Estudio de la microbiota asociada al proceso de fermentación de

las aceitunas arbequinas de mesa

Departament de Bioquímica i BiotecnologiaUniversitat Rovira i Virgili, Tarragona

IP: Nicolas Rozès

Proyecto INIA-RM 2004-0015

Comercio internacional de la aceituna de mesa

Producción mundial aceituna: 13-18 millones de toneladas/año10% destinado a aceitunas de mesaPaíses Mediterráneo 85% del total

Revalorización del producto: Sano y natural

Olea europaea en España

1- Verdes estilo españolNaOH + inoculación BL

2- Negras naturales

En salmuera 5-10%, diferentes métodos:

3- Verdes naturales

ACEITE

Aceitunas de mesa

• 1000 toneladas/año• 73000 ha

• Cataluña (98%): Lleida y Tarragona

Lavado de las aceitunas Salmuera (4-10%)

Fermentación espontánea (BL y levaduras)

Difusión de nutrientes

Hidrólisis de oleuropeína

Salmuera (2-6%)

Envasado

Hierbas: romero, etc

Aromas

Pasteurizadas

Conservantes: cítrico

Aceitunas verdes al natural en salmuera:

• Proceso de elaboración : tradicional e incontrolada

ACEITUNA DE MESA ARBEQUINA

Interés científico de la aceituna arbequina.

• Producto de calidad apreciada y demanda elevada.

• Producto natural y artesanal.

• No se conoce el proceso de fermentación ni los microorganismos que intervienen.

• Gran variabilidad en el proceso elevado riesgo económico.

The production of fermented fruit and vegetable products providesincome and employment to millions of people around the world. (FAO)

Objetivos del estudio de microbiota de Arbequinas

• Identificar los microorganismos predominantes en la fermentación de aceitunas arbequinas

• Caracterizar las especies (y cepas) presentes y estudiar su papel en el proceso

• Establecer cultivos iniciadores que permitan garantizar una correcta fermentación de la aceituna arbequina de mesa

Proyecto financiado INIA-RM 2004-00015

Diseño experimental

• Proceso industrial: ecología (profundidad)

depósitos subterráneos

• Proceso artesanal: madurez y salmuera

• Evaluación de cepas de Lactobacillus pentosuscomo iniciador único o mixto (Levadura o BL)

Metodología de aislamiento e identificación

Muestreo Siembra Aislamiento Identificación de especies

•MRS

•YEPD

•R.Bengala

•VRBG

•Cetramide

Depósitos subterràneos.

Elaborador“Mas d’en Pou”

Vinyols (T)8 meses

Levaduras: PCR 5.8SrRNA+ITS y RFLP CfoI, HaeIII, HinfI(www.yeast-id.com, CSIC, Valencia)

BL: - Multiplex PCR de RecA- 16S-ARDRA MseI, BfaI

Enterobacterias: Api 20E kit

Identificaciones

Efecto profundidad

Surface

0

2

4

6

8

0 50 100 150 200 250t (d)

log

CFU

/ml,

pH pH

LABYeastsEntero

2 m depth

0

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4

6

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0 50 100 150 200 250

t (d)

log

CFU/

ml,

pH

pHLABYeastsEntero

Resultados

Hurtado et al., 2008. Food Res. Int. 41 (7), 738-744.

Evolución microbiota y pH en el proceso industrial de elaboración de Arbequinas

Aislados de levaduras y BL en proceso industrial de Arbequinas

Days Species 4 11 18 28 55 91 194 244 Yeasts

Candida diddensiae 96 117 98 1 Candida boidinii 8 57 86 82 14 Pichia kluyveri 12 61 32 Candida membranaefaciens 41 Pichia membranafaciens 16 12 57 Rhodotorula glutinis 20 Pichia anomala 1 2 Kluyveromyces lactis 8 Pichia rhodanensis 3 3 Pichia minuta 9 Candida aasei 3 Candida parapsilosis 2

Lactic Acid Bacteria Lactobacillus pentosus 2 5 59 88 70 55 Lactobacillus paraplantarum 1 1 36 6 25 Lactobacillus plantarum 1 1

Number of isolates of identified yeast and LAB species during the processing of Arbequina table olives.

Hurtado et al., 2008. Food Res. Int. 41 (7), 738-744.

Levaduras:

Pichia kluyverii

Candida boidinii

BL:

Lactobacillus pentosus

Levaduras:

Candida diddensiae

Enterobacterias:

Proteus vulgaris Providencia

rettgeri

Bacterias lácticas (●), levaduras (□), enterobacterias (◊) y pH (··x··)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 30 60 90 120 150 180 210 240

log(

cfu/

ml)

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

pH

Levaduras:

C. boidinii

BL:

L. pentosus

L. paraplantarum

Levaduras:

C. membranaefaciens

Kluyveromyces lactis

BL:

L. pentosus

L. paraplantarum

Hurtado et al., 2008. Food Res. Int. 41 (7), 738-744.

Resumen del proceso industrial de Arbequinas

e

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 7 14 21 28 35 42 49 56days

log(

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ml)

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4.5

5.0

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pH

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pH

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cfu/

ml)

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5.0

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6.0

6.5

7.0

pH

Bacterias lácticas (●), levaduras (□), enterobacterias (◊) y pH (··x··)

10%

sal

5% s

al

verdes color cambiante maduras

ResultadosEvolución microbiota y pH del proceso (escala laboratorio)

Efectos de madurez y sal (escala laboratorio)

Hurtado et al., 2009. Food Microbiology, 26, 827-833.

Levaduras:

P. anomala

C. boidinii

C. sorbosa

BL:

L. plantarum

verdes color cambiante maduras

Levaduras:

P. anomala

C. boidinii

C. sorbosa

BL:

L. plantarum

Levaduras:

P. anomala

C. boidinii

C. sorbosa

BL:

L. plantarum

Identificación de especies

Hurtado et al., 2009. Food Microbiology, 26, 827-833.

Efectos de madurez y sal (escala laboratorio)

Análisis sensorial

verdes (- - - -), color cambiante (∆), negras (○) aceitunas industria (□).

• Panel sensorial: aceitunas verdes cumplen requisitos de calidad

• Análisis triangular: no se observa diferencia entre muestra comercial y aceitunas verdes ni según concentración sal

a

0

20

40

60

80Spots

GreenBrown

c

020406080100Firm

Crisp

Soft

Flesh

Hurtado et al., 2009. Food Microbiology, 26, 827-833.

Efectos de madurez y sal (escala laboratorio)

Hurtado et al., Food Microbiology, en revisión

Evaluation of a single and combined inoculation of a Lactobacillus pentosusstarter for processing cv. Arbequina natural green olives

• Se ha estudiado por primera vez el desarrollo microbiano a lo largo del proceso de elaboración de las aceitunas arbequinas de mesa.

• Se han identificado especies que no se habían asociado anteriormente a fermentaciones de aceitunas

• Se ha desarrollado un panel de cata para la aceituna de mesa arbequina, de acuerdo con el International Olive Oil Council.

Logros

• Publicación de 2 artículos• Food Research International (2008) “Microbial population dynamics during the processing of Arbequina table olives”, Volume 41, Issue 7, Pages 738-744.• Food Microbiology (2009) “Influence of fruit ripeness and salt concentration on the microbial processing of Arbequina table olives”.26, 827-833.

• En revisión un artículo en Food Microbiology “Evaluation of a single and combined inoculation of a L. pentosus starter for cv. Arbequina natural green olives processing “

• En preparación 3 artículos

Divulgación de los resultados

• 4 comunicaciones en congreso

1. Hurtado et al. Depth effect on yeast and lactic acid bacteria populations during the storage of traditional Catalonia home-made olives. FEMS Congress of European Microbiologists. Madrid, julio de 2006.

2. Hurtado et al. Estudio del proceso microbiano de elaboración artesanal de aceitunas de mesa, variedad arbequina. XV Congreso Nacional de Microbiología de los Alimentos. Ourense, septiembre de 2006.

3. Hurtado et al. Estudio del desarrollo microbiano según grado de madurez y concentración salina en la elaboración de aceituna de mesa Arbequina. XXI Congreso Nacional de Microbiología, Sevilla, 17-20 de setiembre de 2007.

4. Hurtado et al. Estudio ecológico de poblaciones de bacterias lácticas aisladas en depósitos de fermentación de aceitunas arbequinas en las provincias de Lérida y Tarragona. II Jornadas Internacionales de la aceituna de mesa, 26-27 marzo de 2008, Dos Hermanas.

Divulgación de los resultados

Formación de personal

• Tesis : Albert Hurtado

• Estudiante de Licenciatura en Biotecnología : Paula Pena

Participación en otro proyecto

Programa de Cooperación Interuniversitaria e Investigación

(convocatoria PCI-Mediterráneo 2006) 2006-2007

Proyecto: Estudio ecológico de la microbiota asociada a la fermentación de las aceitunas de mesa en diferentes regiones del mediterráneo.

IP: Dra. Cristina Reguant

• Producción de una preparación liofilizada de L. pentosus

• Controlar su imposición en condiciones industriales

• Determinar exactamente el final del proceso fermentativo para envasar las aceitunas mediante:

• seguimiento de las especies de levaduras y BL

• análisis organoléptica de las aceitunas

• Estudiar la microbiota en los envases

Investigaciones futuras

Personas y agradecimientos

Gracias a las personas de Mas d’en Pou (Vinyols, Tarragona) y Masdels Frares (URV) por su total apoyo y colaboración.

Albert HurtadoNicolas RozèsCristina ReguantAlbert BordonsBraulio EstevePaula Pena

Departament de Bioquímica i Biotecnologia Universitat Rovira i Virgili, Tarragona

Gracias por vuestra atención