Estructura y distribución de un intersticio no reconocidoen tejidos humanos

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Informes científicos volumen 8 , Número de artículo: 4947 ( 2018 )doi (Identificador de Objeto Digital) : 10.1038 / s41598-018-23062-6Descargar Citation

Recibido:18 de mayo de 2017

Aceptado:06 de marzo de 2018

Publicado en línea:27 de marzo de 2018

La endomicroscopía confocal con láser (pCLE) proporciona imágenes histológicas entiempo real de tejidos humanos a una profundidad de 60-70 μm durante la endoscopia. ElpCLE del conducto biliar extrahepático después de la inyección de fluoresceína demostróun patrón reticular dentro de los senos llenos de fluoresceína que no tenían un correlatoanatómico conocido. La congelación del tejido de la biopsia antes de la fijación preserva laanatomía de esta estructura, demostrando que es parte de la submucosa y un espaciointersticial lleno de líquido previamente no apreciado, drenando a los ganglios linfáticos ysoportado por una compleja red de gruesos haces de colágeno. Estos haces estánrevestidos de forma intermitente por un lado por células similares a fibroblastos que setiñen con marcadores endoteliales y vimentina, aunque existe una interfaz no alineada muyextensa e inusual entre las proteínas de la matriz de los haces y el fluido circundante.Observamos estructuras similares en numerosos tejidos que están sujetos a compresiónintermitente o rítmica, incluidas las submucosas de todo el tracto gastrointestinal y la vejigaurinaria, la dermis, los tejidos blandos peri-bronquiales y periarteriales, y la fascia. Estasestructuras anatómicas pueden ser importantes en la metástasis del cáncer, el edema, lafibrosis y el funcionamiento mecánico de muchos o todos los tejidos y órganos. Enresumen, describimos la anatomía y la histología de un espacio macroscópico, lleno delíquido y previamente desconocido, aunque ampliamente diseminado dentro y entre lostejidos, una novedosa expansión y especificación del concepto del intersticio humano.

Abstracto

Introducción1/18

El espacio intersticial es la principal fuente de linfa y es un importante compartimiento delíquidos en el cuerpo. Si bien la anatomía y la composición del espacio intersticial entre lascélulas se comprende cada vez más, la existencia, ubicación y estructura de los espaciosinter e intragrandes de mayor tamaño se describen solo vagamente en la literatura. Esto esparticularmente importante en referencia al "tercer espaciamiento" (acumulación de líquidointersticial) y al considerar el flujo y el volumen global de líquido intersticial, que no se hanestudiado bien .

Los avances en microscopía in vivo ofrecen el potencial para identificar nuevas estructurasanatómicas funcionalmente relevantes en humanos. Los vasos linfáticos en el cerebro, porejemplo, se identificaron recientemente por primera vez utilizando imágenes demicroscopía multifotónica in vivo a través de una preparación del cráneo adelgazada . Laendomicroscopía confocal con láser basada en sondeos (pCLE) es una tecnología deobtención de imágenes in vivo que proporciona una evaluación histológica en tiempo realde las estructuras tisulares durante la endoscopia, generalmente después de la inyecciónintravenosa de fluoresceína. Nosotros y otros hemos observado que, en los conductosbiliares extrahepáticos y los conductos pancreáticos, pCLE a la distancia focal fija de 60-70μm muestra un "patrón reticular" submucoso (Fig. 1A, B ) que consiste en bandas deramificación oscuras de 20 μm de ancho alrededor espacios poligonales llenos defluoresceína grandes . Estos no tienen una correlación obvia con las estructurasconocidas. Aunque los endoscopistas han sugerido que esta red representa capilares olinfangiolas , ninguna estructura puede explicar el patrón reticular de las bandas oscurasy los espacios brillantes llenos de líquido.

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Figura 1

Identificación del patrón reticular del conducto biliar y demostración del espaciosubmucoso. ( A , B ) pCLE del conducto biliar después de la inyección de fluoresceínamuestra un patrón reticular a una profundidad de 60-70 μm. Barra de escala, 20 μm. ( C-E) El tejido del conducto biliar retirado en el momento de la cirugía de Whipple se congeló yse realizó pCLE ex vivo , lo que demuestra la persistencia del patrón reticular. Barra deescala, 20 μm. ( F ) El tejido congelado no teñido de la submucosa de un conducto biliarfotografiado por microscopía fluorescente, que muestra el patrón reticular en esta capa depared del conducto biliar. Los espacios "brillantes" ahora están oscuros (el fluidofluoresceinado se drenó durante el procesamiento y las estructuras tisularespermanecieron teñidas con fluoresceína residual). ( G ) El tricrómico de Masson delconducto biliar recién congelado muestra que las bandas oscuras son haces de colágeno(azul) (izquierda). La esquina superior derecha muestra el tricrómico de Masson de unconducto biliar normalmente procesado / fijo del mismo paciente, con colapso de losespacios y adherencia aparente de los haces de colágeno entre sí. La parte inferiorderecha muestra la muestra fija teñida con H & E; los espacios delgados entre las capas decolágeno (flechas) reflejan espacios llenos de líquido que se colapsan casi por completo. (H ) Los conductos biliares congelados (arriba) y fijos (abajo) inmunoteñidos conanticuerpos contra CD34 (izquierda, marrón) y D2-40 (derecha, marrón) muestran célulasque recubren los haces de colágeno; tenga en cuenta que los paquetes a menudo parecentener una celda de revestimiento en un lado, pero no en el otro (20 ×, DAB, hematoxilina). (I ) Esquema del espacio lleno de líquido sostenido por una red de haces de colágenorevestidos de un lado con células. Ilustración de Jill Gregory . Impreso con permiso delSistema de Salud Mount Sinai , con licencia bajo CC-BY-ND . (https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/legalcode ).

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Presumimos que este patrón refleja una extensión del espacio intersticial intercelular.Llevamos a cabo un estudio en profundidad utilizando pCLE e histología de la vía biliarextrahepática humana con el fin de identificar los correlatos microanatómicos del patrónreticular. Presentamos aquí la existencia de una novela intersticial ( i . E . Pre-linfático)espacio definido por una celosía complejo de haces de colágeno de espesor. Observamosestructuras similares cuando ampliamos nuestro estudio para incluir la dermis, el estromaperi-arterial, la submucosa de las vísceras (tracto gastrointestinal, vejiga urinaria), el árbol

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bronquial de los pulmones y los planos fasciales del sistema musculoesquelético y el tejidoadiposo, y como un resultado propone una revisión a gran escala de la macro ymicroanatomía del intersticio humano.

Las muestras se obtuvieron a partir de muestras quirúrgicas de los conductos biliaresresecados durante doce cirugías pancreatico-biliares. Varios minutos antes de la ligaduravascular y la resección de la pieza quirúrgica, los pacientes fueron infundidosintravascularmente con fluoresceína con visualización directa in situ por pCLE del patrónreticular (Fig. 1A, B ). El sitio fue resecado y luego escaneado de nuevo inmediatamentecon pCLE ex vivo , confirmando que el patrón reticular y la fluoresceína seguían intactosdespués de la resección (datos no mostrados). A continuación, las muestras se incrustaronen medio de sección congelada, se congelaron rápidamente usando un aerosol decongelación a base de aerosol, y se volvieron a formar imágenes (Fig. 1C, D, E ). Lassecciones congeladas en serie se cortaron perpendicularmente al ángulo de visión delpCLE exactamente en la cara con respecto a la superficie del lumen, marcando seccionescada 5 μm hasta que se alcanzó una profundidad de 60-70 μm. También realizamossecciones seriales de tejido en un plano transversal. Estas secciones se visualizaron bajomicroscopía de fluorescencia de rutina (Fig. 1F ), que muestra que el patrón reticular secorrelacionaba con haces gruesos, teñidos con fluoresceína (vistos en pCLE como bandasnegras). La ausencia de fluorescencia entre estos haces en los portaobjetos finales sedebe al proceso de preparación de portaobjetos en sección congelada (secado al aire,fijación y lavado) que hace que el fluido drene del portaobjetos final.

Las secciones congeladas en paralelo se tiñeron con tinción con tricrómico de Masson, loque confirma la presencia de bandas de colágeno que separan los espacios abiertos,anteriormente llenos de líquido (Fig. 1G , izquierda). Estas estructuras co-localizadas conla submucosa biliar compacta normalmente observada en las muestras de biopsia yresección (Fig. 1G , derecha, del mismo paciente que la muestra a la izquierda). Estosugiere que la estructura densa previamente descrita de la submucosa representa unartefacto debido a la pérdida de fluido durante la escisión y fijación del tejido, haciendo quelos haces de colágeno normalmente separados colapsen y se adhieran entre sí.Observamos que el patrón reticular apareció dentro de los 30 segundos de la infusiónintravascular de fluoresceína, aproximadamente en el mismo momento en el que sevisualizan los ganglios linfáticos, pero más tarde que cuando se visualizan las estructurasvasculares . Esto sugiere que es una forma de espacio intersticial en el que se acumula oforma fluido intersticial o "prelinfático". La inmunotinción de la submucosa hepática fija ycongelada mostró tinción positiva de CD34 y D2-40 en un lado de cada haz de colágeno(Fig. 1H ). La inmunotinción fue negativa para otros marcadores endotelialeslinfovasculares (CD31, ERG, LYVE-1), pero uniformemente positiva para el marcadormesenquimático vimentina (datos no mostrados). Las tinciones para el marcadormioepitelial de la actina del músculo liso, el marcador de células madre CD117 y la beta-catenina nuclear fueron negativas (datos no mostrados). La Figura 1I es un esquema queresume las observaciones histológicas.

Los estudios ultraestructurales (Fig. 2A, B ) muestran que los haces de colágeno están

Resultados

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revestidos asimétricamente en un lado por células finas y planas (en forma de huso ensección transversal) que tienen un citoplasma escaso y un núcleo oblongo. Estas célulasson similares a fibroblastos, sin estructuras específicas de tipo celular; en particular, estándesprovistos de características ultraestructurales indicativas de diferenciación endotelial,que incluyen vesículas pinocitóticas y cuerpos de Weibel-Palade . La microscopíaelectrónica también muestra que estas células no tienen membrana basal, lo que sugiereque se adhieren directamente a los haces de colágeno subyacentes, y que, aunque unlado de un haz de colágeno determinado está revestido por estas células, el lado opuestosuele estar sin revestimiento y directamente expuesto a fluido en el espacio. Los haces sevisualizan bien mediante imágenes de generación de segundos armónicos (figura 2C ),confirmando que son colágeno fibrilar . También se observan fibras elásticasautofluorescentes, como lo confirma la apariencia similar de la lámina elástica en lasarterias del mismo tejido (figura 2C, recuadro) y mediante una tinción histoquímica elásticade Van Gieson (figura 2D ).

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Figura 2

Evaluación estructural del espacio intersticial. ( A ) El microscopio electrónico detransmisión muestra haces de colágeno (asteriscos) que están compuestos de fibrillas decolágeno bien organizadas. Algunos haces de colágeno tienen una única célula plana a lolargo de un lado (puntas de flecha). Barra de escala, 1 μm. ( B ) Mayor aumento muestraque las células (punta de flecha) carecen de características de endotelio u otros tipos decélulas y no tienen membrana basal. Barra de escala, 1 μm. ( C ) Las imágenes degeneración de segundos armónicos muestran que los haces son de colágeno fibrilar (azuloscuro). Las fibras de color cian son de autofluorescencia y es probable que seanelastinas, como lo demuestra la autofluorescencia similar en la lámina elástica de unaarteria cercana (recuadro) (40 ×). ( D ) La tinción elástica de Van Gieson muestra fibras deelastina (negras) que corren a lo largo de haces de colágeno (rosa) (40 ×).

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Las características histológicas características de esta estructura de la submucosa delconducto biliar (espacios llenos de líquido y con haces de colágeno alineadosasimétricamente por células planas) se visualizan fácilmente en otros tejidos. La estructura

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se reconoció consistentemente en la dermis en muestras de resección clínica de la piel(Fig. 3A ), y pCLE se aplicó a regiones delgadas de la piel in vivo después de la inyecciónde fluoresceína mostró el mismo patrón reticular en la dermis que en el conducto biliar. Losespacios llenos de líquido y los haces de colágeno revestidos por células que se tiñen paraCD34 se observan en histología en múltiples órganos y tejidos, incluso en la submucosade todo el tracto digestivo, la vejiga urinaria, el tejido peribronquial, la fascia y el estromade arterias y venas de todos tamaños (Fig. 3B y Supplemental Fig. 1 ).

figura 3

Se encuentra un espacio intersticial en la dermis y la submucosa y otros tejidosfibroconectores en todo el cuerpo. ( A ) La piel teñida con H & E (superior izquierda 10 ×,superior derecha 40 ×) muestra las mismas estructuras identificadas en el conducto biliarextrahepático. Inmunostain para CD34 (abajo a la izquierda, marrón DAB, azul clarocounterstain de hematoxilina, 40 ×) destaca que las células del revestimiento sonintermitentes y, a menudo en un lado de los haces de colágeno, pero no en el otro. ElpCLE aplicado a la piel in vivo después de esta observación histológica confirma que elaspecto histológico predice el patrón reticular in vivo cuando se aplica pCLE a la piel. ( B )Esquema que muestra la ubicación de las estructuras histológicas idénticas observadas enlos tejidos fibroconectores en todo el cuerpo (ver la Fig. 1 complementaria para lasimágenes de histología). Ilustración de Jill Gregory . Impreso con permiso del Sistema deSalud Mount Sinai , con licencia bajo CC-BY-ND . (https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/legalcode ).

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Estas estructuras parecen ser espacios prelinfáticos, como se sugiere al examinarespecímenes de resección de cáncer colorrectal con tatuajes submucosos (figura 4A ) enlos que el pigmento negro está presente en macrófagos dentro del espacio intersticial(figura 4B ) y en macrófagos asociados , drenando los nódulos linfáticos mesentéricos(Fig. 4C ). Estos macrófagos no se ven en los espacios intersticiales en el examen de lostejidos normales y se presume que ingresan al intersticio en respuesta a la presencia dematerial extraño. Además, el examen de muestras de resección de intestino delgado de

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hernias encarceladas con intestino proximal obstruido muestra una submucosa conproyección difusa de los haces de colágeno por fluido proteináceo (rosa) (Fig. 2complementaria ) histológicamente similar a la linfa.

Figura 4

Continuidad entre intersticio y drenaje linfático. ( A-C ) tejido de colon con tatuajesubmucoso. ( A ) Pigmento negro inyectado endoscópicamente en la submucosa de lapared del colon antes de la resección de la neoplasia maligna del colon (H & E, 10 ×). ( B )El pigmento negro está presente en los macrófagos en los espacios entre los haces decolágeno (H & E, 40 ×). ( C ) Los macrófagos que contienen pigmentos están presentes enlos ganglios linfáticos mesentéricos que drenan el colon tatuado, lo que demuestra que elespacio intersticial se comunica funcionalmente con el drenaje linfático del colon (H & E,20 ×). Imágenes típicas de 4 muestras independientes evaluadas. ( D-F ) Carcinomagástrico en estadio T2, pobremente diferenciado. ( D ) El carcinoma gástrico presente en lasuperficie de la mucosa (flechas) invade la submucosa (cabezas de flecha); la invasiónmás profunda y la invasión linfovascular no se observaron (H y E, 4 ×). ( E ) Las célulastumorales mal diferenciadas se infiltran, individualmente y en grupos muy pequeños, a

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través del espacio intersticial de la submucosa gástrica, aislando los haces de colágenopreexistentes (H & E, 40 ×). ( F ) Carcinoma metastásico en el drenaje de los ganglioslinfáticos mesentéricos de la muestra de resección gástrica; ninguna otra metástasis seidentificó clínica o histológicamente (H & E, 20 ×). ( G-I ) Etapa T2 melanoma maligno de lapiel del brazo izquierdo. ( G ) melanoma maligno (azul oscuro) que invade la dermis;invasión linfovascular no identificada (H & E, 4 ×). ( H ) Las células de melanoma malignose infiltran, por separado y en grupos muy pequeños, a través del espacio intersticial de ladermis, aislando los haces de colágeno preexistentes (H & E, 40 ×). ( I ) Melanomamaligno metastásico en el drenaje de los ganglios linfáticos axilares; no se identificaronotras metástasis clínica o histológicamente (H & E, 10 ×).

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La naturaleza prelinfática del espacio se enfatiza adicionalmente mediante el estudio detumores tumorales invasivos en estadio T2 (Fig. 4D-F , n = 3) y piel (Fig. 4G-I , n = 2). Lainvasión en estadio T2 del estómago se define como la invasión a la submucosa, pero nomás profunda. La invasión de T2 en la piel, asimismo, indica una invasión directamente enla dermis, pero no más profunda. La invasión por carcinoma gástrico invasivo pocodiferenciado (Fig. 4D ) muestra diseminación a través del espacio intersticial, rodeandohaces de colágeno todavía intactos (Fig. 4E ); a pesar de que no hay invasiónlinfovascular demostrable en esta muestra, hay metástasis en un ganglio linfáticomesentérico que drena (Figura 4F ). En un melanoma maligno que surge en la partesuperior del brazo e invade directamente en la dermis (Fig. 4G ), hay una diseminaciónsimilar a través del espacio intersticial con el aislamiento de los haces de colágeno (Fig. 4H ); nuevamente, a pesar de la ausencia de invasión linfovascular demostrable, haymetástasis en un ganglio linfático axilar que drena (Figura 4I ). En ambos casos, no seidentificaron otras lesiones o vías de diseminación incluso después del examen clínico ehistológico completo de los pacientes.

Proponemos aquí una revisión de los conceptos anatómicos de la submucosa, la dermis,la fascia y la adventicia vascular, lo que sugiere que, en lugar de ser paredes densamentecompactas de colágeno, son espacios intersticiales llenos de líquido. La presencia delíquido tiene implicaciones importantes para la función y la patología del tejido. Nuestrosdatos que comparan tejidos rápidamente biopsiados y congelados con tejidos fijados demanera estándar sugieren que los espacios que describimos, soportados y organizadospor un enrejado de colágeno, son compresibles y distensibles y pueden servir así comoamortiguadores. Todos los órganos en los que hemos detectado esta estructura estánsujetos a ciclos de compresión y distensión, ya sean relativamente constantes (pulmones,aorta) o intermitentes (tracto digestivo después de una comida, vejiga urinaria durante lamicción, piel bajo compresión mecánica, planos fasciales durante acción del sistemamusculoesquelético). El intersticio dérmico y el intersticio fascial pueden sermecánicamente importantes para explicar el edema (como en el caso del intestino pre-obstruido en la Fig. 2 complementaria ). El "tercer espaciamiento" en el linfedemapostoperatorio (como cuando se extirpan los nódulos de drenaje) y el anasarca debido ainsuficiencia hepática, renal o cardíaca pueden reflejar distensión de líquido y estasis en

Discusión

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este espacio intersticial. El espacio intersticial submucoso del árbol biliar, que se extiendea lo largo de toda la extensión del estroma portal extra e intrahepático, puede explicar eledema del conducto característico que se desarrolla rápidamente en la obstrucción agudadel conducto biliar grande.

Un apoyo adicional para la relación entre la histología que observamos y la estructura invivo proviene de la ecografía de los tejidos. La ecografía endoscópica del conducto biliarmuestra que consta de tres capas, la mitad de la cual comprende el 90% del espesor de lapared y está llena de líquido ; corresponde al intersticio submucoso. Los espaciossubmucosos de otras vísceras, la dermis y la fascia parecen heterogéneos por ultrasonido,típicamente indicativos de líquido o tejido adiposo, mientras que el estroma colagenizadoverdaderamente denso, como en los tendones y ligamentos, aparece oscuro porultrasonido . Apoyo adicional para nuestras observaciones se encuentra enestudios ultraestructurales publicados de piel, apéndice vermiforme y adventicia peria-aórtica, que también parecen haber incluido estas estructuras, aunque no estaban biencaracterizadas . En el hígado, el "espacio de Mall" previamente identificado en laregión del portal puede representar este intersticio . De hecho, los dibujos originales deMall, derivados de estudios de inyección, parecen representar las mismas estructuras queidentificamos aquí .

La naturaleza de las células del revestimiento no está clara. Mientras que las células delconducto biliar extrahepático se tiñeron tanto para CD34 como para D2-40, la tinción deD2-40 estuvo ausente en todos los demás tejidos examinados. Las células endotelialesvasculares también expresan conjuntamente CD34 y vimentina, pero la falta decaracterísticas endoteliales en el microscopio electrónico excluye esta clasificación paralas células del revestimiento intersticial que observamos, sugiriendo en cambio que sonuna forma nueva, positiva de CD34 de fibroblastos o incluso células madre mesenquimales

. No se sabe si son las células que depositan los haces de colágeno; si es así, seríanimportantes en la formación de cicatrices en la cicatrización de heridas. Notablemente, lascicatrices queloides muestran haces de colágeno y grandes espacios que parecen ser unaexageración de estas estructuras en la dermis subyacente . Los datos recientes quemuestran que las cicatrices queloides aparecen en las regiones de la piel bajo alta tensiónplantean preguntas sobre el impacto de las fuerzas mecánicas y el flujo de fluidos en lasestructuras y las células de este espacio [ .

Es probable que el intersticio submucoso que describimos corresponda a los espaciosintersticiales descritos en estudios de clusters celulares metastatizantes . La presenciade una red de canales submucosos en los tractos digestivo y urinario podría explicar lagran probabilidad de metástasis de los tumores luminales invasivos una vez que alcanzanla submucosa. Como lo ilustran los casos que mostramos de melanoma invasivo y cáncergástrico (Figura 4D-I ), la presencia de canales llenos de líquido submucoso / dérmicotambién sugiere la razón por la cual las lesiones T2 tienen un riesgo significativamentemayor de metástasis sobre lesiones en estadio T1 Debido a que las submucosasviscerales y la dermis son espacios abiertos y llenos de líquido, en lugar de una pareddensa de tejido conectivo, pueden ser fácilmente transitados por células tumoralesinvasivas. Además, la presión mecánica en tales espacios (peristalsis en el tractodigestivo, compresión y / o presión asociada al movimiento en la piel) podría promover aún

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más la diseminación a través de estos espacios. Si las células del revestimiento intersticialson los precursores de los miofibroblastos fibrogénicos, también podrían funcionar comoprimeros respondedores en la esclerosis peri-tumoral del árbol pancreatico-biliar, el tubodigestivo tubular, el árbol bronquial, la vejiga urinaria y la piel. De hecho, se ha informado

una población única de CD34 / vimentina que coexpresa fibroblastos peritumorales .Estas células también podrían desempeñar un papel importante en condicionesescleróticas no malignas, incluida la atresia biliar y la colangitis esclerosante primaria en elárbol biliar, la esclerodermia en la dermis y el esófago y la enfermedad inflamatoriaintestinal en el tracto digestivo. Los estudios en curso se centran en la caracterización deestas células y sus funciones.

El flujo de líquido intersticial a través del espacio submucoso del tracto gastrointestinalluminal probablemente esté guiado por peristalsis, en paralelo con los contenidosluminales. Si hay comunicación entre la luz intestinal y el espacio submucoso, esto planteala posibilidad de que la señalización celular (incluidas las señales hormonales oinmunológicas) pueda regularse de una manera proximal a distal determinada por lavelocidad del peristaltismo. Las interacciones inmunológicas en este espacio intersticialtambién podrían ser importantes en afecciones inflamatorias como la colangitisesclerosante primaria, la pancreatitis crónica, la enfermedad inflamatoria intestinal y laesclerodermia. Curiosamente, aunque los macrófagos no se observaron en estos espaciosen los tejidos normales examinados, trafican claramente en el espacio para tomar elpigmento del tatuaje después de la inyección submucosa (Fig. 4A-C ).

Los haces de colágeno en el espacio intersticial están alineados en un solo lado por lascélulas, lo que implica que la matriz de colágeno en el lado opuesto está en contactodirecto con el líquido intersticial. Hay pocos ejemplos conocidos en el cuerpo humanoademás del espacio intersticial entre las células, el glomérulo renal y el espacio de Disse,donde el fluido está en contacto directo con las proteínas de la matriz sin una barreracelular intermedia. Las fibras de colágeno, que son moléculas cargadas, pueden formaruna superficie fisiológicamente activa importante. Si las células del sistema inmune u otrascélulas que atraviesan el espacio interactúan con los haces de colágeno es una cuestiónaltamente fisiológicamente relevante que requiere una mayor investigación.

En resumen, mientras las descripciones típicas del intersticio sugieren espacios entre lascélulas, describimos los espacios macroscópicamente visibles dentro de los tejidos: senosdinámicamente comprimibles y distensibles a través de los cuales fluye el líquidointersticial alrededor del cuerpo. Nuestros hallazgos requieren la reconsideración demuchas de las actividades funcionales normales de diferentes órganos y de la dinámica defluidos desordenada en el contexto de la enfermedad, incluida la fibrosis y la metástasis.Una submucosa sometida a flujo peristáltico direccional no es la pared de tejido conjuntivodenso previamente prevista, sino un conducto potencial para el movimiento de agentesperjudiciales, moléculas de señalización pro-fibrogénicas y células tumorales. Esto planteala posibilidad de que el muestreo directo del fluido intersticial pueda ser una herramientade diagnóstico. Finalmente, nuestro estudio demuestra el poder de la microscopía in vivopara generar nuevos conocimientos sobre la anatomía y la fisiología de los tejidosnormales y enfermos.

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Pacientes y muestras de tejido

Trece pacientes sometidos a resección quirúrgica del árbol biliar en Mount Sinai Beth Israelfueron reclutados para participar en este estudio entre julio de 2012 y diciembre de 2013.El estudio se realizó con la aprobación de y de acuerdo con las directrices y regulacionespertinentes de la Escuela Icahn de Medicina en Mount Sinai (Mount Sinai Beth IsraelMedical Center) Institutional Review Board (IRB). Se obtuvo el consentimiento informadopor escrito de todos los pacientes para participar en el estudio (incluida la inyecciónintraoperatoria con fluoresceína y pCLE) y el examen de la muestra resecada bajomicroscopio para evaluar los márgenes quirúrgicos con endomicroscopía confocal conláser basada en sonda (pCLE). Los criterios de inclusión incluyen la capacidad de darconsentimiento informado y la edad superior a 18 años. Se obtuvieron tejidos adicionalespara el estudio de otros órganos a partir de materiales de archivo fijos, exentos de larevisión del IRB.

Evaluación intraoperatoria y perioperatoria

Los pacientes fueron infundidos con 2.5 ml de fluoresceína al 10% justo antes de laligadura vascular y la extracción de la muestra (que tomó aproximadamente 5-10 minutosen todos los casos). Posteriormente, se estudiaron más las muestras de conducto biliarperiférico, conducto pancreático y pared duodenal de las muestras de resección final.

Las muestras se obtuvieron de pacientes a los que se les inyectó fluoresceína (conductobiliar común = 10, conducto pancreático = 3, duodeno = 3, ganglio linfático = 1) y pacientescontrol no inyectados (conducto biliar común = 3, conducto pancreático = 1, duodeno = 1,nódulo linfático = 1). Algunas muestras quirúrgicas fueron lo suficientemente grandescomo para permitirnos estudiar varios tejidos diferentes.

Procesamiento y evaluación de muestras

Las muestras se escanearon con pCLE (Mauna Kea Technologies, Cellvizio®Cholangioflex miniprobe) ex vivo inmediatamente después de la eliminación, confirmandoque el patrón reticular y la fluoresceína estaban intactos. Las muestras se incrustaronluego en medio de congelación de OCT a base de glicerina y se congelaron rápidamenteusando un aerosol de congelación a base de aerosol (Cyto-Freeze de Thomas®) paraasegurar la retención de fluoresceína y la formación mínima de cristales de agua. Lasmuestras estaban incrustadas con el lado luminal hacia arriba o en sección transversal.Algunos especímenes eran lo suficientemente grandes como para ser bisecados yevaluados en ambos planos. Todas las muestras se almacenaron a -20 ° C. Comenzandoen la superficie luminal de los conductos biliares en cara y los conductos pancreáticos, lassecciones congeladas se cortaron consecutivamente con un espesor de 5 μm a unaprofundidad de 60-70 μm. También realizamos secciones seriales de tejido en un planotransversal al conducto biliar.

Las muestras se montaron en portaobjetos de vidrio sin fijador y secadas al aire, después

Métodos

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de lo cual se trataron usando un protocolo de sección congelada a base de xileno, secubren con cubreobjetos y se evaluaron y fotografiaron usando un microscopiofluorescente con un filtro de excitación FITC (475-490 nanómetros).

Tinción inmunohistoquímica

La inmunotinción se realizó de acuerdo con procedimientos estándar . Las muestras fijasse desparafinaron primero. Las muestras de secciones congeladas se secaron al aire y sefijaron al calor. Después de una noche de incubación a 4ºC con anticuerpo primario (Tabla1 complementaria ) y lavado con PBS, se sometieron secciones de 4 μm a anticuerposecundario biotinilado y a continuación a reactivo enzimático biotinilado con avidina(peroxidasa de rábano picante biotinilada con avidina). Después de la incubación con 1-3gotas de sustrato de peroxidasa (DAB-3,30-diaminobencidina; 0,6 mg / ml H2O20,03% en0,01 M de tampón Tris-HCl pH 7,6) y posterior lavado en H desionizada O, las seccionesse contratiñeron con Gill de hematoxilina y montada debajo de montura de cristal a basede xileno.

Microscopio de electrones

Las muestras para Microscopía Electrónica se fijaron en fijador Karnovsky, se fijaronposteriormente en tetróxido de osmio tamponado con fosfato al 1% y se incrustaron demanera estándar. Se cortaron secciones epoxi ~ 80 nm en un AO / Reichert Ultracut, setiñeron con uranilo y sales de plomo, y se examinaron en un microscopio electrónico ZeissEM 900 a 80 kV.

Segundo análisis de generación armónica

La microscopía de generación de segundo armónico de colágeno (SHG) se realizó enportaobjetos no teñidos usando un microscopio confocal / multifotón Leica TCS-SP5 con unláser Coherent Chameleon Ultra II sintonizado a una longitud de onda de 900 nm. Lasimágenes se adquirieron con detectores no desangrados.

Disponibilidad de datos

No se generaron o analizaron conjuntos de datos durante el estudio actual.

Nota del editor: Springer Nature permanece neutral con respecto a los reclamosjurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Información Adicional

Referencias1. Aukland, K. Distribución de fluidos corporales: mecanismos locales que protegen el

volumen del líquido intersticial. J. Physiol. (París) 79 , 395 - 400 (1984).1.

13/18

CASGoogle Académico

2. Louveau, A. y col . Características estructurales y funcionales de los vasos linfáticosdel sistema nervioso central. Naturaleza. 523 , 337-341 (2015).2.

3. Loeser, CS, Robert, ME, Mennone, A., Nathanson, MH y Jamidar, P. examenendomicroscópico confocal de estenosis biliares malignas y correlación histológicacon linfáticos. J. Clin. Gastroenterol. 45 , 246-252 (2011).

3.

4. Benias, PC y col . Endomicroscopía confocal a base de aguja para la evaluación delos ganglios linfáticos malignos - un estudio de viabilidad. Endoscopy 48 , 923-928(2016).

4.

5. Tse, D. & Stan, RV Heterogeneidad morfológica del endotelio. Semin. Thromb.Hemost. 36 , 236-245 (2010).5.

6. Cicchi, R. y col . De la estructura molecular a la arquitectura del tejido: organizacióndel colágeno explorada por microscopía SHG. J. Biophotonics. 6 , 129-142 (2013).6.

7. Takaqi, T., Irisawa, A. y Shibukawa, G. Anatomía ultrasonográfica intraductal devarices biliares en pacientes con hipertensión portal. Ultrasonido endoscópico 4 , 44-51 (2015).

ArtículoGoogle Académico

7.

8. Chung, IK y Hawes, RH Ventajas y limitaciones de la ecografía endoscópica en laevaluación y el tratamiento de pacientes con tumores submucososgastrointestinales: una revisión. Rev . Gastroenterol. Disord. 7 , 179-192 (2007).

Google Académico

8.

9. Patil, P. y Dasgupta, B. Papel de la ecografía diagnóstica en la evaluación deenfermedades musculoesqueléticas. El r. Adv. Musculoskelet. Dis. 4 , 341-355(2012).

9.

10. Sharma, M., Rai, P., Rameshbabu, CS y Senadhipan, B. Imágenes de ligamentosperitoneales por ultrasonido endoscópico (con videos). Endosc. Ultrasonido. 4 , 15-27 (2015).

10.

11. Wortsman, X. & Wortsman, J. Utilidad clínica del ultrasonido de frecuencia variableen lesiones localizadas de la piel. J Am Acad Dermatol 62 , 247-256 (2010).11.

12. Smith, LT & Holbrook, KA Desarrollo de tejido conectivo dérmico en la pielembrionaria y fetal humana. Escanear. Electrón. Microsc. 4 , 1745 - 1751 (1982).

Google Académico

12.

13. Ohtani, O., Ohtsuka, A. y Owen, RL Organización tridimensional de los linfáticos enel apéndice del conejo. Un electrón de barrido y estudio microscópico de luz.Gastroenterología. 91 , 947 - 955 (1986).

13.

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Descargar referencias

Agradecemos a Gordon Ruthel y al laboratorio de Microscopía de la Facultad de MedicinaVeterinaria de la Universidad de Pensilvania, a Jill Gregory (Sistema de Salud del MonteSinaí) por sus ilustraciones y a los Dres Stella Gordin, Syed Hoda y Hui Tsou(Departamento de Patología, Nueva York University School of Medicine) para asistenciaen la identificación de muestras de tejido clínico. Este trabajo fue financiado en parte poruna subvención de los Institutos Nacionales de Salud (DK081523) a RGW Este trabajotambién fue apoyado por el Centro de ingeniería MechanoBiology (CEMB), un Centro deCiencia y Tecnología NSF, bajo el acuerdo de subvención CMMI: 15-48571 .

Notas del autor

14. Keech, MK Estudio con microscopio electrónico de la aorta de rata normal. J,Biophys, Biochem, Cytol. 7 , 533 - 538 (1960).14.

15. Niiro, GK y O'Morchoe, CC Patrón y distribución de los vasos linfáticos intrahepáticosen la rata. Anat. Rec. 215 , 351 - 360 (1986).15.

16. Mall, FP Un estudio de la unidad estructural del hígado. Amer. J. Anatomy 5 , 1-82(1906).

Google Académico

dieciséis.

17. Sidney, LE, Branch, MJ, Dunphy, SE, Dua, HS y Hopkinson, A. Revisión concisa:evidencia de CD34 como un marcador común para diversos progenitores. Célulasmadre. 32 , 1380 - 1389 (2014).

17.

18. Berman, B., Maderal, A. y Raphael, B. Queloides y acars hipertróficos: fisiopatología,clasificación y tratamiento. Dermatol. Surg. 43 (Suppl 1), S3-S18 (2017).18.

19. Huang, C. y col . Progresión de queloides: una hipótesis de brecha de rigidez. IntWound J. 14 , 764-771 (2017).19.

20. Alexander, S., Weigelin, B., Winkler, F. y Friedl, P. Microscopía intravital preclínicade la interfaz tumor-estroma: invasión, metástasis y respuesta terapéutica. Curr OpinCell Biol. 25 , 659 - 671 (2013).

20.

21. San Martin, R. et al . Reclutamiento de fibroblastos CD34 (+) en el estroma reactivoasociado a tumores: la hipótesis de la microvasculatura reactiva. A.m. J. Pathol. 184, 1860-1870 (2014).

21.

22. Benias, PC, Gopal, K., Bodenheimer, H. Jr. y Theise, ND. Expresión hepática de losreceptores similares a los toll 3, 4 y 9 en la cirrosis biliar primaria y la hepatitiscrónica C. Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol. 36 , 448-454 (2012).

22.

Expresiones de gratitud

Información del autor

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1. Petros C. Benias y Rebecca G. Wells contribuyeron por igual a este trabajo

2. David L. Carr-Locke y Neil D. Theise supervisaron conjuntamente este trabajo.

Afiliaciones

1. Departamento de Medicina, División de Enfermedades Digestivas, MountSinai Beth Israel Medical Center, Icahn School of Medicine en Mount Sinai,Nueva York, Nueva York, 10003, EE. UU.

Petros C. Benias, Heather Klavan, Markus Miranda, David L. Carr-Locke Y Neil D. Theise

2. Departamento de Medicina, División de Gastroenterología, Escuela deMedicina Zucker en Hofstra / Northwell, 500 Hofstra Blvd, Hempstead, NY,11549, EE. UU.

Petros C. Benias

3. Departamento de Medicina, División de Gastroenterología, PerelmanSchool of Medicine, Universidad de Pensilvania, Filadelfia, Pensilvania,19104, EE. UU.

Rebecca G. Wells Y Bridget Sackey-Aboagye

4. Departamento de Bioingeniería y Centro de Ingeniería MechanoBiology,Facultad de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Universidad de Pensilvania,Filadelfia, Pensilvania, 19104, EE. UU.

Rebecca G. Wells

5. Departamento de Patología, Mount Sinai Beth Israel Medical Center, IcahnSchool of Medicine en Mount Sinai, Nueva York, Nueva York, 10003, EE.UU.

Jason Reidy, Darren Buonocore Y Neil D. Theise

6. Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad deNueva York, Nueva York, Nueva York, 10016, EE. UU.

Susan Kornacki Y Neil D. Theise

7. Departamento de Cirugía, Mount Sinai Beth Israel Medical Center, IcahnSchool of Medicine en Mount Sinai, Nueva York, Nueva York, 10003, EE.

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UU.

Michael Wayne

8. El Centro de Atención Digestiva Avanzada, Weill Cornell Medicine,Hospital Presbiteriano de Nueva York, 1305 York Avenue, 4th Floor,Nueva York, Nueva York, 10021, EE. UU.

David L. Carr-Locke

Contribuciones

PCB, DLC-L., NDT, RGW concibieron el proyecto y desarrollaron el diseño del estudio.PCB, MW obtuvo muestras intraoperatorias de árbol biliar. NDT supervisó y / o realizóanálisis histológicos y ultraestructurales de todos los tejidos. SK ayudó con la selección ypreparación de tejidos, análisis de imágenes y captura. MM realizó adquisición deimágenes histológicas y análisis de muestras gastrointestinales. PCB, HK, DB realizaronanálisis de secciones congeladas. RGW, BS-A. realizó todos los estudios de generaciónde segundo armónico. JR realizó microscopía electrónica. NDT, RGW, PCB co-escribieronel texto del manuscrito. DLC-L. editó y revisó el manuscrito. Todos los autores tuvieron laaprobación final del manuscrito enviado.

Conflicto de intereses

El Dr. Theise ha recibido patrocinio de viajes para asistir a una conferencia científicapatrocinada por Mauna Kea Technology. El Dr. Benias ha recibido patrocinio para asistir auna conferencia científica patrocinada por Mauna Kea Technology. El Dr. Carr-Locke harecibido regalías de US Endoscopy y Telemed Systems, ha sido consultor de BostonScientific Endoscopy, Cook Medical, EndoChoice, Mauna Kea Technologies y OlympusCorporation, y tiene una patente con ValenTx.

Autor correspondiente

Correspondencia con Neil D. Theise .

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