Estudio farmacocinético preliminar de la fagoterapia para ...
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Universidad de Los Andes, Colombia Facultad de Ciencias Escuela de Postgrados de Ciencias Biológicas __________________________________________________________________ Estudio farmacocinético preliminar de la fagoterapia para el control de Salmonella spp. en pollos de engorde Presentado por: Juan Camilo Farfán Esquivel Para obtener el título de Magíster en Ciencias Biológicas, área Microbiología Directora: Martha Vives, PhD. Introducción: Salmonella sp. es un bacilo Gram negativo, motil, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, con aproximadamente 2700 serovares descritos, dentro de dos especies: S. enterica y S. bongori. Esta bacteria es ubicua y hace parte de la microbiota del tracto gastro-intestinal de diferentes animales incluyendo a las aves (Carrasco, Morales-Rueda, & García-Gimeno, 2012). Esta bacteria puede causar enfermedad, frecuentemente, asociada al consumo de carne de aves y productos derivados (Bhunia, 2008); causa dos tipos de toxo- infecciones: fiebre tifoidea y gastroenteritis. Cada una de este tipo de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) es causada por distintas cepas de Salmonella con presentaciones clínicas diferentes; las cepas tíficas causan fiebre tifoidea, mientras que las no tíficas producen gastroenteritis (Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2014). El 99% de las salmonelosis causadas en humanos se encuentran asociadas a la subespecie S. enterica subsp. enterica (INS, 2011). En aves de corral, Salmonella también puede causar dos tipos de enfermedades asociadas a otras cepas, distintas de las que causan enfermedades en humanos. S. enterica subsp. enterica serovar Gallinarum se divide en dos biovares: Gallinarum y Pullorum (Feng, Johnston, Liu, & Liu, 2013). Estos biovares son diferentes a otras cepas de Salmonella en cuanto a que son no motiles y no producen sulfuros; sin embargo, muy similares bioquímicamente entre sí, por lo
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Universidad de Los Andes, Colombia
Facultad de Ciencias
Escuela de Postgrados de Ciencias Biológicas
__________________________________________________________________
Estudio farmacocinético preliminar de la fagoterapia para el control de
Salmonella spp. en pollos de engorde
Presentado por: Juan Camilo Farfán Esquivel
Para obtener el título de Magíster en Ciencias Biológicas, área Microbiología
Directora: Martha Vives, PhD.
Introducción:
Salmonella sp. es un bacilo Gram negativo, motil, perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae, con aproximadamente 2700 serovares descritos, dentro de
dos especies: S. enterica y S. bongori. Esta bacteria es ubicua y hace parte de la
microbiota del tracto gastro-intestinal de diferentes animales incluyendo a las aves
(Carrasco, Morales-Rueda, & García-Gimeno, 2012).
Esta bacteria puede causar enfermedad, frecuentemente, asociada al consumo de
carne de aves y productos derivados (Bhunia, 2008); causa dos tipos de toxo-
infecciones: fiebre tifoidea y gastroenteritis. Cada una de este tipo de
enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) es causada por distintas cepas de
Salmonella con presentaciones clínicas diferentes; las cepas tíficas causan fiebre
tifoidea, mientras que las no tíficas producen gastroenteritis (Murray, Rosenthal, &
Pfaller, 2014). El 99% de las salmonelosis causadas en humanos se encuentran
asociadas a la subespecie S. enterica subsp. enterica (INS, 2011).
En aves de corral, Salmonella también puede causar dos tipos de enfermedades
asociadas a otras cepas, distintas de las que causan enfermedades en humanos.
S. enterica subsp. enterica serovar Gallinarum se divide en dos biovares:
Gallinarum y Pullorum (Feng, Johnston, Liu, & Liu, 2013). Estos biovares son
diferentes a otras cepas de Salmonella en cuanto a que son no motiles y no
producen sulfuros; sin embargo, muy similares bioquímicamente entre sí, por lo
que su identificación puede ser difícil de realizar (Batista et al., 2015). La
presentación clínica de la enfermedad causada por ambas es diferente, sobre todo
en la población de animales en riesgo: S. Gallinarum causa fiebre tifoidea aviar
que puede afectar a aves jóvenes y adultas, mientras que S. Pullorum causa
diarrea blanca bacilar (pulorosis) principalmente en aves jóvenes (Spickler, 2009).
Si bien Salmonella es una bacteria mesófila, se ha encontrado que puede
sobrevivir a temperaturas desde 5.9°C a 49.5°C lo que la hace prevalente en
alimentos con pobre cocción (Oscar, 2009) (Cardinale, Perrier Gros-Claude, Tall,
Gueye, & Salvat, 2005). Crece bien a condiciones altas de actividad acuosa (Aw
=0.94-0.995) y puede resistir valores de pH bajos (hasta 3.8) lo cual facilita su
supervivencia después del paso por la barrera de pH gástrico (Humphrey, 2004).
Todo lo anterior indica que este patógeno puede ser difícil de erradicar, en
especial en granjas de aves en donde se puede encontrar presente en las fuentes
de agua, en los piensos o en los suelos contaminados con heces fecales (Tabo et
al., 2013). Además, la actividad acuosa del pollo, el pH de su carne y de otros
órganos puede facilitar la presencia y el crecimiento del patógeno, debido también
a fallas en el manejo adecuado de temperaturas de conservación y cocción (INS,
2011). En Colombia, existe normatividad vigente que dicta medidas preventivas en
la cadena de producción de productos avícolas, enfocadas principalmente en
evitar la llegada y propagación de Salmonella en granjas avícolas mediante
barreras físicas y desinfección de áreas, personal y utensilios (INVIMA, 2007)
(ICA, 2013).
Generalmente, los casos de salmonelosis no son tratados con antibióticos; sin
embargo, se ha reportado la aparición de eventos de resistencia presentes en
algunas cepas de Salmonella. Dichos mecanismos les confieren resistencia a
diversos antibióticos como fluoroquinolonas (Karczmarczyk et al., 2010),
cefalosporinas de espectro extendido (O'Mahony et al., 2006), beta-lactámicos,
sulfonamidas y cloranfenicol (Rodríguez et al., 2016). La diseminación de eventos
de resistencia, multi-resistencia y pan-resistencia a antibióticos en un problema de
salud pública en aumento, no solo en Colombia (Maldonado et al., 2014) sino
también en el mundo (WHO, 2014) (Arias & Murray 2009). En el caso de
Salmonella, parte de la adquisición de mecanismos de resistencia se ha debido al
uso de antibióticos como promotores de crecimiento en granjas (Rodríguez et al.,
2016) (Grant, Hashem, & Parveen, 2016). Dada esta problemática, es urgente
buscar nuevas alternativas para el control de microrganismos, que mitiguen la
aparición de más cepas resistentes a antibióticos y el fallo en el tratamiento
antibacteriano.
Se han buscado y descrito nuevas alternativas para el tratamiento de infecciones
bacterianas. Algunas de estas incluyen el uso de anticuerpos terapéuticos,
estrategias que inhiban la acción de mecanismos de virulencia bacterianos,
inhibidores de mecanismos de resistencia bacterianos (como bloqueadores de
bombas de eflujo) y la fagoterapia (Fernebro, 2011). Los bacteriófagos (fagos) son
virus cuyo hospedero son bacterias, descritos por primera vez por Frederick Twort
y Felix d’Hérelle en los comienzos del siglo XX. Fueron utilizados para tratar
enfermedades infecciosas humanas antes de la llegada de los antibióticos,
cayendo luego en desuso (Kutter et al., 2010). Para controlar la contaminación con
Salmonella se ha propuesto el uso de bacteriófagos obteniendo buenos resultados
en carcasa, después de la evisceración de los animales, (Hungaro, Mendonça,
Gouvêa, Vanetti, & Pinto, 2013). También se ha probado su efectividad en
condiciones controladas suministrándolos en el agua y el alimento de pollos con
resultados variables (Loc Carrillo et al., 2005) (Fiorentin, Vieira, & Barioni, 2005)
(Bardina, Spricigo, Cortes, & Llagostera, 2012) (Lim et al., 2012). Estos estudios
se han llevado a cabo principalmente en animales modelo tomando en cuenta el
tiempo de administración de dosis (Bardina et al., 2012), la cantidad dosificada
(Lim et al., 2012) y la administración de cócteles de fagos (Fiorentin et al., 2005).
En cuanto a la fagoterapia oral, también se ha explorado levemente el uso de
antiácidos, como el carbonato de calcio, para mitigar el efecto del ácido estomacal
sobre el fago. Sin embargo, no hay datos sobre estabilidad con y sin un excipiente
protector (Loc Carrillo et al., 2005).
Si bien la fagoterapia ha sido utilizada en algunos países de Europa oriental, ésta
todavía no ha sido implementada en los países occidentales (Kutter et al., 2010).
Aún sigue habiendo escepticismo en su uso debido a que hacen falta estudios
sobre la farmacocinética (el movimiento de un fármaco a través del cuerpo) y
farmacodinamia (los efectos deseados e indeseados) de los fagos como
alternativa terapéutica (Tsonos et al., 2014). Es importante mencionar que los
fagos tienen un comportamiento diferente a los fármacos tradicionales,
principalmente debido a su carácter autoreplicativo (Abedon & Thomas-Abedon,
2010). Su comportamiento como fármaco dependerá de la vía y modo de
administración, el tiempo en el que se inicia la fagoterapia, con respecto a la
invasión y crecimiento bacteriano, y a la cantidad inicial de fago administrado
(Payne & Jansen, 2003).
Aunque se han establecido aproximaciones a la farmacocinética de los fagos y al
tratamiento con fagos en aves de corral, los estudios llevados a cabo
anteriormente no reproducen fielmente las condiciones de la industria avícola. En
algunos estudios se ha trabajado con aves jóvenes, de menos de una semana de
edad, libres de microrganismos y artificialmente inoculadas con Salmonella y otros
patógenos. Otros estudios de fagoterapia oral administran el tratamiento de fagos
mediante sondas orales y usan carbonato de calcio como protector ante la barrera
de acidez estomacal, sin embargo, no contemplan sus efectos en la estabilidad y
viabilidad viral. Es importante tomar en cuenta estos aspectos para la
implementación del uso de fagos para el control de patógenos transmitidos por
alimentos, en un ambiente industrial (Grant et al., 2016). Sin embargo, estos
estudios han aportado datos importantes acerca de aspectos sobre el tiempo de
dosificación, el cual debe ser reciente en relación al inicio de infección o antes de
ésta, de manera profiláctica (Bardina et al., 2012). También se ha concluido que el
uso de cócteles de bacteriófagos genera una mayor reducción de los títulos de
Salmonella, comparado con la administración de un solo fago (Fiorentin et al.,
2005). En cuanto a la cantidad de fagos a usar en fagoterapia, ésta debe estar en
mayor proporción a la población bacteriana que se controlará, aplicando títulos
virales altos (Wong et al., 2014). Algunos estudios han investigado el efecto de la
disminución del pH en la viabilidad de los fagos, encontrando disminución en la
generación de unidades formadoras de placas (UFP) (Langlet, Gaboriaud, &
Gantzer, 2007), reducción en el periodo de latencia e implicaciones negativas en
la biogénesis y el ciclo de infección (Traving, Clokie, & Middelboe, 2014). Con
respecto a lo anterior, es relevante saber cómo se afecta la concentración inicial
de un fago con su paso a través del sistema digestivo de pollos de engorde, en
particular en el ambiente ácido del estómago. Para resolver esta pregunta, se
propone medir la recuperación de un fago, efectivo contra Salmonella spp., en
heces y suero, en un ensayo de farmacocinética de la fagoterapia oral en pollos de
engorde.
Para este estudio se eligió el fago San 23, perteneciente al coctel de fagos
efectivos contra Salmonella, SalmoFree® (Patente número: 15281747),
perteneciente a la Universidad de Los Andes, Bogotá, Colombia. Se diseñó un
protocolo de farmacocinética que fue utilizado en pollos de engorde en una granja
de producción avícola local. Se estandarizaron protocolos de PCR y PCR en
tiempo real para la identificación y cuantificación del fago en muestras de heces y
suero. Para evaluar el efecto de la acidez en la viabilidad y estabilidad del fago, se
realizó un modelo animal simulando el tracto digestivo de pollos de engorde de 20
a 27 días de edad. Se enfrentó al fago a soluciones de ácido clorhídrico (HCl) de
diferentes pH en compañía de un excipiente usado en el ensayo de
farmacocinética, y en otros para comprobar su eficacia. Y también se evaluó el
efecto de los excipientes en la viabilidad y estabilidad del fago.
Metodología:
1. Preparación del fago para fagoterapia
El fago San23 fue multiplicado y purificado mediante un proceso de lisis bacteriana
en caja de Petri, de la siguiente manera: Se tomó un cultivo en caldo nutritivo de
Salmonella spp. de 4 horas, el cuál fue utilizado para el plaqueo del fago. Se
realizó una dilución 1:10 del fago en stock en buffer salino fosfatado bufferado
(PBS, siglas en inglés). Se combinaron 100uL de esta dilución con 100uL del
cultivo de Salmonella en un tubo con 4 mL de agar soft derretido y a 50°C. El
contenido del tubo fue vertido sobre una caja de Petri la cual fue incubada a 37°C
durante 20-24 horas. Este procedimiento se repitió con 5 cajas más para obtener
un volumen adecuado de fago para ser utilizado en fagoterapia. Una vez
terminado el tiempo de incubación se retiró la capa superior de la caja, en donde
se observó lisis confluente en toda la superficie, y se apartó en tubos falcon de
15mL. Se realizó un lavado de la capa inferior con 2 a 3mL de buffer PBS el cual
fue vertido en conjunto con la capa superior anteriormente retirada. Se agregaron
900uL de cloroformo por cada caja realizada y se mezcló mediante agitación con
vortex. La mezcla se centrifugó por 20 minutos a 4500rpm a 4°C. El sobrenadante
fue filtrado empleando un filtro de 0.22um y conservado posteriormente a 4°C
(Andes, 2015a).
Se tomaron 100uL de este lisado ( UFP/mL) y se combinaron con 900uL del
excipiente escogido para los ensayos de evaluación del efecto del excipiente en
fagoterapia, con un título final de UFP/mL.
2. Ensayo de farmacocinética de la fagoterapia in vivo y toma de
muestras
El experimento fue llevado a cabo en condiciones de producción de la industria
avícola y con el aval del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales
de Laboratorio (CICUAL) de la Universidad de Los Andes (Número de acta: FUA
17-016, Anexo 1). El número de aves (n=32) fue calculado utilizando una
herramienta de cálculo de tamaño de muestra, basada en pruebas de poder,
disponible en línea en la página del comité institucional del cuidado y uso de
animales de laboratorio de la Universidad de Boston (Institutional Animal Care &
Use, 2014).
Se seleccionó como excipiente carbonato de calcio al 30%. El ensayo de
farmacocinética fue llevado a cabo en un galpón al que se le realizaron dos
divisiones para asegurar que los grupos de animales control no se combinaran con
los grupos tratamiento. Se asignaron 8 aves para cada uno de los grupos que
fueron distribuidos, de acuerdo al tratamiento, así: grupo control 1 (1mL de
solución PBS), grupo control 2 (1mL del excipiente), grupo tratamiento 1 (900uL de
PBS con 100uL de fago) y grupo tratamiento 2 (900uL de excipiente con 100uL de
fago).
Cada tratamiento fue administrado al día 27 del ciclo de vida, directamente a cada
animal mediante sonda bucal. Se tomaron muestras de sangre, mediante
venopunción (250uL aproximadamente), y heces mediante hisopado cloacal, un
día antes del inicio del tratamiento y a las 4, 8, 24, y 48 horas después de iniciado
el tratamiento. Al final del tratamiento se realizó la última toma de hisopado cloacla
y el sacrificio de todas las aves involucradas en el estudio. La muestra final de
sangre se realizó post-sacrificio mediante punción cardiaca.
Las muestras fueron procesadas de la siguiente manera: la sangre fue recolectada
en tubos que fueron almacenados en posición horizontal para facilitar la
coagulación y conservados a temperatura de refrigeración. 12 horas después, se
extrajo manualmente el suero producido en cada tubo. El suero fue,
posteriormente, conservado a temperatura de congelación a -20°C. Los hisopados
cloacales fueron re-suspendidos en buffer SM y posteriormente centrifugados a
4500rpm por 15 minutos para remover contenido orgánico en la suspensión. El
sobrenadante fue conservado en temperaturas de congelación a -20°C (Martinez-
Castillo, Quiros, Navarro, Miro, & Muniesa, 2013).
3. Extracción de ADN de muestras fecales y de sangre:
El ADN proveniente de los hisopados cloacales fue extraído mediante el uso de
fenol-cloroformo y etanol absoluto: por muestra se tomaron 100uL del
sobrenadante conservado y se mezclaron con 0.1uL de DNasa (1.000U/mL),
0.1uL de Buffer 10X para DNasa y 0.2uL de RNasa. La mezcla se incubó 20
minutos a 37°C, terminado este tiempo se agregaron 0.1uL de solución STOP y se
calentó a 65°C por 15 minutos. Después de este tiempo de calentamiento, se
agregó un volumen igual a la muestra de una mezcla de Fenol:Cloroformo:Alcohol
isoamílico en una proporción 25:24:1. Se realizó vortex hasta que el tubo quedara
completamente blanco y se centrifugó a 13.000rpm durante 3 minutos. Se tomó la
fase acuosa para repetir el paso anterior. Después de centrifugar y remover
nuevamente la fase acuosa, un volumen igual de una mezcla de
Cloroformo:Alcohol isoamílico en proporción 24:1 fue agregado. Las muestras
fueron mezcladas mediante vortex y luego centrifugadas por 3 minutos a
13.000rpm. La fase acuosa se removió nuevamente y se le agregó acetato de
sodio 3M, equivalente al 10% del volumen de la fase acuosa, y etanol al 96%-99%
frío, equivalente al doble del volumen de la fase acuosa. Las muestras fueron
mezcladas suavemente y luego incubadas por 10 minutos en hielo. Posterior al
periodo de incubación en frío, la precipitación de ADN se realizó mediante
centrifugación a 13,000rpm por 30 minutos a 4°C. El sobrenadante fue descartado
y el pellet se lavó con 100uL de etanol al 70%. Nuevamente se centrifugó a
13.000rpm por 5 minutos, para descartar el sobrenadante y el remanente de
etanol fue secado al aire por un espacio de 10 a 30 minutos. El ADN fue
resuspendido en 10uL de Tris-HCl 10mM, pH=8, e incubado a 37°C por 30
minutos. Finalmente, se realizó cuantificación por NanoDrop (Piuri, 2015).
El ADN de las muestras de suero fue extraído mediante ebullición de la siguiente
manera: se tomaron 4uL de la muestra de suero y este volumen fue llevado a
20uL con buffer PBS. Esta mezcla fue calentada durante 3 minutos a 95°C en un
bloque de calentamiento de un termociclador. Una vez transcurrido este tiempo,
rápidamente, las muestras se incubaron durante 5 minutos en hielo. Las muestras
fueron cuantificadas por NanoDrop (Abe, 2003)
4. Búsqueda de regiones genómicas únicas y generación de primers.
Se realizó un BLAST en línea de comando, tomando como templado el genoma
secuenciado de San23 y utilizando una base de datos con 1960 secuencias de
genomas de fagos, huéspedes de diferentes bacterias. El formato de salida
generado fue el formato 4 que también muestra sitios en donde no hubo
alineamiento de secuencias. De esta manera, se logró hallar regiones únicas para
cada uno de los fagos (Zhang, Schwartz, Wagner, & Miller, 2000). A continuación,
se realizó un BLAST en línea para confirmar que fueran secuencias únicas para
los fagos probados. Se escogieron dos secuencias únicas las cuales fueron
sometidas a búsqueda de primers utilizando el software PrimerBLAST disponible
en la página del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI, siglas
en inglés) (Ye et al., 2012).
5. Evaluación de la idoneidad de los primers seleccionados mediante
PCR
Se estandarizaron las concentraciones de primers para la reacción y sus
condiciones así: Se eligieron cuatro concentraciones diferentes de primers (0.1uM,
0.3uM, 0.6uM y 0.9uM) que fueron añadidos a una mezcla que incluye todos los
reactivos para PCR (DreamTaq Polymerase, ThermoFisher Scientific) y agua libre
de nucleasas.
El protocolo de amplificación para el par de primers específicos de San23 fue el
siguiente: denaturación a 95°C por 3 minutos; seguido de 34 ciclos de
denaturación a 95°C por 1 minuto, Anillamiento a 54.1°C por 30 segundos y
amplificación a 72°C por 1 minuto; finalmente se dejó un ciclo de elongación a
72°C por 5 minutos.
También se probaron diferentes temperaturas de anillaje de primers para que la
reacción de PCR fuera más restrictiva: 64°C, 62°C, 61.5°, 61°C, 60.5°C, 60°C y
58°C. Para cada temperatura fueron probados tres fagos diferentes (San14,
San15 y San23), pertenecientes a la colección de fagos del Centro de
Investigaciones Microbiológicas (CIMIC).
Los productos de PCR fueron revelados mediante electroforesis en gel de agarosa
al 1%.
6. Preparación de la curva estándar y estandarización de la PCR en
tiempo real
Se extrajo el ADN del fago, proveniente de un stock realizado mediante lisis
bacteriana en placa, de la misma manera que se realizó la extracción de ADN de
muestras de hisopados cloacales con fenol-cloroformo y etanol absoluto. La
concentración del ADN extraído se midió mediante NanoDrop y Qubit (Andes,
2015b) y se realizaron diluciones seriadas (1:10) que fueron sometidas a PCR en
tiempo real, utilizando los primers de las secuencias únicas de San23. La reacción
fue llevada a cabo con el mix SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix
(Biorad) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. La mezcla de
reacción fue realizada de la siguiente manera: 10uL de la mezcla lista para RT-
PCR 2X, 0.06uL de cada uno de los Primers, 9.08uL de agua libre de nucleasas y
0.8uL de la muestra de ADN, para un volumen de reacción de 20uL. Las
condiciones de reacción fueron llevadas a cabo en el termociclador 7500 Fast
Real-Time PCR System (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific) de la
siguiente manera: un ciclo de activación de la polimerasa y denaturación del ADN
a 98°C por 3 minutos, seguida de 38 ciclos de amplificación (denaturación a 98°C
por 30 segundos; anillamiento, extensión y lectura de la placa a 60°C por 60
segundos). El análisis de la curva de fusión se llevó a cabo de acuerdo a lo
sugerido por el sistema de PCR en tiempo real del termociclador.
Para comprobar la eficiencia de la reacción estandarizada, se realizó una PCR en
tiempo real, con las condiciones mencionadas, de muestras inoculadas con un
fago en concentración de 107 UFP/mL, en proporción 1:10. Se espera una lectura
de estas muestras en 106 copias de ADN virales/mL.
7. Medición del título de fagos en muestras de heces y sangre
Las muestras de heces fecales y sangre fueron tratadas como se planteó en el
punto 7 de este documento. Para cuantificar el título viral en estas muestras se
llevó a cabo una PCR en tiempo real, utilizando los primers generados en el punto
3. Nuevamente, la reacción fue llevada a cabo con el mix SsoAdvanced Universal
SYBR Green (Biorad), como previamente se indicó. Los resultados fueron
comparados con la curva anteriormente preparada para hallar la cuantificación
absoluta de la cantidad de fagos que se encuentran en las muestras. Se realizó
una comparación de los títulos en los tiempos 4, 8, 24 y 48h post-tratamiento con
los datos obtenidos antes del tratamiento para confirmar cambios en el título de
fagos en las dos muestras.
8. Evaluación de la viabilidad del fago en condiciones ácidas
El sistema digestivo de las aves de corral se puede dividir en tres partes,
conformadas cada una de órganos comunicados y con condiciones de pH distintas
(Mabelebele, Alabi, Ngambi, Norris, & Ginindza, 2014):
Tomado de: Angel, (2014). What more do we need to know to optimize the use of a proteasa. University of Maryland. Disponible en línea en:
https://www.slideshare.net/DSM_Animal_Nutrition/what-more-do-we-need-to-know-to-optimize-the-use-of-a-protease-angel-r-amsterdam-2014
-1er segmento: Buche, proventrículo y molleja
-2do segmento: duodeno y ciego
-3er segmento: intestino delgado y colon
Se realizó una prueba de viabilidad del fago, de manera exploratoria, tomando un
modelo de tres compartimientos y sometiendo al fago, con cada uno de los
excipientes, al menor de los valores de pH de cada segmento: pH=2 primer
segmento, pH= 5 segundo segmento y pH=6 tercer segmento (Mabelebele et al.,
2014).
Se tomaron 200uL de un stock de fagos con una concentración conocida y se
mezclaron con 1800uL de cada excipiente y el control negativo, a las condiciones
anteriormente planteadas. Se extrajeron 100uL de cada tratamiento que fueron
probados en 900uL de soluciones de HCl a tres diferentes valores de pH: 2, 5 y 6,
de manera consecutiva por triplicado (Baquero, 2016). El experimento inició con la
solución de pH=2 en donde se incubó la mezcla de fago y excipiente en solución
ácida a 37°C por 50 minutos. A continuación, se tomaron 100uL de la mezcla
anterior y fueron suspendidos en la solución con pH=5 incubándola a 37°C por 88
minutos. Finalmente, de la última mezcla se tomaron otros 100uL y se mezclaron
con la solución a pH=6 incubando a 37°C por 80 minutos. Estos tiempos de
incubación corresponden a los tiempos de retención de alimento en pollos de 22
días de nacidos (Mabelebele et al., 2014). El título de fagos se evaluó mediante
diluciones seriadas seguido de siembra en placa mediante la técnica spot.
9. Evaluación de la estabilidad del fago en conjunto con excipientes
Se evaluó el efecto que tienen tres excipientes diferentes que serán candidatos en
el tratamiento in vivo, para descartar efectos negativos de éstos en la viabilidad del
fago. Se probaron los siguientes: solución de sacarosa al 64% p/v, que
comúnmente hace parte de la formula farmacéutica de los jarabes (Rowe, 2006),
solución de hidróxido de magnesio al 8.4% p/v y carbonato de calcio al 30% p/v,
siendo ambos antiácidos (Barrachina & Calatayud, 2008). El carbonato de calcio
se ha utilizado en otros estudios de fagoterapia oral en pollos (Atterbury et al.,
2007), (Carvalho et al., 2010). Como control negativo se utilizó solución Buffer SM
(Para 1 litro: 5.8g NaCl, 2g MgSO4 * 6H2O, 50mL Tris-HCl a 1M pH=7.5, 5mL
gelatina al 2%, 800mL H2O) (Abedon & Thomas-Abedon, 2010).
Se tomaron 200uL del stock del fago San23, con título conocido, y se mezclaron
con 1800uL de cada uno de los excipientes, por triplicado. La evaluación se realizó
haciendo diluciones seriadas con la muestra inicial, hasta el último título detectado
en cualquier excipiente. Se evaluó la estabilidad del fago a la hora de iniciado el
experimento, al siguiente día y una vez al mes durante cuatro meses, mediante
plaqueo de 5uL de cada dilución por spot (Baquero, 2016) (Khan Mirzaei &
Nilsson, 2015).
10. Análisis de datos
Los títulos de fagos hallados en las muestras de sangre y de heces fueron
comparados entre tratamientos mediante un ANOVA, para verificar si hay
diferencias entre tratamientos y si es significativo. Este análisis se llevó a cabo
construyendo un modelo mixto con el objetivo de tomar en cuenta la variación de
cada individuo en el tratamiento, con una significancia estadística de valor-P<0.05.
Resultados:
1. Generación de primers y evaluación in Silico
Se llevó a cabo el alineamiento de las secuencias del fago San23 con una base de
datos de 1960 secuencias genómicas de fagos mediante BLAST en línea de
comando. Se encontraron 2 segmentos únicos, la secuencia más larga fue
utilizada para realizar la búsqueda de primers, la cual arrojó los siguientes
resultados:
San23 Secuencia 5'-3' Longitud Inicio Parada Tm GC% Auto-complementariedad
Auto-complementariedad 3'
Forward primer
GGGACGGTTGGGACAATAGG 20 214 233 60.11 60.00 3.00 0.00
Reverse primer
ACACCTTTTGGCAACCCAGA 20 316 297 60.03 50.00 5.00 2.00
Longitud del producto
103
Tabla 1. Resultados de búsqueda de primers para el fago San23. Los primers tienen una longitud de 20pb cada uno, se indica el inicio y el final teóricos de la región amplificada del genoma de San23, que tiene una longitud de 103pb. El contenido GC está entre el rango de 40-60% que es lo indicado para un buen diseño de primers. Los valores de autocomplementariedad, que indican la probabilidad de formación de dimeros de primers, son menores en el primer forward.
Estos primers fueron sometidos a una segunda evaluación con ayuda de la
herramienta In Silico PCR de UGENE. Los primers específicos para San23
arrojaron un producto de 103 pares de bases (pb) en la región comprendida entre
los nucleótidos 41151-41253 del tercer contig del genoma de San23. Sin embargo,
al ser probados contra el genoma de otro fago de la colección (San15) también se
obtiene un producto de 103pb en la región comprendida entre los nucleótidos
40945-41047 del primer contig. Esto hace que, al utilizar estos primers pueda
haber amplificación inespecífica de otro fago perteneciente al coctel de fagos o
que pueda hacer parte de la microbiota de los animales. Por lo tanto, se decidió
realizar la toma de muestras anterior al inicio de la fagoterapia para realizar una
línea de base que sirviera como comparación frente a las otras muestras. De esta
manera, se podría hallar el titulo viral debido a la terapia en las aves que fueron
seleccionadas para el tratamiento.
2. Estandarización de PCR con primers generados para San23:
Se probaron cuatro concentraciones diferentes de los primers para San23 (0.1,
0.3, 0.6 y 0.9uM), utilizando el ADN de dos fagos como blanco. Se encontró que
en todas las concentraciones probadas hubo amplificación de material genético.
También se probó un protocolo de Touchdown PCR en donde se elevó la
temperatura de anillaje a 64°C, con reducciones de 1°C cada dos ciclos de
amplificación. Sin embargo, se obtuvieron resultados similares a la PCR estándar.
Figura 1. Touchdown PCR probando los primers diseñados para San23, en concentraciones de
0.6uM (izquierda) y 0.9uM (derecha), para los fagos San15 y San23. El marcador de peso
molecular fue de 100pb.
Como último recurso, otros protocolos de PCR fueron probados en donde se
probaron las siguientes temperaturas de anillaje: 64°C, 62°C, 60°C y 58°C, a una
concentración de primers de 0.3uM y con tres fagos de la colección de fagos,
efectivos contra Salmonella, del laboratorio (San14, San15 y San23) como
blancos. Se encontró que a 60°C no hubo amplificación completa del fago San15.
Sin embargo, hubo amplificación del ADN del fago San14, con la misma intensidad
de banda de San23.
Figura 2. PCR con diferentes temperaturas de anillaje para el par de primers diseñados para San23
con concentración de 0.3uM. Cada reacción fue realizada para tres fagos diferentes (San14, San15
y San23). Se puede observar una banda tenue a 60°C para el fago San15 que indica una pobre
amplificación del material genético.
También se probaron diferentes concentraciones de primers (0.1, 0.2 y 0.3uM) a
60°C. En este experimento solamente hubo amplificación en la concentración de
0.3uM, por tanto, se decidió dejar el protocolo de amplificación con una
temperatura de anillaje de 60°C y una concentración de 0.3uM. La mezcla de PCR
se estableció así, para una reacción: 12.5uL de la mezcla lista para PCR que
contiene la polimerasa, 0.075uL de cada primer, 11.35uL de agua libre de
nucleasas y 1uL de la muestra de ADN.
3. Extracción de ADN de muestras de sangre y heces:
La estandarización de extracción del material genético en muestras de heces y
sangre fue llevada a cabo en muestras provenientes de aves de la misma especie
(Gallus gallus domesticus), de raza criolla, pero que no provenían de la granja en
donde se llevó a cabo la fagoterapia. Estos animales tampoco son de engorde, sin
embargo, el método de obtención de las muestras siguió el mismo protocolo
propuesto en este documento.
Tipo de muestra
Concentración promedio (ng/uL)
Rango de concentración (ng/uL)
260/280 promedio
Rango 260/280
260/230 promedio
Rango 260/230
Heces 201,32 94,3-357 1,21 1,06-1,44 1,35 1,17-1,6
Suero 1992,93 398,8-10432,4 1,09 0,91-1,46 0,54 0,21-1,92
Tabla 2. Valores de concentración y pureza de ADN extraído de muestras de sangre y heces. Los métodos de extracción utilizados están orientados a la extracción de ADN total.
Se observan altas concentraciones de ADN que provienen del ADN total de las
muestras. Sin embargo, las relaciones que indican el nivel de pureza del material
genético son bajas (valores esperados: 260/280=~1.8, 260/230=2.0-2.2) (Matlock,
2015). Para descartar posibles fallas en la amplificación del ADN por presencia de
contaminantes, se realizó una PCR del ADN extraído de estas muestras. Se
tomaron 90uL de tres muestras de heces y 9uL de tres muestras de suero que
fueron inoculadas con 10uL y 1uL de un stock del fago San23, con concentración
de UFP/mL. Como control se tomaron 100uL de tres muestras de heces y
10uL de muestras de suero, sin inocular. El ADN de cada muestra fue extraído de
acuerdo a los protocolos sugeridos en este documento para cada fuente, seguido
de amplificación mediante PCR. Se obtuvo una amplificación del ADN del fago en
cada muestra inoculada con el mismo, concluyendo que la metodología de
extracción es apta para PCR.
Figura 3. Resultados PCR para muestras de heces y de sangre inoculadas con el fago San23. Los carriles 3 al 8 muestran muestras de suero, las tres primeras sin fago añadido, las siguientes tres fueron inoculadas con el fago. Los carriles 9 a 14 son muestras de hisopados cloacales, las tres primeras son control, las tres últimas fueron inoculadas con fago. Las bandas observadas coinciden con el control positivo que consiste en el ADN del fago extraído del stock.
4. Preparación de curva estándar y estandarización de PCR en tiempo real
La lectura de Qubit del ADN extraído del fago fue de 5.05 ng/mL; a partir de este
dato se halló el número de copias de ADN por mililitro que representa el número
de fagos que hay por mililitro: 5.56 copias/mL (Anexo 2). Las diluciones, a
partir de esta muestra de ADN fueron amplificadas mediante PCR en tiempo real
con las condiciones anteriormente descritas en el punto 8 de la metodología de
este documento.
Las muestras de ADN extraídas para la estandarización de los protocolos de
extracción fueron sometidas en conjunto con la curva estándar por duplicado. La
eficiencia de reacción fue de 94.17% y el umbral de detección de la señal
fluorescente fue generado automáticamente por el software del termociclador en
0.301902, que es el nivel de señal que refleja un aumento significativo del ruido
(Applied Biosystems, 2016). Se observa una distinción entre las muestras que
fueron inoculadas con el fago de las que sirvieron como control (Gráfico 6). Sin
embargo, según los datos calculados por el sistema de PCR en tiempo real, hubo
amplificación en las muestras control y en el control sin muestra. Se asumió que
esta amplificación pudo haber sido debida a emisión inespecífica de fluorescencia
por parte de la unión entre primers. Para corregir este efecto la cantidad calculada
de copias/mL de los controles negativos fue restada al resto de muestras de heces
y suero.
En promedio, las muestras inoculadas de heces contenían ~106 copias virales/mL,
mientras que las muestras inoculadas de suero contenían ~ 105 copias virales/mL.
En cuanto a las muestras no inoculadas se detectaron ~102 copias virales/mL
tanto para muestras de heces como para las de suero. Esto concuerda con lo
esperado, ya que las muestras fueron inoculadas con el stock del fago que se
utilizó para realizar la curva estándar.
a.
b.
Gráfico 1. Resultados gráficos de PCR en tiempo real de la curva estándar realizada a partir de ADN del fago San23. En la primera imagen (a) se observa la regresión lineal realizada a partir de la amplificación de los puntos de la curva estándar (pendiente = -3.47, intercepto con el eje Y= 36.104, R
2 = 0.999). La cantidad es expresada en número de copias por mililitro. En la segunda
imagen (b) se observan las curvas asociadas al aumento significativo de la emisión de fluorescencia de SYBRGreen en cada punto de la curva.
Gráfico 2. Muestras de heces y suero con curva estándar. Se inocularon una serie de muestras de heces y de suero (colores azul y verde, respectivamente) que fueron amplificados y comparados en conjunto con la curva estándar generada (color gris). También se amplificaron otras muestras de heces y suero sin inocular (colores rojo y naranja, respectivamente). La cantidad es expresada en número de copias por mililitro.
5. Medición de títulos de fagos en suero y heces
El ADN extraído de las muestras de heces y suero obtenidas, de las aves
utilizadas en el experimento, fue amplificado mediante PCR en tiempo real
utilizando el protocolo anteriormente descrito y estandarizado. Las reacciones de
PCR de estas muestras también tuvieron una eficiencia cercana al 100%.
Se observó amplificación en la mayoría de muestras de heces, incluyendo las
tomadas antes del inicio del tratamiento. El análisis inicial de los datos de PCR en
tiempo real sugerían cambios muy bajos en el número de copias virales por
mililitro para cada grupo de tratamiento (Gráfico 7).
Gráfico 3. Resultados de PCR en tiempo real para muestras de heces ordenados por grupo de tratamiento y tiempo de toma de muestra. El par de gráficas de arriba corresponden a los grupos de tratamiento con PBS (sin fago y con fago). Las gráficas de abajo corresponden a los grupos de tratamiento con el excipiente (sin fago y con fago). Se observa que la varianza entre los grupos y las muestras es amplia y se sobrelapan entre sí. Hay amplificación de ADN en los grupos control (grupos 1 y 2) así como en los grupos de tratamiento (grupos 3 y 4).
Para comprobar si existían diferencias entre grupos de tratamiento a través del
tiempo fue construido un modelo lineal mixto, tomando en cuenta el logaritmo del
número de copias de virus por mililitro para cada muestra. Según el modelo, hay
diferencias, que pueden ser consideradas como relevantes, en el número de
copias de virus por mililitro a través de los diferentes tiempos (valor-t = 4.745). Sin
embargo, no hay un efecto significativo de los grupos de tratamientos en la
varianza explicada por el modelo (valor-t =-1.508). Esto indica que la cantidad de
ADN amplificado en las muestras de heces no tiene relación con los tratamientos
realizados en el experimento de fagoterapia. El modelo fue validado mediante una
prueba de razón de verosimilitud, según lo recomendado por Winter (2013),
comprobando que la varianza de los resultados no es debida a los diferentes
grupos de tratamiento (valor-P = 0.133).
Gráfico 4. Resultados de PCR en tiempo real para muestras de suero ordenados por grupo y tiempo de toma de muestra. En este caso hubo amplificación de algunas muestras en el grupo 1 y
grupo 3 antes del inicio del tratamiento. En las muestras amplificadas de nuevo hay sobrelapamiento de las varianzas.
En cuanto a las muestras de suero tampoco hubo un efecto significativo de los
diferentes grupos de tratamiento (valor-t = -1.524), lo que fue comprobado
realizando una prueba de razón de verosimilitud (valor-P = 0.129).
Según los modelos, solamente el tiempo tiene un efecto en el número de copias
virales amplificadas en la PCR en tiempo real. Sin embargo, al realizar el análisis
gráfico previo en algunos grupos no se observan cambios del nivel de
amplificación a través del tiempo. Por tanto, los datos fueron divididos por grupos
experimentales y se realizó un modelo lineal mixto y una ANOVA por cada grupo,
para comprobar para cuáles grupos hay un efecto real del tiempo en la
amplificación de ADN. En las muestras de heces, los grupos 3 y 4, que
corresponden a tratamiento con fago sin excipiente y tratamiento con fago y
excipiente, respectivamente, mostraron un efecto significativo del tiempo sobre la
cantidad de ADN amplificado (valor-t = 3.417 y 2.886 respectivamente, con valor-P
<0.01). Mientras, en las muestras de suero solamente el grupo 4, correspondiente
al tratamiento con fago y excipiente, muestra un efecto significativo del tiempo
(valor-t = -2.389, valor-P = 0.023) sobre la cantidad de copias amplificadas de
ADN. Los resultados de estos modelos por grupos son comparables con lo
observado en la representación gráfica del número de copias amplificado por
grupo y tiempo (Gráficos 7 y 8). Allí, se puede observar que hay aumento del
número de copias de ADN a través del tiempo a partir de las 24 horas de iniciado
el tratamiento en las muestras de heces para los grupos 3 y 4. Para las muestras
de suero, la diferencia solamente es notable en el tiempo 8 del grupo 4.
6. Ensayo de estabilidad en condiciones ácidas:
En la primera solución, a pH=2, se evidencia una diferencia entre la efectividad de
los tratamientos como protectores del fago. Se realizó una prueba ANOVA
confirmando que hay diferencias significativas entre los tratamientos (valor P=
1.02 , se observa que la sacarosa no tiene efecto de protección frente a
condiciones de acidez. El buffer SM confiere una ligera protección, quizás debido
a su naturaleza como solución tampón que intenta mantener el pH estable. En
cuanto al hidróxido de magnesio y el carbonato de calcio parecen tener igual
efecto protector. Se realizó otra prueba de ANOVA para este set de datos, pero
esta vez solamente evaluando dos tratamientos: hidróxido de magnesio y
carbonato de calcio. Se pudo concluir que no hay diferencias estadísticamente
significativas (valor P= 0.329).
Gráfico 5. Estabilidad del fago San23 en condiciones de acidez expresado en unidades logarítmicas de unidades formadoras de placa (Log(UFP/mL)). La sacarosa no tiene un efecto protector ante condiciones de acidez. El hidróxido de magnesio y el carbonato de calcio, dada su naturaleza antiácida, tienen mayor efecto protector recuperando títulos virales de hasta
UFP/mL.
En la siguiente solución ácida, a pH=5, ya no se evidenció aparición de placas en
el buffer SM al igual que en la sacarosa. Los títulos obtenidos con el efecto
protector del carbonato de calcio y el hidróxido de magnesio siguen siendo
similares. Sin embargo, al realizarse la prueba ANOVA para las medias de estos
dos excipientes se obtiene que sí hay diferencias estadísticamente significativas
(valor P= 0.011), en donde el hidróxido de magnesio tiene un mejor efecto
protector que el carbonato de calcio por una diferencia de 0.911 en escala
logarítmica.
0
2
4
6
8
10
pH2 pH5 pH6
Log(
UFP
/mL)
Estabilidad de San23 en acidez
Control Hidróxido de magnesio Carbonato de Calcio Sacarosa
Finalmente, en la última solución ácida, a pH=6, el hidróxido de magnesio sigue
recuperando, significativamente, un mayor número de partículas virales a
comparación del carbonato de calcio (valor P= 2.54 ). Sin embargo, la
diferencia expresada en escala logarítmica es menor que en la solución anterior:
0.361.
Para confirmar nuestras predicciones acerca del efecto químico de los excipientes
frente al ácido se llevó a cabo un experimento en paralelo en donde se
combinaron 2mL de cada uno de los excipientes con 18mL de cada solución de
HCl a los tres diferentes pH. Se conservaron los tiempos de retención, la
temperatura y el orden de ejecución del experimento anterior. El hidróxido de
magnesio elevó el pH a 9.66 en promedio, mientras que el carbonato de calcio dio
un pH más neutral a las soluciones de ácido, 7.70 en promedio. En contraste, la
sacarosa no tiene un efecto marcado en la acidez de las soluciones de ácido, ya
que las lecturas con este excipiente son en promedio de 2.07. Acerca del efecto
parcial del buffer SM se puede pensar que es debido a su función como solución
tampón. En promedio, dicho buffer elevó el pH a 3.70, protegiendo
momentáneamente a los fagos del efecto de la acidez en su estabilidad.
7. Estabilidad en excipientes:
Para cada excipiente, sometidos a tres diferentes temperaturas (4°C, 25°C y
37°C), se realizaron tres réplicas, a las cuales se les midió el título viral, del fago
San23, en el día del inicio del experimento (t=1), al día siguiente (t=2), al mes
siguiente (t=3), al segundo mes (t=4), al tercer mes (t=5) y al cuarto mes (t=6).
Esta medición se realizó mediante diluciones seriadas y siembra por spot. Es
preciso aclarar que una de las réplicas de control con buffer SM, a 25°C, se
perdió; por lo tanto, no fue posible hacer el seguimiento de esta réplica. Los
resultados, expresados en unidades logarítmicas, para cada temperatura, se
encuentran a continuación:
Gráfico 6.
Gráfico 7.
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4 5 6
Log(
UFP
/mL)
Tiempo
25°C
Hidróxido de Magnesio Carbonato de Calcio
Sacarosa Control
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4 5 6
Log(
UFP
/mL)
Tiempo
37°C
Hidróxido de Magnesio Carbonato de Calcio
Sacarosa Control
Gráfico 8.
Gráficos 6 al 8. Estabilidad del fago San23 en tres diferentes excipientes. Los ensayos de estabilidad fueron llevados a cabo a tres temperaturas: 4°C (temperatura de refrigeración), 25°C (temperatura ambiental), 37°C (temperatura ambiental elevada). Los resultados se expresan en unidades logarítmicas de unidades formadoras de placas por mililitro: Log(UFP/mL).
A 4°C la viabilidad de los fagos se mantuvo en todos los excipientes, sin mostrar
una pérdida en el título viral. A las temperaturas de 25°C y 37°C hubo
decrecimiento de los títulos de los fagos en los excipientes a partir del segundo
mes.
Para comprobar si había diferencias estadísticamente significativas de la
estabilidad en los diferentes excipientes se realizó una prueba de ANOVA de una
vía, comparando la reducción logarítmica de cada uno en cada temperatura
probada, desde el inicio del experimento hasta la última medición. Para las
temperaturas de 25°C y 37°C hay diferencias significativas (valor P= 1.12x y
0.01 respectivamente) entre la reducción logarítmica de los excipientes probados.
Mientras que, a 4°C, pareciera no existir dicha diferencia, dado que los excipientes
tienen un comportamiento muy similar entre si. Sin embargo, hay una diferencia
significativa entre la reducción logarítmica de todos los excipientes (valor P=
0.038 En todas las temperaturas, el carbonato de calcio tiene mejor estabilidad a
través del tiempo, mientras que la sacarosa tiene la peor estabilidad. En especial a
37°C, al igual que con los otros dos excipientes, con la sacarosa se puede
apreciar una disminución significativa del título viral presente en suspensión con el
excipiente.
0
2
4
6
8
10
12
1 2 3 4 5 6
Log(
UFP
/mL)
Tiempo
4°C
Hidróxido de Magnesio Carbonato de Calcio
Sacarosa Control
Discusión de resultados:
Para detectar el fago San23 en las muestras de heces y suero tomadas en el
ensayo de farmacocinética se escogió la técnica de PCR en tiempo real, ya que
esta no solamente detecta la presencia del fago en las muestras, también permite
la cuantificación absoluta del mismo eliminando pasos experimentales posteriores
para el análisis de resultados (Mackay, Arden, & Nitsche, 2002). Para ello se
diseñaron primers que amplifican el ADN del fago San23 proveniente de estas
muestras. Los resultados de la búsqueda y diseño de primers (Tabla 1) indican los
parámetros de temperatura de fusión, porcentaje G+C, longitud de primers y
productos, que son adecuados de acuerdo a la literatura (Grunenwald, 2003). Este
set de primers fue escogido debido a que era la mejor combinación que arrojaba el
programa, teniendo en cuenta que el producto de amplificación debía ser
pequeño. Esto debido a que es recomendado diseñar un par de primers que den
lugar a amplicones pequeños, de 50 a 150 pares de bases, ya que si son más
grandes pueden dar lugar a disminución de la eficiencia de la reacción de PCR en
tiempo real (Applied Biosystems, 2016). Sin embargo, hay probabilidad de auto-
complementariedad, acompañada de baja especificidad.
Los problemas de baja especificidad se evidencian en la estandarización de la
PCR punto final (Figuras 1 y 2), en donde hay amplificación inespecífica de otros
fagos provenientes del cóctel de fagos efectivos contra Salmonella, pertenecientes
a nuestro laboratorio. La amplificación inespecífica de otros fagos conllevó a tomar
dos estrategias. En primera instancia, se realizó una PCR touchdown que, si bien
mostraba bandas más nítidas (datos no mostrados), amplificaba el ADN de los
otros fagos. Y en segunda instancia se realizó un gradiente de temperaturas
(Figura 2) el cual mostró que 60°C es la temperatura óptima para esta reacción de
PCR. Por lo general, la temperatura de anillamiento en el protocolo de
amplificación debe estar por debajo de 5°C de la temperatura de fusión de los
primers. Como dato interesante, el protocolo de PCR fue estandarizado con una
temperatura de anillamiento igual a la temperatura de fusión de los primers
(~60°C). Esto, teóricamente, reduciría la probabilidad de encontrar productos
inespecíficos (Grunenwald, 2003).
A parte de posibles dificultades técnicas en la PCR, la inespecificidad también
podría ser explicada debido a la naturaleza genética de fagos de una misma
especie bacteriana. La mitad de los fagos, pertenecientes al coctel, fueron
aislados de aguas residuales de la Universidad de Los Andes; la otra mitad fueron
aislados de aguas residuales del Hospital Militar Central. Una posibilidad es que,
al compartir ambientes comunes en donde se encontraban los fagos, pudieron
haberse presentado fenómenos de recombinación genética. Este fenómeno se ha
reportado en la naturaleza debido a procesos de coinfección o mediante
superinfección e interacción con profagos (Diaz-Munoz & Koskella). De esta
manera, los fagos que puedan encontrarse en un mismo hábitat y, como en este
caso, compartan su huésped, podrían ser similares genéticamente entre sí.
Entonces, sería recomendable realizar un diseño de primers adicional para la
identificación de este fago. Una forma más apropiada de hacer identificación de
San23, y otros fagos, quizás involucre el diseño y realización de una PCR
multiplex tomando ambas secuencias “únicas” halladas en el BLAST en línea de
comando para diseñar dos o más pares de primers, de esta manera restringiendo
los productos amplificados. Pero debido a que el diseño de estos primers quizás
no garantice el cubrimiento de todas las diferencias sutiles entre fagos similares,
una alternativa más segura sería modificar al fago mediante la inserción de un gen
marcador. Una técnica para lograr esto fue propuesta por Marinelli y
colaboradores (2008), llamada BRED: Ingeniería recombinante de bacteriófagos
usando ADN electroporado (siglas en inglés). En esta técnica se toman células
bacterianas sensibilizadas a las que se les ha introducido previamente un
plásmido con proteínas necesarias para recombinación. Se introduce el ADN
genómico del fago y el gen de interés mediante electroporación y se plaquean las
células en técnica de doble agar. Se purifican las placas que contengan el gen
deseado, identificado mediante PCR, y de esta manera se genera un stock del
fago transformado (Marinelli et al., 2008).
Así como la calidad de los componentes de la reacción de PCR son importantes
para una reacción óptima, la pureza y concentración de ADN también es
fundamental para obtener productos específicos. Cuando se trabajan muestras
orgánicas se debe prestar especial atención en estos parámetros; ya que este tipo
de muestras pueden contener inhibidores de PCR que alteran la eficiencia de la
reacción (Schrader, Schielke, Ellerbroek, & Johne, 2012). Se escogieron métodos
de extracción tradicionales que no involucraran el uso de kits comerciales de
extracción. Debido al bajo volumen de todas las muestras hubiera podido ser útil el
uso de estos kits. Sin embargo, en un estudio realizado por Hart y colaboradores
(2015), se comprobó que metodologías tradicionales como la extracción de ADN
desde heces con isopropanol permite recuperar mayor cantidad de ADN total en
comparación con kits diseñados para tal fin (Hart, Meyer, Johnson, & Ericsson,
2015). Así las cosas, la elección del método de extracción para las muestras de
heces es adecuado. Puesto que no sabíamos qué cantidad de copias de ADN viral
íbamos a esperar en las muestras, la metodología debía cubrir la eventualidad de
recuperar bajas cantidades. La misma razón fue validada para la extracción de
ADN de muestras de suero. Según Abe (2003), la metodología de PCR directa de
suero es sensible ya que puede detectar hasta una sola copia de genoma viral en
1uL de muestra. El autor asegura también que no hay diferencia en la estabilidad y
sensibilidad de esta metodología comparada con la extracción basada en fenol-
cloroformo. Para este estudio fue particularmente beneficioso escoger esta
metodología de extracción para las muestras de suero, ya que, en algunas, el
volumen de suero recuperado fue muy pequeño, debido a problemas en el
momento de la toma de muestra.
La idoneidad de estos métodos de extracción fue probada mediante una PCR
punto final (Figura 3) y una reacción en tiempo real (Gráfico 2). En ambas, se
evidenció amplificación en las muestras inoculadas con el fago. En la figura 3 se
evidencia la presencia de un producto cercano a las 100pb para las muestras de
heces y suero inoculadas. Es importante notar que en las muestras no inoculadas
de heces hay presencia de una banda muy débil que no se encuentra en las
muestras de suero sin inocular, así como en el control negativo, por lo que se
descartó contaminación de los reactivos de PCR. Una primera hipótesis que surgió
fue la formación de dímeros de primer como se puede apreciar en la figura 1 y 2,
antes de la puesta a punto del protocolo de PCR. Ésta puede ser plausible debido
los valores de autocomplementariedad de los primers generados (Grunenwald,
2003).
En adición a lo anterior, en la reacción de PCR en tiempo real hubo amplificación
de todas las muestras sin inocular, a bajos niveles. También hubo amplificación en
el control negativo. Lamentablemente, este defecto nunca se pudo corregir. Se
tomaron varias estrategias: se cambiaron las alícuotas de todos los reactivos, se
cambió de lugar en donde se realizaba el montaje de las placas de PCR, cada
micropipeta usada fue previamente limpiada con hipoclorito de sodio al 10% al
igual que la cámara de flujo laminar, antes de cada montaje. Además, las
micropipetas, tubos eppendorf, guantes, placas, puntas con filtro y agua para PCR
eran sometidos, antes de cada montaje, a luz ultravioleta por 30 a 60 minutos en
la cámara de flujo laminar. Por lo tanto, dicha amplificación, en especial en el
control negativo, puede deberse a una razón diferente a contaminación de los
reactivos. Como método de detección fluorescente se utilizó SYBR Green, que es
un método de detección altamente sensible y fácil de implementar. Sin embargo,
este fluorocromo es a la vez inespecífico lo que permite que en caso de formación
de dímeros de primer o presencia de contaminantes, aún muy pequeños, puede
darse emisión de señal fluorescente (Mackay et al., 2002). Para verificar la
formación de dímeros en cada montaje se realizó un paso adicional de análisis de
curva de disociación. Como se puede observar en el gráfico 9, en algunos
montajes había aparición de múltiples picos que pueden indicar la presencia de
dímeros de primer. Sin embargo, no todos los montajes presentaban estos picos;
además, el pico más pequeño que puede pertenecer a un dímero se acerca a la
temperatura de disociación de los amplicones. Debido lo anterior, se tomó la
determinación de restar la señal del control negativo en todos los casos de los
demás resultados, tomando esta emisión como ruido basal. Este error puede
prevenirse en futuros montajes utilizando dUTP y UDG en el mix de PCR que
degradan posibles contaminaciones debidas a anteriores reacciones (Applied
Biosystems, 2016).
Gráfico 9. Curva de disociación de uno de los montajes de PCR en tiempo real. Las flechas indican posibles formaciones de dímeros de primer en este montaje en particular.
Se tomó la misma determinación de restar la emisión de fluorescencia del control
negativo en las placas que se montaron para el análisis de las muestras de suero
y sangre. La cantidad de copias de ADN detectadas en las muestras de suero y
sangre no son significativamente distintas entre cada uno de los grupos de
tratamiento. Debido a esto, no fue posible realizar las curvas farmacocinéticas que
expresaran la absorción de los fagos en el suero, en función del tiempo, ni su
excreción por vía fecal.
Sin embargo, es interesante observar los leves cambios en la cantidad de ADN
para cada grupo a través del tiempo. En primer lugar, si se observan con mayor
detalle los valores de número de copias por mililitro para cada tipo de muestra en
cada grupo por separado, es importante notar que hay cambios en la
concentración de ADN a través del tiempo que sí son significativos. En el caso de
las muestras de heces, los grupos 3 y 4, que corresponden al tratamiento de buffer
PBS con San23 y carbonato de calcio con San23 respectivamente, muestran un
incremento de las copias de ADN viral a las 48 horas de iniciado el tratamiento.
Gráfico 10. Comparación visual de la cantidad de copias virales/mL de los grupos que fueron tratados con el fago San23, en verde claro el grupo 3 con buffer y en verde el grupo 4 con carbonato de calcio. El tratamiento diferencial por grupo (valor-t = -0.412) no tuvo efecto en la presentación de estos datos, aunque las diferencias entre tiempos si son representativas (valor-t = 3.164)
Según esta representación gráfica, a las 48 horas hay un incremento de la
cantidad de copias de ADN/mL en las muestras de heces. Dicho incremento se
diferencia del nivel basal de ruido mostrado en el tiempo 0, antes del inicio de la
fagoterapia. En cuanto a las muestras de suero, solamente el grupo 4 (tratamiento
con carbonato de calcio y San23) presenta diferencias estadísticamente
significativas en la cantidad de ADN amplificado en los diferentes tiempos de toma
de muestras. Allí se observa un incremento de las lecturas a las 8 horas después
de iniciado el tratamiento. Un patrón similar es observado en el grupo 2, en donde
si bien el nivel basal de ruido es amplio, las lecturas a las 8 horas parecieran
indicar un incremento en el número de copias de ADN amplificados. Sin embargo,
la comparación entre cada uno de los grupos de tratamiento permite evidenciar
que estas amplificaciones podrían estar dentro del nivel basal de emisión de señal,
por lo tanto, también son consideradas como ruido.
Estos resultados evidencian una baja recuperación del fago al final del tracto
digestivo de las aves, con un máximo de partículas virales por mililitro, y
ausencia de estos en sangre. Para entender qué explicaría estos bajos niveles de
fagos en las muestras procesadas es importante revisar los resultados de
estabilidad del fago en condiciones ácidas. El ensayo de estabilidad frente a
condiciones ácidas aquí propuesto revela que el carbonato de calcio tiene un
efecto protector, como algunos estudios sugieren (Atterbury et al., 2007) (Carvalho
et al., 2010), frente a condiciones de acidez, así como el hidróxido de magnesio.
Estos resultados son esperados ya que ambas sustancias son encontradas en el
mercado farmacéutico como antiácidos (Drake & Hollander, 1981). Hay diferencias
de efectividad de cada uno de los excipientes exitosos probados, sin embargo,
dichas diferencias no son muy grandes. Ambos excipientes recuperaron una
cantidad aproximada de 107 UFP/mL del fago después ser sometidos a todas las
soluciones de ácido. Si bien el hidróxido de magnesio se comporta mejor como
protector ante la acidez, el carbonato de calcio también puede ser una buena
opción ya que, al final del experimento, logra recuperar un título viral similar y es
más económico que el hidróxido de magnesio. Así mismo, al realizar las
mediciones de pH en los experimentos de estabilidad, el hidróxido de magnesio
subió, en promedio, los valores de pH de las soluciones a 9.66. Mientras que el
carbonato de calcio dio a las soluciones un pH más neutral, 7.70 en promedio, lo
que también sería deseable puesto que los fagos comúnmente tienen actividad a
valores neutros de pH (7.0 a 8.0) (Langlet et al., 2007). Según este experimento, el
75% del título viral original del fago puede soportar condiciones ácidas presentes
en el tracto digestivo de los pollos de engorde, sin contar con el paso mismo por el
tracto digestivo del animal en donde también se podría perder algo del título viral.
No obstante, estos resultados difieren mucho de lo que se halló in vivo.
Por tanto, también se evaluó el efecto de los excipientes frente a la estabilidad y
viabilidad de los fagos en compañía de los diferentes excipientes probados. En
este estudio se ha probado el efecto que tiene la temperatura y diferentes
sustancias en la estabilidad del fago San23. Se concluye que, a temperaturas
bajas y moderadas, durante dos meses, se pueden conservar los fagos en buenas
condiciones de estabilidad; sin que existan grandes pérdidas en términos de título
viral original de la suspensión de fagos. Las concentraciones de fagos fueron
estables a lo largo del estudio a 4°C, lo cual era esperado, y en las otras dos
temperaturas existen diferencias de acuerdo al medio en donde sean
almacenados. En particular, el carbonato de calcio muestra un buen
comportamiento de estabilidad a temperaturas de 4°C y 25°C. En todas las
temperaturas, el carbonato de calcio tuvo un comportamiento similar al del Buffer
SM, con lo que se concluye que en este excipiente se podrían almacenar los fagos
por, al menos, dos meses. Entonces, esto tampoco explicaría el porqué de las
bajas concentraciones de fagos en las muestras.
Como se mencionó anteriormente, los resultados en muestras de heces no tienen
una justificación estadística que permita apoyar cualquier hipótesis o que
confirmen las sospechas que se plantean. Sin embargo, es importante tomar en
cuenta que los fagos pueden verse asociados a mucosas y dar protección frente a
patógenos que puedan entrar por estas matrices. En un estudio elaborado por
Barr y colaboradores (2013) se demostró que los fagos pueden tener dominios
similares a inmunoglobulinas que les permiten adherirse a mucina y permanecer
fijados en diferentes mucosas. De esta manera, puede que San23, en su vía de
excreción por el intestino de las aves, se halla quedado en la superficie del
intestino de estas (Barr et al., 2013). Aplicando la teoría de la fagoterapia pasiva,
en donde las concentraciones de fagos que entran al sistema son bajas hasta
encontrar su respectivo huésped y aumentan paulatinamente (Abedon & Thomas-
Abedon, 2010), los fagos que fueron introducidos pudieron estar en bajas
concentraciones y, solamente hasta que empezaron a replicarse en sus
huéspedes, que podrían estar también a bajas densidades, se empezó a dar un
aumento de los títulos virales. Y este fue tardíamente percibido en los ensayos de
PCR en tiempo real. Así, se podría explicar el aumento que se da de los títulos
virales en heces a partir de las 24 horas en el grupo 4 de tratamiento (Gráfico 10).
De manera interesante, también pareciera ocurrir lo mismo en el grupo 3, en
donde también se ve un aumento significativo de copias de ADN amplificadas a
las 48 horas de iniciado el tratamiento. Para probar esta hipótesis es importante
estudiar con mayor detalle la relación entre el fago, la bacteria huésped y el tracto
gastrointestinal. Los fagos, como las entidades más abundantes en el tracto
intestinal, pueden tener un papel muy importante en la dinámica de poblaciones
bacterianas y en la homeostasis intestinal, algo que aún no se ha estudiado por
completo (Mirzaei & Maurice, 2017).
En comparación con la cantidad de ADN amplificado en las muestras de heces, en
la mayoría de muestras de suero no hubo amplificación de ADN. Las excepciones
son pocas y se podrían explicar debido quizás a contaminación de las muestras en
el entorno de recolección de las mismas, puesto que la toma de muestras tuvo
lugar en el mismo galpón donde los animales se encontraban. Sin embargo, el
fenómeno de fagemia, la circulación de fagos en sangre, está descrita en diversos
estudios (Gorski et al., 2006). En un estudio realizado por Reynaud y
colaboradores (1992), demostraron que una especie de colifagos pueden ser
recuperados en la sangre de conejos hasta ~104 UFP/mL, después de haberlos
inoculado de manera oral. Incluso, persistieron en el bazo por 12 días. Sin
embargo, los autores también descubrieron que para que se diera la recuperación
de los fagos debió haberse dado la lisis de los eritrocitos. De esta manera se
sugiere que los fagos pueden adherirse a la superficie de eritrocitos y,
posiblemente, a leucocitos (Reynaud et al., 1992). La baja presencia de fagos en
sangre, en nuestro caso, pudo haberse debido a esto, toda vez que la obtención
de suero para las muestras usadas en este estudio requirió la separación del
fragmento celular de la sangre.
La ausencia de amplificación de ADN viral en suero también pudo haber sido
gracias a la respuesta innata y humoral de las aves. En otro estudio realizado por
Duerr y colaboradores (2004), utilizando la tecnología de Phage display en
ratones, concluyeron que hay varios péptidos que pueden estar involucrados en la
adhesión de fagos a células M en el intestino. Estas células facilitarían la entrada
al sistema circulatorio incluso llegando a encontrarse fagos en órganos como el
bazo (Duerr, White, & Schluesener, 2004). Los fagos también pueden encontrarse
en otros órganos filtradores como en el hígado y otros órganos filtradores del
sistema retículo-endotelial. Se ha documentado que los fagos tienen un especial
tropismo por estos órganos, en especial el bazo (Dabrowska, Switala-Jelen,
Opolski, Weber-Dabrowska, & Gorski, 2005). Teniendo en cuenta la información
anterior, para futuros estudios, podría ser interesante no solamente realizar un
muestreo en sangre, también en órganos sólidos para verificar si hubo absorción
de los fagos.
Conclusiones:
En este estudio se evaluó la estabilidad del fago San23 en diferentes excipientes y
el efecto protector de estos ante condiciones de acidez. El carbonato de calcio al
30% es un excipiente que no tiene un efecto negativo en la viabilidad del fago, se
podría almacenar durante 2 meses, aproximadamente. También, tiene un buen
efecto protector, ya que podría neutralizar el pH del tracto gástrico de las aves. Sin
embargo, es importante evaluar nuevos excipientes y tecnologías para la
dispensación de los fagos de manera segura, eficaz y que mantenga viable el
“producto” por tiempos prolongados en ausencia de cadena de frío. También es
relevante realizar ensayos de seguridad a las aves, ya que si existe una hiper-
alcalinización del tracto digestivo, la digestión de proteínas puede verse afectada,
puesto que ésta depende del incremento en la acidez estomacal (Rynsburger,
2009).
Los ensayos de estabilidad en acidez y en excipientes no explican por qué hay
bajas concentraciones de fagos en muestras de heces y la ausencia de estos en
sangre. Estos resultados podrían deberse al paso mismo del fago por el tracto
digestivo de los pollos de engorde. Surge una hipótesis en donde los fagos, que
pudieron atravesar el sistema digestivo de las aves, pudieron unirse al epitelio
intestinal de las mismas y, posteriormente, multiplicarse conforme hacían contacto
con su célula huésped. Para evaluar esta hipótesis, en un futuro estudio, es
relevante probar si San23 puede tener dominios similares a inmunoglobulinas o
proteínas de anclaje a células epiteliales. También sería importante medir por
cuanto tiempo estarían adheridas a dichas mucosas. Y finalmente, evaluar las
dinámicas de poblaciones bacterianas, en concreto de Salmonella, en el intestino
de las aves en conjunto con la capacidad del fago de multiplicarse encontrándose
anclado a la membrana. Dicho lo anterior, los futuros estudios de farmacología de
la fagoterapia no pueden evaluar por separado la farmacocinética de la
farmacodinamia. Debido a la naturaleza autoreplicativa de este posible “fármaco”,
es necesario realizar aproximaciones farmacológicas que combinen todos los
aspectos de la fagoterapia: la estabilidad e idoneidad del fago en el sistema al cual
va a ser aplicado, la relación con su huésped in vivo y la respuesta inmunológica
del individuo sometido a fagoterapia. Este último aspecto es fundamental, ya que
puede tener un papel importante en la tolerancia a la fagemia, circulación de fagos
en sangre, y la eliminación del fago del sistema circulatorio.
En este estudio, se diseñaron un par de primers para la detección de San23 en
muestras de heces y suero. Los primers generados no fueron suficientemente
específicos, ya que generaron ruido en la técnica usada. Para minimizar este
ruido, y en estudios posteriores, se sugiere realizar una PCR anidada en tiempo
real con dUTP y UDG, cambiando la tecnología de detección de SYBR Green por
sondas, diseñadas de forma anidada. De esta manera, se obtendría una adecuada
especificidad sin sacrificar la sensibilidad de la reacción, que es necesaria en caso
de esperar bajos números de copias de ADN viral en las muestras y evitando la
posible aparición de contaminación cruzada. Esto, en combinación con métodos
de extracción de ADN que no generen reducción en el número de copias
detectado por la técnica en tiempo real, como los que fueron planteados aquí
(extracción de fenol-cloroformo para muestras de heces y PCR directa desde
suero).
Finalmente, se podría considerar tomar en cuenta todos los aspectos y variables
antes mencionadas y realizar estudios en ambientes más controlados. Pueden
existir otros factores que afecten los resultados obtenidos y que tengan que ver
con la naturaleza del estilo de vida de los pollos de engorde en granjas de
producción avícola. Es necesario tener un mayor control sobre estas variables
para un mejor entendimiento de los fagos como alternativa terapéutica.
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Anexos:
Anexo 1. Concepto del Comité Institucional para el Uso de Animales de
Laboratorio
Anexo 2. Estimación concentración de estándares
Se realizó extracción de ADN de una alícuota del fago San23 para la obtención del
stock que fue utilizado para la realización de la curva estándar. El resultado
arrojado por Qubit reveló una concentración de 5.05ng/mL. La estimación de la
concentración de este estándar se realizó así:
Asumiendo:
(1)
(2) (
) (
)
(3) (
)
El fago San23 tiene un tamaño de genoma estimado en 90Kpb, es decir:
Reemplazando este valor en (3), se obtiene:
( (
))
Reemplazando este valor en (2), se obtiene:
(
)
Utilizando un factor de conversión de microlitros (uL) a mililitros (mL):
Tomado y modificado de: Restrepo, S. (2016). Notas de clase curso Biología
Molecular Avanzada: PCR cuantitativa. Inédito. Programa de Maestría en Ciencias
Biológicas, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Los Andes,
Bogotá.
