroimidazlicos son activos despus de la reduccin del grupo
nitro unido al anillo imidazlico. Este proceso genera compuestos intermediarios de
vida corta y altamente txicos. El metronidazol tras ingresar en la clula mediante
difusin pasiva es qumicamente reducido por protenas del metabolismo anaerobio
(protenas de transporte de electrones de bajo potencial redox). Estas protenas son
exclusivas de algunos parsitos y de bacterias anaerobias y algunas microaerfilas. El
metronidazol reducido produce prdida de la estructura helicoidal del DNA, rotura de
la cadena e inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos y muerte celular. En H. pylori
se ha descrito una piruvato flavodoxina oxidorreductasa, que puede ser la protena
capaz de reducir el metronidazol y otros posibles aceptores de electrones, como
ferredoxina, flavodoxina, protena ferredoxina-like o NAD(P)H flavin nitrorreductasa.
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Introduccin.
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El mecanismo de resistencia a metronidazol es menos conocido pero parece ser que el
principal mecanismo es la inactivacin del gen rdx, que codifica para una
nitrorreductasa insensible al oxgeno (Jenks 1999). La inactivacin se puede producir
por una mutacin puntual que crea un codn de terminacin adicional, dando lugar a
una protena truncada o por la insercin de una secuencia IS605. Otros genes, como
frxA, fdxB, ribF o mdaB, pueden tener tambin implicacin en la resistencia (Know
2001, Marias 2003, Yang 2004, Matteo 2006, Kim 2009). La resistencia a
metronidazol est aumentando en los ltimos aos en Espaa y en el resto del mundo.
El porcentaje de resistencia es muy variable; en los pases subdesarrollados es mayor,
debido principalmente al alto consumo de este antibitico para tratar enfermedades
parasitarias e infecciones ginecolgicas (Albert 2006, Parsons 2001).
TETRACICLINA: la tetraciclina presenta buena actividad in vitro y ha
demostrado su utilidad en la prctica clnica, aunque su principal inconveniente es el
no poder utilizarse en enfermos peditricos. La tetraciclina atraviesa la membrana
externa a travs de porinas mediante difusin pasiva, llega al citoplasma por un
mecanismo dependiente de energa y en el interior se unen reversiblemente a la
subunidad 30 S produciendo una inhibicin de la sntesis de protenas. En cuanto a los
mecanismos de resistencia de las tetraciclinas se puede producir por: cambios en la
permeabilidad de la membrana, una expulsin activa a travs de una protena de
membrana, proteccin del ribosoma mediante una protena soluble e inactivacin
enzimtica del propio antibitico. El mecanismo de resistencia descrito para H. pylori
consiste en mutaciones puntuales en el gen 16S RNA en la posicin 926-928 (cambio
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Introduccin.
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de AGA por TTC) (Lawson 2005). Cuando se lleva a cabo una nica sustitucin se
producira resistencia de bajo nivel; sin embargo, si se presentan 3 mutaciones la
resistencia sera de alto nivel. Tambin se ha propuesto como mecanismo de
resistencia la reduccin de la permeabilidad, ya que algunas cepas resistentes no
presentan las mutaciones descritas y muestran una disminucin de la acumulacin de
la tetraciclina. La resistencia a tetraciclinas de H. pylori es muy baja.
FURAZOLIDONA: los nitrofuranos tienen tambin buena actividad
frente a H. pylori, siendo furazolidona el ms eficaz en la curacin de la lcera
duodenal y en erradicar H. pylori de la mucosa gstrica. El mecanismo de accin es
similar al del metronidazol: reduccin de la prodroga llevando a la formacin de
radicales nitro aninicos y se produce dao del DNA. El mecanismo de resistencia no
se conoce pero es diferente del de metronidazol porque la resistencia no es cruzada.
LEVOFLOXACINO: el rango inhibitorio de quinolonas como
ciprofloxacino y ofloxacino frente a H. pylori es similar a betalactmicos y
macrlidos. Sin embargo las primeras quinolonas utilizadas no mostraron eficacia
clnica, por la disminucin de la actividad en pH cido o por el desarrollo de
resistencia despus del tratamiento. Actualmente levofloxacino se ha utilizado con
xito en la erradicacin de la bacteria. Las quinolonas inhiben la replicacin del DNA,
actan en el DNA cromosmico bacteriano, unindose a las topoisomerasas e
inhibiendo su accin. Las quinolonas actan sobre dos protenas diana: DNA girasa y
topoisomerasa IV (ambas son topoisomerasas responsables de los cambios en la
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Introduccin.
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topologa del DNA). En el caso de bacterias Gram negativas, como es el caso de H.
pylori, actan inhibiendo la DNA girasa, la cual es un tetrmero con dos subunidades
A y dos subunidades B, codificadas por los genes gyrA y gyrB. La funcin principal
de la DNA girasa es mantener un nivel de enrollamiento del DNA que facilite la
formacin de los complejos durante la replicacin y la transcripcin. En cuanto a los
mecanismos de resistencia descritos principalmente son alteraciones en alguna de las
subunidades de la DNA-girasa, mutaciones en el gyrA: el gen que codifica la
subunidad A. Las mutaciones suelen producirse en una regin concreta de esos genes
que se denomina QRDR (quinolone resistance domain region). Cambios en los
aminocidos de esta regin alteran la estructura del sitio al que se unen las quinolonas
en el complejo girasa-DNA, y la resistencia se debe a una disminucin de la afinidad
de la quinolona por dicho complejo. Otro mecanismo de resistencia de las bacterias a
las quinolonas puede ser por alteraciones de porinas, debido a la disminucin en la acumulacin de antibitico, bien por descenso en la permeabilidad de la membrana
externa o mediante un incremento de la expresin de un sistema de expulsin activa.
En H. pylori se han descrito cuatro tipos de mutaciones en el gen gyrA, cambio de Asn
por Lys en el aminocido 87, cambio de Ala por Val en el aminocido 88, cambio de
Asp por Gly, Tyr o Asn en el aminocido 91 y mutaciones simultneamente en 91
(Asp-Asn) y en 88 (Ala-Val) (Fujimura 2004, Tankovic 2003). Otras mutaciones en el
gen gyrA o en el gen gyrB pueden aparecer junto con las anteriores y no tienen el
mismo impacto clnico. La resistencia a quinolonas, aunque se ha observado un
aumento, todava contina siendo baja (Kim 2005).
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RIFABUTINA: es un antibitico derivado semi-sinttico de la
rifampicina, utilizado normalmente para el tratamiento de infecciones producidas por
micobacterias y en infecciones producidas por Staphylococcus aureus o Legionella
spp. entre otras, ha demostrado tener una alta eficacia contra H. pylori. El mecanismo
de accin consiste en la inhibicin del inicio de la sntesis de RNA al inhibir la enzima
RNA polimerasa (Cibrelus 2006). La resistencia a la rifampicina tiene lugar por
mutaciones en el gen rpoB, que codifica la subunidad beta de la RNA polimerasa, que
reducen la afinidad de esta subunidad por el antibitico. Las mutaciones descritas
corresponden a los aminocidos 149, 524-545 y 586. La resistencia a este antibitico
es todava baja (Glocker 2007).
1.6.4 Causas de fracaso del tratamiento.
En el fracaso del tratamiento pueden intervenir factores relacionados con el
mismo tratamiento (dosis inadecuadas, una duracin incorrecta del tratamiento y el tipo y
la dosis del inhibidor de la bomba de protones), factores del paciente (falta de adherencia
al tratamiento) o factores de las cepas (Graham 2008). Entre los factores del
microorganismo es muy importante la resistencia a los antibiticos y quiz las
caractersticas particulares de la cepa (Alarcn 1999).
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1.6.5 Mtodos de deteccin de resistencia.
La resistencia a antimicrobianos se puede detectar mediante diferentes mtodos
que se pueden clasificar en fenotpicos y genotpicos. Los mtodos fenotpicos estn
basados en la apariencia macroscpica tras cultivo de la bacteria y los mtodos
genotpicos en la deteccin de los genes y las mutaciones implicadas en la resistencia
(Mgraud 2007).
DILUCIN EN AGAR: es el mtodo fenotpico de referencia, pero poco til
para realizar de forma rutinaria, aunque vlido para confirmar los resultados obtenidos
por otros mtodos y realizar estudios para conocer la tasa global de resistencia en un
rea determinada. El mtodo de dilucin en caldo es til para otras bacterias pero no
para H. pylori ya que se contamina con facilidad.
DIFUSIN CON DISCO: es el mtodo fenotpico ms fcil y barato para
determinar la sensibilidad i