UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

QUÍMICA INDUSTRIAL

Estudio fitoquimico y microbiológico en el extracto etanólico de Acalypha arvensis y

Acalypha Alopecuroidaes

LABORATORIO DE FITOQUÍMICA

DOCENTE: QI. MARÍA MAGDALENA LUNA BARRADASTÉCNICO ACADÉMICO: MC. ODÓN CASTAÑEDA CASTRO

INTEGRANTES:JESUS ANTONIO CRUZ NAVARRO

ALDO MARTÍNEZ HERNÁNDEZOSCAR ANTONIO SÁNCHEZ AGUIRRE

MARCO TEÓRICO

Descripción de Acalypha arvensis Poepp. & Endl

Los autores Standley y Steyermark, 1949; Stevens et al., 2001, describen a la hierba del

pastor como una hierba de vida corta (a veces perennes), a veces leñosa en la base, que

llega a medir 70 cm de alto, su tallo es erecto o ascendente, simple o ramificado, con

pelillos cortos (a veces erguidos).

Sus hojas son alternas, rómbico-ovadas, de hasta 7 cm de largo y hasta 4 cm de ancho, con

el ápice variable, los márgenes aserrados, la base redondeada o angostándose, cubiertas de

abundantes o escasos pelillos. Los pecíolos de hasta 3 cm de largo, con pelillos como en los

tallos, sin glándulas en el ápice. En el tallo, junto a la base del pecíolo, se presentan un par

de hojillas llamadas estípulas, muy angostas, de hasta 5 mm de largo.

Sus inflorescencias son Espigas en las axilas de las hojas. Las espigas masculinas están

ubicadas en la parte media de la planta, de hasta 3 cm de largo y hasta 1.5 mm de grueso,

sobre pedúnculos de hasta 2.5 cm de largo y cubiertos de pelillos como los de los tallos,

estas espigas están compuestas de flores masculinas dispuestas en grupitos en las axilas de

brácteas diminutas. Las espigas de la parte superior de la planta (de hasta 8 cm de largo y 2

cm de ancho cuando ya se han desarrollado los frutos) son femeninas, sobre pedúnculos de

hasta 3 cm  de largo y cubiertos de pelillos que a veces son glandulares, estas espigas están

compuestas por flores femeninas (a veces unas pocas masculinas) dispuestas en grupitos (1

a 3 flores) en las axilas de brácteas, éstas densamente agrupadas (ocultando el eje de la

espiga), divididas en 3 a 7 lóbulos triangulares con una larga y delgada punta (de hasta 5

mm de largo), cubiertas de pelillos largos y erguidos y pelos glandulares.

Sus flores masculinas son muy pequeñas, casi sésiles, el cáliz con 4 lóbulos, pétalos

ausentes, estambres generalmente 8, libres. Las flores femeninas sésiles, el cáliz de 3 a 5

lóbulos, pétalos ausentes, el ovario con 2 a 3 estilos de hasta 4 mm de largo, unidos hacia la

base y divididos en delgados segmentos hacia el ápice, rojizos. A veces se presentan

algunas flores femeninas sésiles o pedunculadas, que no van acompañadas de brácteas.

El fruto es una cápsula de hasta 1.5 mm de largo y más o menos 2 mm de ancho, cubierta

de pelillos, y que al madurar se separa en 2 o 3 segmentos (quedando la columnela en el

centro).

Clasificación taxonómica de Acalypha arvensis Poepp. & Endl

Se encuentra en el reino Plantae dentro del subreino Traqueobionta (plantas vasculares) con

superdivisión Spermatophyta (plantas con semillas) en la división Magnoliophyta (plantas

con flor) dentro de la clase Magnoliopsida, ubicada en la subclase Rosidae y finalmente se

ubica en el orden Euphorbiales.

Distribución en México

Se ha registrado en Campeche, Chiapas, Colima, Morelos, Oaxaca, Tabasco y Veracruz

(Villaseñor y Espinosa, 1998).

Nombres comunes usados en español

Hierba del cáncer, gusanillo, gusanito, mata-gusano, corrimiento, gatito, espinosilla, hierba

del gusano (Martínez, 1979; Standley y Steyermark, 1949).

Imagen 1. Inflorescencias de Acalypha arvensis Poepp. & Endl

Usos de Acalypha arvensis Poepp. & Endl

En Veracruz, los usos medicinales que se dan a esta planta la indican contra la diarrea y

como antiemético, para lo cual se emplea la planta entera en cocimiento administrada por

vía oral. Se prescribe: en buches para aliviar granos en la boca (aftas); de forma externa, en

lavados locales para sanar heridas y granos, o en baños para los niños recién nacidos.

Incluso se aconseja su uso contra las picaduras de capulincillo (picadura de araña capulina).

En Tabasco, para la aliviar la sarna se dan baños con la cocción de las hojas, o maceradas

junto con tabaco se aplican para el piquete de araña.

Efectos farmacológicos de Acalypha arvensis Poepp. & Endl

Únicamente se ha demostrado la actividad antibiótica contra Staphylococcus aureus que

ejerce la tintura de las hojas, la cual fue probada también contra Escherichia

coli, Pseudomona aeruginosa y Candida albicans con resultads negativos. Además se

investigaron, la actividad diabética en rata y la acción citotóxica de los extractos

metanólico, clorofórmico y etéreo, en cultivos de células de carcinoma humano de colon

CO-115, sin resultados positivos.

El inicio de la Herbolaria y la Medicina Tradicional

El consumo sistemático de plantas con atributos medicinales se remonta posiblemente a 2

millones de años en algún lugar de África, cuna de la humanidad. Los primeros prosimios,

probables ancestrales del hombre, buscaban en las imponentes selvas los paliativos para

eventuales disturbios orgánicos. A medida que la evolución ensayaba y esculpía la

inteligencia en los primeros hominídeos, el instinto fue cediendo lugar a la razón, y la

búsqueda de la flora, ahora empírica, pasó a contar con un fuerte aliado: el espíritu

investigador. (Chifa, 2010)

En los orígenes de la historia, cuando la sabiduría popular fue emergiendo de las tinieblas,

la noción de planta activa fue englobando tanto a la que alimentaba, a la que curaba como a

la que mataba. Brujos, magos y curanderos poseían a la vez la ciencia de los venenos y de

las drogas, por lo que se les atribuía un poder relacionado con los espíritus y con lo

sobrenatural. La herbolaria, producto de una rica tradición cultural de nuestros pueblos,

posee mayor antigüedad que cualquier otra terapia. La eficacia terapéutica intrínseca que

posee la herbolaria americana, se debe a las propiedades que derivan de los principios

activos de las plantas y que han sido utilizadas por generaciones enteras con el éxito

deseado. Pero no solamente curan los metabolitos secundarios contenidas en las plantas, un

fuerte componente de carácter cultural se añade a la terapia para hacer de esta un

tratamiento exitoso (Chifa, 2010).

La interacción del hombre con su variada naturaleza generó una gran cantidad de

conocimientos científicos y empíricos sobre el correcto aprovechamiento de los recursos

que nos ofrecen las plantas. Es por esta razón que la medicina tradicional encuentra en

América Latina un lugar preponderante, pues la cosmovisión indígena valoriza las formas

naturales de entender y curar las enfermedades en contraposición de lo que predica la

medicina clásica.

En América, la medicina reconocida oficialmente para atender las distintas enfermedades

del pueblo es la alopática, que reduce al enfermo como si se tratara de una máquina

descompuesta que será restaurada. Utiliza para esto un despliegue impresionante de

tecnología producida en los países capitalistas avanzados y, por otra parte, se basa en el

consumo inmoderado o descontrolado de fármacos. La mayoría de estos fármacos fueron

investigados y elaborados para atender las patologías de los países desarrollados de acuerdo

a las necesidades propias de aquellos países. Las corporaciones multinacionales que los

producen, invaden los países que dependen de una economía de mercado circunscripta al

capitalismo internacional, en virtud de que en dichos países existen pocas estrategias de

control.

Dentro de estas otras medicinas, se encuentran la herbolaria, la homeopatía, la acupuntura,

el naturismo, el curanderismo, el chamanismo, el espiritualismo, y en general la medicina

indígena tradicional. Estas prácticas alternativas de la medicina, muchas veces

denominadas medicinas paralelas, quedan ignoradas por la ciencia médica oficial y por lo

tanto borrada de las preocupaciones de las demás ciencias, incluidas las sociales. No

obstante, en el panorama cotidiano, las medicinas marginales, especialmente la medicina

indígena tradicional, muchas veces llamada medicina popular, constituyen una realidad a la

que se debe conocer, respetar y contribuir a su preservación de una manera positiva y

creativa.

La Medicina Tradicional ha desempeñado un papel importante en el tratamiento de diversas

patologías, fundamentalmente en los países en desarrollo. En ellos, el 80 % de la población

acude a este tipo de medicina para satisfacer las necesidades primarias de salud. Si bien los

productos de origen vegetal, particularmente las drogas secas y los extractos, pasaron de

ocupar un lugar preponderante a un segundo plano, en las últimas décadas han vuelto a

alcanzar una presencia cada vez mayor en la Medicina Occidental. Este retorno ha sido

propiciado por el regreso hacia lo natural, pero también debido al desarrollo científico de

los fitomedicamentos y al mayor conocimiento del riesgo beneficio de los fármacos

sintéticos. (Prieto-Gonzales, et al. 2002).

Muchos profesionales de la salud cuestionan esta medicina por el hecho de no contar con la

explicación de algunos de los efectos que produce. El hecho de que no exista en este

momento un método capaz de desentrañar los fenómenos físico/químicos que expliquen los

cambios biológicos que tienen lugar con la aplicación de estas terapias, no invalida su

carácter científico, por lo que cada día hay más investigación sobre los principios activos en

plantas. (Barranco, 2009).

El estudio químico de las plantas

Se estima que el número de especies de plantas con flores está situado entre 200000 y

250000, distribuidas entre 300 familias y 10500 géneros. Pese a la rápida expansión de la

literatura fitoquímica, solo un pequeño tanto por ciento de la totalidad de las especies se ha

estudiado y queda, por tanto, un amplio campo de investigación (Trease y Evans, 1991).

Dependiendo la cultura y el país, las plantas que se encuentran en dichas regiones han sido

utilizadas para fines curativos o remedios naturales, lográndose una colección vegetal

recopilada por siglos mediante tanteos y errores utilizando al propio humano como

conejillo de indias, sin saber cuáles fuesen las consecuencias y las reacciones secundarias.

A raíz de ello, se sabe que plantas sirven para curar determinadas enfermedades y que parte

de la planta utilizar, logrando que este conocimiento sea transferido de generación a

generación, sin embargo, la población desconoce cuál es el principio activo o que ocasiona

que la enfermedad sea curada.

Este tema ha llamado la atención considerablemente, y al cabo de muchos años, ha llevado

al químico hacia la investigación básica y aplicada en el campo de la botanica, logrando

que en los últimos 40 años se hayan aislado y caracterizado miles metabolitos secundarios

(alcaloides, heterósidos, etc), permitiendo una prospección de muchas muestras de plantas.

Un examen de la lista de fármacos derivados de fuentes naturales revela que la mayoría

procede de Espermatofitas, plantas con semilla que predominan en el campo.

El análisis fitoquímico tiene por objetivo determinar los metabolitos secundarios presentes

es una especie vegetal a estudiar, aplicando para ello una serie de técnicas de extracción,

separación, purificación y determinación estructural (UV, IR, RMN, Masas, etc). (Look,

1994).

Se han desarrollado una serie de métodos para la detección preliminar de los diferentes

constituyentes químicos, basados en la extracción de estos con disolventes apropiados y en

la aplicación de pruebas de coloración.

Uno de los métodos clásicos de análisis muy utilizado para el estudio químico de una planta

son los ensayos a la gota o marcha fitoquímica (esquema 1), que consiste en una previa

maceración de la parte de la planta a estudiar, para posteriormente realizar pruebas al

extracto utilizando diversos reactivos reportados en la bibliografía, con el objetivo de

conocer qué tipo de metabolitos secundarios están presentes. Actualmente, esta

metodología suele ser complementadas con técnicas más avanzadas como las técnicas

cromatograficas, dentro de las cuales, las más utilizadas son: cromatografía en capa fina

(CCF) la cual se utiliza para tener una noción de la cantidad de metabolitos presentes en

una muestra, cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC, por sus siglas en inglés) que

se usa para cuantificar los metabolitos en un extracto de una planta, y la cromatografía de

gases, que se utiliza para la identificación de metabolitos secundarios volátiles, como

aceites esenciales y diversos tipos de alcoholes.

Planta seca y pulverizada

Extracto etanólico

Maceración en caliente con EtOH por 48 h

Fracción A

Taninos Aminoacidos Flavonoides

Insoluble Solución acida

Fracción B

Esteroles Quinonas Fase orgánica Fase acuosa

Fracción C

Esteroides Alcaloides

cc. a sequedad + 4ml de DCM

cc. a sequedad + 4ml de HCl al 1%

Fracción D Fracción E

Fase orgánica Fase Ac.

Extraer con EtOH, DCM

3:2

cc. a sequedad y ext con 150ml de HCl al 1% a 50°C

Lavar con agua y ext con DCM.

Alcalinizar con NH4OH y extraer con DCM

Lavar con agua, secar y llevar a 50mL

Esteroides Flavonoides Antocianinas Alcaloides

Alcaloides Antocianidinas

Esquema 1.

Metabolitos secundarios frecuentes en las plantas

Se llaman metabolitos secundarios a los compuestos químicos sintetizados por las plantas

los cuales cumplen funciones “no esenciales”, de forma que su ausencia no es fatal para la

planta, ya que no intervienen en el metabolismo primario de la planta. Los metabolitos

secundarios intervienen en las interacciones ecológicas entre la planta y su ambiente.

(Swain, 1973).

Los metabolitos secundarios se agrupan según su origen biosintético, y así podemos

mencionar a los terpenos, esteroides, flavonoides, saponinas, cromenos, benzofuranos,

coumarinas, quinonas, entre otros.

Alcaloides

Un diverso número de plantas contienen alcaloides, y tan solo las propiedades químicas

debidas al nitrógeno básico unifican las numerosas clases de alcaloides, por lo que su

importancia, taxonomía y biogénesis son enjuiciadas de forma adecuada en relación a una

determinada clase de alcaloides. (Trease y Evans. 1991).

Es un tanto difícil definir el termino alcaloide debido a que no existe una clara distinción

entre alcaloides y aminas complejas de origen natural, sin embargo, en la literatura se

encuentran diferentes “definiciones” del termino alcaloide, Pelletier (1982) citado por

Bañuelos, et al. (2006) define a los alcaloides como “compuestos cíclicos que contienen

nitrógeno en un estado de oxidación negativo, cuya distribución está limitada en

organismos vivos”, mientras que Korolkovas y Burchkalther (1983) definen a los alcaloides

como sustancias orgánicas nitrogenadas con carácter básico.

Los alcaloides típicos son de origen vegetal, básicos, contienen uno o más átomos de

nitrógeno (generalmente en un anillo heterocíclico) y suelen poseer una marcada acción

fisiológica en el ser humano y otros animales. En la práctica, las sustancias presentes a los

ensayos cualitativos descritos más adelante son denominados alcaloides. Varios

compuestos nitrogenados derivados de bacterias, hongos y animales también son

considerados como alcaloides, entre ellos los aislados de las ranas del genero Phyllobates,

que constituyen algunas sustancias más venenosas para el hombre, hasta ahora conocidas.

Imagen 2: Ejemplo de alcaloides.

Los alcaloides pueden clasificarse como primarios (mescalina), secundarios (efedrina) y

terciarios (atropina) o cuaternarios; aspecto que afecta, tanto a los derivados alcaloídicos

que pueden prepararse como a los procedimientos de su aislamiento. En las plantas los

alcaloides pueden existir en estado libre, al estado de sales, como amina o como alcaloide

N-oxidos.

Clasificación de los alcaloides

Debido a la gran diversidad de alcaloides que se han aislado y a su variedad de estructuras,

es difícil una clasificación, sin embargo, Martínez (2007) clasifica a los alcaloides

dependiendo del aminoácido de procedencia de la siguiente manera:

Alcaloides derivados de la ornitina y lisina

Alcaloides derivados de la tirosina y fenilalanina

Alcaloides derivados del triptófano

Alcaloides derivados del ácido nicotínico

Alcaloides derivados de la histidina.

El metabolismo de la ornitina da origen a un conjunto de alcaloides denominados

pirrolizidínicos (procedentes de dos moléculas de ornitina). Los alcaloides tropánicos se

caracterizan por tener un núcleo de tropano (biciclo formado por un anillo de piperidina y

uno de pirrolidina) además de ser esteres entre el alcohol tropánico y un ácido aromatico o

alifático. Los alcaloides derivados de la lisina tienen un anillo de piperidina, de indol o

derivados de quinolinas. Los alcaloides de la tirosina y fenilalanina tienen un núcleo de

isoquinolina.

Los alcaloides del triptófano son derivados de un producto de descarboxilación, la

triptamina. Se caracterizan por presentar un núcleo de tipo indol y se considera un grupo de

alcaloides con más amplia variedad, dicho grupo tiene grandes intereses farmacológicos,

terapéuticos y químicos. Entre estos alcaloides existen multitud de derivados que presentan

propiedades psicodislépticas.

Los alcaloides derivados de la ergolina presentan una estructura tetraciclica, llamada

ergolina, formada a partir de la inserción de un resto de isopreno al nucleo de indol, los

alcaloides más activos de este tipo son los derivados del ácido lisérgico.

Figura 3. Tipos de Alcaloides

Métodos de identificación

Las técnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en

estado de sal (extractos ácidos), de combinarse con el yodo y metales pesados como

bismuto, mercurio, tugsteno formando precipitados; estos ensayos preliminares se pueden

realizar en el laboratorio o en el campo.

En la práctica, se utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como: la solución de

yodo-yoduro de potasio (Reactivo de Wagner), mercurio tetrayoduro de potasio (reactivo

de Mayer), tetrayodo bismuto de potasio (reactivo de Dragendorff), solución de ácido

pícrico (reactivo de Hager), ácido sílico túngtico (reactivo de Bertrand), p-dimetilamino

benzaldehido (reactivo de Ehrlich); nitración de alcaloides (reacción de Vitali-Morin se usa

para alcaloides en estado base).

El reactivo de Mayer: se prepara disolviendo 1.3 g de bicloruro de mercurio en 60 ml de

agua y 5 g de yoduro de potasio y se afora a 100 ml. Los alcaloides se detectan como un

precipitado blanco o de color crema soluble en ácido acético y etanol. El reactivo de

Dragendorff: se prepara mezclando 8 g de nitrato de bismuto pentahidratado en 20 ml de

ácido nítrico al 30% con una solución de 27.2 g de yoduro de potasio en 50 ml de agua. Se

deja en reposo por 24 horas, se decanta y se afora a 100 ml. La presencia de alcaloides se

detecta por la formación de un precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo

a una solución ácida de alcaloides. Algunas sustancias oxigenadas con alta densidad

electrónica como es el caso de las cumarinas, chalconas, maltol, acetogeninas, etc. pueden

dar falsos alcaloides con el reactivo de Dragendorff.

Saponosidos

Los vegetales cuyo contenido de saponinas es alto, se han utilizado en diversas regiones del

mundo debido a sus propiedades tenso activas.

Las saponósidos se caracterizan por producir espuma en solución acuosa, siendo esta

propiedad una prueba de identificación para reconocer a estos compuestos, así mismo,

poseen propiedades hemolíticas, es decir, si se inyectan al torrente sanguíneo pueden

producir intoxicación, tienen un elevado peso molecular y su aislamiento en estado puro es

difícil, ya que se hidrolizan en ácidos dando una genina y diversos azucares y ácidos

urónicos relacionados.

Los saponósidos tienen un gran interés por su explotación industrial, ya que la industria

farmacéutica utiliza diversas drogas con saponosidos para la obtención de formas galénicas.

La biosíntesis de las saponósidos se realiza mediante la ruta del ácido mevalónico. La

ciclación que sufre el escualeno (Imagen 4) da origen al colesterol, el cual a su vez, sufre

diversas modificaciones para generar diferentes sapogeninas (imagen 5).

Imagen 4. Ciclación del escualeno y formación del colesterol

Imagen 5. Metabolitos del colesterol

Clasificación de los saponosidos

Según la estructura de la genina se conocen dos grupos de saponósidos; los tipo esteroide y

triterpenoide pentacíclico (imagen 6 ).

Imagen 6. Saposido esteroidal (izquierda) y saposido triterpenoide pentacíclico (derecha)

Los saponósidos esteroidales poseen un esqueleto de 27 átomos de carbono que consta

habitualmente de seis ciclos: los dos ciclos E (furánico) y F (piránico) ocurren por

cetalización intramolecular causada por una oxidación.

Los saponósidos esteroidales no se encuentran ampliamente distribuidos como las

triterpenoides pentacíclicas, sin embargo, estos compuestos son de gran interés debido a su

alta relación con las hormonas sexuales, cortisona, esteroides diuréticos, vitamina D y

heterosidos cardiotónicos.

Los saponósidos naturales se diferencian por su configuración en los átomos de carbono 3,5

y 25, en algunos casos, el anillo F se mantiene abierto para la formación de glucósido.

Muchos saponósidos esteroidales se utilizan para la fabricación de fármacos, un ejemplo

claro es el da la hecogenina, la cual se utiliza como producto de partida parta la síntesis de

corticosteroides, mientras que la diosgenina se utiliza para la fabricación de anticonceptivos

orales. A diferencia de los saponósidos esteroidales, los saponósidos triterpenoides

pentacíclicos abundan en muchas familias de dicotiledóneas. En estas, la saponina se

encuentra unida a una cadena de azucares o de ácido urónico, generalmente en la posición

3.

Los saponósidos triterpenoides se han clasificado en tres grupos, representados por α-

amirina, β-amirina y lupeol (imagen 7).

Imagen 7. Tipos de saponósidos triterpenoides. a) α-amirina, b) β-amirina y c) lupeol

Esta ciclación conduce a los dammaranos, moléculas tetracíclicas que existen al estado de

heterósidos en drogas como el ginseng, o, cuando dicha ciclación implica una

conformación diferente del precursor, a los cucurbitanos. Los ácidos triterpenoides

relacionados se forman por sustitución de un grupo metilo por un grupo carbonilo en

posiciones 4, 17 ó 20 de dichas sustancias. Muchas plantas tienen cantidades considerables

de saponósidos triterpenoides, alrededor del 5-10%, sin embargo, la purificación de estos

compuestos resulta una tarea difícil.

Métodos de identificación

Las saponinas esteroides se pueden reconocer fácilmente en los análisis fitoquímicos

preliminares mediante los ensayos de la espuma, hemólisis de glóbulos rojos, Liebermann-

Burchard y ensayos para carbohidratos.

Al agitar una solución acuosa de una muestra que sea o contenga saponinas, se forma una

espuma estable como la obtenida al agitar la solución acuosa de un jabón. Puesto que

existen otras sustancias que pueden formar también espuma, se debe asumir este ensayo

como una prueba presuntiva de la presencia de saponinas esteroides. (Muñoz, 1956).

El ensayo de hemolisis es más confiable que el de la espuma. A una suspensión de glóbulos

rojos en solución salina diluida, se añade una solución de la muestra que se presume que es

o que contiene saponinas. Si los glóbulos rojos se rompen (lisan o hemolizan), se asume

que la prueba es positiva. Este ensayo puede realizarse en tubo de ensayo Cuando la

muestra contiene taninos, deben eliminarse antes de realizar la prueba ya que la interfieren.

Esto se logra por tratamiento repetido de la muestra con óxido de magnesio, el cual forma

complejos insolubles con los taninos, por lo cual es fácil eliminarlos por filtración.

Este ensayo, junto con el de la espuma, cuando ambos resultan positivos en una muestra

vegetal (extracto, fracción ó sustancia pura) permiten establecer que la muestra contiene

saponinas. La sola prueba de espuma positiva no es concluyente para determinar la

presencia de saponinas. Además hay sustancias que interfieren estas dos pruebas como son

los taninos. Si la muestra contiene taninos, estos pueden eliminarse pues se absorben en

MgO.

Por la porción esteroide que poseen las saponinas esteroides, el ensayo de Liberman-

Buchnar puede confirmar su presencia por ejemplo en muestras y extractos vegetales, tal

como se indicó anteriormente para los esteroles, pero debe tenerse en cuenta que al igual

que en el caso de los esteroles -y los esteroides en general- solamente dan un resultado

positivo los que tengan grupos dienos conjugados reales o potenciales. Sin embargo otras

saponinas como las triterpenoides también dan positiva la prueba. (Martinez, 2001)

Técnicas cromatográficas

La cromatografía es una técnica que permite separar los componentes de una mezcla. Esta

separación se logra utilizando un sistema bifásico: fase estacionaria donde se retienen los

compuestos a separar y fase móvil que desplaza de forma diferencial los compuestos a

través de la fase estacionara.

Cromatografía en capa fina

Cromatografía de capa fina (CCF) es un método de separación y purificación de

compuestos orgánicos que depende de la distribución de ellos en la fase estacionaria. Para

efectuar una separación cromatográfica se requiere de una fase estacionaria sólida (material

adsorbente como alúmina, gel de sílice, carbón o celulosa) y de una fase móvil (eluyente).

La muestra se aplica en el adsorbente (en la placa) y luego se deja que pasen a través del

adsorbente los componentes de la mezcla, que se desplazarán dependiendo de su

solubilidad relativa en el eluyente y en el adsorbente. Aquellos que son más solubles y que

son menos atraídos por la fase estacionaria se desplazarán más rápido, mientras que

componentes insolubles quedan en el punto de aplicación.Después del proceso se tiene

como resultado un cromatograma en el cual los componentes separados se revelan, ya sea

por su color inherente o por medio de un método físico o químico. La cromatografía

generalmente se usa como un método cualitativo, pero también se puede usar para efectuar

análisis cuantitativo. (Douglas A Skoog 2008).

Imagen 8. Ejemplo de una elución

Cromatografía en columna

La cromatografía en columna (CC) es el método más utilizado para la separación y

purificación de compuestos orgánicos, sólidos o líquidos, a escala preparativa. La fase

estacionaria (adsorbente) se coloca en una columna de vidrio que termina en un

estrechamiento con una llave y se impregna con el eluyente (fase móvil). La mezcla a

separar se deposita en la parte superior de la columna y la fase móvil atraviesa el sistema.

Los compuestos se van eluyendo disueltos en el eluyente, se van recogiendo

ordenadamente en fracciones de pequeño volumen (1,2,..) y se analizan por cromatografía

en capa fina (CCF). Los productos van saliendo de la columna según su polaridad, primero

salen los menos polares que son los menos retenidos por el adsorbente y los últimos los más

polares por su mayor retención en la fase estacionaria. El adsorbente más utilizado para este

tipo de cromatografía es gel de sílice y en segundo lugar la alúmina.

El tamaño de partícula del adsorbente es importante para la separación y su elección

depende en gran medida de que la elución de la cromatografía se realice por gravedad o a

media presión (flash chromatography). En una elución a media presión se pueden emplear

tamaños de partícula más pequeños, que permiten una separación más eficaz. Sin embargo,

en una elución por gravedad el uso de tamaños de partícula pequeños impediría el flujo del

disolvente. Antes de realizar una separación en cromatografía de columna hay que elegir

adecuadamente el disolvente haciendo ensayos en CCF. (Dupont Durst H. 2007).

Antimicrobianos

Desde el siglo XVIII se han empleado sustancias químicas para el tratamiento de las

emfermedades infecciosas. Paul Ehrlich, quien formulo los principios de toxicidad

selectiva, reconoció las reacciones químicas específicas entre microorganismos y

medicamento, la aparición de la resistencia a estos y el papel de la terapéutica combinada

para combatirlos. Posteriormente se descubrieron las sulfonamidas y se acrecentó el interés

en sustancias antibacterianas de origen microbiano, llamadas antibióticos, de ahí surgió la

penicilina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, etc. Las cuales también han sido

obtenidas sintéticamente, a través de modificación química, total o parcial, de las moléculas

por biosíntesis (Manrique E, 1997).

El ataque a los microorganismos, por parte de los antimicrobianos, se pueden dar de

diferentes maneras: por inhibición de la síntesis de la pared celular, de las funciones de la

membrana celular, de la traducción de material genético y de la síntesis de ácidos nucleicos

(Manrique E, 1997).

El término antibiótico, se refiere a un producto metabólico de un organismo que es

perjudicial o inhibitorio para otros microorganismos en muy pequeñas cantidades, estas

sustancias pueden actuar de dos maneras:

a. Como microbiocidas, es decir, que matan las formas vegetativas de los

gérmenes, específicamente se denominan bactericidas, refiriéndose a bacterias y

fungicidas refiriéndose a hongos.

b. Como microbiostatico, es decir que inhibe el crecimiento de microorganismos y

se denominará, bacteriostático o fungistático, según se refiera a bacterias o a

hongos, respectivamente (Barreto J, 1997).

Control químico antimicrobiano

De acuerdo a lo que menciona (Madigan et al, 2004). Un agente antimicrobiano es un

compuesto químico, natural o sintético, que mata o inhibe el crecimiento de los

microorganismos. Los agentes que matan microorganismos se denominan agentes-cida,

con un prefijo que indica el tipo de microorganismos que mata. Así, tenemos agentes

bactericidas, fungicidas y virucidas. Un agente bactericida mata bacterias; aunque puede

matar o no otros microorganismos.

Los agentes que no matan pero inhiben el crecimiento se denominan agentes-estáticos; así,

se hablará de agentes bacteriostáticos, fungistáticos y virustáticos.

Efecto de los agentes antimicrobianos sobre el crecimiento

Se observan tres tipos de efectos cuando se añade un agente antimicrobiano a un cultivo

bacteriano en fase exponencial de crecimiento: bacteriostático, bactericida y bacteriolítico.

Se observa un efecto bacteriostático cuando se inhibe el crecimiento pero las células no

mueren. Con frecuencia, los agentes bacteriostáticos son inhibidores de la síntesis de

proteínas y actúan uniéndose a los ribosomas. No obstante, dicha unión no es una unión

fuerte y, cuando disminuye la concentración del agente, el antimicrobiano se libera de los

ribosomas y se reanuda el crecimiento. Muchos antibióticos actúan según este mecanismo.

Los agentes bactericidas matan las células pero no dan lugar a la lisis o rotura de las

células. Los agentes bactericidas son una clase de agentes químicos que generalmente se

unen fuertemente a sus dianas celulares de acción.

Los agentes bacteriolíticos provocan la muerte celular por lisis, la rotura celular se detecta

por un descenso en el número de células o en la turbidez, después de que se haya añadido el

agente. Dentro de los agentes bacteriolíticos se incluyen antibióticos que inhiben la síntesis

de la pared celular, como la penicilina y los compuestos químicos que lesionan la

membrana citoplasmática.

Mecanismos de resistencia a antibióticos

Una de las características importantes en las bacterias es su resistencia a los antibióticos. En

este sentido, los mecanismos de resistencia que presentan estos agentes frente a antibióticos

son muy diversos, sin embargo, Flórez et al. (2008) los clasifica en cinco tipos principales:

1) Bloqueo del transporte del antibiótico, 2) expulsión del antibiótico por un mecanismo

activo de bombeo, 3) la modificación enzimática del antibiótico, 4) la modificación del

blanco o sitio de acción del antibiótico, y 5) la producción de una enzima alternativa que

evita el efecto inhibitorio.

En estos mecanismos se encuentran involucrados procesos de mutación, transducción,

transformación y conjugación en las bacterias, que ayudan a que éstas adquieran

resistencia, frente a los fármacos (Calderón, 2008).

Metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana

Algunos de los metabolitos secundarios de las plantas presentan actividad biológica contra

agentes patógenos de humanos (Ríos y Recio, 2005; Barrera-Figueroa et al., 2011)

ofreciendo una fuente alternativa de los recursos disponibles en el combate de

enfermedades infecciosas. Los grupos de metabolitos que se han reportado como agentes

antimicrobianos, de acuerdo a Daciana y Băra (2007), son los siguientes:

Fenoles, polifenoles simples y ácidos fenólicos. El ácido caféico es un ejemplo de

estos compuestos, y es efectivo contra virus, bacterias y hongos. Los grupos

hidroxilo que tienen este tipo de compuestos, se cree que son los que son

responsables de su toxicidad contra microorganismos patógenos.

Quinonas. Grupo de compuestos aromáticos altamente reactivos. La vitamina K es

una naftoquinona que tiene actividad antihemorrágica, lo que puede estar

relacionado con su facilidad de oxidarse en los tejidos.

Por otro lado, este tipo de compuestos se caracterizan por su compleja irreversibilidad al

combinarse con los aminoácidos de las proteínas, con lo cual la inactivan provocando que

pierda su función. Así, el potencial antimicrobiano que se le atribuye a estos compuestos se

debe a la posibilidad elevada de adherirse a polipéptidos de membrana, adhesinas y

enzimas de unión de membrana.

Flavonas, flavonoides, y flavonoles. Compuestos fenólicos con un grupo carbonilo,

los flavonoides también contienen grupos hidroxilo y se agrupan generalmente a un

anillo aromático. Su actividad antimicrobiana probablemente se deba a su afinidad y

unión a proteínas solubles extracelulares como las quinonas. Los flavonoides que

son lipofílicos también pueden romper las membranas microbianas.

Taninos. Estos compuestos tienen una propiedad muy particular ya que son

astringentes, son capaces de unirse a proteínas y desnaturalizarlas. Se dividen en dos

grupos, hidrolizables y condensados. Se encuentran en casi todas las partes de la

plantas. Los taninos también se pueden formar por la polimerización de unidades de

quinonas.

Las actividades biológicas que se les atribuyen son: capacidad de estimular a los fagocitos,

como antitumorales y con un espectro amplio de actividades anti-infectivas contra

bacterias, levaduras, hongos filamentosos, etc. Su capacidad antimicrobiana proviene de su

habilidad para inactivar adhesinas, enzimas, proteínas de transporte, etc.

e. Cumarinas. Compuestos fenólicos resultado de la fusión de bencenos y pironas.

Las actividades más representativas que tiene son anti-inflamatorias,

vasodilatadoras y antitrombóticas. Los reportes sobre su actividad antimicrobiana

son escasos, pero se ha reportado que algunos compuestos de este grupo tienen

actividades fungicidas.

f. Terpenoides y aceites esenciales. Los compuestos que le brindan los olores a las

plantas pertenecen a este grupo, su estructura base son isoprenos. Comparten su

origen con los ácidos grasos, pero difieren de éstos últimos en que los terpenos

forman estructuras largas y cíclicas. Se encuentran reportados como antibacterianos,

fungicidas, antivirales y antiparasíticos.

g. Alcaloides. Grupo de compuestos de las plantas más eficientes y

terapéuticamente significativos químicamente muy diverso. Las actividades

biológicas más representativas que tienen son como analgésico, antiespasmódico y

antibacteriano.

Bacterias patógenas en salud pública

Las bacterias que pueden producir enfermedad se llaman patógenas (pathos: enfermedad,

afeccion) y se conoce como patogenicidad a la capacidad que tiene una bacteria para causar

enfermedad.

Las bacterias pueden ser patógenas para el hombre y para animales así como para las

plantas, por lo que son de gran importancia, no solo en salud pública, sino también en el

campo económico (García, 2005).

Staphylococcus aureus

Imagen 9. Staphylicoccus aureus

Son cocos Gram positivos de 0,5 - 1 mcm de diámetro, inmóviles, aerobios o anaerobios

facultativos, caracterizados por su agrupación en forma de racimo. Crecen a una

temperatura óptima de 37 °C y se desarrollan mejor en un pH ligeramente alcalino de 7.6 la

adición de glucosa favorece el crecimiento (Peñaranda, 2003).

Forma parte de la flora normal de mucosas y piel e intervienen en procesos patológicos

diversos como infecciones supurativas e intoxicaciones alimenticias (Arévalo A, 1996).

Más del 95% de los Staphylococcus aureus producen proteína A, la cual puede estar

asociada a la célula o al medio extracelular, con una importante afinidad. La presencia de

proteína A o coagulasa es de gran utilidad clínica para diferenciar Staphylococcus aureus

de otras especies de Estafilococos (Uribe C, 2003). Staphylococcus aureus es una bacteria

que puede causar infección en todos los grupos de edad tanto en forma esporádica como

epidémica y se ha identificado como una de las principales causas de infección de heridas

quirúrgicas. Su principal forma de transmisión es por contacto (Uribe C, 2003).

La capacidad de S. aureus para fermentar los azúcares como maltosa, manitol, trehalosa es

positiva. La producción de una nucleasa termoestable es un buen indicador de la presencia

S. aureus, al igual que la conversión de nitratos a nitritos (Peñaranda O, 2003)

Escherichia coli

Imagen 10. Escherichia coli

Es un bacilo de 1 – 3 μm por 0.5 μm, que se presenta sólo, en pares, en cortas cadenas o

formando grupos. En general es móvil (por flagelos perítricos), aunque existen variantes

inmóviles no flageladas. No forma esporas y por lo general es no cápsulado y Gram

negativo. En cultivos jóvenes la forma cocobacilar es bastante frecuente; en los viejos se

presentan formas de una dimensión mayor (Peñaranda O, 2003).

En agar forma colonias circulares de 3 a 5 mm convexas, de borde continuo o un tanto

ondulado, brillantes y de coloración blanca un poco amarillenta. Con producción de ácido y

gas, fermenta la lactosa y un gran número de carbohidratos; algunas cepas son lactosa

negativas. Es indol positiva, rojo de metilo positiva, Voges Proskauer (VP) negativa y no

utiliza el citrato. Produce H2S en determinados medios.

Acidifica y coagula la leche. Pueden necesitarse pruebas adicionales en casos de E. coli

aislada de colitis hemorrágicas, las cuales son típicamente negativas a sorbitol. Este bacilo

es aerobio y anaerobio facultativo. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37 °C, pero

posee propiedades de desarrollo en una gama bastante amplia de temperaturas; el pH

favorable es de 7 alguna cepas producen hemolisina (Peñaranda O, 2003).

Se ha considerado inicialmente sólo como un habitante del intestino, desde hace cerca de

tres décadas se empezó a estudiar su poder enteropatógeno. Se ha visto que las cepas

toxigénicas de E. coli pueden producir una enterotoxina termolábil (TL), una termoestable

(TS) o ambas. La TL es una proteína de alto peso molecular, que bioquímicamente es muy

similar a la toxina de Vibrio cholerae, activando la adenilciclasa. Es inactivada a 60 ºC. La

TS es una pequeña molécula relativamente estable al ser hervida (Rodríguez V, 1995).

Salmonella typhi

Imagen 11. Salmonella typhi.

Es un bacilo Gram negativo, aerobio y anaerobio, flagelado, no encapsulado, muere por

ebullición y pasteurización, produce una endotoxina, posee los antígenos somático (O),

flagelar (H) y (Vi).

Los síntomas más frecuentes son: fiebre de 40ºC a 41ºC que puede durar hasta tres semanas

en caso de no dar antimicrobianos, desciende alrededor del quinto día si se administran; la

diarrea se presenta en la mitad de los pacientes alternándose con periodos de constipación,

otros síntomas que pueden presentarse son dolor abdominal, cefalea, fiebre sin sudación,

embotamiento mental, vómitos, dolor faríngeo (Chin, 2001).

Métodos de evaluación de la capacidad antimicrobiana de extractos de plantas

No existe una reglamentación y/o estandarización de la metodología para la evaluación de

la capacidad inhibitoria de extractos de plantas (EP), como se establece para antibióticos.

La mayoría de los métodos están basados en los métodos utilizados para evaluar la

resistencia y/o susceptibilidad a antibióticos.

Los métodos utilizados para evaluar actividad de extractos de plantas sobre bacterias y

hongos suelen ser similares, variando la preparación del inóculo, medio de cultivo,

temperatura y tiempo de incubación (Cowan, 1966).

Los métodos más comúnmente utilizados en laboratorio por su sencillez y rapidez, son: La

técnica de difusión por discos en agar, es utilizada para generar datos cualitativos

principalmente, y los métodos de dilución en medio líquido de cultivo y en agar, ambos

métodos nos permiten conocer datos cuantitativos (Hammer, 1999).

Métodos en Agar

Entre estos métodos el más utilizados por su sencillez y rapidez en la lectura de resultados

es el método de difusión por discos, basados en la metodología utilizada por Bauer et al.,

1966. El principio del método involucra la aplicación de una cantidad determinada de un

antimicrobiano u otra sustancia en un sustrato, (usualmente discos de papel) en la superficie

del agar sobre el cual se ha distribuido un inóculo del microorganismo en estudio; se

formará así, por difusión un gradiente de concentración del producto alrededor del disco y

la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición

del crecimiento bacteriano.

Imagen 12. Ejemplo de inhibición bacteriana

El diámetro obtenido dependerá no sólo de la sensibilidad del microorganismo y la carga

del disco, sino también del espesor de la capa de agar, del pH y de la composición del

medio de cultivo, de la capacidad de difusión del producto en ese medio, de la temperatura

y de la atmósfera de incubación, de la velocidad de duplicación bacteriana, y del tamaño

del inóculo y fase de crecimiento de la bacteria o microorganismos en estudio (INPPAZ,

2000).

Otro método de evaluación en agar es el de dilución en agar, en éste método se incorpora el

producto a evaluar a un medio con agar. El producto se añade cuando el medio aún está

líquido. Para lograr el rango de dilución deseado se prepara una serie de placas, cada una

con una determinada concentración de producto. Las placas se inoculan con un replicador

una vez que se haya solidificado el medio de cultivo (Hammer, 1999).

Los resultados de las pruebas de dilución en agar se expresan como concentraciones

mínimas inhibitorias (CMIs).

Métodos en medios de cultivo líquidos

La cuantificación de la actividad in vitro de los aceites esenciales se realiza habitualmente,

mediante alguna de las variantes de los métodos de dilución. Estos métodos se basan en la

determinación del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones

crecientes del aceite esencial, que se encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo).

Se pueden realizar determinaciones empleando series de tubos con caldo de cultivo con un

rango determinado de aceite (macrodilución). Esta metodología es muy engorrosa, por la

cantidad de material y de manipulaciones necesarias para su realización. La utilización de

micropipetas y de placas de microtitulación facilita la utilización del método de

microdilución en caldo.

Este último método se ha venido usando para la determinación de las concentraciones

mínimas inhibitorias (CMIs) de extractos de plantas (Carro, 2002), describen la CMI como

la menor concentración que mantiene o reduce la viabilidad del inóculo luego de 24 horas

de contacto. En la mayoría de los casos se preparan diluciones del producto a evaluar en

progresión geométrica en base 2 utilizando un medio de cultivo adecuado; posteriormente

se inocula dicho medio y tras la correspondiente incubación para permitir el crecimiento del

microorganismo se realiza la lectura, determinando qué concentración causa la inhibición

del crecimiento del microorganismo.

HIPOT ESIS Y OBJETIVOS

Hipótesis

Los metabolitos secundarios de la planta Acalypha Arvensis y Acalypha Alopecuroidaes

podrían identificarse mediante análisis cualitativo, así mismo, las propiedades bactericidas

de estas planta podrían utilizarse para la inhibición del crecimiento de Staphylococus

aureus y Salmonella typhi

Objetivos

Obtener el extracto etílico de la hierba la Acalypha Arvensis y Acaplypha Alopecuroidaes y

confirmar su efecto inhibidor en las sepas Staphylococus aureus y Salmonella typhi, y

realizar pruebas cualitativas para la identificación y un posible aislamiento de metabolitos

secundarios.

Objetivos particulares

Seleccionar la zona con mayor población de Acalypha.

Muestrear en base a la norma de conducta.

Preparar correcta la muestra en estudio.

Obtener el extracto etanólico de la muestra.

Evaluar la Alelopatia en las sepas seleccionadas.

Ensayo fitoquímico preliminar en la hierba del pastor (Arcalypha arvensis) y su efecto

alelopático en Staphylococus aureus y Salmonella typhi

METODOLOGIA

Toma y acondicionamiento de la muestra

La muestra se obtuvo en el mes de septiembre del 2014 en dos terrenos diferentes ubicados

en la avenida 37 y 39 en la colonia Lázaro Cárdenas, del municipio de Córdoba Veracruz.

Posteriormente se determinó el pH del suelo, las coordenadas y la temperatura, y otra

muestra más, tomada en la avenida 23, calle 43, colonia López Arias.

Imagen 14. Mapa de la zona de recolección

Materiales y reactivos

Los disolventes utilizados en este trabajo fueron de la marca JT Baker® y se usaron sin un

tratamiento previo, para la separación en columna se utilizó Silica Gel de la marca Merk®,

los reactivos utilizados para llevar a cabo la identificación de metabolitos fueron

proporcionados en el Lab. 113 de la Facultad de Ciencias Químicas, Orizaba. Ver.

Extracción de principios activos de Acalypha arvensis

Para la extracción de los componentes del material vegetal se realizó un análisis

fitoquímico preliminar la cual consistió en preparar extractos de las partes de Acalypha

arvensis y Acaplypha Alopecuroidaes (flores, tallo y hojas) tomando una pequeña porción

de ellas y por separado fueron depositadas en matraces Erlenmeyer de 250 mL, donde se

empleó etanol como disolvente, llevándose a cabo la extracción se realizó en caliente.

Imagen 15. Distribución de la extracción.

Se realizaron pruebas fotoquímicas de los extractos de cada parte de la planta con el

objetivo de determinar cuál extracto tiene la característica de presentar un mayor número de

metabolitos, comprobando que la flor y la hoja presentaron dicha característica

Posteriormente, se depositaron en un matraz Erlenmeyer de 1500 mL, 73 g del material

vegetal (Acaplypha Arvensis) previamente triturado y se le añadió etanol, asi mismo, se

añadió 200g de hojas y flor de Acaplypha Alopecuroidaes en otro matraz de 1500mL. Se

mantuvo en reflujo durante 12 horas con la finalidad de hacer una extracción exhaustiva,

cambiando el disolvente cada determinado tiempo por disolvente limpio para continuar con

la extracción.

Imagen 16. Maceración en caliente

Decoloración y disminución del volumen del extracto etanólico de Acalypha arvensis

Al término de la extracción, se tomó una pequeña cantidad de los extractos y se depositaron

en tubos de ensaye para escoger el mejor método para eliminar las clorofilas.

Se realizaron pruebas con arcilla de tonsil y carbón activado, para ello se calentó el

extracto hasta su punto de ebullición seguidamente se le añadió arcilla de tonsil a uno de los

tubos y al otro carbón activado, se continuo calentando por unos momentos más y se filtró

en caliente a través de papel filtro Whatman no.1, observándose que el carbón activado

tiene una mayor adsorción de clorofilas. Una vez decolorado el extracto, se concentró a

50ml en un rotovapor.

Imagen 18. Evaporación en rotavapor

Pruebas fitoquímicas

Teniendo el extracto previamente decolorado, se procedió a realizar pruebas fotoquímicas

mediante ensayos a la gota para identificar alcaloides, flavonoides, coumarinas, esteroles,

quinonas, saponinas, glicosidos cardiotónicos, sesquiterpenlactonas, polifenonesl

fenilpropanoides e iridoides, siguiendo las presentes metodologías.

Alcaloides

Se realizaron las pruebas fitoquímicas al extracto etanólico de Acalypha arvensis de

acuerdo a la metodología de Dominguez, 1983, para la identificación de los metabolitos

secundarios. Las cuales consisten en reacciones de precipitación y coloración.

Para la identificación de alcaloides, se utilizó la prueba de Mayer y de Dragendorff. Para la

prueba de Mayer, se utilizó una muestra de extracto previamente acidulada con ácido

sulfúrico o ácido clorhídrico diluido, se trató con unas gotas de reactivo de Mayer, mientras

que para la prueba de Dragendorff, se usó una muestra de extracto previamente acidulada

con ácido sulfúrico o ácido clorhídrico diluido y se tratío con unas gotas del reactivo de

Dragendorff.

Como método adicional, se utilizó la prueba de Wagner, en la cual se manejó una muestra

del extracto acuoso o etanólico previamente acidulada, y se trató con el reactivo de

Wagner.

Flavonoides

Para la identificación de flavonoides se utilizó la prueba con vapores de amoniaco y otra

metodología utilizando NaOH al 5%. Se sometió una muestra del material a estudiar, a

dichos reactivos con el objetivo de observar cambios de coloración en la muestra vegetal.

Como método adicional, se utilizó la reacción de Shinoda, usando una porción de extracto

alcohólico incoloro o ligeramente amarillo, con una viruta de magnesio y 3 gotas de ácido

clorhídrico concentrado con la finalidad de observar un cambio de coloración.

Coumarinas

Para la identificación de coumarinas, se utilizó la reacción de formación de hidroximato,

donde se utilizó una gota de extracto etanólico a la cual se le añadió una gota de solución

de metanol 2N de clorhidrato de hidroxilamina y una gota de solución metanólica 2N de

KOH. Se calentó la mezcla durante unos minutos y se enfrió para posteriormente acidular

con HCl 0.5 N y añadir una gota de cloruro ferrico al 1%, con la finalidad de observa la

formación de una coloración violácea.

Se utilizó como complemento la prueba de Legal, donde se disolvió una pequeña muestra

de extracto con tres gotas de piridina y se adicionó una gota de solución de nitroprusiato de

sodio al 0.5% y posteriormente cuatro gotas de KOH 2N, con el objetivo de observar un

cambio de coloración a rosa-rojo.

Finalmente se usó la prueba de Erlich para grupo furano, donde a una muestra del extracto

etanólico, se le agregaron unas gotas de p-dimetilaminobenzaldehido al 5% en etanol y se

añadió HCl concentrado, con el propósito de observar un cambio de coloración.

Esteroles

Para determinar la presencia de esteroles se utilizó la prueba de Liebermann-Burchard,

mezclando 1mL de anhídrido acético y 1mL de cloroformo, posteriormente se añadió una

gota de ácido sulfúrico concentrado. Una porción de esta mezcla se puso en contacto con

una muestra de extracto etanólico con el objetivo de observar cambios de coloración.

Así mimo, se utilizó la ´prueba de Rosenheim, donde una muestra del extracto etanólico se

puso en contacto con ácido tricloroacético en agua. Finalmente se usó la prueba de

Salkowski, donde una muestra del extracto etanólico se trató con un volumen igual de ácido

sulfúrico concentrado.

Glicosidos cardiotónicos

Para la identificación de glicosidos cardiotónicos se utilizó la prueba de Kedde, donde se

mezclaron cantidades iguales de ácido 3,5-dinitrobenzoico y de potasa solución y se

añaden 2 gotas del material. Adicionalmente se manejó la prueba de Legal, donde una

pequeña muestra se disolvió en 3 gotas de piridina y se agregó una gota de solución de

nitroprusiato de sodio y 3 gotas de sosa.

Quinonas

Para la identificación de quinonas se utilizó la reacción de Borntrager, que consistió en

acidular una muestra de extracto alcalino y extraer con benceno. El extracto bencénico se

trató con un volumen igual de KOH del 2 al 5%, esto con el objetivo de observar un cambio

de coloración

Saponinas

Para determinar la presencia de saponinas, se manejó la prueba de la espuma, donde se

agitó una muestra de extracto etanólico en agua con el motivo de observar la formación de

espuma, así mismo se realizó la prueba de Molisch, donde una gota del extracto se mezcló

con dos gotas de alfa naftol en etanol al 5%. Por la pared del tubo se agregó ácido sulfúrico

concentrado, con la finalidad de presenciar una coloración.

Sesquiterpenlactonas

La prueba de Tollens fue utilizada para la identificación de estos metabolitos, la cual

consistió agregar unas 3 gotas de nitrato de plata al 5%, una gota de NaOH al 10%.

Posteriormente se añadió hidróxido de amonio al 2% hasta disolver precipitado. Un

mililitro de esta mezcla se agregó a una muestra del extracto libre de disolvente.

Polifenoles

Para la identificación de polifenoles se usó la prueba de Folin-Ciocalteu, donde en un

microcono se colocó 0.5 mL de extracto con cinco gotas del reactivo Folin-Ciocalteu, más

dos gotas de carbonato de sodio al 7.5%.

Fenilpropanoides

Se adicionaó 1 mL de extracto etanólico más 2 mL de HCl 0.5 N, posteriormente se añadió

2 mL de la solución acuosa de nitrito de sodio al 10% y finalmente se agregó 2 mL de la

solución acuosa de NaOH 2N.

Iridoides

Se colocó 0.5 mL del extracto vegetal y se mezclaron con 3 mL de vainillina (4% p/v en

metanol) y con 1.5 mL de HCl concentrado. La muestra se protegió de la luz durante 1-2

horas para obtener el resultado de la reacción.

Cromatografía en capa fina

Se realizó un ensayo en CCF para determinar la presencia de metabolitos secundarios,

utilizando las muestras de extracto etanolico sin diluir, y usando diferentes fases móviles,

con la finalidad de obtener la fase correcta para separar los metabolitos en columna. Se

utilizó un cromatofolio de silica gel 20 x 20 marca Merck. Como revelador se empleó luz

UV obtenida de una lámpara portátil (254 – 365 nm).

Imagen 19. Cromatografía en capa fina

Cromatografía en columna

Para separar los metabolitos se realizó cromatografía en columna al extracto, utilizando

arena de otawa para fijarlo dicho extracto, y silica gel parta la columna. Se utilizó como

fase móvil, la mezcla 7:2:1 de éter de pretroleo, butanol y metanol.

Imagen 20. Cromatografía en columna

Pruebas de inhibición del extracto

Preparación del inoculo

Para la preparación del inoculo se llevó a cabo en medio líquido utilizando como medio de

cultivo caldo nutritivo, para el experimento se emplearon las cepas de Staphylococcus

aureus que se encontraba en caldo nutritivo y Escherichia coli en medio EMB y Salmonella

thypi en el medio Salmonella shigella, estos fueron proporcionados por el laboratorio de

Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas, de la Universidad Veracruzana.

En tres tubos de ensaye con 2 mL de caldo nutritivo se colocó 2 colonias de cada cepa

respectivamente y se dejó incubar a temperatura ambiente por 24 h. Transcurrido el tiempo

se observa el crecimiento de cada tubo.

Método de difusión en agar

Se tomaron 3 mL de los extractos etanólicos concentrados de Acalypha arvensis y

Acaplypha Alopecuroidaes y se depositó en un vial previamente tarado, este extracto se

redisolvio con 3 mL de etanol para conocer la concentración de la dosis a emplear en los

sensidiscos.

Utilizando un hisopo estéril, fueron sembrados los microorganismos a estudiar por estriado

en agar nutritivo, enseguida se colocaron sobre la placa los sensidiscos impregnados del

extracto de interés, con una concentración de 0.00134mg.mL-1 equivalente a 20 µL.

Como control positivo se empleó el ciprofloxacino el cual es un antibiótico de amplio

espectro y con diversos usos a padecimientos patológicos, además se utilizó etanol para

comprobar que la inhibición existente sea por los principios activos del extracto y no el

efecto del etanol.

Las cajas Petri fueron incubadas a 35ºC por 24 h en una estufa de incubación, seguidamente

se procedió a la observación y medida de los halos de inhibición de crecimiento con ayuda

de un vernier.

RESULTADOS Y DISCUCIÓN

Análisis del suelo

Se realizó una examinación al suelo de los dos terrenos de los cuales se obtuvo la planta, se

observó que ambos terrenos tenían diferente tierra, una de color naranja oscuro

(vulgarmente conocida como tierra “roja y el otro terreno presentó tierra de color café

oscuro (imagen 21).

Imagen 21. Tipos de suelo

Utilizando tiras de pH, se determinó el pH de los suelos, disolviendo 10g de suelo en 100ml

de agua, obteniéndose los siguientes resultados:

Tipo de tierra pHTierra “roja” 8Tierra café oscuro 6

La variación de pH en la tierra es debida al contenido de Fe2O3, lo que le otorga un carácter

más básico a la tierra roja.

Obtención de coordenadas

Con la ayuda de un GPS de bolsillo marca Garmin® se determinó las coordenadas de los

terrenos en los cuales se obtuvieron las pruebas, obteniéndose los siguientes datos

Terreno CoordenadasCol. Lázaro Cárdenas (1) 18° 52’ 11.7’’ N, 96° 55’ 47.2’’ ECol. Lázaro Cárdenas (1I ) 18° 52’ 11.4’’ N, 96 °55’ 39.1’’ ECol. López Arias (III) 18° 52’ 22.8’’ N, 96° 55’ 41.7’’ E

Análisis fitoquímico

Se realizó un análisis fitoquimico preeliminar a los tres primeros extractos de Acalypha

Arvensis y Acaplypha Alopecuroidaes realizados con diferentes partes de la planta,

obteniéndose los siguientes resultados.

Acaplypha ArvensisMetabolitos secundarios Prueba Extracto de hojas Extracto de flor Extracto de tallo

Alcaloides Mayer - - -

Dragendorff + + -

Wagner + + -

Quinonas Borntrager + + -

Saponinas Espuma + + -

Molish + + -

Coumarinas Hidroximato - + -

Legal + + -

Erlich - - -

Flavonoides Vapores de

amoniaco

+ + -

Álcali + + +

Shinoda - + -

Glucosidos cardiotónicos Kedde - - -

Legal + - -

Keller-Kiani + - -

Baljet - + -

Sapogeninas Rosentaller - - -

Polifenoles Folin-

Cicalteu

+ + +

Sesquiterpenlactonas Tollens + + +

Esteroles Lieberman-

Burchard

- - -

Rosenheim-

Salkowski

- - -

Fenilpropanoides + + +

Iridoides - - -

Acaplypha AlopecuroidaesMetabolitos secundarios Prueba Extracto de hojas Extracto de flor Extracto de tallo

Alcaloides Mayer + + -

Dragendorff + + -

Wagner + + -

Quinonas Borntrager - - -

Saponinas Espuma + + -

Molish + + -

Coumarinas Hidroximato + + -

Legal + + -

Erlich - - -

Flavonoides Vapores de

amoniaco

+ + -

Álcali + + -

Shinoda + + -

Glucosidos cardiotónicos Kedde - - -

Legal - - -

Keller-Kiani - - -

Baljet - - -

Sapogeninas Rosentaller + + -

Polifenoles Folin-

Cicalteu

+ + +

Sesquiterpenlactonas Tollens - - +

Esteroles Lieberman-

Burchard

+ + -

Rosenheim-

Salkowski

+ + -

Fenilpropanoides - - +

Iridoides - - -

Cromatografía

El análisis por cromatografía en placa fina realizado para el extracto de la planta se llevó a

cabo con la fase 7:2:1 Éter de petróleo/N-Butanol/Metanol dando un resultado aceptable en

la separación de los metabolitos presentes.

Este resultado fue aplicado para realizar una separación en cromatografía por columna, sin

embargo, no se logró separar los metabolitos, probablemente a la alta polaridad de la fase

móvil utilizada, la cual no permitió separar los metabolitos de una manera eficiente.

Pruebas de inhibición antimicrobiana

Mediante la técnica de difusión de discos se evaluó la actividad antimicrobiana de los

extractos de Acalypha arvensis frente a microorganismos patógenos tales como Escherichia

coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus se realizaron las pruebas suceptibilidad del

extracto vegetal para comparar su capacidad inhibitoria, se usa como control positivo el

ciprofloxacino, teniendo en cuenta que es un antibiótico de amplio espectro activo en

técnicas in vitro contra un gran número de microorganismos Gram positivos y negativos.

Se midió la capacidad antibacteriana a través del diámetro del halo de inhibición, el cual

puede ser afectado por las exigencias del microorganismo en estudio y la composición

química del extracto vegetal.

En la siguiente figura se observa el efecto inhibitorio de los extractos etanólicos de

Acalypha arvensis donde solo hubo inhibición frente a Salmonella typhi y Escherichia coli,

sin embargo en el caso de Staphylococcus aureus no se desarrolló en ninguno de los casos

esto es debido a que la cinética de crecimiento de este microorganismo es más lenta a

comparación a las anteriores.

Para el caso del gusano largo el

comportamiento fue igual solo se observó inhibición en Salmonella typhi y Escherichia

La evaluación de la prueba de actividad antimicrobiana frente a bacterias patógenas de

salud pública se presenta en la Tabla X, donde se observa el valor de inhibición; se puede

señalar que la adición de 20 μL de extracto etanólico de Acalypha arvensis los sensidiscos,

originan una actividad antimicrobiana en la mayoría de las especies estudiadas.

Acalypha ArvensisReplica Salmonella typhi Escherichia coli Ciprofloxacino

1 0.3 0.1 0.752 0.2 0.3 0.90

Acalypha AlopecuroidaesReplica Salmonella typhi Escherichia coli Ciprofloxacino

1 0.10 0.15 0.62 0.125 0.25 0.43 0.07 0.07 1.05

Los resultados señalan que Escherichia coli es el microorganismo que más sensibilidad

presento

Escherichia coli forma parte de las bacterias Gram negativas estas, además del

peptidoglicano, poseen una capa adicional en su pared que está compuesta de

lipopolisacáridos. Esta capa representa una segunda bicapa lipídica, que no consta

solamente de fosfolípidos como la membrana plasmática, sino que contiene polisacáridos y

proteínas. Los lípidos y polisacáridos están estrechamente unidos en la capa externa

formando estructuras lipopolisacáridas específicas (Lizcano, 2008).

Los mecanismos de resistencia de estas bacterias pueden presentarse como alteración del

sitio blanco o diana de antimicrobianos, disminución de la permeabilidad de la pared por

poseer una pequeña capa de peptidoglicano, la cual es más sensible, adquisición de

mecanismo de eflujo y cambio de vía metabólica externa (Lizcano, 2008), lo anterior

podría sugerir que el extracto etanólico de Acalypha arvensis puede poseer sustancias

capaces de contrarrestar los mecanismos de resistencia del microorganismo.