Juan Kruze25/09/2009

Esterilización

La esterilización es un proceso clave en los laboratorios de microbiología puesto que siempre tenemos que trabajar con productos estériles.

Este es un proceso destinado a destruir, el objetivo de la esterilización es destruir a todos los m.o vivos incluyendo a las formas de resistencia que como Uds. saben se denominan endosporas, y para lograr este objetivos hacemos uso de una gente físico (la desinfección se diferencia de la esterilización en que mientras aquí aplicamos un agente físico y destruimos todos los organismos, en la desinfección utilizamos un agente químico y nos concentramos principalmente en organismos que producen enfermedades, que infectan).

Para poder entender el concepto de esterilización, necesitamos entender el concepto de muerte bacteriana, recuerden que cuando hablamos de crecimiento, la bacteria crece aumentando su masa, pero fundamentalmente crece aumentado el número de las células la población, siempre trabajamos con población, y aquí también la muerte bacteriana de una población de células o individualmente es la pérdida absoluta irreversible de la capacidad de multiplicarse, de reproducirse. Y como estamos hablando de una población de células, no tenemos que centrarnos en el individuo, sino los individuos que constituyen una población, y después de eso conocer la cinética de muerte de las células que componen esta población, y esa cinética de muerte de las bacterias es exponencial, de la misma manera como el crecimiento de la bacteria en condiciones optimas es exponencial, la muerte también es exponencial, es decir decrece el número de células vivas de forma logarítmica, cuando uno aplica un agente esterilizante.

MUERTE BACTERIANA

PÉRDIDA IRREVERSIBLE DE LA CAPACIDAD DEREPRODUCIRSE DE UN MICROORGANISMO

Aquí tenemos los conceptos:La curva de crecimiento con sus 4 fases características y al final tenemos una curva que es la fase de declinación o muerte donde las bacterias empiezan a declinar, a morir. Si nosotros aplicamos en un momento dado por ejemplo aquí un agente esterilizante, nunca mueren todas las bacterias o las células instantáneamente, la muerte instantánea no existe

Esto significa que estas células van a requerir, o el método que estamos aplicando va a requerir cierto tiempo para lograr destruir a todas las bacterias , y se va a producir entonces una curva de muerte que es intermedia, entre la muerte ideal de todas las células comparada con la muerte natural, por ende una curva de muerte intermedia y el lapso k hay entre el momento que aplico el agente y el momento en que se produce la muerte total, es lo k se conoce como el tiempo requerido para destruir a todas las células de una población dada. Este tiempo requerido de esterilización varia con el tipo de agente que estemos utilizando o con el método que estemos aplicando para destruir, y eso es sumamente importante tenerlo presente, de lo contrario nuestro proceso de esterilización no va a ser eficiente.

Cuáles son los agentes físicos que se disponen para esterilizar:Son fundamentalmente 3 mas uno adicional que se los voy a comentar.

CALOR

FILTRACIÓN

RADIACIONES

ULTRASONIDO

El más importante de todos es el calor, hay diferentes formas de calor, y vamos a ver que tenemos distintas alternativas de esterilizar por calor

Si hay elementos que no podemos calentar para esterilizarlos, podemos recurrir a la filtración. Si hay cosas que no podemos esterilizar ni calentar ni poder filtrar por ejemplo una sala de clases, yo puedo recurrir a la esterilización por radiación, o por agentes químicos.

Y estas son las 3 formas básicas fundamentales o los 3 agentes. Y el complementario es la ultrasonicación, vibraciones a altas velocidades que son capaces de romper bacterias, matar bacterias, pero nosotros usamos el ultrasonicadores no con fines de esterilización, sino con fines de investigación, para romper células, extraer proteínas. Lo textos incluyen la ultrasonicación como método de esterilización, pero no tiene aplicación práctica. Igual es un agente físico.

MÉTODOS DE ESTERILIZACION POR CALOREs importante tener presente cual es la cinética de muerte bacteriana por calor. Existe una

relación inversamente proporcional entre temperatura ye l tiempo requerido para destruir por calor, es inverso, mientras ,as alta es la temperatura menor es el tiempo requerido para esterilizar, por ejemplo en este caso, voy de 90° hasta 50° , vean Uds. como se va cumpliendo el tiempo para poder reducir el número de bacterias vivas en una población determinada. Entonces la primera pregunta que me interesa es cuanto resisten las bacterias al calor, depende de la bacteria, y qué cosa fundamental de una bacteria tiene importancia para la resistencia al calor La pared igual, pero no es lo más importante; pensemos en un laboratorio, que elemento tienen las bacterias que las hacen ser más resistentes al calor, las endosporas, entonces estamos obligados a separar los organismos en esporulados y no esporulados cuando hablamos de resistencia a la temperatura. Las bacterias que no son esporulados, los que se conocen como células vegetativas no tenemos problema con la destrucción, una T° promedio de 60°C prácticamente mata a la mayoría de las esporas promedio??? Las Mycobacterium resisten hasta 70°C, que tienen esporas, pero una célula vegetativa un polio un espe?(no se escuchó), un estáfilo, salmonella, 55° ya los mata. Otra cosa es si la bacteria tiene esporas, hay bacterias esporuladas que son terriblemente resistentes.

Aquí hay una escala de temperaturas con diferentes hechos cotidianos, T° del freezer -10,- 20°, T° del refrigerador -4, -5°C, de ahí el cuerpo humano 37°C.

Recuerden Uds. que las esporas son citoplasma que se ha condensado, la bacteria cuando tiene condiciones adversas nutritivas y ambientales densa su material citoplasmático y se rodea por una carcasa por así decir una gruesa cubierta, uan membrana, de varias capas y puede permanecer durante 20 30 años mas años incluso en la naturaleza resistiendo los 2 tipos de efecto, desinfectantes, radiaciones, calor. Pero cuando las condiciones son favorables nutritivas y ambientales, las bacterias eliminan está cubierta, y la misma espora se transforma una vez más en la bacteria que la formo. Ojo que una bacteria produce una espora, y una espora cuando germina produce una bacteria, no hay multiplicación.

Y vean Uds. que ya empezamos a tener una temperatura donde la bacteria ..(tos..) aborigen? A 33° vamos a tener las bacterias mesófilas aquellas que tienen su óptima en 35 36 37 °. A los 63° las bacterias patógenas ya pueden ser destruías en 30 min, soy destruidas también por la pasteurización,

Si yo subo un poco la T yo reduzco estos 30 min a 15 seg. para destruir y esa es la T por ejemplo de de la pasteurización de la leche, 71,5°; si yo subo un poco más la T a 82°C ya las bacterias patógenas son destruidas en solo 3 seg, o sea mientras más yo subo la T más corto es el tiempo que requiero para matarla, hasta aquí estamos hablando de bacterias que no tienen esporas, estas son bacterias vegetativas.

Diferente es la cosa cuando tengo bacterias esporuladas, esa T ninguna de estas me destruye una esporulada. A 100° las esporas yo las puedo destruir con agua hirviendo en 2 hrs, eso es mucho. Entonces generalmente lo que yo hago es aumentar la T y usas métodos especiales en un autoclave, yo puedo destruir en 20 min más o menos las esporas a 120°. Ahora si yo aumento más la t 160° yo la puedo destruir en 2 hrs pero en este caso con aire caliente, el aire caliente es mucho menos efectivo que el autoclave, por eso el método k da confianza no es el aire caliente sino que el autoclave, el vapor de agua no funciona. Entonces está claro, diferente es una célula vegetativa respecto de una célula esporulada.Uno puede pensar que calor es uno solo, pero hay formas de calor

FUEGO DIRECTO CALOR HÚMEDO CALOR SECO (AIRE CALIENTE)

Calor directo que es el fuego, es la llama, algunos lo hablan que es calor seco, pero yo lo separo.

Tenemos un calor húmedo, que es cuando se asocia con el agua caliente o el vapor de agua, y el calor seco que es aire caliente.

Ahora vamos a ver para qué sirve cada uno de estos tipos de calor

FUEGO DIRECTOTenemos 2 alternativas: o incineramos algo con la desventaja de que el material se pierde porque se quema (Habla del tratamiento de residuos peligrosos y que la U tiene un proyecto de lujo.). Pero eso no nos interesa a nosotros como un método de esterilización en el laboratorio.El método de esterilización que usamos en el laboratorio es el mechero, sin mechero no se puede trabajar. El uso es básicamente para esterilizar las asas de cultivo con las cuales Uds. hacen sus siembras, para esterilizar las bocas de los tubos cuando hacen un traspaso o para las puntas de las pipetas cuando hacen también alguna manipulación. El mechero no se usa para esterilizar tubos y pipetas enteras.

Hay varios modelos, algunas tienen piloto, otras no, lo importante es que produce una llama de 2 colores, una llama color azul o otra rojo intenso en el medio, la zona de mas caloría es la zona que está en el interior de esta llama, es ahí donde Uds. deben colocar el asa o micrónFoto: mal procedimiento de esterilización del asa. El asa nunca debe ir de arriba para abajo. Hay un riesgo, de que rápidamente el mango del asa se les va a calentar. Hay unas asas que no son de muy buena calidad, hay unas de plástico y se derrite. Lo más peligroso es que se van a quemar la mano. La manera correcta de colocar esto es de abajo hacia arriba.

La esterilización de la boca de los tubos, cada vez que Uds. abren el tubo de ensayo, el tubo de ensayo queda expuesto a la contaminación de las bacterias del aire, de modo que cada vez que trabajen Uds. con un medio de cultivo liquido en un tubo siempre tienen que trabajar con la boca del tubo lo más próximo al mechero. (habla de que hay alumnos que trabajan a 15 cm del mechero, está mal!).El mechero tiene que crear un arco de fuego, un arco de esterilización en la zona donde debe estar manipulando las bacterias, sino de qué sirve el mechero prendido. Entonces, si Uds. tienen el mechero prendido, esta llama les hace un arco de esterilidad, y todas

las bacterias que puedan estar en el área y que estén cayendo se destruyen, incluso a veces, particularmente cuando trabajamos con bacterias patógenas usamos 2 mecheros, uno al lado del otro, entonces el arco de fuego es mucho más grande, el área que yo tengo de trabajo, de seguridad, es como una mini cámara de bioseguridad, entonces es útil.

La otra precaución que tienen que tener con el tubo, es que no pueden dejar el tubo en forma estática sobre el mechero porque se les va a quebrar el vidrio, el mechero lo tiene que ir rotando, cosa que la llama esterilice toda la boca.

Y la otra alternativa que tengo es para esterilizar la punta de la pipeta (foto está correcta), en este caso una pipeta Pasteur, en otros casos puede ser una pipeta volumétrica, pero cada vez que Uds. usen una pipeta la punta se tiene que esterilizar porque basta que la saquen de su condición de esterilidad, generalmente la pipeta estéril se guardan envueltas en papel, o se guarda en un cañón de acero inoxidable, donde se esterilizan 10-15-20 pipetas juntas, pero el hecho de sacarlas y pasar por el aire hasta que la usen, se va a contaminar; tengan presente que las bacterias están en el aire, en todos lados, entonces hay que esterilizar la punta, que es lo que yo voy a introducir dentro del tubo cuando voy a sacar mi muestra.La otra forma de calor es el calor húmedo.

CALOR HUMEDO EBULLICIÓN

VAPOR DE AGUA (VAPORIZADOR)

VAPOR DE AGUA A PRESIÓN

PASTEURIZACIÓN

TINDALIZACIÓN

Hay muchas formas de calor húmedo, el más simple y antiguo de todos es producido por la ebullición, agua hirviendo, pero también puedo usar el vapor de aguay además puedo usar el vapor de agua sometido a presión sobre la presión atmosférica. Esas son las 3 formas básicas de calor. Y dentro de este capítulo de calor húmedo también se usa o se describe la pasteurización y la tindalización, y ya vamos a ver que difieren un poquito de los otros en su uso.

EBULLICIÓNEs un proceso que cada vez está más en desuso, porque ha sido superado por equipos más sofisticados, pero en el pasado fue un elemento bastante popular, los esterilizadores, así se llama, un equipo de sobremesa. Que ponen Uds. un recipiente de acero inoxidable que tiene una bandejita adentro y acá van a ver que tiene 2 perillitas, como estas freidoras eléctricas que uno sube o baja el canastillo del freidor, es exactamente igual, yo agarro estas 2 perillas, en esta posición la perilla está arriba entonces yo puedo llegar y sacar las cosas, y si no, las bajo y esta rejilla llega hasta el fondo y se sumerge en el agua que Uds. tienen adentro. Entonces yo subo y bajo esta rejilla a ver si me soporta los materiales que quiero

esterilizar. ¿Qué aplicación tiene este equipo? Foto en el edificio Pugin, teníamos una pieza de toma de muestra, pequeñas biopsias de animales, entonces tenían este equipo de emergencia, para esterilizar los cuchillos, los bisturí, las pinzas.

No es un método 100% afable confiable?? Palpable?, por qué, el gran inconveniente del método es que no destruye la esporas bacterianas, ya veíamos que las esporas soportan 100°C. Sí sirve para esterilizar estas cosas, como método de emergencia, cuando yo tengo que usar un bisturí varias veces yo tengo que esterilizar, a veces no tengo material estéril disponible y usar un autoclave significa esperar un día este ciclo de esterilización, y esto es rápido (ebullición)

Tiempo y temperatura: la T° son 100°C y el tiempo mínimo requerido para esterilizar por ebullición son mínimo 10 minutos contados desde el minuto en que el agua empieza a hervir, no desde el momento en que yo pongo las cosas adentro y enchufo el esterilizador; 10 minutos y listo.

Llegamos a la forma más importante de calor que es vapor de agua, vapor de agua que puede ser natural o fluyente. Cuando uso un vapor fluyente los aparatos que se usan para ello se denominan vaporizadores obviamente, o perfectamente yo puedo usar un autoclave a llave abierta. No es un método muy efectivo, la verdad es que nosotros no lo usamos como método de esterilización, sí usamos los vaporizadores para ayudar a disolver algunos ingredientes que llevan los medios de cultivo que tienen baja solubilidad, cuando uno agita algo, un ingrediente poco soluble, una manera de favorecer o facilitar la disolución es calentarlo, entonces uno puede tener una olla, también con una especie de canastillo una rejilla, Uds. colocan los materiales y el agua hierve, hierve y hierve y uno somete a vapor y puede hacer esto, pero no es un método recomendado para esterilizar.

Sí el método cambia radicalmente si este vapor de agua yo lo someto a presión por sobre la presión atmosférica.

Veamos aquí la relación que hay entre la presión y la temperatura:

Si yo tengo a presión a nivel del mar, presión atmosférica a nivel del mar, el agua hierve a 100°C. Si Ud. sube a una montaña, el agua hierve a menor T°, hierve antes de 100°C. Ahora si yo aumento por sobre la presión atmosférica 5 Lb de presión sobre el agua agregada??, la T° es de 108°C, si yo sigo aumentando la presión a 10 Lb la T° alcanza 115°C, si aumento a 15 Lb de presión, la T° llega a

121°C. Nosotros aprovechamos entonces esta relación T° v/s presión para utilizar un método de esterilización, yo diría con baja T° pero muy eficiente.

Se marcó con verde los 2 ciclos de esterilización que se utilizan en un laboratorio de microbiología. Y le vamos a llamar convencional al segundo ciclo que consiste en obtener una presión de 15 Lb con lo cual se logra 121,6°C de T° y se esteriliza durante 20 minutos. Este método se llama convencional porque es el que debiéramos usar siempre, es el que me asegura la destrucción total de las bacterias, todas las formas de resistencia, es el método que yo ocupo para esterilizar todos los materiales que llegan contaminados, infectados del laboratorio, todo lo que se

ocupa en la zona de practico, todo lo que se recoge de los laboratorios de investigación de los profesores, todo va a una pieza una sala de esterilización, donde hay un gran autoclave, que funciona fijo con este ciclo, 121°C, 15 Lb, 20 minutos, incluso a veces 30 minutos.

Sin embargo, cuando yo preparo medios de cultivo, es otro uso que le damos al autoclave, el autoclave tiene 2 grandes usos: para esterilizar el material contaminado o para esterilizar medios de cultivo que están limpios, pero no están estériles. Cuando yo voy a preparar medios de cultivo, la mayoría de los cultivos soportan un ciclo convencional. Un agar peptona no tiene ningún problema con resistir los 121°C, pero si yo preparo un material de cultivo que tiene materiales orgánicos como hidratos de carbono, estos son bastante menos resistentes a la T°, se pueden caramelizar, la lactosa, la glucosa se caramelizan con mucha T° en mucho tiempo. Entonces existe este ciclo alternativo en que yo reduzco la presión a 10 Lb, reduzco la T° de 121°C a 115°C y reduzco el tiempo de 20 minutos a no más de 10 minutos es el tiempo de esterilización, para no destruir la naturaleza química de los compuestos que son esterilizados, y así y todo hay compuestos que no soportan la T°, no soportan ni los 110°C, entonces no me sirve, y tendré que buscar otro método como por ejemplo la filtración (cómo suero sanguíneo).

Pregunta: ¿por qué no se puede esterilizar suero fisiológico en un horno Pasteur? Suero fisiológico no tiene proteínas, no confundir con suero sanguíneo. No se puede esterilizar por calor, porque se deshidrata. Un horno Pasteur funciona a 170°C por una hora y media; un tubo con 5 mL de suero fisiológico a 170°C por hora y media le queda el tubo seco.

Entonces tenemos 2 ciclos de esterilización, uno que es el convencional el fuerte el tradicional, y otro que es excepcional para medios de cultivo.

Foto: 2 secciones del laboratorio de microbiología.

A la derecha: Sala donde funcionaba la esterilización con 2 autoclave prácticamente gigantes. En los países desarrollados los laboratorios de investigación están en el primer piso. Era 100% automatizado. Tenía una puerta en forma de gillotina, habia un carrito donde se cargaba el material y venia el carrito y se acoplaba a la puerta.

Teníamos 2 salas donde hay autoclave, una donde funciona la esterilización de material contaminado, donde se requiere aparatos de alto volumen, de alta capacidad. Después tenemos otra pieza en un laboratorio de microbiología donde funciona la preparación de los medios de cultivo que uno va a usar. Esto es lo que se llama la cocina, donde se preparan los medios de cultivo. Entonces la finalidad de estos aparatos, el uso es diferente, aquí destruyo todo lo que está contaminado, tengo que tener la certeza de que esta T° destruya todo lo que está contaminado, entonces en esta pieza utilizábamos el método convencional, incluso le dábamos 30 minutos en vez de 20. En cambio en esta (preparación medios de cultivo usábamos los 2 ciclos, convencional pero muchas veces teníamos que usar el setting de las 10 Lb a 110°C por 10 minutos. A la izquierda: eran absolutamente manuales, comprados en 1957.

Como funciona un autoclave:

Foto: este es un esquema, uno de los autoclaves de la sala de esterilización, lleva una cubierta de acero inoxidable, si le sacan la cubierta aparece el cuerpo, el corazón del aparato que es así. 3 o 4 cosas importantes del uso del autoclave: el 1° el sistema de puertas, independiente de cuál sea el autoclave, vertical u horizontal como son estos, siempre el autoclave tiene que tener una puerta que se pueda cerrar herméticamente y la manera de cerrar herméticamente la puerta además de tener una empaquetadura, que era el gran problema que esta empaquetadura se quema, es la puerta, el timón, fíjense que las manillas del aparato tienen una forma de triángulo como timón de barco para que pueda girar y cerrar herméticamente (los antiguos también). 2° después tienen un manómetro que les mide como indica la presión para que yo pueda controlar 10 o 15 Lb de presión. 3° tiene obviamente termómetro en la puerta, un barómetro incorporado en este que es automático. 4° y lo más importante es esta válvula, el exhaust del vapor (tubo de escape).

Cuando uno carga el autoclave con el material que tiene que esterilizar, representado aquí por un matraz, pongo los materiales, cierro la puerta, lo conecto a la electricidad, y el agua que tiene el autoclave, obviamente 1/3 se llena con agua, debe tener una entrada de agua, generalmente estos vienen conectados al agua potable. Entonces cuando se empieza a calentar, el agua empieza a hervir obviamente genera vapor, pero dentro del autoclave hay aire, yo tengo que sacar el aire para poder esterilizar, si yo no saco el aire, no sube la T°, entonces cuando empieza a generarse vapor, como el aire es más liviano que el vapor, el vapor empuja al aire, lo expulsa y va saliendo por este exhaust; el aire yo no lo veo, pero cuando empieza a salir vapor yo digo se acabó el aire, en ese momento entonces yo cierro esta válvula y no dejo salir el vapor, entonces sigue calentando como una olla a presión, y ahí empieza a subir la aguja en el vapor. Como estos aparatos vienen pre-setiados o yo los puedo presetiar, yo digo córtese cuando la presión llega a 10-15 Lb, y en ese momento yo empiezo a contar el tiempo de esterilización, cuando la T° llega a 121°C y la aguja del manómetro llega a 15 Lb de presión, yo empiezo a contra los 20 min o 20 min de esterilización.

Cuando hablamos de vaporizadores, yo dije se usan los autoclaves de llave abierta, si yo cuando empiezo a calentar, y está saliendo aire y está saliendo vapor, si yo no cierro esta llave, voy a generar un vapor fluyente, entonces puedo usarlo de 2 maneras.

¿Qué cosas esterilizo en un autoclave? La respuesta es muy general.

Casi todos los medios de cultivos pasan por autoclave, también puedo esterilizar agua, ropa, tierra, cualquier cosa que resista la T° del autoclave, pero el objetivo es en nuestro laboratorio MEDIOS DE CULTIVO.Ciclos del autoclave: no es instantáneo, se alcanzan los 120°C en 2 minutos, serie de cosas técnicas… (sin importancia).Hay 2 factores que son importantes que pueden afectar la eficiencia de un ciclo de esterilización. El primero ya lo comentamos: es el efecto del aire. Ahora datos de cómo el aire afecta negativamente un ciclo de esterilización. Columna 1: presiones con las cual puedo trabajar, al lado T° que logro a esa presión sin aire (saturación total de vapor) y las columnas aberrantes o erróneas, lo que no debe ocurrir, que pasa si cierro la válvula antes d eliminar todo el aire, y elimino solo 2/3, no se alcanza la T°, y con 1/3 es menor la T°.

El otro factor importante que muchas veces no se cumple por falta de experiencia, se debe tener licencia otorgada por departamento de prevención de riesgo para uso de autoclave, prohibido para estudiantes. Es gente entrenada, capacitada. A veces este error se comete por ignorancia, de qué manera el volumen que estoy usando me puede afectar negativamente el ciclo de esterilización; pensemos que la esterilización por vapor significa que el vapor tiene que penetrar lo que estoy esterilizando, ahora es muy fácil que el calor llegue rápidamente a la parte externa de un matraz, pero requiere más tiempo, si el matraz es muy grande, para que el vapor llegue al centro de este, un punto de 15 o 20 L, con 20 min en el autoclave, no se va esterilizar completamente. Entonces, la máxima es que, mientras menor es el volumen de líquido que yo esterilice, menor es el tiempo requerido para esterilizar.

Tabla: compara matraces de diferentes volúmenes, cuantos matraces de medio litro puedo yo colocar que me reemplacen a un matraz de 5 L, si uso matraces pequeños, que es lo que nosotros recomendamos, que es de 1 L máximo. A pesar que yo necesite 5 L de cultivo, a veces preparamos 10 L de medio de cultivo, coloco 10 matraces de litro, no coloco 1 matraz de 10 L. Si Uds. usan matraces de ½ litro, 1 litro, requieren 30 min, 20 min, aquí pusieron 44 de tiempo total del ciclo, cuando hablo del tiempo total hablo del tiempo de calentamiento del autoclave, pero el tiempo requerido para esterilizar son 20 minutos. Si Uds.

usan un matraz de 5-6 L se triplica el tiempo requerido, 1 hora, hora y ½, no tiene sentido, y además así y todo no asegura que el vapor penetre con absoluta seguridad al centro de ese matraz.

PASTEURIZACIÓN

SHOCK TÉRMICO PARA DESTRUIR M/O ELIMINA >95 DE LOS M/O (NO ESTERILIZA) PROLONGA LA VIDA ÚTIL DEL ALIMENTO HACE INOCUO AL ALIMENTO PARA LA SALUD

No es un proceso de esterilización, sin embargo en todos los textos se incluye dentro de este capítulo.

Que es, es un método que aplico por 1ª vez Pasteur, por eso queda su nombre, no fue el que le puso ese nombre. En el norte de Francia, un grupo de viñeteros tenía problemas con la acidificación de los vinos, recurren a Pasteur por su fama de microbiólogo, del tratamiento de los microorganismos, del concepto de la fermentación, etc. y Pasteur resuelve el problema, toma un par de muestras del los moscos que estaban agridos y los otros que estaban sanos, los mira en un microscopio rudimentario que tenia, y se da cuenta que los moscos que estaban agridos tenían algo que los moscos sanos no tenían y el dijo bueno veámoslo calentando él sabía ya la destrucción de microorganismos por calor, la teoría de generación espontanea, estaba calentito el experimento de Tindall cuando incuba las esporas, en fin, entonces calienta estos moscos y destruye las levaduras. Después cuando aparece la tuberculosis, que ha matado a más personas que la guerra, y una de las maneras de contagiarse con el Mycobacterium de la tuberculosis es con leche contaminada, de vacas que tienen tuberculosis; no sé si Uds. saben que la tuberculosis es un problema de salud pública mundial, 1/3 de la población del mundo tiene tuberculosis, la actual.

Una de las recomendaciones que hizo la ONU para reducir la enfermedad de tuberculosis, la leche era la principal fuente de contaminación con tuberculosis en humanos, porque la tuberculosis bovina también es un problema de salud pública persistente. Y la ONU dice que una manera de proteger a la población es haciendo algo con la leche que destruya al agente de la tuberculosis, y ahí es donde dice bueno, hagamos lo que hizo Pasteur, calentemos la leche, y de ahí surge el nombre de pasteurización, que originalmente fue pensada en destruir a los agentes zoonóticos (zoonosis: enfermedades que se transmiten de los animales a los humanos o viceversa). Habían 3 grandes zoonosis a comienzos del siglo XIX, que eran la tuberculosis, la brucelosis y la fiebre..(no entendí), entonces una manera de cortar la transmisión de para estas zoonosis era pasteurizando la leche, entonces se busco la T° que fuera capaz de destruir a estas bacterias patógenas, pero que no alterara las propiedades de la leche. Y así, entonces nace la pasteurización de los alimentos, hoy día se pasteuriza el vino, se pasteuriza la cerveza, los jugos, por nombrar entre los más conocidos. Entonces en qué consiste la pasteurización, la pasteurización es un shock térmico con la finalidad de destruir algunos m.o, por eso no es un proceso de esterilización, no deja un producto estéril. Elimina aproximadamente el 97-98% de las bacterias presentes en la leche, pero no la esteriliza. En el supermercado se compra la leche pasteurizada convencional, pero sí existe hoy día leche pasteurizada que es estéril. La leche pasteurizada convencional es aquella que se vende en bolsitas de plástico y que está generalmente en anaqueles refrigerados, porque se tiene que mantener refrigerado. Cuál es la finalidad de la pasteurización entonces si no esteriliza, son 2 objetivos:

- Hacer inocuo el alimento para el consumo humano, es decir, asegurarme que esa leche que viene de un animal, no esté contaminada con tuberculosis, brucelosis o de otra enfermedad bacteriana, la pasteurización destruye esa bacteria.- Al destruir las bacterias patógenas también destruye otras bacterias, que no son problemas para la salud, pero si son problema para el producto, entonces aparte de hacer inocuo para el consumo humano, aumenta la vida útil del producto. Una leche bien pasteurizada debiera durar 6 semanas, sin problemas.

Hay varios tipos de pasteurización: PASTEURIZACIÓN BAJA (LTLT = 60°c x 30 m) PASTEURIZACIÓN ALTA (HTST = 71.5°C x 15 s) PASTEURIZACIÓN UHT (140°C x 3 s) (ESTÉRIL)

LTLT (Low temperature & long time)Al correr de los años se demostró que calendar la leche por 30 minutos a 60°C producía un fuerte deterioro de la condición organoléptica de la leche, pero como ya sabemos a menor tiempo mayor T°.

STHT (High temperature, short time)De ahí surge la actual, que está vigente en la mayoría de los países del mundo HTST, y esa T° al menos en Chile es de 71,5°C. La norma Chilena del ministerio de economía dice que la T° oficial es de 71,5°C por 15 a 20 segundos.

UHT (Ultra High Temperature)La revolución de la Pasteurización UHT, que a diferencia de los 2 anteriores sí es un proceso estéril, este me elimina todas las bacterias. Pero vean que un golpe térmico soportan? 12 volt, 13 volt 130°C, también la T° y el tiempo depende de la industria, de la fábrica, en los tetrapack por ley debe decir a que T° se esteriliza. Esta leche dura 6 meses. (La que debiera durar 6 semanas es la HTST refrigerada, si la abren y no se refrigera se corta, ahora está durando 3 meses.)Una leche optima no debiera tener más de 1000 UFC/mL.

A la izq. Pasteurizador de placas tradicional sistema HTST. Por un lado se calienta el agua. Por contacto se calienta la leche por 15 segundos. Si por alguna razón fracasa el proceso eso es detectado por un proceso enzimático, una enzima que cambia de color, llega a cierta T° y si ese cambio no se produce al término existe aquí un bypass y la leche

vuelve a pasar y se vuelve a pasteurizar.

A la derecha un pasteurizador UHT (Parmalat, Brasil).

TINDALIZACIÓNEfecto Tindall: cuando uno deja pasar un rayo de luz en una pieza oscura y se ven millones

de partículas suspendidas en el aire. Le sirvió a Tindall para descubrir este proceso de esterilización.

Tindall un día se encuentra con la sorpresa que pro más que calentaba un caldo de cultivo contaminado con bacterias, las bacterias no morían. Y para eso usó su efecto, en una caja oscura hizo pasar un rayo coloca los tubos aquí en medio de cultivos estériles, deja tubos abiertos para demostrar que las partículas que estaban aquí en el aire era donde estaban las bacterias presentes y que de esta manera uno podía ver que había algo suspendido en el aire que era lo que caía dentro de los tubos, y por eso se producía la “generación espontanea”, pero no era eso, sino que el medio estaba contaminado con bacterias. Como el calor no le funciono, pensó que era por las esporas. Entonces él propone calentar estos medios de cultivos por 3 días consecutivos, por 30 minutos a 100°C, esto se define como la pasteurización fraccionada, cuyo objetivo es eliminar las esporas, NO matarlas, este método no mata las esporas, elimina esporas. A los 100°C el primer día yo mato todas las células vegetativas, con ellas no hay problema se mueren con 60°C sin ningún problema, pero van a resistir las esporas, y como las esporas son resistentes a condiciones adversas, entre un día y otro, voy a incubar, para darle la T°, las condiciones optimas, y esa espora va a germinar, y al día siguiente van a ser bacterias vegetativas, entonces vuelvo a calentar al 2do día por 30 minutos, a 60, a 100°C y voy a matar todas las células vegetativas, y si alguna espora me quedara sin germinar le doy un 3er día. O sea, al 3er día, yo no me matado ninguna espora, he matado las células vegetativas pero no hay ninguna espora.

AIRE CALIENTEEl aire caliente tiene la desventaja que es menos caliente que el aire húmedo, por lo tanto, necesitamos mucho mas T° y mucho más tiempo. Vean Uds. la relación que hay entre tiempo de esterilización y la T° del aire caliente: a medida que yo subo la T° yo puedo reducir, pero aun así hablamos de 170°C comparado con 120°C del autoclave, o sea, es casi el doble del tiempo y la T° que necesito yo, con aire caliente. El aparato para utilizar, comercialmente se conoce como Horno Pasteur, 170°C durante 90 minutos (en su laboratorio).

Es un horno, una caja, el equivalente a un horno, una cocina eléctrica o a gas. Es una caja metálica o de madera que tiene una doble pared aislante para mantener la T°, tiene un termostato..(ruido).

El horno Pasteur con aire caliente se utiliza para esterilizar material limpio, pero no estéril. Todo el material que Uds. ven ahí, placas, matraces, pipetas, todo lo que sale de la sala de esterilización, pasa a una sección de lavado, y volver a esterilizarlo para ser reutilizado, en ese momento se utiliza el horno, para esterilizar le material limpio pero no estéril, las pipetas, las

placas, jeringas. Estos deben estar también protegidos de contaminación, guardados. Las placas Petri en paquetes de papel (con no más de 3-4), deben ser paquetes chicos porque si son muy grandes el aire puede no va a penetrar al corazón del paquete. Entonces ojala hacer paquetes

pequeños y dejar espacios vacíos para que circule el aire. Matraces o vasos de precipitado están cubiertos por papel y tienen una pita que sujeta el papel, los tubos también, todo está protegido de la contaminación ambiental, y esos protectores se sacan cuando se va a utilizar el material, no antes. Medios de cultivo por 170°C 1 ½ hora se evaporaría (medios de cultivo entonces en el autoclave).

FILTRACIÓNTenemos medios de cultivo que no se pueden esterilizar en autoclave porque no soportan la T°, como el suero sanguíneo, algunos antibióticos, algunas soluciones H. de C.ES EL PASO DE SUSTANCIAS LÍQUIDAS A TRAVES DE MATERIALES POROSOS (membranas porosas).

Es importante que conozcan el tamaño de las bacterias con respecto a otros organismos inferiores, bacterias promedio 1 micra, virus más pequeños, protozoos más grandes.

Nuestro problema está aquí en esta banda amarilla: rango de resolución del microscopio óptico que Uds. usan en práctico, su poder de resolución es la dimensión más pequeña que el organismo puede resolver y eso está alrededor de 0,1 µ, por debajo de eso necesitamos microscopio electrónico.

Entonces, si hablamos de filtro tenemos que pensar en filtros que sea capaz de retener estos organismos o los virus. Entonces, en esta curva de Gauss vamos a ver que la mayoría de las bacterias tienen alrededor de 0,5 µ, algunas pueden medir de 7, 10, 15 µ, y de las bacterias más pequeñas son más pequeñas que los virus más grandes, el virus más grande que se conoce es el virus POX, el virus de la viruela que mide 0,5 µ.

Eso significa que voy a tener diferentes tipos de filtros, voy a tener un pre filtro, que puede ser a lo mejor un papel filtro, que me separe las partículas mas groseras y no me sature los otros filtros que a mí me interesan que son los bacteriológicos. Ruido..virus.Historia

Habían muchos filtros hecho a base de asbesto, porcelana, o de vidrio fricado, o de tierra porosa, en fin. Según el material se llamaban bujías, los de tierra porosa, que uno hace pasar un líquido pro estas cosas. Dependiendo de los materiales tenían distintos nombres, Chamberland, Berkerfield. Eso es historia, ya no se usan, eran complicados de limpiar, se saturaba con facilidad, no permitían filtrar pequeñas cantidades, etc.

De repente a alguien se le ocurrió hacer estos ULTRA Filtros, que son membranas de esteres de celulosa, son sumamente delicados, muy frágiles, pero la ventaja es que son desechables y baratos, y vienen en tubitos de 100 unidades, o de 10, hay de todas las capacidades, hay pre filtros, bacteriológicos, virológicos, de todos los tañamos, el más chico tiene el tamaño de una moneda de 50 pesos, y el más grande puede medir 30-40 cm si yo quiero filtrar grandes volúmenes de liquido. Se usan y se botan. Son frágiles porque son tan delgaditos como una tela de cebolla. Estos se colocan en un soporte cosa que al pasar el liquido la presión del líquido no me rompa el filtro, entonces el filtro queda apoyado sobre un soporte, y hay un sistema de acople (ensamble) donde uno coloca el filtro, después se coloca o a un tubo de ensayo o a un matraz, y recojo, no se pierde nada. La precaución es cambiar el filtro cada cierto tiempo, no se puede usar infinitamente, uno tiene más o menos calculado cuanto puedo pasar a través de una jeringa, lo otro, no hacer mucha presión porque puede romper el filtro, dejar caer por gravedad.

Hay algunas jeringas que vienen con el filtro adentro, pero es más barato comprar una caja y montar esto. Usamos una jeringa, colocamos el líquido, abajo el tubo de ensayo y recogemos.

ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONESCuando hay cosas que no podemos calentar o filtrar, es la alternativa que queda.Diferentes tipos de radiaciones electromagnéticas que existen:

RADIACIONES UV RAYOS INFRAROJOS RAYOS X RAYOS GAMMA ELECTRONES

Derecha: onda largaIzquierda: onda corta

Mientras más corta la longitud de onda mas germicida es esta radiación. De aquí entonces que los rayos X, γ, iónicos, son terriblemente perjudiciales y peligrosos, no se pueden utilizar como agentes esterilizantes. Nosotros usamos generalmente las ondas UV, son bastante germicidas, no son tan peligrosas. Están en una longitud de onda de 100 a 200 nm, los colores aquí son las radiaciones luminosas que nosotros somos capaces de ver, los colores del arcoíris, y el extremo derecho las radiaciones infrarrojas (aparatos: microondas)Las radiaciones UV son las más usadas con fines de esterilización, y también se está masificando el microondas, rayos X y gamma no se utilizan por ser muy peligrosos.

RADIACIONES UVVienen de los rayos solares, sin bastante germicidas y mas allá de eso tienen u poder

mutagénico, es un agente mutagénico utilizado en esterilización para mutar genes de bacterias. Pero otra característica es que son cancerígenos. Una exposición prolongada la piel de este agente produce una mutación y puede producir cáncer. Uso práctico de las radiaciones desde el punto de vista de la esterilización

Foto: sala de rayos UV que se utilizaba cuando uno tenía que trabajar con bacterias peligrosas o hacer traspasos de cultivo, uan sala muy pequeña de 2 metros cuadrados, provista de un tubo de rayos UV arriba, y la manera de usarlo era dejarlo prendido toda la noche y cuando uno llegaba en la mañana la sala esta estéril. La otra alternativa son estos gabinetes o cámaras de bioseguridad, con la misma finalidad, pero ya para trabajar dentro de un ambiente, y no necesita más espacio, simplemente está provista de un rayo UV en el interior, tiene una abertura acá abajo, con en las incubadoras del hospital, esta es una aleta de goma móvil, puedo pasar las 2 manos y trabajar sin estar expuesto directamente a los rayos UV. Pero lo que es más sofisticado que usamos hoy son las cámaras de flujo laminar, es una cámara de flujo laminar, este es un gabinete de bioseguridad, cuyo otro nombre es cámara de flujo laminar, porque tiene un doble sistema de seguridad, un sistema de flujo laminar de aire forzado, que entra aire y abajo tienen unos filtros donde el aire circula por convección en este sentido y no me deja entra partículas desde la sala hacia el interior ni viceversa, tiene doble mecanismo de protección, protege al operador, medio ambiente y a lo que estoy trabajando, por ejemplo trabajo con virus y bacterias. Es imprescindible para investigación bacteriana.

Lo otro que tiene atrás es una lámpara de rayos UV, cosa que si alguna cosa pudiera entrar, estos rayos UV irradian inmediatamente.

Como mata la luz UV, por qué es germicida. Rayo UV va dirigido directamente sobre el DNA de las bacterias, específicamente actúa sobre las timinas, cuando en una secuencia de

polinucleótidos de DNA, existen 2 timinas, una al lado de la otra, los rayos UV actúan sobre esas timinas y producen y un dímero de timinas, que se conoce como dimerización e las timinas, esto significa que estas 2 bases nitrogenadas se juntan, por lo tanto, se acorta la distancia natural entre ellas 2 y se forma un enlace, y como esta molécula de DNA se replica, se pierde la secuencia y la réplica no es idéntica a la secuencia original, mutación (cambio en el DNA) que puede ser viable o letal dependiendo de cuanto sea el daño producido. En consecuencia, la luz UV la puedo utilizar como agente esterilizante, dependiendo del tiempo de acción, de la distancia que hay entre 2 tubos??, o como agente mutagénico. Por ejemplo si yo lo usara como agente mutagénico, yo irradio el cultivo por 10 segundos, si lo ocupo como agente esterilizante lo puedo usar por ½ hora, entonces depende de cuánto tiempo va a actuar, depende del efecto letal o viable.

FACTORES IMPORTANTES Algunos factores que tiene que tener en cuenta cuando uno esteriliza con UV:• Longitud de onda (< longitud de onda > poder o efecto germicida)• Tipo de germen (esporulados y fluorescentes más resistentes)• Medio ambiente (medio opaco o turbio no deja pasar rayos UV; materia orgánica protege a las bacterias; vidrio y plástico no deja pasar rayos UV• Tiempo de exposición

Ahora dentro de la radiación UV también hay radiaciones de onda corta y de onda larga. Se ha visto el uso de una lámpara de luz UV en los hospitales (quirófano), en la carnicería, en los bancos, para ver si los billetes son falsos.

En esa lámpara, la que nosotros usamos en nuestro laboratorio para diagnostico, se usan onda s larga, porque el objetivo no es matar bacterias, se usa para ver si un billete es falso o no.En el caso de las rotiserías, carnicerías, se usan de onda corta, porque su objetivo es destruir gérmenes.

Dependiendo del uso hay lámparas que tienen un switch, y dicen onda corta y onda larga, entonces uno escoge.

El tipo de germen es otro factor importante a considerar, que los gérmenes varían en su resistencia a la acción de los rayos UV. Hay ciertas estructuras celulares, por ejemplo la producción de pigmentos hace que las bacterias sean más resistentes a la radiación; la presencia de esporas o de cápsulas hace que la bacteria sea más resistente.

El medio ambiente: es sumamente importante en qué condiciones uno irradia en el laboratorio. En el medio ambiente natural por ejemplo toda la materia orgánica, la grasa, todos los bitritus? Protegen a las bacterias sobre los rayos UV, a pesar de las fuertes radiaciones solares que tenemos por el ozono.

En el laboratorio tenemos que tener cuidado con los medios de cultivo. Los rayos UV no traspasan el vidrio, no traspasan el plástico.

Entre más turbio, más denso sea el cultivo bacteriano, mayor es la absorbancia de los rayos UV y menor el efecto sobre las bacterias que está adentro, por lo tanto, si yo quiero irradiar por ejemplo, a una bacteria para producir una mutación, tenemos que tener la precaución de irradiar directamente sobre la suspensión bacteriana y no a través de la tapa placa Petri o a través de un tubo de vidrio, porque no va a pasar.

El tiempo de exposición: dependiendo del tiempo de exposición es el efecto viable o letal que yo puedo tener, mientras más tiempo, más letal.

RAYOS INFRARROJOLos microondasNo está diseñado para esterilizar, no es su objetivo, es descongelamiento o calentamiento de alimentos, pero se uso por razones económicas. A diferencia de los rayos UV (penetran), los rayos IR no penetran, por eso tiene que estar en permanente rotación la sustancia que estoy irradiando para tener efecto. Es efectivo para material de plástico que no se puede esterilizar de otra manera, siempre que se respeten algunas condiciones. Máximo de 8 tubos por 10 minutos y colocando un vaso de pp con agua adentro, porque los rayos IR funcionan con la humedad. Produce calor, y lo que esteriliza es el calor, con la ventaja que no derrite como el autoclave.

ULTRASONIFICACIÓNEl ultrasonido no es un método de esterilización, aunque produce esterilización de células, se usa con otros fines, para extraer bacterias, para extraer productos de bacterias. Y la razón por la cual no sirve para esterilizar es porque para que la sonicación sea factible, tienen que estar las bacterias en una suspensión en medio liquido, en consecuencia no puedo esterilizar una pared, un piso, algo que sea metálico, porque le mecanismo de acción es esta alta frecuencia sonora, se hace con un vástago un sonicador y vibra, y si lo podemos sentir. Puede ser peligroso, produce burbujas y estas burbujas producen un shock violentísimo para las bacterias y estas bacterias finalmente se rompen por este shock de las ondas sonoras.

Natalia Uribe B.Química y Farmacia