Estructura y propiedades de proteínas

Parte I. Extracción y precipitación por salado

Q.A. Moisés Méndez Ramírez

Dra. Sobeida Sánchez Nieto

Lactato deshidrogenasa (LDH) de músculo esquelético de Gallus gallus

https://swissmodel.expasy.org/interactive#sequence

Ciclo de Cori

Función de LDH

• https://www.kegg.jp/kegg-bin/show_pathway?ec00620+1.1.1.27

Conversión de Lactato a Piruvato

https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=1.1.1.27&Suchword=&reference=&UniProtAcc=&organism%5B%5D=Gallus+gallus&show_tm=0

Ejercicio de estructura de LDH

• MSLKDHLIHNVHKEEHAHAHNKISVVGVGAVGMACAISILMKDLADELTLVDVVEDKLKGEMLDLQHGSLFLKTPKITSGKDYSVTAHSKLVIVTAGARQQEGESRLNLVQRNVNIFKFIIPNVVKYSPDCKLLIVSNPVDILTYVAWKISGFPKHRVIGSGCNLDSARFRHLMGERLGIHPLSCHGWIVGEHGDSSVPVWSGVNVAGVSLKALHPDMGTDADKEHWKEVHKQVVDSAYEVIKLKGYTSWAIGLSVADLAETIMKNLRRVHPISTAVKGMHGIKDDVFLSVPCVLGSSGITDVVKMILKPDEEEKIKKSADTLWGIQKELQF

¿Para qué purificar una proteína?

• Investigación

• Industrial

• Farmacéutica

• Agroalimentaria

• Caracterización de actividad• Determinación de estructura-función• Establecimiento de relaciones evolutivas

¿Qué necesito saber para purificar proteínas?

• Fuente. Cuánto necesito y de dónde puedo extraerla y en dónde esta

• Función/Propósito. Para qué la necesito. Qué tan pura se requiere

• Propiedades de la proteína. Estabilidad, pH, pI, peso molecular (Da), solubilidad, afinidad por ligandos, hidrofobicidad.

• Equipo y presupuesto. Con qué y cuánto dispongo para el proceso

• Protocolo. Cuál será el diseño experimental. Qué hay en la literatura

Consideraciones generales• Grado de pureza, cantidad y nivel de actividad.Definir los objetivos de la purificación

• En función de su localización celular: compartimientos extracelulares y/o intracelulares.

Seleccionar muestra biológica de inicio

• Determinación rápida de pureza, actividad o contenido total de proteína. Desarrollar una técnica de análisis

• Evitar protocolos largos. Perdida de actividad biológica y/o rendimiento.Minimizar la manipulación de la muestra

• Interferencia con análisis. Evitar degradación de proteína.Remover contaminantes

• Aumento del costo y posible perdida de actividad.Reducir uso de aditivos

• Incrementar la pureza y mejorar el rendimiento.Usar una técnica diferente en cada paso

• 5-8 pasos para un enriquecimiento alto.Minimizar el número de pasos

Pasos para la obtención de una proteína

• Homogeneizado

• Fraccionamiento

• Aislamiento/Purificación

FASE I: Ruptura de membranas celulares y centrifugación diferencial o por gradiente. FASE II: Precipitación selectiva por adición de sales o disolventes.FASE III: Aislamiento de proteína con base en su propiedades fisicoquímicas.

Selección de fuente de proteína

Debe considerar:

• Tipo de proteína

• Facilidad de obtención de biomasa

• Cantidad de proteína en el tejido

• Propiedades de la proteína

• Ensayos piloto con proteína similar

Homogeneizado

• Proceso para la obtención de una suspensión uniforme por la ruptura celular y liberación del contenido al medio mediante un método mecánico, químico o enzimático.

• Requiere un medio o solución de homogenización que evite la desnaturalización o inactivación de la proteína. Permite ajustar pH, la fuerza iónica y estabilizar a la proteína.

TIPO TÉCNICA MECANISMO ESTRÉS APLICACIÓN

Mecánico

Mortero Molienda con abrasivos Moderado Células vegetales

Esferas Trituración con bolas de

acero o vidrioFuerte

Células animales y vegetales

Aspas Mezclados con cuchillas ModeradoTejidos duros y

blandos

Alta presiónFuerzas de cizalladura al

pasar a través de un orificioFuerte Bacterias

SonicaciónProducción de ondas de

ultrasonidosFuerte Levaduras y bacterias

Químico

Choque osmóticoSuspensión en medio

hipotónicoSuave Células animales

Tratamiento alcalino Saponificación de los lípidos FuerteEnzimas resistentes a

pH básicos

Disolventes orgánicosSolubilización de asociados a

membranaModerado Levaduras con tolueno

Detergentes Solubilización de membranas Suave Bacterias con SDS

Enzimático Permeabilización enzimáticaPermeabilización de la pared

celularSuave Gram (+) con lisozima

CentrifugaciónPermite eliminar contaminantes o clarificar a la proteína mediante la separación de los componentes del homogeneizado en función de su tamaño, forma y densidad.

Localización de proteínaFracción Condición Componente celular

Nuclear 600g / 10’ Núcleos, células intactas y restos de tejido no homogeneizado

Mitocondrial 15000g / 15’ Mitocondrias, lisosomas, peroxisomas y cloroplastos

Microsomal 100000g / 60’ Membrana plasmática, RE, Golgi, vesículas

Soluble 600000g / 120’ Ribosomas, polisomas, macromoleculas

Centrifugación por gradiente

Fuerza centrífuga relativa (RCF)

• Es la fuerza de aceleración aplicada a la muestra que depende del radio del rotor (r) y las revoluciones por minuto (rpm).

𝑅𝐶𝐹 = 1.12 𝑟𝑅𝑃𝑀

1000

2

• Controla el tamaño de los componentes a sedimentar y los que quedaran en suspensión

Precipitación por salado

Precipitación se da por cambios en la solubilidad de la proteína debido a modificaciones en el pH, temperatura, polaridad del medio o adición de moléculas cargadas.

Adición de Sulfato de amonio (NH4)2SO4 es el método más común

Desnaturalización de proteínas

La precipitación de la proteína dependerá sus características fisicoquímicas y estructurales.Cada proteína precipita a ciertas condiciones.

“Salting in” y “Salting out”

• Salting in

Incremento de iones

Solubilidad

• Salting out

Exceso de iones

SolubilidadPrecipitación de proteína

Video: Salting in and Salting out

• https://www.youtube.com/watch?v=gnhUh6qVD5Y&t=7sResiduos

hidrofóbicos

Residuos hidrofílicos

Proteína

H2O

Sal (NH4)2SO4

Aglomeración y precipitación de la proteína

Proteína soluble

Modificación conformacional de la proteína

Estructura nativa

• Ocurre la solvatación de la capa de agua de la proteína al incrementar los iones, aumentando la solubilidad.

• A altas concentraciones, se extrae el agua de la proteína modificando su conformación, por lo tanto, se aglomera y precipita.

Cálculo de cantidad de sulfato de amonio

http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl

Desalado

Consiste en retirar el agente precipitante. Puede interferir con las propiedades de la proteína o pasos posteriores de purificación.

• Dilución

• Diálisis

• Ultrafiltración

• Filtración en gel o exclusión molecular

Diálisis• Separación por medio de una membrana semipermeable de celulosa o

celofán de tamaño de poro determinado.

Requiere de una solución al menos 30 veces el volumen de la muestra.

Agitación constante a 4°C por aprox. 12 h.

Necesita varios cambios de solución.

Alto costo de membranasTiempo prolongadoProbabilidad de ruptura de la membrana

Filtración/ Ultrafiltración

• Permite separación empleando filtros de diferente tamaño de poro.

• Pueden emplearse velocidades de centrifugación superiores a 300000g.

• Cambio de amortiguador y eliminación de sales. Alto costo de filtros.

Pueden agregarse proteínas.Volúmenes pequeños.

Posible perdida de proteínaDepende de la elección del poro del gel

Monitoreo por absorbancia a 280 nm

Diagrama experimental• Ruptura mecánica del tejido.

• Filtración en gasa

• Separación por peso (centrifugación)

• pp Salado

Muchas proteínas pp, pero NO la LDH y otras proteínas

• pp Salado

Muchas proteínas pp y también la LDH

• LDH y otras proteínas en el botón se resuspenden

antes de desalar

• Desalado