ESTUDIO INICIAL DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE …
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1 ESTUDIO INICIAL DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE LAS HOJAS DE PALMA DE ACEITE MEDIANTE UN PROCESO DE FERMENTACIÓN Y SACARIFICACIÓN SIMULTÁNEAS (SFS). Proyecto de grado presentado por: JORGE LUIS MARTÍNEZ ALTAMIRANDA DANIELA ZAWADY FERNÁNDEZ DE CASTRO Presentado a: UNIVERSIDAD DE LOS ANDES En cumplimiento de los requisitos para obtener el título de INGENIERO QUÍMICO Asesor M.Sc, Ph.D ANDRÉS GONZALEZ UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTÁ D.C 2016
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1
ESTUDIO INICIAL DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE LAS
HOJAS DE PALMA DE ACEITE MEDIANTE UN PROCESO DE
FERMENTACIÓN Y SACARIFICACIÓN SIMULTÁNEAS (SFS).
Proyecto de grado presentado por:
JORGE LUIS MARTÍNEZ ALTAMIRANDA
DANIELA ZAWADY FERNÁNDEZ DE CASTRO
Presentado a:
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
En cumplimiento de los requisitos para obtener el título de
INGENIERO QUÍMICO
Asesor
M.Sc, Ph.D ANDRÉS GONZALEZ
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C
2016
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ESTUDIO INICIAL DE LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE LAS
HOJAS DE PALMA DE ACEITE MEDIANTE UN PROCESO DE
FERMENTACIÓN Y SACARIFICCIÓN SIMULTÁNEAS (SFS) USANDO
MICROORGANISMOS AISLADOS POR LA UNIVERDISAD DE LOS ANDES.
Proyecto de grado presentado por:
JORGE LUIS MARTÍNEZ ALTAMIRANDA
DANIELA ZAWADY FERNÁNDEZ DE CASTRO
__________________________________________ ANDRÉS GONZALEZ, M.Sc, Ph.D
Asesor
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C
2016
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CONTENIDO
1. Introducción ................................................................................................................. 5
2. Objetivos ...................................................................................................................... 9
2.1 Objetivo general ....................................................................................................... 9
2.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 9
3. Marco teórico ............................................................................................................... 9
4. Metodología ................................................................................................................ 16
4.1 Determinación de azúcares totales extraíbles ........................................................ 16
4.1.1 Obtención de material lignocelulósico .......................................................... 16
4.1.2 Preparación de reactivo DNS ...................................................................... 16
4.1.3 Preparación de las muestras ....................................................................... 17
4.1.4 Determinación de componentes extraíbles .................................................. 18
4.1.5 Determinación de azúcares estructurales .................................................... 19
4.1.6 Curva de calibración para espectrofotometría de azúcares reductores ..... 19
4.2 Obtención de etanol por medio de Sacarificación y Fermentación Simultánea......... 20
4.2.1 Preparación de muestras ............................................................................. 21
4.2.2 Pretratamiento químico ................................................................................ 21
4.2.3 Sacarificación y fermentación simultánea .................................................... 21
4.3 Medición de azúcares reductores, conteo celular y cuantificación de etanol .......... 22
4.3.1 Medición de azúcares reductores ................................................................ 22
4.3.2 Determinación del conteo celular de biomasa.............................................. 23
4.3.3 Cuantificación del etanol por cromatografía de gases .................................. 23
5. Resultados ................................................................................................................. 24
5.1 Determinación de azúcares reductores totales ....................................................... 24
5.1.1 Curva de calibración de azúcares reductores .............................................. 24
5.1.2 Determinación de azúcares extraíbles ......................................................... 25
5.1.3 Determinación de azúcares estructurales .................................................... 26
5.2 Conteo celular de Saccharomyces cerevisiae durante el proceso SSF ................. 28
5.3 Determinación de azúcares durante el proceso SSF ............................................. 30
5.3.1 Curva de calibración para la prueba DNS en muestras de SSF ................... 30
5.3.2 Cuantificación de azúcares reductores durante el proceso SSF ................. 31
5.4 Cuantificación del etanol presente al final del proceso SSF ................................... 33
6. Conclusiones ............................................................................................................. 39
7. Bibliografía ................................................................................................................. 42
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ÍNDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1. Reacción de óxido-reducción entre un azúcar reductor (glucosa en este
ejemplo) y ácido 3-5-dinitrosalicílico en medio básico. ............................................................ 17
Ilustración 2. Curva de calibración para la concentración de azúcares reductores. ............ 27
Ilustración 3. Estimación de conteo celular por densidad óptica (absorbancia) a 600 nm de
longitud de onda. ............................................................................................................................ 31
Ilustración 4. Resultados del análisis estadístico realizado en el software Minitab. A la
izquierda se encuentra el gráfico de los efectos principales, y a la derecha se muestran los
factores e interacciones de estos que causan un efecto en el desarrollo de la biomasa
fúngica. ............................................................................................................................................. 32
Ilustración 5. Curva de calibración para la determinación de azúcares reductores en cada
Erlenmeyer por medio de espectrofotometría............................................................................ 33
Ilustración 6.Concentración de azúcares reductores durante el proceso SSF ..................... 34
Ilustración 7. Resultados del análisis estadístico realizado en el software Minitab. A la
izquierda se encuentra el gráfico de los efectos principales, y a la derecha se muestran los
factores e interacciones de estos que causan un efecto en la concentración de azúcares
reductores presentes. .................................................................................................................... 35
Ilustración 8. Gráfica que muestra el porcentaje de etanol final. A la derecha, la tabla con
estos datos. ..................................................................................................................................... 36
Ilustración 9. Resultados del análisis estadístico realizado en el software Minitab. A la
izquierda se encuentra el gráfico de los efectos principales, y a la derecha se muestran los
factores e interacciones de estos que causan un efecto en la cantidad final de etanol en
las experimentaciones. .................................................................................................................. 36
Ilustración 10. Gráfica de efectos de cada factor sobre el rendimiento del proceso. .......... 41
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Diseño experimental de la SSF. ................................................................................... 22
Tabla 2. Resultados de la Determinación de azúcares extraíbles ......................................... 28
Tabla 3. Resultados de la determinación de azúcares estructurales. ................................... 29
Tabla 4. Azúcares totales obtenibles a partir de 10 gramos de material lignocelulósico
seco. ................................................................................................................................................. 29
Tabla 5. Nomenclatura para cada experimento. ....................................................................... 30
Tabla 6. Conversión del azúcar a etanol en el proceso. ......................................................... 38
Tabla 7. Rendimiento del proceso de sacarificación para cada tratamiento. ....................... 39
Tabla 8. Rendimiento del proceso SSF ............................................................................ 40
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RESUMEN
Se realizó la caracterización de dos lotes de hojas de palma para determinar la cantidad de
azúcares totales que se pueden obtener a partir de estas. Se ejecutó la extracción de
azúcares solubles en agua y la hidrólisis de polisacáridos que dieran como producto más
azúcares reductores, y se cuantificaron por medio del método DNS. Se obtuvo que
alrededor del 45% de material lignocelulósico seco puede ser obtenido como azúcar
reductor para la producción de etanol, mas este método demostró no ser efectivo pues se
pudo obtener más de este porcentaje en azúcares. Posteriormente las hojas de palma se
sometieron a un proceso de sacarificación y fermentación simultánea en donde se obtuvo
que hasta 5 gramos de etanol por 100 gramos de hojas podían ser obtenidas por este
proceso.
Palabras clave: Azúcar reductor, extracción, material lignocelulósico, DNS, espectrofotometría,
cromatografía, etanol.
1. INTRODUCCIÓN
Gran parte de la calidad de vida que se tiene actualmente, es gracias a los avances
realizados en el siglo XX. Sin embargo, para que estos avances pudieran ocurrir,
fue necesario el uso indiscriminado de carbón, petróleo, gas natural, entre otros, lo
que trajo consigo cambio climático y otros problemas ambientales. En la Ilustración
1 se puede observar cómo ha aumentado la demanda energética a nivel mundial
hasta el año 2008, teniendo como protagonistas a los combustibles fósiles [1].
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Ilustración 1: Demanda energética a nivel mundial entre 1971 y 2008 (1 toe= 10 millones de calorías) [1].
Por otro lado se puede observar en la Ilustración 2 la proyección del consumo de
energía hasta el año 2030, avalada por la Agencia Internacional de Energía. Esta
ilustración muestra que el consumo de energía incrementará con el tiempo y que
los combustibles fósiles seguirán siendo la principal fuente. Teniendo en cuenta que
dichos combustibles son un recurso no renovable y que además generan un impacto
negativo al medio ambiente, se hace necesario buscar fuentes de energía
alternativas que sean sostenibles [1].
Ilustración 2: Proyección de consumo de energía hasta el 2030 [1].
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Es aquí en donde entran al panorama los biocombustibles. Sin embargo estas
sustancias poseen ciertas singularidades: la primera consiste en que su producción
genera gasto de combustibles fósiles, que es el material que se quiere sustituir; la
segunda consiste en que la productividad es muy variable dependiendo del tipo de
materia prima que se utilice (azúcar, almidón, celulosa o aceites vegetales) y de las
condiciones bajo las cuales fueron cultivadas. Por esta razón, en las distintas zonas
geográficas hay diferencias significativas en los rendimientos y por ende en los
costos y las rentabilidades [2].
Actualmente son dos los biocombustibles en uso: el etanol, usado para la sustitución
de la gasolina en motores de combustión interna, y el biodiesel, usado para sustituir
el gasoil en motores de biodiesel [2]. Estos se clasifican de acuerdo al origen de su
materia prima en primera y segunda generación. La primera generación abarca
todos los biocombustibles producidos por cultivos que pueden destinarse a la
alimentación como el maíz, la caña de azúcar, la soja y los aceites vegetales
vírgenes. Por otro lado, los combustibles de segunda generación utilizan materias
primas que no se pueden utilizar como alimentos en primera instancia, usualmente
son materiales que contienen gran cantidad de celulosa y hemicelulosa, por lo cual
requieren tratamientos previos a su fermentación [3].
A nivel mundial, la producción de biocombustibles ha crecido sostenidamente y se
espera que lo siga haciendo. En el caso del etanol, la producción mundial se triplicó
entre los años 2000 y 2007, con un total de 62 mil millones de Litros, teniendo como
principales productores a Brasil y a Estados Unidos. Por otro lado, la cifra del
biodiesel aumentó hasta más de 10 mil millones de Litros, es decir 10 veces más de
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la cifra inicial, teniendo como principal productor a la Unión Europea [4]. Sin
embargo, la mayoría de estos biocombustibles producidos actualmente son de
primera generación, lo cual ha generado gran polémica por su uso alternativo al
alimentario, que ha ocasionado un incremento en los precios de dichas cosechas
de hasta un 70%. Por esta razón han entrado al panorama los biocombustibles de
segunda generación, que son más ecológicos y avanzados que los actuales, usando
tierras marginales que no se emplean en el cultivo de alimentos. No obstante, sus
elevados costos de manufactura implican que aún no se pueden producir a gran
escala [6].
Entre los países latinoamericanos que figuran como grandes productores de
biocombustibles en el mundo se encuentran Brasil, Argentina y Colombia. Brasil se
encuentra como el segundo productor de etanol en el mundo, con una participación
del 33,2% en el mercado, detrás de Estados Unidos quien domina el 54,7% de la
producción mundial. Por su parte, Argentina es el segundo productor mundial de
biodiesel con un 13,1% del mercado, luego de Estados Unidos que maneja el
14,3%. En cuanto a Colombia, figura en el décimo lugar entre los países productores
de etanol, con un mercado del 0,4% [7].
En Colombia, desde el 2001 el gobierno nacional ha implementado diversas
políticas que promueven la producción de biocombustibles, con el fin de generar
plantas de producción eficientes y sostenibles que puedan competir con el mercado
internacional. Un claro ejemplo de estas normatividades es la Ley 693 de 2001 que
establece una mezcla obligatoria de alcohol carburante con la gasolina que
consumen los automóviles de todo el país; por otro lado la Ley 939 de 2004
9
estableció que el combustible diésel del país debe tener una mezcla con
biocombustibles de origen vegetal animal de 7% o 10% dependiendo de la región.
Además existen diversos procesos de desgravación que iniciaron con la aprobación
de la Ley 788 del 2002, que generó varias exenciones. Entre estas el impuesto
sobre las ventas, el cual para la caña de azúcar y el alcohol carburante se eliminó
por completo; mientras que para el fruto de la palma de aceite y el azúcar se redujo
del 16% al 7%. También estableció exención del impuesto global y sobretasa al
alcohol carburante. De igual manera, la Ley 939 de 2004 establece que la renta
generada por el aprovechamiento de la palma de aceite y otros cultivos de tardío
rendimiento estaría exenta de impuestos en un periodo de diez años. Sin embargo,
estos solo son unos de los varios incentivos que hay a nivel gubernamental para
producir biocombustibles en Colombia [8].
Actualmente hay solo seis plantas productoras de bioetanol en Colombia, las cuales
producen aproximadamente 1’275.000 L/día [9]. Sin embargo, la única materia
prima que se está utilizando es la caña de azúcar, por lo cual su uso es muy
controvertido al ser biocombustible de primera generación. Es por esta razón que
se están realizando investigaciones sobre otras posibles materias primas que sean
residuos biomásicos de procesos industriales [10]. En virtud de favorecer dichas
investigaciones, se realizará un estudio sobre la viabilidad de la producción de
etanol a nivel industrial con dos variantes de hojas de Palma de Aceite (Elaeis
Guineesis SACQ Indupalma OxG y Elaeis Guineesis Dami) como residuo
lignocelulósico en la producción de aceite.
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2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general:
Estudiar la viabilidad de la producción de etanol a partir de dos variantes de
hojas de palma de aceite, a partir de un proceso de sacarificación y
fermentación simultáneas (SSF), utilizando celulasas comerciales para la
sacarificación y la levadura Saccharomyces cerevisiae para la fermentación.
2.2. Objetivos específicos:
Caracterizar las dos variantes de las hojas.
Determinar los porcentajes de rendimiento del etanol respecto a la
masa de material lignocelulósico empleado en cada muestra.
Realizar seguimiento a variables de interés del proceso como la
concentración de azúcares reductores libres y concentración de
biomasa fúngica.
3. MARCO TEÓRICO
Los biocombustibles son combustibles provenientes de biomasa. Se consideran
ambientalmente amigables debido a que su materia prima es renovable y generan
menores emisiones de gases de efecto invernadero que los combustibles fósiles.
Estos se clasifican en primera y segunda generación, de acuerdo al tipo de materia
prima que utilicen. La primera generación se produce a partir de azúcares, almidón
11
y aceites vegetales; mientras que la segunda generación utiliza cultivos no
comestibles o desechos [11].
Actualmente, el biocombustible más utilizado es el etanol, este puede ser obtenido
por síntesis química y por fermentación. Sin embargo, el proceso líder en la industria
y con el cual se produce bioetanol es la fermentación [12]. Esta se realiza a partir
de tres materias primas principales: la que contiene azúcares, almidón o
lignocelulosa. Las dos primeras no requieren de un pre-tratamiento complejo antes
de la fermentación, contrario a la lignocelulosa que necesita una ruptura de la misma
hasta conseguir azúcares para fermentar [13].
La principal fuente de azúcares para producir etanol es la caña de azúcar, esto
debido a que es la materia prima que proporciona el mayor rendimiento. Para su
fermentación se utiliza usualmente un tipo de levadura llamada Saccharomyces
cerevisiae y el proceso puede ser continuo o discontinuo [14].
En el proceso discontinuo se esteriliza la muestra y luego se le agrega ácido
sulfúrico como regulador de pH, manteniendo los grados Brix entre 14 y 22. Luego
de la formación del etanol, este se separa de los demás productos y de los residuos
de la fermentación. Para esto se centrifugan los residuos, posteriormente se
decanta la fase del etanol para finalmente separarlo por destilación. Este es el
método más implementado debido a que se obtiene un buen desempeño, al poder
reutilizar el medio fermentativo [14].
Por otro lado, el proceso continuo puede llegar a ser más económico que el Batch,
esto debido a que tienen requerimientos de control menores. Además el bioetanol
en constante movimiento permite disminuir su capacidad inhibidora, obteniendo
12
mayores índices de productividad. Sin embargo este no es el proceso más utilizado
[14].
El almidón generalmente se degrada mediante hidrólisis ácida, sin embargo también
se pueden utilizar enzimas específicas para hacer el proceso más eficiente debido
a la ausencia de reacciones en paralelo, entre estas la alpha-amilasa. La
temperatura óptima para este proceso está entre 90°C y 110°C [14].
En cuanto a la materia prima lignocelulósica, se necesitan más etapas para la
producción de etanol. Primero, es necesaria la ruptura del complejo lignina-celulosa-
hemicelulosa mediante un pre-tratamiento. Esto con el fin de reducir el grado de
cristalinidad de la celulosa y aumentar la celulosa amorfa, que es más accesible al
ataque enzimático. Para este proceso existen diversos métodos: físicos, químicos
biológicos o una combinación de estos [12].
Entre los métodos físicos se encuentran la pirólisis y la cominución. En la pirólisis la
celulosa se descompone al ser tratada con altas temperaturas; mientras que en la
cominución se realiza una molienda de la materia prima [12].
En cuanto a los métodos químicos se encuentra la ozonólisis, en la cual se utiliza
ozono a presión y temperatura ambiente. En este método no hay formación de
inhibidores, la lignina sufre degradación y la conversión de celulosa puede llegar a
ser mayor a 57%. La hidrólisis con ácido diluido, utiliza ácido sulfúrico, ácido
clorhídrico o ácido nítrico al 5% máximo y una presión atmosférica. En este método
es necesaria la corrección de pH, y la conversión de celulosa posterior se favorece
por el uso de altas temperaturas. En la hidrólisis con ácido concentrado, se utiliza
ácido sulfúrico o ácido clorhídrico del 10 al 30% a una temperatura de 170°C a
13
190°C; sin embargo, en este método es necesaria la recuperación del ácido y el
tiempo de residencia es mayor en comparación a la técnica anterior. La hidrólisis
alcalina utiliza Hidróxido de sodio diluido por 24 horas o Hidróxido de Calcio por 4
horas, ambos a 120°C; en este método hay una baja formación de inhibidores y el
costo del reactor es menor que el de la hidrólisis ácida. El proceso organosolv utiliza
solventes orgánicos como el metanol o acetona con un 1% de ácido sulfúrico o ácido
clorhídrico a 185°C por un tiempo de 30 a 60 minutos, con un pH de 2 a 3,4. En este
método se requiere la recuperación del solvente y hay una hidrólisis prácticamente
complete de la hemicelulosa [12].
Los métodos biológicos abarcan el uso de hongos o macrohongos y el proceso Bio-
organosolv, que consiste en la fermentación de Ceriposiopsis subvermispora de 2
a 8 semanas, seguida de etanólise a 200°C por 2 horas [12].
Por último, existen métodos físico químicos entre los que se encuentran: la
explosión a vapor, en la cual se utiliza vapor saturado a una temperatura de 160°C
a 290°C y una presión entre 0,69 y 4,85 MPa, seguido por descompresión hasta
presión atmosférica. Con este método se obtiene una hidrólisis de la hemicelulosa
del 80% al 100%, sin embargo hay formación de inhibidores. El método de agua
caliente utiliza una temperatura entre 170°C y 230 °C de 1 a 46 minutos, generando
una hidrólisis de hemicelulosa de 80% a 100%, con una solubilización parcial de la
lignina y baja formación de inhibidores. La explosión con amoníaco diluido (AFEX),
añade de 1 a 2 Kg de amoniaco por cada Kg de biomasa seca, a una temperatura
90°C y una presión de 1,12 a 1,36 MPa, por 30 minutos. Este método requiere la
recuperación de amoníaco y tiene una hidrólisis de hemicelulosa de 0% a 60%
14
dependiendo de la humedad, además no hay formación de inhibidores. Finalmente,
la explosión de CO2 utiliza 4 Kg de CO2 por cada Kg de fibra, a una presión de 5,6
MPa; durante este proceso no ocurre formación de inhibidores y la conversión de la
celulosa puede ser mayor a 75% [12].
Como la variedad de materiales lignocelulósicos a utilizar es extensa, es importante
tener en cuenta el contenido de lignina y de hemicelulosa de la materia prima para
escoger el pretratamiento. En el presente proyecto se seleccionó un pretratamiento
de molienda y posterior hidrólisis con ácido diluido por recomendaciones de trabajos
pasados con palma africana [15].
Luego de finalizado el pre-tratamiento, la celulosa se expone a hidrólisis para
obtener glucosa, siguiendo la siguiente reacción:
(𝐶6𝐻10𝑂5)𝑛 + 𝑛𝐻2𝑂 → 𝑛𝐶6𝐻12𝑂6 (1)
Dicha reacción puede ser catalizada por ácido diluido, ácido concentrado o enzimas.
Sin embargo, esta última tiene muchas ventajas sobre las otras dos pues a las
condiciones de pH y temperatura óptimas de las enzimas se obtienen altos
rendimientos, bajos costos de operación y no se produce corrosión. Este proceso
puede llevarse a cabo unido a la fermentación (sacarificación y fermentación
simultánea, SSF) o por separado (sacarificación y fermentación separadas, SHF).
Generalmente el proceso óptimo es SSF, sin embargo para los dos tipos de
procesos surgen constantes mejoras [15].
La SHF se realiza en dos pasos, en el primero se realiza la sacarificación de la
biomasa pretratada mediante un hongo que degrada celulosa; a continuación ocurre
15
la fermentación usando generalmente el microorganismo Saccharomyces
Cerevisiae. Contrario a este proceso, la SSF realiza la sacarificación y la
fermentación en el fermentador. El problema de este método consiste en que no se
puede trabajar a las condiciones óptimas de cada proceso, sin embargo
generalmente es el mejor de acuerdo a las estadísticas, por lo tanto se utilizará en
este proyecto [15].
En cuanto a la materia prima a utilizar en este proyecto, se tienen dos variedades
de las hojas de palma de Agoindustrias del Tibú, las cuales no son aprovechadas
actualmente. La primera es Elaeis Guineensis Dami, una variedad generada para
garantizar semillas de alta calidad, que fue estudiada desde 1967 [16]. La otra es
Elaeis Guineensis Indupalma OxG, la cual es híbrida y por lo tanto es menos
susceptible a las plagas, se tiene aceites de más alta calidad y pueden estar más
años de producción en el cultivo [17].
Colombia es el primer productor de aceite de palma en América y el cuarto del
mundo. Actualmente se tienen cerca de 500 mil hectáreas sembradas de palma de
aceite [17]. Sin embargo, hay partes de la planta que se tratan como desecho, entre
estas las hojas. Por esta razón, se busca usar estos desechos y convertirlos en
bioetanol, debido a su alto contenido de celulosa. La importancia de las hojas de
palma como materia prima radica en su alta disponibilidad y en su bajo costo, ya
que al ser desechos, se consiguen de forma gratuita; además al producir bioetanol
de segunda generación no existe el dilema de si utilizar la materia prima para la
producción de alimentos o de biocombustibles.
16
A nivel industrial la materia prima utilizada en Estados Unidos, como el principal
productor a nivel mundial, es el maíz [19]. Este es un cereal, gramináceo,
monocotiledóneo, hermafrodito y monoico [20]. Su cosecha es anual y de esta se
aprovecha solo el 50% en forma de grano, de modo que la obtención de biomasa
residual por hectárea oscila entre 7 y 10 toneladas [21].
El maíz pasa por un molino y el producto resultante se hidroliza para obtener
glucosa. Este proceso se puede aplicar de dos maneras: molienda húmeda y
molienda seca [21].
La molienda húmeda se aplica en plantas con grandes producciones de alcohol y
se usa por los productores en Estados Unidos. Este proceso comienza secando los
granos, que luego se inspeccionan y se limpian, después se colocan en remojo en
una solución de agua, ácido láctico y dióxido de azufre por uno o dos días, para
liberar el almidón. De aquí se pasa la disolución por un separador para obtener la
parte fibrosa y por último se separa el almidón de las proteínas con un proceso de
centrifugado [21].
En la molienda seca se limpian y muelen los granos con un sistema mecánico,
produciendo una harina con el germen, la fibra y la fécula de maíz. Esta harina es
hidrolizada con enzimas o una solución ácida, la mezcla resultante se enfría y se le
añade levadura para que comience a fermentar [21].
Luego del proceso de molienda, las moléculas de almidón se someten a hidrólisis
para formar la glucosa que pasa a ser fermentada siguiendo la siguiente reacción
[21]:
𝐶6𝐻12𝑂6 → 2𝐶𝐻3𝐶𝐻2𝑂𝐻 + 2𝐶𝑂2 (2)
17
En condiciones ideales, una hectárea de maíz puede llegar a producir 3100 Litros
de etanol [21].
Otra materia prima muy utilizada a nivel industrial en Colombia y en Brasil es la caña
de azúcar. Esta es una planta herbácea de familia gramínea, originaria de la India,
con flores hermafroditas que son polinizadas por el viento [21].
A nivel industrial el primer paso es cortar la caña y transportarla para su
procesamiento. Este consiste en extraer el jugo usando molinos que comprimen la
caña; luego se hace un proceso de filtración para eliminar el bagazo en suspensión,
que es llevado de nuevo a los molinos. Por último se realiza un proceso de
clarificación, con el fin de separar las impurezas presentes para así poder obtener
azúcares de alta pureza. Este jugo se puede utilizar como suplemento alimentario
agrícola o en la producción de etanol [23].
Para la producción de etanol, el jugo pasa a una fermentadora a la cual se le
adiciona una bacteria para acelerar el proceso; luego pasa por un proceso de
destilación del cual se pueden obtener dos tipos de alcoholes: el hidratado, que es
recomendado para bebidas alcohólicas; y alcohol anhidro, que es recomendado
para mezclar con gasolina [23].
18
4. METODOLOGÍA
4.1. Determinación de azúcares totales extraíbles
Las etapas del procedimiento para la determinación de la cantidad de azúcares
reductores (estructurados y no estructurados) que pueden ser obtenidos a partir de
los distintos tipos de material lignocelulósico estudiados, son las siguientes:
4.1.1. Obtención de material lignocelulósico
Las hojas son enviadas desde una finca propiedad de la empresa Agroindustrias
del Tibú, ubicada en cercanías del municipio de Tibú, en Norte de Santander. Se
envió el primer lote (Lote I) el día 26 de agosto y un segundo lote (Lote II) el día 9
de septiembre, ambos por correo convencional, correctamente empacado para
evitar la contaminación y posibles daños al material durante su transporte.
4.1.2. Preparación de reactivo DNS
Los azúcares reductores, claves para este proyecto, pueden ser determinados por
medio de la reacción que estos presentan con el ácido 3-5-dinitrosalicílico:
Ilustración 1. Reacción de óxido-reducción entre un azúcar reductor (glucosa en este ejemplo) y ácido 3-5-
dinitrosalicílico en medio básico. Tomado de [24] y realizado en web.chemdoodle.com.
19
Ilustración 3. Reacción de óxido-reducción entre un azúcar reductor (glucosa en este ejemplo) y ácido 3-5-
dinitrosalicílico en medio básico. Tomado de [24]
El producto de esta reacción, ácido 3-amino-5-nitro-salicílico, presenta una máxima
absorción en la longitud de onda de 540 nm [25]. Por esta razón, se emplea un
espectrofotómetro para la cuantificación de la presencia de este componente, el
cual será consecuencia de la presencia de azúcares reductores.
100 mL de reactivo DNS se componen de:
1 g de ácido 3-5-dinitrosalicílico
1.6 g de hidróxido de sodio anhidro (para garantizar el medio básico)
40.3 g de tartrato de sodio y potasio (brinda estabilidad al color) [26]
Agua hasta los 100 mL
En primer lugar, se disuelve el ácido en ~20 mL de agua. A esto se le añade el
hidróxido de sodio, seguido del tartrato de sodio y potasio. Una vez se añade este
es necesario filtrar el líquido y luego completar este líquido con agua pura hasta
obtener 100 mL de solución. Esta solución debe conservarse a menos de 20 °C en
un frasco ámbar [27].
4.1.3. Preparación de las muestras
La primera operación que sufren las hojas es el secado. Para esto se hizo uso de
hornos de convección a una temperatura de 45 °C durante 48 horas para garantizar
una humedad menor al 10%. Para la caracterización es necesario mantener la
humedad de las muestras menor a este en lo posible, ya que las pruebas
experimentales han sido basadas en los “Biomass Compositional Analysis
20
Laboratory Procedures” de la National Renewable Energy Laboratory (NREL), y
estos procedimientos han sido optimizados para niveles de humedad menores al
especificado [28].
Luego del secado, el posterior tratamiento fue molienda. Esto con el fin de reducir
el tamaño de partículas y aumentar el área de contacto de las hojas para los
procedimientos que se ejecutarán después. Se utilizó un molino de cuchillas para
esta labor.
4.1.4. Determinación de componentes extraíbles
Esta parte del procedimiento se basó en un sistema de extracción Soxhlet. Se tomó
la muestra ya triturada y se dejó durante 6 horas en una extracción con agua como
solvente para arrastrar los componentes extraíbles más polares. Luego se secó la
muestra y se realizó el mismo procedimiento utilizando etanol. Todo esto en base al
procedimiento del NREL [29]”. El primer extracto, con agua como solvente, es donde
se espera que se encuentren los azúcares no estructurales como describió Navarro
en sus resultados [30], donde no hubo presencia de estos en los extractos con
solventes no polares. Se realizó entonces una determinación de azúcares
reductores haciendo uso del reactivo DNS para cuantificar la presencia de estos
componentes que se encuentran de forma no estructural en el material
lignocelulósico, ya que contarán como material para la fermentación.
4.1.5. Determinación de azúcares estructurales
21
Haciendo uso del procedimiento de laboratorio de la NREL “Determination of
Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass” [31] se realiza la evaluación del
contenido de azúcares que se obtienen de la degradación de celulosa presente en
la muestra. Se toman 300 mg de la muestra de material lignocelulósico, seco y sin
componentes extraíbles, y se le añaden 3 mL de ácido sulfúrico al 72% p/p de
concentración. Esta mezcla se debe introducir en un baño termostatado a 30 °C
durante una hora mientras se agita cada 5 o 10 minutos para garantizar un contacto
parejo entre el material y el ácido [31]. Pasados los 60 minutos se procede a diluir
la solución hasta una concentración de ácido de 4% al añadir 84 mL de agua.
Posteriormente esta mezcla se autoclava por una hora a 121 °C.
Luego, esta mezcla es filtrada al vacío, donde el líquido filtrado corresponde a la
fracción soluble en ácido, donde se encuentra la celulosa. Este líquido se neutraliza
con hidróxido de sodio hasta llegar a un pH entre 5 y 6; debe tenerse especial
cuidado puesto que un pH mayor a 9 puede significar la pérdida de azúcares [31].
Finalmente, esta muestra se somete a una reacción con el reactivo DNS para
cuantificar los azúcares producidos por la hidrólisis de la muestra por medio de un
espectrofotómetro.
4.1.6. Curva de calibración para espectrofotometría de azúcares reductores.
Debido a que cada prueba será finalmente evaluada por su concentración de
azúcares reductores, es necesario contar con una curva de calibración. Para ello,
se debe obtener 5 diluciones de glucosa de alta pureza en agua con
concentraciones de 0.001, 0.002, 0.003, 0.004 y 0.005 moles por litro.
Posteriormente tomar 10 mL de cada una de estas diluciones y otra muestra de 10
22
mL de agua pura, a las cuales se les añade 2 mL del reactivo de DNS. Luego de
calentar las muestras por 20 minutos para que se dé la reacción, se debe observar
la absorbancia de cada muestra, utilizando la que no contiene glucosa como blanco.
Finalmente, al graficar las absorbancias versus las concentraciones de glucosa, se
debe obtener una línea recta con el fin de garantizar que se cumpla la ley de Beer
para ese rango de concentraciones. De lo contrario, sería necesario hacer muestras
más diluidas.
4.2. Obtención de etanol por medio de Sacarificación y Fermentación Simultánea
Luego, para la sacarificación y fermentación simultánea se realizó un diseño de
experimentos 23 con los siguientes factores y niveles:
Tabla 1: Diseño experimental de la SSF.
Nivel Bajo Nivel Alto
Temperatura (ºC) 25 37
Actividad de celulasa (FPU/g) 20 30
Tipo de Hoja Guineensis Híbrida
El objetivo es realizar mediciones para conocer la cantidad de levadura y la
cantidad de azúcar presentes en cada muestra. Además se realizó una
medida final utilizando cromatografía para conocer la cantidad de etanol
producida. Este experimento se realizó con tres réplicas para darle validez
estadística al experimento. El procedimiento a seguir fue el siguiente:
4.2.1. Preparación de muestras:
23
El primer proceso que sufren las hojas es el secado, tal como en el
procedimiento anterior se usa una temperatura de 45°C durante 48
horas, con el fin de garantizar una humedad menor al 10% ya que para
este valor se han especializado las pruebas realizadas [32].
Posteriormente se utiliza un molino de cuchillas para moler las hojas
previamente secas. El procedimiento anterior puede ser considerado
parte del pretratamiento para mejorar la degradación celulolítica.
4.2.2. Pretratamiento químico:
Se realiza el pretratamiento con ácido sulfúrico, en el cual las hojas
molidas son inmersas a una concentración de 6% p/v en una solución
de ácido sulfúrico al 1.5% p/v. Este finaliza con un autoclavado a 121°C
y 1 atm durante 15 minutos.
4.2.3. Sacarificación y fermentación simultánea:
Primero, es necesario autoclavar todos los Erlenmeyers que se van a
utilizar, en las mismas condiciones que el paso anterior. Se utilizó
levadura fresca que fue conseguida en una panadería del sector, se
activa en agua de 37°C a 40°C hasta que comience a espumar. Se
añadió 26.6 g de levadura por 100 mL de agua, siguiendo las relaciones
que indica la literatura que para la levadura seca la relación de dilución
en agua debe ser 1:10, y que la relación de magnitudes que deben
considerarse cuando se maneja levadura fresca en vez de levadura seca
es de 8:3 [33] .
Simultáneamente se debe preparar el medio nutritivo para la levadura,
que contiene:
24
Cloruro de amonio.
Fosfato de monopotasio.
Sulfato de Magnesio.
Buffer de citrato de sodio (pH 4,5)
Luego, se autoclava el medio y a 50 mL de este, se le añaden 50 mL de
material pretratado, celulasa y la levadura activada. El volumen de
celulasa fue añadido respecto a la actividad de esta, que fue hallada en
la literatura, para el Celluclast 1.5L, como 65 FPU/mL [34]. Por último
estas muestras se introducen en un Shaker durante 11 días a las
condiciones indicadas en el diseño de experimentos. Durante el proceso
se toman mediciones de azúcares y de cuantificación celular de la
biomasa.
4.3. Medición de azúcares reductores, conteo celular y cuantificación de etanol:
4.3.1. Medición de azúcares reductores:
Para la detección de azúcares reductores en las muestras es necesario
realizar una segunda curva de calibración realizando un barrido con el
espectrofotómetro para observar si existe alguna variación en la longitud
de onda en que se presentaba el pico de absorbancia. Se toma una
alícuota de cada Erlenmeyer y se diluye a razón de 1:10 en agua
desionizada. Posteriormente se procede a ejecutar la reacción con DNS
donde se añaden 0.2 mL de muestra diluida, 0.3 mL de reactivo DNS y
3.5 mL de agua desionizada, comparado con una muestra de igual
25
composición sin reaccionar, y se determina la absorbancia en el
espectrofotómetro.
4.3.2. Determinación del conteo celular de biomasa:
Se toma una alícuota de cada Erlenmeyer y se diluye posteriormente a
razón de 1:10 en agua desionizada. Luego se analizó en un
espectrofotómetro Nanodrop a longitud de onda de 600 nm para obtener
la absorbancia causada por las células de levadura presentes en la
muestra. Por medio de correlaciones en literatura pudo estimarse el
número de células de levadura por unidad de volumen presentes en la
muestra.
4.3.3. Cuantificación del etanol por cromatografía de gases
Al final de los 11 días de proceso se analizaron las muestras haciendo
uso del cromatógrafo de gases. A partir de una curva de calibración
haciendo uso de agua como solvente se pudo determinar el etanol
producido por medio del proceso de SSF.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
26
Para esta caracterización se tuvo en cuenta la variable del tiempo desde que las
hojas (Lote I y Lote II) fueron enviadas a Bogotá para las experimentaciones. Las
hojas fueron cortadas el día anterior al que llegaron a la capital del país. El lote I
pertenece al tipo de hoja Guineensis y el Lote II a la hoja Híbrida. Los resultados
aquí expuestos corresponden a la determinación de azúcares totales extraíbles, al
seguimiento a la concentración de azúcar y de la biomasa a lo largo del proceso de
SSF y el etanol obtenido al final del proceso.
5.1. Determinación de azúcares reductores totales
La primera parte de la experimentación correspondió a la cantidad de azúcares
teórica que podría obtenerse a partir del material lignocelulósico según el
procedimiento descrito en el inciso 4.1 de la metodología.
5.1.1. Curva de calibración de azúcares reductores
Se realizó lo descrito en el inciso 4.1.6, con lo cual se pudo obtener la siguiente
gráfica que relaciona la absorbancia de la muestra versus la concentración de
azúcares reductores:
27
Ilustración 4. Curva de calibración para la concentración de azúcares reductores.
De esta forma se observa un comportamiento muy aproximado al lineal, lo cual
indica que se cumple la ley de Beer, incluso a absorbancias altas.
5.1.2. Determinación de azúcares extraíbles
Los azúcares extraíbles, como se mencionó anteriormente citando a Navarro [30],
serán extraídos en su totalidad en el agua como solvente de la extracción Soxhlet.
Al final de las 6 horas de extracción se obtuvo un volumen de extracto cercano a los
160 mL para todas las muestras, el cual fue luego llevado hasta 200 mL para
facilidad en los cálculos. Se procedió a hacer una dilución 1:10 a las muestras
debido a la fuerte coloración que presentaban, se tomó una alícuota de 10 mL y se
combinó con 2 mL de reactivo DNS.
Las muestras aquí evaluadas fueron hojas del lote I con 3 y 4 semanas desde que
se recolectaron, y del Lote 2 con 1 y 2 semanas desde que se recogieron. Los
resultados que se expresan son la absorbancia de las muestras y, tras una serie de
y = 487,13x + 0,0065R² = 0,9989
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030 0,0035 0,0040 0,0045
Ab
sorb
anci
a
Concentración azúcar reductor mol/L
Absorbancia @540 nm
28
cálculos debidos a las diluciones realizadas a lo largo del proceso, el porcentaje de
azúcares extraíbles en el material libre de agua:
Tabla 2. Resultados de la Determinación de azúcares extraíbles
Lote I – 3 Semanas
Lote I – 4 Semanas
Lote II - 1 Semana
Lote II – 2 Semanas
Absorbancia 1.198 1.865 0.155 0.423
% azúcar en peso seco 10.60% 22.05% 1.47% 4.94%
De esta tabla se puede concluir que el tiempo influye en la cantidad de azúcares
reductores en las hojas; las mediciones una semana más tarde causan una mayor
presencia de estos azúcares extraíbles. Sin embargo, queda difícil argumentar si el
tiempo es el único factor influyente, o si también existe una diferencia de porcentaje
de azúcar inicial entre los dos distintos tipos de hojas a los que correspondían los
lotes.
5.1.3. Determinación de azúcares estructurales
Los azúcares estructurales son aquellos que provienen de la degradación de
polisacáridos por medio de la acción hidrolítica del ácido sulfúrico sobre estos. Al
final, estos polisacáridos son llevados a formas más elementales hasta llegar a los
monosacáridos. En este estado final es cuando se cuantificará la cantidad de
azúcares generados a partir de la hidrólisis de estos polisacáridos. Por medio de
espectrofotometría se pudo medir la concentración de azúcares reductores usando
el reactivo DNS:
29
Tabla 3. Resultados de la determinación de azúcares estructurales.
Lote I –
4 Semanas
Lote II –
2 Semanas
Absorbancia 0.14 0.237
% azúcar en peso sin extraíbles 26.59% 45.91%
Resumiendo la información obtenida de los resultados, se puede calcular la cantidad
de azúcares reductores que fueron obtenidos a partir de las muestras:
Tabla 4. Azúcares totales obtenibles a partir de 10 gramos de material lignocelulósico seco.
Lote I - 4 Semanas Lote II - 2 Semanas
Azúcares extraíbles (g) 2.205 0.494
Azúcares estructurales (g) 2.073 4.364
Azúcares totales (g) 4.278 4.858
% azúcares reductores 42.78% 48.58%
A partir de esta tabla, puede concluirse que el proceso tuvo alrededor de un 45% de
rendimiento para la obtención de azúcares reductores a partir de material
lignocelulósico seco.
Si se realiza un análisis a los datos, puede decirse que los resultados fueron lógicos.
Las hojas, al igual que las frutas, son organismos biológicos vivos aun después de
ser retirados de la planta [35]. Por tanto, al ser retiradas de la planta, la única fuente
de glucosa que tiene la hoja para realizar sus labores metabólicas es por medio de
la degradación de los polisacáridos en glucosa. Esto explica porqué el nivel de
azúcares extraíbles fue mayor a medida que aumentaba el tiempo (ver Tabla 2), al
contrario de los azúcares estructurales (ver Tabla 3). Sin embargo, como las células
van consumiendo la glucosa para subsistir, la cantidad de azúcares totales
obtenibles son mayores cuando la hoja ha sido arrancada recientemente (ver Tabla
30
4). De esta forma, se afirma que es mejor utilizar las hojas para el proceso de
formación de etanol lo más recientemente posible.
5.2. Conteo celular de Saccharomyces cerevisiae durante el proceso SSF
Se realizó una prueba espectrofotométrica a 600 nm haciendo uso de un
espectrofotómetro Nanodrop a lo largo de los 11 días de prueba. Los resultados
obtenidos se muestran en la Ilustración 3. Durante la corrida se asignaron nombres
a cada muestra, donde cada letra o número indicaba la configuración de niveles de
dicha muestra, como se expresa en la Tabla 5:
Tabla 5. Nomenclatura para cada experimento. Por ejemplo: BG32 indicaría una muestra que estuvo a 37 °C con hojas Guineensis bajo una actividad de celulasa de 30 FPU/g, siendo la segunda réplica de estos.
Para la transformación del valor de absorbancia obtenido del espectrofotómetro Nanodrop al de
concentración de biomasa, se empleó un factor de 1.3x107 células/mL por cada 1.0 de absorbancia
[36].
Factor Nivel Índice
25 °C A
37 °C B
Guineensis G
Híbrida H
20 FPU/g 2
30 FPU/g 3
#1 1
#2 2
#3 3
Réplica
Temperatura
Hoja
Actividad
31
Ilustración 5. Estimación de conteo celular por densidad óptica (absorbancia) a 600 nm de longitud de onda.
Sobre los datos del último día del proceso se realizó un análisis estadístico para
evaluar el efecto de los factores sobre la producción de biomasa. En el diagrama de
Pareto de la se puede observar que los factores relevantes son la temperatura, la
hoja y la interacción entre estar variables. Se puede analizar que al tener una
temperatura de 37 °C y la hoja tipo Híbrida se obtienen un mejor crecimiento celular
de la levadura, y que la actividad celulolítica no influye en mayor manera. Se obtuvo
el resultado esperado de que a 37 °C se tuviera un mayor crecimiento celular que a
25 °C, tal como lo determinaron Arroyo-López et. al. [37]. Un análisis más a fondo
debe ser realizado para determinar la influencia del tipo de hoja sobre la variable de
respuesta aquí evaluada.
0
10
20
30
40
50
0 2 4 6 8 10 12
10
^6 c
élu
las/
mL
Día
Conteo levadura @25 °C
AG2x
AG3x
AH2x
AH3x
0
10
20
30
40
50
0 2 4 6 8 10 12
10
^6 c
élu
las/
mL
Día
Conteo levadura @37 °C
BG2x
BG3x
BH2x
BH3x
32
5.3. Determinación de azúcares durante el proceso SSF:
Para el seguimiento de los azúcares reductores a lo largo del proceso SSF fue
necesario realizar un barrido de absorbancias sobre el rango de longitudes de onda
entre 200 y 900 nm para conocer si con la presencia de otros componentes además
de agua y el producto de la reacción del DNS cambiaría el pico de absorbancia con
el objetivo de obtener mejores mediciones.
5.3.1. Curva de calibración para la prueba DNS en muestras de SSF:
Efectivamente, el barrido lanzó como resultado que el pico de absorbancia para las
muestras contra su respectivo blanco se hallaba alrededor de los 475 nm, a
diferencia de los 540 nm que se especifica en la teoría para la reacción del DNS.
Esto era esperado pues investigadores han informado obtener mejores resultados
en sus experimentos a longitudes de onda distintas como 490 o 510 nm [38]. En la
Ilustración 5 se muestra la curva de calibración obtenida, logrando un ajuste lineal
con alto coeficiente de correlación. Haciendo los cálculos correspondientes a partir
de la pendiente y de las diluciones realizadas, se obtiene que cada unidad en la
Ilustración 6. Resultados del análisis estadístico realizado en el software Minitab. A la izquierda se encuentra el gráfico de los efectos principales, y a la derecha se muestran los factores e interacciones de estos que
causan un efecto en el desarrollo de la biomasa fúngica.
33
absorbancia corresponde a una concentración de 35.51 g/L de azúcares reductores
en cada Erlenmeyer de proceso SSF.
Ilustración 7. Curva de calibración para la determinación de azúcares reductores en cada Erlenmeyer por medio de espectrofotometría.
5.3.2. Cuantificación de azúcares reductores durante el proceso SSF:
Los azúcares reductores fueron determinados para el seguimiento del proceso. Los
resultados promediados para cada tratamiento pueden ser observados en la
Ilustración 6. De forma inesperada se obtuvo una menor cantidad de azúcares en el
nivel alto de actividad de la celulasa para los tratamientos, ya que resulta lógico que
a un mayor nivel de actividad de degradación de la celulosa se obtendrían mayores
niveles de azúcar en el tiempo. Se observa en la Ilustración 6 que la inflexión más
notoria en todas las curvas se da cerca al día 7 de proceso, siendo más fuerte a 37
°C.
y = 5,632x + 0,2176R² = 0,9947
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4
Ab
sorb
anci
a
Concentración azúcar Añadida (g/L)
Absorbancia @475 nm
34
Ilustración 8.Concentración de azúcares reductores durante el proceso SSF
El análisis estadístico muestra en la gráfica de efectos principales que la actividad
tuvo un efecto totalmente adverso a la concentración de azúcares. De igual manera,
se observa que existe una alta correlación entre la temperatura de operación y la
actividad, lo cual puede indicar el inesperado comportamiento. Estudios más
incisivos deben ser realizados para reconocer las causas de este.
0
5
10
15
20
0 2 4 6 8 10 12
Co
nce
ntr
ació
n d
e az
úca
res
(g/L
)
Día
Azúcares reductores @25 °C
AG2x
AG3x
AH2x
AH3x
0
5
10
15
20
0 2 4 6 8 10 12
Co
nce
ntr
ació
n d
e az
úca
res
(g/L
)
Día
Azúcares reductores @37 °C
BG2x
BG3x
BH2x
BH3x
35
5.4. Cuantificación del etanol presente al final del proceso SSF:
Para este procedimiento se empleó el cromatógrafo de gases para determinar el
porcentaje de etanol presente en los Erlenmeyer al final de los 11 días. La Ilustración
8 muestra los resultados promediados y la desviación estándar para cada
combinación de niveles de los factores evaluados usando la nomenclatura de la
Tabla 5:
Ilustración 9. Resultados del análisis estadístico realizado en el software Minitab. A la izquierda se encuentra el gráfico de los efectos principales, y a la derecha se muestran los factores e interacciones de estos que causan un efecto en la concentración
de azúcares reductores presentes.
36
Ilustración 10. Gráfica que muestra el porcentaje de etanol final. A la derecha, la tabla con estos datos incluyendo la desviación estándar de las réplicas.
Se observa que el mayor valor lo obtiene el experimento a 25 °C con hoja Híbrida
con una actividad de celulasa de 20 FPU/g, sin embargo con una muy alta
desviación que indica que este tratamiento no muestra resultados que puedan ser
considerados concisos; en este tratamiento, una réplica alcanzó el 1.59% de etanol,
lo cual es exageradamente mayor a todas las demás mediciones. A partir de esto
se ve que debe observarse este caso con cuidado. Posterior a esta observación se
ejecutó el análisis factorial para poder dar conclusiones más certeras:
0,00%
0,10%
0,20%
0,30%
0,40%
0,50%
0,60%
0,70%
AG2x AG3x AH2x AH3x BG2x BG3x BH2x BH3x
Porcentaje en peso de etanol obtenido
AG2x 0.00% ± 0.00%
AG3x 0.00% ± 0.00%
AH2x 0.59% ± 0.87%
AH3x 0.25% ± 0.03%
BG2x 0.06% ± 0.03%
BG3x 0.04% ± 0.04%
BH2x 0.23% ± 0.22%
BH3x 0.17% ± 0.14%
Ilustración 11. Resultados del análisis estadístico realizado en el software Minitab. A la izquierda se encuentra el gráfico de los efectos principales, y a la derecha se muestran los factores e interacciones de estos que
causan un efecto en la cantidad final de etanol en las experimentaciones.
37
A partir del resultado arrojado por Minitab, se ve que el tipo de hoja es el único factor
que influye de forma importante en el nivel de etanol obtenido con un p-value menor
a 0.05. De igual manera, para los factores Temperatura y Actividad de celulasa se
ve que se obtienen los mejores resultados en sus niveles bajos: a 25 °C y 20 FPU/g,
aunque estadísticamente no se puede aseverar con el mismo nivel de confianza
como con el factor Tipo de hoja. Por otro lado, se observa que ninguna de las
interacciones entre los factores demostró ser de importancia estadística.
El etanol obtenido puede ser determinado a partir de la información entregada en la
Ilustración 8 y en la Tabla 7, teniendo en cuenta que una prueba de densidad arrojó
que las muestras tenían una densidad cercana a la del agua: 1.02 g/mL. La
conversión fue determinada como las moles de azúcar que reaccionaron,
equivalente a la mitad de las moles de etanol producidas (ver Ecuación (2)), dividido
sobre las moles de azúcar que reaccionaron y las que fueron medidas por
espectrofotometría. Esto se basa en la suposición de que la transformación del
azúcar en etanol y dióxido de carbono es la única reacción en el proceso donde se
consume el sacárido:
%𝐶𝑜𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖ó𝑛 =𝑀𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝑞𝑢𝑒 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑛
𝑀𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠=
𝑊𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙2∗𝑃𝑀𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
𝑊𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠𝑃𝑀𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟𝑒𝑠
+𝑊𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
2∗𝑃𝑀𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
(3)
38
Tabla 6. Conversión del azúcar a etanol en el proceso.
Con los resultados obtenidos, se observa que se obtuvo un buen nivel fermentación
en el proceso, siendo este especialmente efectivo para la hoja tipo Híbrida. Deben
evaluarse las causas por las cuales no se obtuvo etanol en lo absoluto para los
primeros dos tratamientos de la tabla.
Respecto a los resultados obtenidos en la sacarificación, la mayor concentración de
azúcares libres obtenida al último día y en general a lo largo del proceso fue para el
tratamiento BH2x y la menor fue del tratamiento BH3x, con 16.38 y 1.93 g/L
respectivamente. El volumen de cada muestra era de aproximadamente 112 mL (50
mL medio buffer + 50 mL hojas pretratadas 6% p/v + 11 mL levadura activada + 1
mL celulasa). Con estos valores conocidos más los encontrados para los azúcares
totales extraíbles de las hojas se puede determinar el porcentaje de sacarificación
al final del proceso teniendo en cuenta el azúcar convertido a etanol:
Tratamiento Azúcares (g) %Etanol p/p Etanol (g) Conversión
AG2x 1.46 0.00% 0.000 0.00%
AG3x 0.91 0.00% 0.000 0.00%
AH2x 1.60 0.59% 0.677 45.22%
AH3x 0.86 0.25% 0.285 39.32%
BG2x 1.41 0.06% 0.069 8.77%
BG3x 0.40 0.04% 0.046 18.40%
BH2x 1.83 0.23% 0.269 22.30%
BH3x 0.22 0.17% 0.196 63.97%
39
Tabla 7. Rendimiento del proceso de sacarificación para cada tratamiento.
Los porcentajes por encima del 100% indican que la sacarificación fue más eficiente
que en el proceso para la determinación de azúcares reductores totales extraíbles.
Esto no resulta del todo ilógico, puesto que el procedimiento SSF incluyó celulasas,
a diferencia del procedimiento descrito en el inciso 4.1, donde no fueron incluidas
estas enzimas. Debe recordarse que el dato de etanol detectado en una réplica del
tratamiento AH2x merece ser revisado por ser muy grande, trasladando el error
hasta este punto.
Sin embargo, se recomienda en trabajos futuros realizar una revisión al método
implementado para la determinación de azúcares totales pues al parecer no se
obtuvo la cantidad de azúcares absoluta que podía obtenerse de las hojas; sin
embargo, las cantidades de azúcar parecen ser demasiado altas. Aun así, estos
resultados demuestran que para algunos niveles el pretratamiento empleado para
el proceso SSF fue inequívocamente apropiado.
Finalmente, se calculó el rendimiento del proceso realizando el producto entre la
eficiencia de la sacarificación y de la fermentación. Debido a que los porcentajes de
sacarificación hallados fueron mayores al 100%, se tomó como base el mayor de
Tratamiento Azúcares (g) Azúcar reacc. (g) Azúcar teór. (g) %Sacarificación
AG2x 1.46 0.00 1.2834 113.53%
AG3x 0.91 0.00 1.2834 70.97%
AH2x 1.60 1.32 1.4574 200.93%
AH3x 0.86 0.56 1.4574 97.15%
BG2x 1.41 0.14 1.2834 120.36%
BG3x 0.40 0.09 1.2834 38.23%
BH2x 1.83 0.53 1.4574 162.03%
BH3x 0.22 0.38 1.4574 41.16%
40
estos ignorando el resultado del tratamiento AH2x por el posible error que pueda
seguir transmitiendo, por tanto se toma el valor del tratamiento BH2x:
%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =%𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛
%𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛𝐵𝐻2𝑥
∗ %𝐶𝑜𝑛𝑣𝑒𝑟𝑠𝑖ó𝑛 (4)
Tabla 8. Rendimiento del proceso SSF. *El valor del tratamiento AH2x queda a revisión por el alto error presentado en las mediciones de etanol obtenido.
De esta manera se tiene, ignorando el resultado para AH2x, que se obtuvo un
rendimiento del 23.58% del proceso. Esto indica en otras palabras que de cada 1
mol de azúcar que pudo obtenerse en el proceso, se obtuvieron 0.236 moles de
etanol. Pasando este valor a unidades de masa y teniendo la relación de azúcares
obtenidas del tratamiento BH2x (el de mayor sacarificación) por masa de hojas
presentes en cada muestra, se obtiene que por cada 100 gramos de hojas secas,
se obtienen 5.08 gramos de etanol:
𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 =23.58 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
100 𝑚𝑜𝑙𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟∗
46𝑔𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
180 𝑔𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟
𝑚𝑜𝑙𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟
∗1.83+0.53 𝑔𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟
3 𝑔ℎ𝑜𝑗𝑎= 0.0508
𝑔𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
𝑔ℎ𝑜𝑗𝑎 (5)
Queda para estudios futuros la revisión de datos como el error de la cantidad de
etanol obtenida del tratamiento a 25 °C de la hoja Híbrida con 20 FPU/g de celulasa
(AH2x), del cual es posible que se tenga un rendimiento notable. Se realizó un
Tratamiento %Sacarificación %Conversión %Rendimiento
AG2x 113.53% 0.00% 0.00%
AG3x 70.97% 0.00% 0.00%
AH2x* 200.93% 45.22% 56.07%
AH3x 97.15% 39.32% 23.58%
BG2x 120.36% 8.77% 6.51%
BG3x 38.23% 18.40% 4.34%
BH2x 162.03% 22.30% 22.30%
BH3x 41.16% 63.97% 16.25%
41
análisis factorial de la variable Rendimiento. Para este análisis se dejó vacía la
casilla de rendimiento para todas las réplicas del tratamiento AH2x. Esto ocasiona
que el diseño factorial no sea ortogonal, pero se puede generarse de todas formas
la gráfica de efectos principales que se muestra a continuación:
Ilustración 12. Gráfica de efectos de cada factor sobre el rendimiento del proceso.
De esta manera se puede analizar que, aunque no sea un diseño factorial
adecuado, el rendimiento suele ser mayor cuando se tiene de forma individual una
temperatura de 25 °C, hoja Híbrida o actividad en 20 FPU/g. Estos 3 sucesos
aconteciendo de forma simultánea pueden generar un nivel de etanol prometedor
que deberá ser probado en trabajos futuros.
42
6. CONCLUSIONES
Para la primera parte de las experimentaciones se puede comentar que el tiempo
en la determinación de azúcares extraíbles del material lignocelulósico es una
función a tener en cuenta. Al aumentar el tiempo, la cantidad de azúcares
estructurales disminuye para transformarse en glucosa y ser consumida por
procesos metabólicos propios de la hoja. Ya que se emplean celulasas, enzimas
especializadas en la degradación de celulosa en azúcares más simples, lo mejor es
emplear las hojas cuando son recién cortadas para evitar el consumo de azúcares
en el metabolismo de las mismas.
Los resultados de sacarificación demuestran que el pretratamiento dado a las hojas,
a pesar de su sencillez, fue adecuado; con este se obtuvo al final en algunos casos
más azúcares de los esperados, así que se recomienda aplicar este pretratamiento
a posibles trabajos futuros con material lignocelulósico parecido al utilizado en este
proyecto.
Ya en el proceso de sacarificación y fermentación simultáneas los resultados de
conteo celular dieron no presentaron problema alguno, puesto que los cultivos
crecieron, unos a ritmos diferentes de los otros gracias a la temperatura y al tipo de
hojas; la relación entre el crecimiento celular y el tipo de hojas es interesante y
podría ser estudiado a futuro.
Por otro lado, el seguimiento de azúcares reductores libres presentó valores lógicos,
aunque se debe revisar la interacción de este con la actividad de la celulosa, la cual
resultó ser inversa a la esperada. El análisis estadístico determinó que la interacción
43
Temperatura-Actividad era significativa, de lo cual se puede intuir que a una
temperatura dada la enzima puede dejar de ser efectiva o no actúa en lo absoluto,
causando niveles mínimos de sacarificación.
En cuanto a la variable de interés, la producción de etanol, se puede reconocer que
el proceso fue provechoso en ciertos niveles, donde se obtuvo una eficiencia en
peso de hasta 5%. De todas maneras hay un tratamiento cuyos resultados poco
confiables no permiten aseverar que tenga un rendimiento mayor, pero
estadísticamente se espera que el mejor resultado se obtenga a 25 °C con una
actividad de 20 FPU/g con hoja híbrida. Mientras esto no pueda ser asegurado, el
mejor rendimiento lo dio el tratamiento a 25 °C, actividad de 30 FPU/g y hoja híbrida.
44
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