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ESTUDIO DE LA ESTERILIZACION Y ALMACENAMIENTO PARA EMULSIONES
DE PERFLUOROCARBONO UTILIZADAS COMO TRANSPORTADORAS DE
OXÍGENO
ALBA DEL PILAR VANEGAS CORTES
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C
2012
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ESTUDIO DE LA ESTERILIZACION Y ALMACENAMIENTO PARA EMULSIONES
DE PERFLUOROCARBONO UTILIZADAS COMO TRANSPORTADORAS DE
OXÍGENO
ALBA DEL PILAR VANEGAS CORTES
Trabajo de grado para optar por el título de Ingeniero Químico
Asesor (a)
CAMILA IRENE CASTRO PÁEZ, MS.
Departamento de Ingeniería Química
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C
2012
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DEDICATORIA
De nuevo, a mi padre, porque que sin importar que no esté físicamente, sigue siendo mi modelo a seguir y
a la persona a quién quiero hacer sentir más orgulloso, gracias por cumplir y “Acompañarme en cada uno
de mis afanes”.
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AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Investigaciones Microbiológicas (CIMIC) de la Universidad de los Andes y en especial
a Guillermo Rangel, Investigador CIMIT, por toda su colaboración y paciencia en este trabajo.
A José Alfredo Santamaría y Gerly Viviana Ferreira, Técnicos de Laboratorio del Departamento de
Ingeniería Química, Universidad de los Andes por toda su colaboración y disposición con mi
proyecto.
A Diana Marcela Vásquez, del Grupo Ingeniería Biomédica (GIB) Universidad de los Andes, por
compartir su conocimiento y experiencia para el desarrollo de este trabajo, y por su apoyo y
colaboración.
A mi asesora Camila Castro, por su confianza, guía y paciencia durante el desarrollo de este proyecto
y por los consejos que surgieron para este trabajo y que traspasaron a consejos para la formación
como ingeniera fuera de la academia.
A mis amigos por su apoyo, paciencia y preocupación durante la realización de este proyecto, en
especial a Sara Segura, Asistente graduada de la Universidad de los Andes por ese apoyo
incondicional hasta el último día de este proyecto.
Y finalmente, sin ser menos importante, a mis padres porque, sin importar donde estén, sin su apoyo
y formación no habría logrado llegar a este punto.
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Tabla de contenido
OBJETIVOS .............................................................................................................................. 6 General ..................................................................................................................................... 6 Específicos .............................................................................................................................. 6
I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 7
A. Emulsiones ...................................................................................................................... 7 B. Emulsiones de perfluorocarbono ..................................................................................... 8 C. Esterilización de preparaciones inyectables o parentales ............................................... 9
II. METODOLOGÍA ................................................................................................................. 10 A. Materiales y preparación ................................................................................................ 10 B. Caracterización de emulsiones ...................................................................................... 10 C. Pruebas microbiológicas ................................................................................................ 13
III. RESULTADOS Y ANÁLISIS .............................................................................................. 15 A. Esterilización .................................................................................................................. 15 B. Condiciones de almacenamiento. .................................................................................. 15 C. Caracterización .............................................................................................................. 16 D. Oxidación de la lecitina .................................................................................................. 27 E. Pruebas microbiológicas ................................................................................................ 29
IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ..................................................................... 32
V. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 33 Anexos: ............................................................................................................................... 35
ANEXO 1. MICROSCOPÍAS .................................................................................................. 35
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OBJETIVOS
General
Evaluar la variación en las propiedades de la emulsión de perfluorocarbono con respecto a la condiciones
de almacenamiento y las temperatura de esterilización con el fin de determinar si son las adecuadas para
garantizar que las propiedades no cambian en el tiempo y que no hay presencia de patógenos en esta
emulsión.
Específicos
Preparar emulsiones de perfluorocarbono y separarlas para analizar las condiciones de
almacenamiento y la temperatura de esterilización.
Caracterizar las emulsiones de perfluorocarbono: tamaño de partícula, osmolalidad, espectro
infrarrojo cercano, pH, potencial z y comportamiento reológico.
Comparar diferentes condiciones de temperatura de esterilización propuestas (100ºC y 121ºC) y
evaluar su eficacia mediante pruebas de crecimiento microbiano para la emulsión de
perfluorocarbono.
Comparar las emulsiones que fueron almacenadas a las temperaturas propuestas (4ºC, 18ºC y
37ºC) y determinar que condición garantiza la estabilidad de las mismas.
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I. INTRODUCCIÓN La Universidad de los Andes en conjunto con la Fundación Cardioinfantil, han trabajado en el desarrollo de
emulsiones de perflorocarbono (PFCOCs) que se utilizan como transportadores de oxígeno intravasculares.
Estas emulsiones son conocidas como hemosustitutos porque complementan algunas funciones de la sangre
[1].
Las propiedades de este tipo de emulsiones pueden afectarse debido a diferentes factores externos, como lo son
la temperatura (durante la etapa de esterilización o en el almacenamiento), la presencia de luz y de
microorganismos. Debido a esto, el presente trabajo realiza caracterizaciones en el tiempo de las emulsiones de
perflorocarbono (PFC) bajo los factores externos que afectan la calidad y estabilidad de estas.
El primer factor de estudio corresponde a la temperatura de esterilización, procedimiento que para estas
emulsiones se realiza mediante el método de inactivación a través de tratamiento térmico con vapor húmedo,
usando autoclave. El presente trabajo realizó la caracterización con un tiempo de residencia en el autoclave fijo
y seleccionando dos niveles de temperatura. Se estudió la relación entre este factor y seis características
importantes para el desempeño in vivo de las emulsiones: pH, espectro infrarrojo cercano, tamaño de partícula,
osmolalidad, comportamiento reológico y potencial zeta.
Para las condiciones de almacenamiento evaluadas, temperatura y presencia/ausencia de luz, al igual que en el
anterior factor, se realizó el estudio sobre las mismas características en el tiempo, lo que permitió identificar la
relación entre la temperatura y la estabilidad; así como la relación entre la estabilidad y la presencia de luz
durante el almacenamiento, determinando de este modo las condiciones y escenarios más favorables para
almacenar dichas emulsiones.
Finalmente, con el fin de verificar la calidad de las emulsiones estériles, este trabajo incluye los resultados de
las pruebas de crecimiento microbiológicas para hongos y bacterias adoptadas por la Organización mundial de
la salud (WHO, por sus siglas en inglés) que son requisito de soluciones parentales o inyectables.
A. Emulsiones
Se define una emulsión como una dispersión (sistema polifásico) en el cual una fase líquida inmiscible (fase
discontinua o interna) se encuentra dentro de otra fase líquida (fase continua o externa) [2].
A partir de lo anterior, se refieren en la literatura a los líquidos de las emulsiones, por su nombres en inglés,
como aceite (Oil) y agua (Water), para diferenciar la parte apolar y polar de las emulsiones respectivamente. A
su vez, esto permite clasificar las emulsiones en simples, para aquellas en las que una fase está dispersa en la
otra (O-in-W y W-in-O) y múltiples, en las que la fase interna es a su vez una emulsión (W/O/W y O/W/O). En
la Imagen 1 se muestra un esquema de los tipos de emulsiones nombrados previamente.
Imagen 1. Tipos de Emulsiones [2]
8
Por otro lado, las emulsiones son sistemas inestables que tienden a separarse con el tiempo; para generar una
mayor estabilidad y retrasar este fenómeno se utiliza un surfactante o emulsionante. Los surfactantes son
compuestos que poseen una doble afinidad, es decir que están formados por una parte afín a sustancias polares
y otra afín con sustancias apolares, siendo estables en la interface entre estos dos tipos de líquidos. A esta clase
de sustancias que presentan este comportamiento se les conoce como anfífilicas [3]. La adición del surfactante
es necesaria para asegurar la reducción de la tensión superficial en la interface de las fases continua y dispersa,
que evitan los fenómenos de coalescencia, además de mejorar la estabilidad de la sustancia [4].
En estos sistemas emulsiones-surfactantes, existen dos tipos de fuerzas: atractivas y repulsivas. Las primeras,
conocidas como fuerzas de van der Waals que dependen del volumen de las gotas vecinas; las repulsivas,
dependen de la acción del surfactante absorbido y favorecen la estabilidad de la emulsión; sin embargo no es el
único criterio que afecta la estabilidad, y se deben considerar otros criterios externos que se tratará más
adelante.
En la literatura se reportan 5 métodos principales de inestabilidad de las emulsiones [5]:
1. Cremaje y sedimentación: El primero sucede cuando la fase interna es más ligera que la fase
continua, en el caso contrario sucede la sedimentación. Se caracterizan por una acumulación de gotas
y no a un cambio en el tamaño de estas propiamente.
2. Floculación: Se da cuando se genera un agregado de gotas que no pierden su identidad debido a las
fuerzas atractivas entre ellas.
3. Coalescencia: Es la unión de gotas pequeñas para formar una más grande de manera irreversible.
Puede presentarse después del método 1 y/o 2 debido a que las atracciones se incrementan.
4. Ostwald Rippening: consiste en la unión de gotas debido a una diferencia de solubilidades entre las
gotas de diferentes tamaños.
5. Inversión de fases: Se presenta cuando la fase externa se convierte en la fase interna, y la fase interna
en la fase externa.
Es posible que ocurran todos de manera simultánea, pero únicamente los dos primeros son fenómenos
reversibles.
B. Emulsiones de perfluorocarbono
Existen dos tipos de hemosustitutos principales: productos derivados de la hemoglobina y las emulsiones
sintéticas a partir de perfluorocarbono.
Los perfluorocarbonos (PFCs) se caracterizan principalmente por su alta capacidad para disolver gases, por ser
biológicamente inertes y por su gran estabilidad, entre otras [6]. Sin embargo, como son aceites apolares e
inmiscibles en agua (y por ende en el plasma sanguíneo), deben emulsificarse para permitir su uso como
hemosustituto [7]. Dentro de las ventajas de los PFCOCs frente a los productos derivados de hemoglobina, se
encuentra la facilidad en la entrega del oxígeno debido al mecanismo de transporte (difusión) [1].
Las gotas de perfluorocarbono tardan en sedimentarse totalmente 14 días luego de su preparación, generando
que en la emulsión se generen dos fases, sedimento y sobrenadante, promoviendo dos mecanismos de
envejecimiento: Coalescencia y/o crecimiento de Ostwald [8]. En la imagen 2 se puede apreciar la apariencia
normal de la sedimentación en estas emulsiones.
9
Imagen 2. Sedimentación en emulsión de Perfluorocarbono
C. Esterilización de preparaciones inyectables o parentales
Existen 3 tipos de esterilización [7]: (1) por destrucción total de microorganismos; (2) por muerte o
inactivación; (3) por eliminación con medios físicos. Sin embargo, por las características de los PFCOCs el
método más adecuado corresponde al de inactivación mediante tratamiento térmico, usando el método de
vapor húmedo, con autoclave. Este método permite la eliminación de microorganismos sin desintegración de
las células a través de calentamiento (seco o húmedo), radiaciones o por agentes químicos [7]. Adicionalmente,
en este trabajo identificaron las condiciones de esterilización que bajo este método y basados en los resultados
de la caracterización entre las condiciones iniciales y justo después de la esterilización, no presentaban
cambios o eran mínimos, las cuales correspondían a un tiempo de residencia de 40 minutos y temperatura de
esterilización de 100ºC.
La esterilización de preparaciones parentales por el método de vapor húmedo está documentada en la guía de
buenas prácticas para la Manufactura de Productos Farmacéuticos (GMP por sus siglas en inglés) de la WHO.
Para este método, algunos autores reportan como condiciones ideales de esterilización la temperatura de 121ºC
y el tiempo se ajusta dependiendo de las propiedades del material a esterilizar, pero señalan que el tiempo
mínimo debe ser 15 minutos [6].
Independientemente del método de esterilización seleccionado, debe incluirse métodos de control que permitan
monitorear el proceso de esterilización mediante pruebas que midan la posible contaminación microbiológica a
este tipo de sustancias inyectables [9]. Dentro de las pruebas de esterilidad para preparaciones inyectables,
adoptada por la WHO y publicadas por la farmacopea europea se incluyen dos medios de cultivo, tioglicolato
para bacterias y caseína de soya digerido para hongos, mediante los métodos, filtración por membrana e
inoculación directa [10].
Sobrenadante
Sedimento
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II. METODOLOGÍA
A. Materiales y preparación
Los PFCOCs se prepararon siguiendo los protocolos de preparación del Laboratorio de Hemosustitutos de la
Universidad de los Andes [11][12], que involucran las siguientes etapas: preparación de fase acuosa, pre-
mezcla, adición de agentes, microfluidización y filtración.
En la preparación de la fase acuosa se utiliza soluciones buffer de fosfatos preparados previamente y
mezclados con glicerol , alpha-tocoferol y lecitina de soya usado como surfactante con una composición 4.5
% p/v. Esta preparación se conocerá como la fase continua de la emulsión, que es la fase donde se encuentra
la sustancia en mayor proporción dentro de la mezcla [13].
Durante la premezcla, se homogeniza el perfluorocarbono (que será la fase dispersa) en la fase continua. Los
agentes adicionados modifican propiedades de la emulsión, para ello se utilizó alginato de sodio y dextrosa.
Finalmente, la emulsión obtenida pasa al microfluidizador para reducir el tamaño de gota y luego es filtrada
para quitar residuos.
Durante el desarrollo de este trabajo, se prepararon en total ocho emulsiones de 200 ml, tres para la etapa de
esterilización de las cuales dos fueron sometidas a tratamiento de esterilización (la otra se mantuvo sin
esterilizar) y cinco en la etapa de condiciones de almacenamiento: cuatro para evaluar tres niveles de
temperatura (dos de ellas se destinaron a las réplicas para cada nivel) y una para evaluar la influencia de la
presencia de luz a temperatura ambiente.
B. Caracterización de emulsiones
Dada la aplicación de las emulsiones de perfluorocarbono, es decir parental o inyectable, este tipo de
emulsiones deben cumplir con ciertas exigencias y requerimientos que le permitan ser aprobadas por las
diferentes entidades encargadas de verificar la calidad de los productos farmacéuticos, como por ejemplo la
agencia de Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA por sus siglás en inglés) en Estados Unidos o
el INVIMA en Colombia. Dentro de los requisitos que las preparaciones inyectables deben cumplir se
encuentran los requerimientos de esterilidad y estabilidad, tanto física como química [4], incluso en la etapa
de almacenamiento.
Debido a que las emulsiones son sistemas inestables que tienen a separarse en el tiempo, la caracterización se
realizó en: el sobrenadante, el sedimento y la emulsión agitada (durante 1 minuto a 5000 rpm con el fin de
eliminar aglomerados causados por mecanismos de inestabilidad reversibles).
En la tabla 1 se relacionan los tiempos de toma de datos y características de los niveles de medición durante la
etapa de esterilización.
Tabla 1. Diseño experimental: Temperatura de esterilización
Nivel Temperatura Tiempo de Toma de
Datos
Bajo 100ºC t0 (preparación)
tinmediato ( después de
esterilización)
t4 (4 días después de t0)
t11 (11 días después de t0)
t18 (18 días después de t0)
t25 (25 días después de t0)
t32 (32 días después de t0)
Alto 121ºC
SE Sin esterilizar
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Las emulsiones fueron repartidas en ocho muestras de 25 ml, que se almacenaron en envases de vidrio
resistentes a altas temperaturas y transparentes, para poder observar los cambios que se presentaran después
de la esterilización durante un almacenamiento de 39 días.
Para la etapa de caracterización de las condiciones de almacenamiento se seleccionaron dos factores de
estudio; el primero es la temperatura, donde a su vez, se seleccionaron tres casos de estudio que se
caracterizaron durante 32 días, los cuales se encuentran relacionados en la Tabla 2. El segundo factor, la
presencia/ausencia de luz, se evaluó a temperatura ambiente (18ºC) y se realizaron las mediciones en los
mismos tiempos que el factor de temperatura de esterilización (ver Tabla 1), exceptuando el tiempo después
de la esterilización, puesto que para esta etapa no se esterilizaron las emulsiones.
Tabla 2. Diseño experimental: factor de temperatura de almacenamiento
Nivel Temperatura Características
1 4ºC Temperatura de refrigeración y
condición actual.
2 18ºC Temperatura ambiente
3 37ºC Temperatura corporal
Los valores ideales de las propiedades que se caracterizaron para el cumplimiento de calidad y estabilidad de
las emulsiones y el método de medición se nombran a continuación:
1. pH
Los valores normales para las preparaciones parentales corresponden al pH normal de la sangre, que está en el
rango de 7.35 a 7.45 [14]. Sin embargo, algunos autores afirman que el pH de las emulsiones parentales debe
estar entre 6 y el valor normal de la sangre, con el fin de producir una mayor carga superficial (mayor
potencial Z) y generar mayor estabilidad [14].
Para realizar las mediciones, se utilizó el pH-metro (pH meter MP220 Seven Multi Mettler Toledo) el cual
utiliza la diferencia de potencial entre el medio externo y el electrodo, que se encuentra a pH neutro. Esta
propiedad se mide a la fase agitada de la emulsión y se realiza réplica.
2. Espectro infrarrojo cercano Las mediciones del espectro infrarrojo cercano (NIR, por sus siglas en inglés) permiten analizar formulaciones
químicas, líquidas y sólidas mediante el escaneo de las muestras para determinar la identidad y la calidad del
material usando un algoritmo patrón de reconocimiento.
Este trabajo utilizó el NIR, en el cual se expone la muestra a rayos infrarrojos de diferentes longitudes de
onda, que son absorbidos según la composición de esta. La región infrarroja cercana del espectro
electromagnético, se extiende desde la región del espectro visible para las emulsiones estudiadas en el rango
de 1100 nm, hasta el comienzo del espectro de la región infrarroja, 2500 nm.
Se utilizó como sustancia blanco el aire, ya que esta es la referencia adecuada para medir líquidos [8]. En la
imagen 3 se muestra el espectro normal de la emulsión obtenido con el NIR para el PFCOC, que corresponde
a la absorbancia obtenida (eje y) a diferentes longitudes de onda (eje x), y sobre el cual se realizó una
subdivisión de zonas para el análisis de resultados correspondiente a la subdivisión por longitud de onda
como en la guía del NIR.
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Imagen 3. Espectro normal de PFCOCs
3. Tamaño de partícula Esta característica es, en todas las emulsiones inyectables una de las más importantes, debido a que es la que
más afecta la estabilidad y es la que puede generar mayores efectos nocivos una vez el producto es inyectado
en el paciente, por lo cual es indeseable un aumento en el tamaño y necesario un estricto control en esta
propiedad.
Algunos autores indican que el tamaño ideal debe ser menor a 5 µm y generalmente en intervalos de 100-500
nm [15], debido a dos aspectos: (1) el tamaño de partícula debe ser menor al tamaño de los capilares (500
nm), puesto que se pueden generar efectos adversos como embolia si se supera esta referencia [14]; (2) debido
a que el sistema retículo-endotelial identifica partículas ajenas al cuerpo con tamaños entre 0.3 y 0.5 micras
[7] y las elimina rápidamente, lo cual afectaría el funcionamiento o alteraría su tiempo de residencia vascular.
Por lo anterior, el valor ideal sería igual o menor a 200 nm.
Adicionalmente, trabajos previos señalan que el tamaño de partícula de la emulsión no sólo se ve afectado por
la presencia de gotas de PFC sino además por otras estructuras conocidas como liposomas, que son
estructuras formadas espontáneamente por las lecitina en medios acuosos [8].
El tamaño de partícula fue medido utilizando un analizador de tamaño de partícula (Zetasizer, Malvern
Instruments), el cual utiliza el método de dispersión de láser dinámica, y mide la difracción de luz a través de
la muestra, generando un reporte estadístico del tamaño de partícula. Como complemento a estos resultados,
se realizaron mediciones microscópicas (Motic type 102M, USA).
4. Comportamiento reológico
El estudio del comportamiento reológico provee información sobre la estabilidad y la microestructura interna
de las emulsiones. En las emulsiones y los sistemas coloidales, la relación entre el esfuerzo y velocidad de
cizalla aplicada no es lineal, clasificandolas como fluidos no newtonianos y pseudoplásticos.
Es necesario aclarar que la viscosidad de las emulsiones depende de diversos factores tales como la
viscosidad de la fase externa (proporcional), la cantidad de la fase interna (proporcional), entre otros [16] y
por eso no existe un valor exacto de referencia. Teniendo presente que las afirmaciones generales no son
válidas en todas las circunstancias y que las emulsiones son sistemas coloidales complejos es deseable
viscosidades bajas al valor de la sangre y que no presenten variaciones en el tiempo [17].
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Para estudiar el comportamiento reológico de las emulsiones, se usó un reómetro (AR-G2 Magnetic Bearing
Rheometer, TA Instruments Ltd, USA) con una geometría de tubos concéntricos, por medio del cual se
obtuvieron los perfiles de flujo para cada una de las emulsiones caracterizadas (Gráficas viscosidad vs.
Velocidad de cizalla) y donde se evidenció la presencia de fenómenos como histéresis.
5. Potencial zeta
El potencial z indica el potencial generado por el movimiento de partículas como respuesta a una fuerza
externa aplicada al sistema [7].
Algunos autores estudiaron el efecto del potencial z y la velocidad de floculación, encontrando que al
disminuir el potencial, crece la velocidad de floculación en sistemas coloidales [18]. Por lo anterior, se desean
valores absolutos altos de potencial z, que permitan dar una mayor estabilidad a las emulsiones y tamaños de
partícula menores. Los valores de referencia absolutos para los que se reporta estabilidad son cercanos a 30
mV [19].
Se utiliza analizador de tamaño de partícula (Zetasizer, Malvern Instruments) para determinar el potencial z,
que arroja un valor promedio de la distribución en la muestra.
6. Osmolalidad
Es una medida farmacéutica que indica la concentración de electrolitos en la emulsión. Normalmente se
expresa en mOsm/kg de solvente puro.
Para la medición se utilizó el osmómetro (110-Fiske), el cual utiliza el método de punto de congelación, en el
que se enfría la muestra por debajo del punto de congelación, que corresponde a la temperatura en el que la
fase líquida y cristalina de una sustancia pueden coexistir en equilibrio. La guía del usuario de este equipo
define la osmolalidad como:
𝑂𝑠𝑚𝑜𝑙𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = 𝑛𝐶∅
Donde Φ es el coeficiente osmótico, que representa el grado de disociación molecular, n el número de
partículas en el cual una molécula puede disociarse y C la concentración molal de la solución.
Los valores de referencia e ideales para las PFCOCs corresponden al rango normo-osmolar de la sangre, que
está entre 275 y 310 miliOsmoles por kg de agua. Esta propiedad es importante pues las paredes vasculares
funcionan como membranas, en decir, un valor menor de osmolalidad indica que el fluido sale desde el
sistema vascular hacia los tejidos para igualar las concentraciones, y si es mayor al valor superior indicaría la
situación contraria.
C. Pruebas microbiológicas
La guía de pruebas de esterilidad adoptada por la WHO y publicada por la Farcopedia Europea, exige pruebas
microbiológicas de control de esterilidad para emulsiones parentales que permitan descartar la presencia de
(1) bacterias aerobias mediante el uso del medio de cultivo tioglicolato y (2) hongos utilizando el medio de
caseína digerida. Estas pruebas pueden realizarse a través de microfiltración o inoculación directa.
Para el desarrollo de esta etapa se realizaron 3 pruebas de crecimiento microbiano a cada una de las
temperaturas de esterilización evaluadas, usando cada uno de los medios para las pruebas de esterilidad
nombrados anteriormente mediante inoculación directa. Los medios fueron preparados e inoculados siguiendo
las condiciones de asepsia requeridas para este tipo de pruebas, con la colaboración y guía del Centro de
Investigaciones Microbiológicas (CIMIC) de la Universidad de los Andes.
14
Se realizaron 3 pruebas para ambos medios donde se inocularon 10 μl de las emulsiones esterilizadas (en la
tabla 3 se encuentra las características de las emulsiones de cada una de las pruebas). Los medios de
tioglicolato y caseína se mantuvieron a 37ºC y 25ºC respectivamente, que corresponden a las temperaturas
óptimas para el crecimiento en cada uno de los medios.
Tabla 3. Diseño de Experimentación Pruebas Microbiológicas
Prueba Días
estériles
Temperaturas
Evaluadas
1 1 100 ºC y 121 ºC
2 4 100 ºC y 121 ºC
3 >80 100 ºC y 121 ºC
Al existir evidencia del crecimiento en los medios, fue necesario identificar el número de microestructuras
presentes, y realizar pruebas adicionales para la identificación, como la prueba de Gram en el caso de
bacterias y microscopía para la identificación de hongos.
La prueba de tinción de Gram permite identificar y clasificar en dos grupos la identidad de bacterias
desconocidas en una muestra a partir de su coloración: Gram positivas y Gram negativas. Las primeras
retienen el color azul-morado del cristal violeta, mientras que las segundas el color rosado-rojizo de la fucsina
[20].
15
III. RESULTADOS Y ANÁLISIS
A. Esterilización
Después de realizada la experimentación y con base en los resultados obtenidos, se encontró que la
temperatura de esterilización influye de forma directa en los aspectos organolépticos y en las propiedades
físico-químicas de las emulsiones. Una primera evidencia de lo anterior se obtuvo justo después de la
esterilización (tinmediato), en donde se presentaron cambios significativos en aspectos físicos como tonalidad y
olor; en donde la emulsión para el nivel alto presentó cambio de tonalidad (de crema a café) luego de la
esterilización y olor característico, comparado con el nivel bajo en el mismo tiempo. En la Imagen 4a y 4b se
muestra el aspecto físico luego de la esterilización para los niveles Bajo y Alto respectivamente.
Imagen 4. A) (IZQUIERDA) Emulsión estéril nivel bajo (inmediato). B) (DERECHA) Emulsión estéril nivel alto (inmediato)
B. Condiciones de almacenamiento.
Al igual que en la fase de esterilización, las PFCOCs preparadas para las condiciones de almacenamiento que
están sin esterilizar, evidencian una dependencia de la estabilidad tanto con la temperatura de almacenamiento
como con la presencia de luz. Las propiedades físicas de las emulsiones variaron a partir del día 25 en el nivel
1 y 2 donde se presentó una capa viscosa dentro de la emulsión y en el día 18 para el nivel 3, cuando se
evidenciaron conglomerados de coloración café y olor fuerte, que se podrían atribuir al surfactante, debido a
que este presenta sensibilidad en sus propiedades bajo las condiciones de temperatura a las que estuvo
expuesto, oxidándose rápidamente y tomando una coloración oscura. La imagen 5 muestra lo anteriormente
nombrado en el nivel 3 (37ºC).
Imagen 5. Emulsión 37ºC día 25.
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C. Caracterización
1. pH
En la imagen 6, se presenta la evolución del pH en el tiempo para todos los valores de temperatura de
esterilización en la fase agitada, donde los valores presentados son los promedios de las réplicas de cada
sistema y el error es la desviación estándar.
Aunque el comportamiento en el tiempo es similar para las tres emulsiones caracterizadas, una emulsión sin
esterilizar presenta una diferencia entre el momento de la preparación y el día final de medición (día 39) de
2,8 unidades; siendo mucho mayor al presentado por las emulsiones estériles que presentaron una diferencia
de 0,98 y 1,9 unidades para el nivel bajo y alto, respectivamente, indicando que existe acidificación de la
emulsión y que la esterilización disminuye la velocidad a la que ocurre. Sin embargo, la diferencia entre
ambos niveles de temperatura puede deberse específicamente a la influencia de la temperatura sobre la
emulsión o sobre sus componentes. La desviación estándar baja de los datos indica una dispersión muy baja
entre los valores obtenidos en las mediciones y confiabilidad en estos.
Las mediciones donde hay mayor cambio en las emulsiones estériles, corresponden a realizadas en el
inmediato (encerradas en círculo imagen 6), que disminuyen considerablemente debido a las altas
temperaturas a las que son sometidas las emulsiones y al posible cambio en las propiedades de algunos
compuestos, como por ejemplo en la lecitina [21].
Imagen 6. Evolución del pH con esterilización a 100ºC (azul), 121ºC (rojo) y sin esterilización (verde). Valores promedio ± SD.
Si se considera como rango ideal el de Márquez y colaboradores (2007) [14], el nivel bajo de temperatura de
esterilización es aquel que en el tiempo, además de disminuir la variación, mantiene en el rango ideal de esta
condición para emulsiones parentales.
En la imagen 7 y 8 se muestra la evolución en el tiempo del pH para la fase agitada de las emulsiones
almacenadas sin luz evaluando los tres niveles de temperatura de almacenamiento y para las emulsiones a
temperatura ambiente, evaluando las condiciones de presencia/ausencia de luz en el almacenamiento
respectivamente. Los valores presentados son los promedios de las réplicas de cada sistema y el error es la
desviación estándar.
Aunque ninguno de los niveles logra mantener el pH en los valores ideales antes relacionados, los resultados
evidencian de nuevo que el pH en las emulsiones es una variable dependiente de la temperatura y en este caso,
adicionalmente a la luz. Las emulsiones que estuvieron sometidas a luz (ver imagen 8) alcanzaron una mayor
disminución en la variable que aquellas que estuvieron en ausencia de luz (0,26 unidades). Por otro lado, tal
como se señaló en trabajos previos [22], la temperatura de refrigeración actual garantiza una menor variación
en el tiempo de las propiedades de la emulsión; sin embargo, contrario a lo que se esperaría, la temperatura
ambiente presenta una disminución mayor con respecto a la condición de temperatura corporal.
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Para aquellas emulsiones que no están el rango, es necesario considerar estos resultados como un factor de
descarte de las emulsiones, puesto que valores por debajo al rango podrían generar una disminución en la
repulsión electrostática, dando lugar a un aumento de tamaño de gota y coalescencia [14].
Imagen 7. Evolución pH a condiciones de temperatura de almacenamiento sin luz. Valores promedio ± SD.
Imagen 8. Evolución pH a condiciones de presencia/ausencia de luz en el almacenamiento a temperatura ambiente. Valores
promedio ± SD.
2. Espectro infrarrojo cercano
En las imágenes siguientes se presentan los espectros obtenidos con el equipo NIR. Las imágenes 9 y 10
corresponden a las emulsiones estériles, en las cuales se evidencia un aumento en la absorbancia en las zonas 1
y 2 para ambas temperaturas; además se presenta una significativa diferencia entre la preparación y la
medición en el tiempo inmediato y el día final. Lo anterior puede atribuirse a un aumento en el tamaño de los
liposomas, lo cual genera aumento en la absorbancia del espectro [8] y como se mencionó previamente estaría
asociada al cambio en las propiedades de algunos componentes debido a la temperatura. Este comportamiento
se presenta para todos los niveles estudiados en condiciones de almacenamiento como se observa en las
imágenes 11 a 14. Sin embargo, las condiciones de temperatura de almacenamiento presentan variaciones
adicionales en la zona 3.
A 37ºC en los días 25 y 32 todas las zonas presentan un aumento en la absorbancia y un cambio en el patrón,
que coinciden con los cambios físicos presentados para este nivel mencionados previamente.
Otros autores que realizaron caracterizaciones para las condiciones de almacenamiento de PFCOCs
identificaron aumentos en el tamaño, y ausencia de aceite a 37ºC luego de 100 días, por lo cual podría
atribuirse este cambio a la ausencia de fase dispersa [23]. La posible relación del tamaño y los espectros se
determinará en el numeral siguiente.
18
Imagen 9. Espectro en el tiempo estéril nivel bajo.
Imagen 10. Espectro en el tiempo emulsión estéril nivel alto
Imagen 11. Espectro en el tiempo T=4ºC, sin Luz
19
Imagen 12. Espectro en el tiempo T=37ºC, sin luz
Imagen 13. Espectro en el tiempo T=18ºC, sin luz
Imagen 14. Espectro en el tiempo T=18ºC, con luz
20
3. Tamaño de partícula
Los valores reportados por el equipo para temperatura de esterilización y condiciones de almacenamiento
de las emulsiones agitadas para el tamaño y tamaño promedio de partícula en el tiempo se presentan en las
imágenes 15 a 19.
Imagen 15. Tamaño promedio de partícula condiciones de esterilización
Imagen 16. Tamaño de partícula temperatura de esterilización 100ºC
Imagen 17. Tamaño promedio de partícula temperatura de esterilización 121ºC
21
Imagen 18. Tamaño promedio de partícula condición de almacenamiento: Temperatura
Imagen 19. Tamaño promedio de partícula condición de almacenamiento: presencia/ausencia de luz
La temperatura y la luz de nuevo son factores que afectan la estabilidad de las emulsiones, en este caso a
través del tamaño de partícula. Temperaturas muy altas como las utilizadas en la esterilización generan un
mayor incremento en el tamaño de partícula entre la preparación y el tiempo inmediato luego de la
esterilización.
Aunque para todos los casos de esterilidad se presenta aumento en el tamaño, la velocidad y los valores
alcanzados son mayores a 121ºC, generando una mayor inestabilidad a esta condición. Adicionalmente a
esta temperatura, el aumento del diámetro entre la preparación y el inmediato es del 30%, contrario a lo
que ocurre en el nivel bajo (100ºC) donde no se afecta significativamente, tal y como se había reportado
en trabajos anteriores [7].
En general, el tamaño de partículas muestra un incremento en el tiempo desde el día 4, incluso en las
emulsiones no estériles, lo cual se podría atribuir al inicio de sedimentación generada por la densidad del
PFC, que es casi el doble de la densidad del agua (1,96 g/ml) [4], fenómeno que desaparece al agitarse.
Este mismo comportamiento se presenta en la temperatura de almacenamiento.
Sin embargo, en el nivel bajo de temperaturas de esterilización ocurre una disminución en el diámetro
promedio en el día 4. Dado que el mismo comportamiento se evidenció en el espectro infrarrojo cercano
en las zonas 1 y 2 (para dicha muestra, en el mismo tiempo de medición), se corrobora que la
disminución/aumento del tamaño promedio de las emulsiones está asociado a las zonas 1 y 2 del espectro
infrarrojo cercano.
Velasco & Alvarez (2010) [4], asocian la zona 1 a la identidad y el comportamiento característico de cada
sustancia y las zonas 2 y 3 a las vibraciones de las gotas de PFC y de los liposomas. Adicionalmente, la
guía del equipo utilizado, presenta una clasificación de zonas por longitud de onda, en donde se identifican
para cada una de las longitudes de onda (o rangos) los posibles enlaces presentes (ver imagen 20).
Si se considera lo anterior, en los espectros obtenidos se observaría la variación de las composiciones de
las sustancias involucradas en la emulsión de la fase continua, principalmente porque a estas longitudes se
22
encuentran presentes los enlaces C-H y H2O dentro de la zona 1 y la zona 2 y en la zona 3 la fase dispersa,
un poco más notorias en las emulsiones no estériles estudiadas para condiciones de temperatura de
almacenamiento.
Imagen 20. Clasificación de enlaces presentes en el NIR según la longitud de onda [24]
En el caso de la luz se ratifica que la presencia afecta la estabilidad, puesto que como se observa en la
imagen 15, el diámetro promedio es mucho mayor en presencia de luz. Por otro lado, el tamaño del
diámetro promedio obtenido mediante este método de refleja que las emulsiones transportadoras de
oxígeno preparadas no se encuentran en el rango ideal, lo cual no permitiría el su uso in vivo.
Se recomienda descartar las condiciones de almacenamiento a 37ºC, puesto que como se mencionó
anteriormente, la temperatura genera incrementos significativos en el tamaño promedio en el tiempo a una
mayor rata, para esta variable poniendo en riesgo al paciente (ver imagen 18).
Las microscopías comparativas para las condiciones de almacenamiento en el tiempo se encuentran como
en el anexo 1 de este documento., A 37ºC no parece haber evidencia de gotas de PFC al final de la
medición lo que soportaría a las evidencias encontradas previamente en mediciones de tamaño, NIR y pH,
por lo cual se podría intuir que es posible que al igual que en otros estudios, con el tiempo, la fase dispersa
desaparezca. Por otro lado, se observa una mayor polidispersidad cuando hay presencia de luz, y se
corrobora que a 4ºC, la variación en el tamaño es menor que en las otras condiciones.
Es importante anotar que bajo cualquier condición de almacenamiento se presenta un incremento en el
tamaño del diámetro promedio al incrementar el tiempo de almacenamiento, incluso a 4ºC, sin embargo
esta temperatura de almacenamiento es la más recomendada puesto que presenta una menor variación.
4. Comportamiento reológico
En la tabla 4 y 5 se presentan los valores de viscosidad obtenidos a velocidad de cizalla 100/s para los
niveles de la temperatura de esterilización y para las condiciones de almacenamiento respectivamente.
23
Tabla 4. Valores de viscosidad a velocidad de cizalla de 100/s para temperatura de esterilización
Día
Viscosidad
[Pa*s] N.
Bajo
Viscosidad
[Pa*s] N.
Alto
Viscosidad
[Pa*s] Sin
Esterilizar
0 6,39E-03 6,73E-03 5,92E-03
inm 6,56E-03 6,76E-03 -
4 6,57E-03 7,16E-03 5,82E-03
11 6,94E-03 7,27E-03 5,76E-03
18 7,10E-03 7,10E-03 5,69E-03
25 6,88E-03 7,53E-03 5,88E-03
32 6,82E-03
5,62E-03
Tabla 5. Valores de viscosidad [Pa*s] a velocidad de cizalla 100/s Condiciones de Almacenamiento
Día
4ºC
nivel 1
18ºC
nivel 2
(Luz)
37ºC
nivel 3
18ºC
nivel 2
(Sin Luz)
0 6,66E-03 6,32E-03 6,32E-03 6,51E-03
4 6,67E-03 5,98E-03 6,39E-03 6,14E-03
11 7,08E-03 6,02E-03 6,62E-03
18
25 6,35E-03 6,69E-03 7,47E-03 6,92E-03
32 6,54E-03 7,06E-03 3,50E-03 6,68E-03
En general, el comportamiento reológico de las emulsiones estériles presenta viscosidades mayores a las
no estériles y, presenta variaciones mínimas en el tiempo entre las que no lo son (ver imagen 21). Sin
embargo para el nivel alto, la viscosidad es mayor. También se evidencia que la luz es un factor que afecta
directamente esta propiedad puesto que en ausencia de esta, la diferencia es menor entre el día cero y el
día 32.
Imagen 21. Evolución del comportamiento reológico en el tiempo para las condiciones de esterilización
A la misma velocidad, las viscosidades para los niveles 1 y 2 de temperatura de almacenamiento presentan
una tendencia a disminuir; aunque el día 25 presenta cambios en este comportamiento. Aunque los valores
reportados evidencian que en el caso del nivel 3, la viscosidad presenta un comportamiento diferente, esta
tiende a aumentar en el tiempo, y que después del día 25 disminuye considerablemente, el comportamiento
24
reológico se mantiene constante en el tiempo con variaciones mínimas (ver imagen 22). Esta misma
tendencia ocurrió para los niveles de temperatura de esterilización evaluados, en donde ocurre
disminución en el día 18. Velasco y Alvarez (2011) [4], evidencian que las emulsiones de PFC tienen
viscosidades mayores en el día en el que la sedimentación llega al equilibrio (día 14). Con base en lo
anterior, dependiendo de la temperatura de almacenamiento, el equilibrio ocurre en diferentes días: para
los niveles 2 y 3, este punto se obtiene en el día 25, mientras que en el nivel 1 debe ocurrir antes. Sin
embargo no se puede ser preciso dado que no se pudo realizar esta caracterización justo antes de ese día.
Adicionalmente cuando hay presencia de luz, la viscosidad máxima ocurre en el día 32 (ver imagen 23)
Imagen 22. Evolución del comportamiento reológico a condiciones de temperatura de almacenamiento
Imagen 23. Evolución del comportamiento reológico en el tiempo a condiciones de presencia/ausencia de luz.
Por otro lado, al analizar las condiciones de almacenamiento se observa que existe presencia de histéresis,
la cual ocurre justo cuando se reporta la viscosidad máxima. La histéresis se genera cuando el perfil de
flujo entre la primera corrida (ida) y la segunda (vuelta) son diferentes, debido a que la viscosidad en la
segunda corrida cambia luego de aplicar un esfuerzo (velocidades de cizalla) sobre el fluido, alterando los
mecanismos de inestabilidad reversibles presentes en la emulsión. Este fenómeno se relaciona
directamente con el tamaño de partícula, puesto que en emulsiones homogéneas no se presentarían
cambios entre las corridas al someterse a un esfuerzo.
25
5. Potencial zeta
Las emulsiones transportadoras de oxígeno estudiadas, presentan valores absolutos entre 14 mV y 16 mV
justo después de la preparación. Sin embargo luego de la esterilización el potencial disminuye rápidamente
y genera mayor inestabilidad en las emulsiones (ver imagen 24).
Imagen 24. Evolución del Potencial Z en el tiempo para condiciones de esterilización.
Adicionalmente, al relacionar estos valores obtenidos, se observa que los cambios son proporcional al pH
e inversamente proporcional al tamaño del diámetro reportado, tal como se mencionó previamente.
Algunos autores reportan que el potencial zeta está asociado principalmente a los componentes
fosfolípidos [23], por lo cual sería posible asociarlo directamente al surfactante. De este modo, es posible
relacionar el potencial zeta con el pH y el tamaño de partícula, puesto que una disminución en el pH, es un
indicativo de aumento de electrolitos disueltos, que a su vez genera una mayor aglomeración de iones
alrededor de los liposomas del surfactante, lo que crea una capa alrededor de estos y un mayor diámetro
reportado por el equipo [8].
Al comparar los valores reportados con el rango ideal de esta propiedad, se concluye que el potencial zeta
presenta valores “no tan altos” en el momento de la preparación, lo que genera una emulsión inestable y
que en el tiempo puede llegar a generar métodos de inestabilidad no reversibles como floculación,
formación de agregados, aumento en el diámetro de las gotas y liposomas, como lo que ocurrió en el caso
de las condiciones de temperatura de almacenamiento, donde los valores disminuyeron hasta obtener
valores absolutos de cero, para la temperatura de 37ºC (ver imagen 25).
Aunque el potencial zeta para las emulsiones estériles es mucho menor a las emulsiones no estériles, no es
posible determinar con exactitud si esta variación se relaciona con factores externos como la temperatura,
puesto que se generaron errores por el equipo durante las mediciones para las condiciones de
almacenamieto (QR=Quality report,), posiblemente porque la polidispersidad de la muestra es mucho
mayor.
26
Imagen 25. Evolución del Potencial Z en el tiempo a condiciones de Temperatura de almacenamiento.
6. Osmolalidad
La medición de esta propiedad se realizó para las fases de sedimento y sobrenadante únicamente. En las
imágenes 26 y 27 se presentan los resultados obtenidos en la caracterización para el nivel bajo, alto y sin
esterilizar respectivamente.
Con base en los resultados mostrados, se observa que la tendencia de la osmolalidad en el tiempo depende
de las fases, y que los cambios son mayores a las condiciones sin esterilizar, por lo cual es posible creer
que la esterilización afecta esta variable de forma leve, puesto que todas las emulsiones se mantienen en el
rango de referencia.
No se puede establecer la dependencia de esta propiedad con factores externos como temperatura y
presencia/ausencia de luz, puesto que los resultados medidos no fueron constantes en el tiempo para las
fases.
Imagen 26. Evolución de osmolalidad en el tiempo para el sobrenadante-temperaturas de esterilización
27
Imagen 27. Evolución de osmolalidad en el tiempo para sedimento- temperaturas de esterilización.
D. Oxidación de la lecitina
Algunos autores señalan que a condiciones aceleradas de temperatura, las emulsiones que contenían
lecitina de soya mostraban cambios en la apariencia, tomando un color café debido a la oxidación de
fosfolípidos [25], tal como ocurrió en el nivel alto de esterilización.
La oxidación de la lecitina se evidencia en trabajos previos relacionándola con la variación de pH y el
tamaño de partícula [14]. Sin embargo, existen otros factores que pueden alterar la variación de estas
propiedades como es la presencia de microorganismos. Con el objetivo de conocer si dentro de los factores
que promueven estos cambios se encuentra la oxidación de la lecitina o de otros compuestos de las
emulsiones, se sometieron 3 preparaciones de lecitina en fase continua de 100 ml a dos condiciones
aceleradas durante una hora, la presencia directa de luz y temperatura a 70ºC (justo en el rango entre la
temperatura corporal y el nivel bajo de esterilización). A cada una de las muestras se le realizaron
mediciones de pH y espectro infrarrojo cercano (imágenes 28, 29 y 30), que corresponden a las
propiedades donde se evidenciaron mayores cambios en el tiempo.
La tabla 6 presenta las composiciones de las preparaciones de lecitina, manteniendo las relaciones p/v y
v/v de la formulación de la Universidad de los Andes. En la tabla 7 se presentan los resultados promedio
obtenidos para las mediciones de pH bajo las condiciones de luz y temperatura.
Tabla 6. Composiciones de preparaciones - Fase continua
Preparación Lecitina [g] Agua [ml] Alginato [ml] Dextrosa [ml]
Lecitina- Agua (L-Ag)
4,5
100 - -
Lecitina – Agua-
Alginato (L-Alg)
99,4 0,55 -
Lecitina-Agua-
Dextrosa (L-Dxt)
40,5 - 5,5
Tabla 7. Resultados promedio mediciones de pH para condiciones de almacenamiento - Fase continua
Medición
L-Ag L-Alg L-Dxt
Prom SD Prom SD Prom SD
inicial (t=0) 6,535 0,035 6,230 0,0247 5,3325 0,0049
Luz (t=1h) 5,588 0,016 5,648 0,0078 4,6555 0,0078
Temperatura
(t=1h) 5,763 0,134 5,965 0,0134 5,251 0,0071
28
Los resultados obtenidos evidencian que las variaciones para cualquiera de los dos factores afectan
directamente el pH de cualquiera de las preparaciones, sin embargo las variaciones son más significativas
en presencia de luz que con la temperatura, especialmente en la preparación L-Ag cuya diferencia fue 0,94
unidades, respecto a las otras L-Alg (0,582 unidades), L-Dxt (0,677 unidades). Cómo la mayor variación
por la temperatura correspondió a la preparación L-Ag, se sugiere de este modo que si existe una relación
entre las disminuciones de esta propiedad en la caracterización de las emulsiones estudiadas y el
surfactante.
En el espectro infrarrojo cercano, se evidencia que la exposición de luz afecta principalmente al alginato, y
que este factor afecta a las zonas 1 y 3, generando una disminución en la absorbancia de forma menos
significativa, la cual también se observa en las preparaciones de L-Ag. Al evaluar la temperatura en el
NIR, la preparación L-Ag de nuevo es la preparación afectada, generando un aumento en la absorbancia en
la zona 3 y disminución en la zona 1.
Para el caso de la preparación L-Dxt se evidenció que los factores evaluados no afectan las propiedades
evaluadas (ver imagen 30), por lo cual se concluye que este agente no afecta las propiedades
caracterizadas de las emulsiones de PFC.
Imagen 28. Espectro Lecitina-Agua-Fase continua condiciones de almacenamiento (Azul t=0; verde temperatura t=1h; Roja Luz
t=1h)
Imagen 29. Espectro lecitina Alginato-Fase continua: condiciones de almacenamiento (Azul t=0; Verde Temperatura t=1h; Roja
Luz t=1h)
29
Imagen 30. Espectro Lecitina- Dextrosa. Fase continua: condiciones de almacenamiento (Azul t=0; Verde Temperatura t=1h;
Roja Luz t=1h)
E. Pruebas microbiológicas
Las pruebas microbiológicas de control de esterilidad realizadas a las emulsiones luego de su esterilización,
presentaron crecimiento bacterias y hongos en ambos niveles de temperatura de esterilización en dos de los
tres casos evaluados (luego de 1 día y 4 días de esterilización).
En la prueba de 1 día de estéril, se identificó únicamente bacterias en el nivel bajo (100ºC), con sólo un tipo
de morfología presente, luego se procedió a aislar dicha morfología en dos medios enriquecidos (LB) para
luego hacer prueba de Gram, en donde se identificó bacterias Gram positivos por su coloración. En la
imagen 31 y 32 se presenta la evidencia encontrada. Finalmente luego de hacer microscopía a la muestra, se
identificó que por forma correspondía a bacterias “cocos” gram positivos (asesoría del CIMIT).
En la segunda prueba, con 4 días de esterilidad, se identificó crecimiento de bacterias y hongos. Dado que
se identificó un mismo tipo de crecimiento no se realizó aislamiento y se procedió a realizar prueba de
Gram para las bacterias y análisis microscópico para ambos casos. El resultado de identificación de
estructuras para bacterias se identificó de nuevo “bacterias cocos Gram positivas”, por la coloración y
forma. En el caso de hongos no hay claridad sobre el tipo identificado, de acuerdo a la microscopia
realizada para este medio se observa cerca de 3 morfologías por lo que se sugieren pruebas adicionales. En
las imágenes 33 a 34 muestran la evidencia de crecimiento obtenido para este caso.
30
Imagen 31. Evidencia de crecimiento microbiológico Emulsión estéril 100ºC, medio de cultivo tioglicolato prueba estéril 1 día.
Imagen 32. Microscopía bacterias emulsiones estériles 1 día, Temperatura de esterilización 100ºC.
Imagen 33. Evidencia de crecimiento microbiológico emulsión estéril 121ºC, medio de cultivo caseína, prueba 4 días
de esterilidad
31
Imagen 34. Microscopía 121ºC hongos- prueba: 4 días de esterilidad
Finalmente en el tercer caso, se presentó crecimiento de hongos en ambos medios, sin embargo, al igual
que en la prueba 2, el medio que corresponde al control para ambos medios presentó crecimiento, por lo
cual fue necesario descartarlo.
Los “cocos” Gram positivos están involucrados en un cuarto de todas las infecciones humanas anaeróbicas
aisladas [26]. La identificación del tipo de coco Gram positivo presente en las emulsiones permitirá además
identificar la patología y los efectos que puede generar en el paciente.
Por lo anterior y con el propósito de continuar con una identificación más rigurosa a las bacterias obtenidas,
se sugiere la realización de pruebas como PCR (reacción en cadena de la polimerasa por sus siglas en
inglés), bioquímicas y API, con el fin de determinar actividad enzimática, fuentes nutricionales. Sin
embargo el CIMIT recomienda pruebas API para Gram positivas, puesto que reúnen las anteriores pruebas
en una sola, sin incurrir en gastos excesivos en medios de cultivos para cada una.
32
IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Las PFCOCs estudiadas no son emulsiones estables y aptas para el uso in vivo, puesto que sus propiedades
presentan variaciones significativas en el tiempo.
Se comprobó que la estabilidad de las emulsiones se ve afectada por dos factores: la temperatura y la luz;
y estos factores inciden directamente sobre los componentes de la fase continua, principalmente sobre el
surfactante.
Temperaturas elevadas (de esterilización y almacenamiento) afectan las propiedades organolépticas y
físico-químicas de las emulsiones de forma directa, debido a que existe una oxidación del surfactante y
puesto que aceleran las variaciones en las propiedades de las emulsiones.
La esterilización para estas emulsiones además de ser un requisito, es una necesidad, puesto que se
observó la susceptibilidad de estas emulsiones a ser contaminadas (ver pruebas microbiológicas) por
condiciones externas como el almacenamiento. Esto puede ser atribuido a la composición rica en carbono
de las emulsiones, una de las condiciones necesarias para que haya crecimiento microbiológico.
No se recomienda almacenar estas emulsiones por un tiempo mayor a 25 días, puesto que la inestabilidad
es máxima en este tiempo bajo las condiciones evaluadas, afectando todas las propiedades caracterizadas.
Por otro lado, es importante resaltar que se presenta una diferencia entre los espectros obtenidos para la
fase continua estudiadas en la sección 4.4 y las emulsiones en cada uno de los niveles de temperatura de
esterilización y condiciones de almacenamiento. Esta diferencia se ubica en la zona 3, en el rango de 2100
y 2350 nm donde se presenta concavidad. Está diferencia estaría asociada al comportamiento de PFC en la
emulsión. De este modo y con la verificación de la absorbancia del PFC se podría comprobar que la zona
3 también está a las gotas de PFC.
Se recomienda mantener refrigeradas a 4ºC con el fin de garantizar variaciones mínimas en las
propiedades de las emulsiones. Es posible contemplar el almacenamiento en ausencia de luz a 18ºC.
Del mismo modo, la temperatura de esterilización a 100ºC es aquella que presenta menores variaciones en
el tiempo en las mismas propiedades, por lo que se recomienda continuar con esta temperatura de
esterilización.
Es importante hacer un seguimiento riguroso a las pruebas de crecimiento microbiano, con el fin de
determinar con exactitud el tipo de bacterias y hongos a los que es susceptible de contaminarse la
emulsión, con el fin de identificar las rutas o situaciones que lo generan y de este modo evitarlas, para ello
se recomienda realizar las pruebas de PCR y API.
El método de esterilización no se considera cómo un método suficiente para evitar la presencia de
microorganismos en la emulsión. Se recomienda considerar en conjunto la esterilización con condiciones
como: almacenamiento, condiciones de transporte.
33
V. BIBLIOGRAFÍA
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34
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[28] Fiske. (s.f.). User's Guide Fiske Model 110.
35
Anexos:
ANEXO 1. MICROSCOPÍAS
Imagen 35. Microscopía emulsión Temperatura almacenamiento4ºC- Día 32
Imagen 36. Microscopía Emulsión Temperatura almacenamiento 18ºC sin Luz- día 32
Imagen 37. microscopía emulsión temperatura de almacenamiento 18ºC con luz, día 32
36
Imagen 38. Microscopía emulsión temperatura de almacenamiento 37ºC-día 32