1

ESTUDIO DE LOS FACTORES QUE IMPIDEN EL ESTABLECIMIENTO DEL PLÁSMIDO pRAS1 EN ALGUNAS CEPAS DE Aeromonas hydrophila

INTRODUCCION pRAS1 es un plásmido de 44 Kb que posee una región de resistencias que consiste en un integrón (clase 1) con el cassette de una dihidrofolato-reductasa dhfrA16 que confiere resistencia a trimetropim, sulI

codificante para una dihidropteroíco-sintasa que proveee resistencia a sulfonamidas y un Tn1721 truncado con el gen de resistencia a tetraciclina

tetA. pRAS1 fue hallado en A. salmonicida subs. salmonicida (As) v irulenta en salmones (Sorum y cols., 2003). En los proyectos: Transferencia de

plásmidos R entre As y otras especies de Aeromonas aisladas de alimentos (V ázquez, 2005) y Transferencia in vivo de pRAS1 entre As y A. hydrophila

(Ah) aisladas de pescado congelado y cuadros diarreicos (Bello, 2007), se observaron frecuencias de conjugación de 10-2 a 10-6. S in embargo en

estos ensayos se encontraron cepas incapaces de recibirlo. Aunque se ha descrito que el rango de hospedero está determinado por las

características del plásmido, se ha mencionado que el fondo genético del huésped puede influenciar el mecanismo de conjugación (De Gerlder y cols., 2005). F actores como: estabilidad, integración, restricción,

incompatibilidad y reconocimiento del ori contribuyen al establecimiento de plásmidos.

JUSTIFICACIÓN Aunque la transferencia de plásmidos esta determinado por los genes codificados en estas estructuras, estudios sugieren que el

fondo genético del huésped puede influenciar transferencia y permanencia del material genético; este tipo de información es nula cuando se habla del

género Aeromonas, por lo que este trabajo explorará los mecanismos que impiden el establecimiento de pRAS1 en Ah y ahondar en la relación

donador-receptor-plásmido entre As y Ah. HIPÓTESIS Algunas cepas de Ah carecen de sistemas que permiten el

establecimiento de pRAS1. OBJETIVO GENERAL Estudiar por que pRAS1 no puede establecerse en Ah.

OBJETIVOS PARTICULARES Establecer si la deficiencia conjugativa de Ah esta en función

de su reconocimiento con As 718. Determinar si pRAS1 puede establecerse por electroporación

en Ah. Establecer si existe incompatibilidad U en A h.

Determinar si el establecimiento de pRAS1 en A h es impedido por sistemas de restricción.

Determinar la estabilidad de pRAS1 en Ah al introducir un oriV. Determinar si existe complementación del defecto conjugacional en Ah.

Establecer la existencia de elementos desestabilizadores de pRAS1 en Ah.

METODOLOGÍA

RECONOCIMIENTO DEL DONADOR Conjugaciones con diferentes donadores (As 896Tn5lux, Ah 839Tn5lux y E.

coli J53-1) a Ah 65. ESTABILIDAD

E lectroporación de pRAS1 en Ah 65 y E. coli INVF e inducción de estrés en Ah 65 antes del cruce con As 718.

INCOMPATIBILIDAD Determinar la presencia de IncU por PCR contra repB y conjugación entre Ah 65 y pAr-32.

SISTEMAS DE RESTRICCIÓN Infección de Ah 65, 839, 5881 y 5794 con fago Aeh1.

RECONOCIMIENTO DE OTRO ORIGEN DE REPLICACIÓN: Transposición in vitro con EZ-Tn5™ <oriV / KAN -2>

Electroporación de pRAS1oriV /KAN-2 en E. coli INVF E lectroporar y conjugar con E. coli INVF (pRAS1 oriV/KAN-2) a Ah 65. Determinación de la estabilidad de pRAS1 oriV /KAN-2 por cultivos seriales.

COMPLEMENTACIÓN DEL DEFECTO CONJUGACIONAL

Construcción de biblioteca genómica de A h 839 y mutante de A h 65 recA -

por mutación-inserción-duplicación, ensayo de complementación,

secuenciación y análisis bioinformático de biblioteca que confiera la capacidad conjugativa para así establecer su identidad.

RESULTADOS RECONOCIMIENTO DEL DONADOR. Si el establecimiento de pRAS1 está en función del NO reconocimiento del donador original, generando

diferentes donadores, existe la posibilidad que el receptor (Ah 65) pueda reconocer al donador y así este pueda establecerse. Por lo anterior se

montaron diferentes matrices de conjugación (incluidas las mutantes generadas) para así recuperar transconjugantes que serv irían como

donadores de pRAS1. pRAS1 es incapaz de transferirse a Ah 65 aun siendo desde los donadores, aun cuando se utilizó la mezcla de conjugación

completa para la selección de transconjugantes. INCOMPATIBILIDAD Preparaciones plasmídicas y DNA genómico de Ah

65, Ah 839, A s 718 (pRAS1) y E. coli W3102 (pA r-32), fueron sometidas a PCR con iniciadores específicos para un fragmento de 598 pb´s que

corresponde a RepB, replicón del grupo IncU. pRAS1 y pAr-32, siendo ambos de este grupo, se logró amplificar un fragmento de 598 pb. Por el contrario en Ah 839 y Ah 65 no se logró amplificar dicho fragmento, por lo

que se descarta la posibilidad de la existencia de replicones IncU en Ah. Para confirmar la ausencia de IncU en Ah, se sometieron a conjugación con

pA r-32, obteniéndose frecuencias de 4.48 X 10-6 y 6.65 X 10-7 utilizando a Ah 65 y Ah 839 como receptoras. Lo anterior confirma la capacidad conjugativa de Ah 65 para plásmidos IncU.

ESTABILIDAD Suponiendo que la transferencia vía conjugación no es suficiente para la incorporación y establecimiento de pRAS1 en Ah 65, este

fue electroporado a A h 839, A h 65, y E. coli J53-1. Con el objetivo de forzar por otros medios la introducción del mismo, incluyendo a pAr-32

como control. Los resultados de los ensayos de electroporación de pRAS1 y pA r-32 en diferentes Aeromonas (receptora y NO receptora) y E. coli,

muestran que en ambos casos pueden ser incorporados y mantenerse en ambos (A eromonas y Escherichia) a excepción de Ah 65. Trabajos previos

indican que sometiendo a estrés con etanol y SDS antes del cruce con la donadora, la fertilidad en las receptoras se ve incrementada hasta en 5 log.

Con este antecedente se montaron ensayos de estrés con etanol y SDS en Ah 65 para determinar si el estrés en Ah 65 pudiera hacerla receptiva al cruce con A s 718. La fertilidad en Ah 839 (control) se v e incrementada

hasta en dos log cuando es sometida a estrés antes del cruce con As 718. Por el contrario para A h 65 ningún tipo de estrés logra inducir la

conjugación con As 718. SISTEMAS DE RESTRICCIÓN Trabajos prev ios indican que intentos por

introducir DNA plasmídico por electroporación en Ah han fracasado, esto por la presencia de sistemas de restricción. Por lo que claramente, estos

sistemas podrían representar una barrera para la transferencia de pRSA1 en A h 65. Para abordar este problema, se llevó a cabo una prueba común

para la búsqueda de sistemas de restricción. Este fue mediante la infección con de fagos específicos para A h denominados A eh1. A partir de un titulo

conocido (1 X 1010 partículas/mL), se llevaron a cabo infecciones en diferentes cepas de Ah, tanto conjugativas como no conjugativas de pRAS1. Los resultados los ensayos de infección muestran que no hay una

diferencia importante entre el titulo inicial del fago con el numero de UFP/mL encontrados por cepa.

RECONOCIMIENTO DE OTRO ori La inestabilidad de pRAS1 puede estar asociada a que no hay reconocimiento de los iterones en el origen de

replicación lo que impide su permanencia en el huésped. Es por esto que se que posiblemente al introducir un nuevo origen del replicación

(promiscuo), este fuera reconocido y así pRAS1 pudiera replicarse de forma estable Ah 65. La mezcla de transposición fue electroporada a E. coli

INVF , para así amplificar el plásmido pRAS1/oriVKAN2 y utilizarlo para electroporar a Ah 65 o para utilizar a E. coli INVF como donadora de pRAS1/oriVKAN2 en conjugación con Ah 65. Para verificar si la inserción

del oriVKAN2 en pRAS1 permitía que este se estableciera en Ah 65, se montaron matrices de conjugación entre la donadora que se generó por

electroporación (E. coli INVF´ (pRAS1/oriV ) con Ah 65 y Ah 839 como control positivo de conjugación. Se lograron recuperar

transconjugantes en ambos casos tanto para la no receptora Ah 65 y Ah 839 con frecuencias de 6.65 X 10-7 y 4.48 X 10 -3

respectivamente. COMPLEMENTACIÓN DEL DEFECTO CONJUGACIONAL Hasta el

momento se ha determinado las condiciones de macrorestricción del DNA para la construcción de la biblioteca, se ha purificado el fragmento de

interés del vector de clonación pRANGER BTB3CAT con - agarasa y se esta caracterizando la mutante de Ah 65 RecA-. ACTIVIDADES PENDIENTES

Caracterizar pRAS1oriVKAN2 e implementar un metodología para determinar la conjugabilidad de pRAS1oriVKAN2 cuando se utiliza E.

coli INVF . Establecer por cultivos seriales la segregación de

pRAS1oriVKAN2 en Ah 65. Caracterización fenotípica de A h 65 recA -.

Construcción de biblioteca de Ah 839. Ensayos de complementación entre As 718 y Ah 65 recA -.

En función de los resultados de las pruebas de complementación, realizar la búsqueda del (los) genes que restablecen la

conjugabilidad en Ah 65 y así establecer su identidad. CONCLUSIONES PRELIMINARES

La deficiencia conjugativa de Ah 65 no esta en función del reconocimiento especifico con As 718.

pRAS1 no puede establecerse por electroporación en Ah 65. No existe incompatibilidad tipo U en Ah 65.

No existen sistemas de restricción en A h 65. pRAS1/oriVkan2 se logra transferir por conjugación a Ah 65.

BIBLIOGRAFIA Bello, L. J. M. 2007. Transferencia in vivo del plásmido pRAS1 entre A. salmonicida y cepas de A. hydrophila aisladas de pescado congelado y cuadros diarreicos. Tesis Maestría. Instituto Politécnico Nacional, ENCB. México. De Gelder, L., F.P.J. Vandecasteele, C.J. Brown, L.J. Forney, E.M. Top. 2005. Plasmid Donor Affects Host Range of Promiscuous IncP-1Plasmid pB10 in an Activated-Sludge Microbial Community. Appl. Environ. Microbiol. 71:5309-17. Sorum, H., T.M. Lábèe-Lund, Solberg, A. Solberg, A. Wold. 2003. Integron-Containing IncU R Plasmid and pAr-32 from the fish Pathogen Aeromonas salmonicida. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 1285-1290. Vázquez, N. J. 2005. Transferencia de plásmidos R conjugativos entre A. salmonicida y otras especies

2

Estudio de los factores que impiden el establecimiento del plásmido pRAS1

en algunas cepas de Aeromonas hydrophila ANTECEDENTES

El plásmido pRAS1 es una estructura genética de 44 Kb, que confiere res istencia a

tetraciclina, trimetoprim y sulfonamidas, fue identificado en 1989 de una cepa atípica de A. salmonicida subsp. salmonicida (patógeno de peces), la cual es sensible a ampicilina, este plásmido presenta una región de resistencias de 12 Kb que consiste en un integrón clase 1 insertado con el cassette de una dihidrofolato-reductasa dhfrA16, así como un gen sulI que codifica una dihidropteroíco sintasa y un transposón truncado Tn1721 en el gen de la transposasa con el gen tetA (Sorum y cols., 2003).

pRAS1 se transfiere por conjugación a Escherichia coli con una frecuencia de 6.5 X 10-3 y

se reporta como un plásmido de amplio rango de hospedero, ya que es transferido con éxito a Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus y Yersinia ruckeri (Sorum y cols., 2003; Schmidt y cols., 2001b), mientras que Adams y cols. (1998) reportan que plásmidos como pRAS1, pASOT (47 kb), pASOT2 (47 kb), pASOT3 (39kb), todos correspondientes al grupo de incompatibilidad U, pueden transferirse por conjugación a E. coli con frecuencias que varían de 10 -4 a 10-8 y que el número de transconjugantes se incrementa cuando la receptora es A. salmonicida.

En los proyectos de investigación: “Transferencia de plásmidos R conjugativos entre A.

salmonicida y otras especies de Aeromonas aisladas de alimentos” (Vázquez, 2005) y ”Transferencia in v ivo del plásmido pRAS1 entre A. salmonicida y cepas de A. hydrophila aisladas de pescado congelado y cuadros dia rreicos” (Bello, 2007), se observó que en los ensayos de conjugación empleando como receptoras del plásmido pRAS1 a cepas de A. hydrophila adquirieron el plásmido, con frecuencias de conjugación varían en magnitud de 10 -2 a 10-6.

Con lo anterior, cepas pertenecientes a la misma especie no logran recibir el plásmido

pRAS1 y aunque generalmente se ha descrito que el rango de hospedero se determina por las características del plásmido y por los genes codificados en estas estructuras, existen estudios que indican diversos mecanismos del hospedero o su fondo genético pueden influenciar de manera importante el proceso de conjugación o la permanencia de material extracromosomal en este tipo de células (De Gerlder y cols., 2005), estas características se describen a continuación y aunque no están en función de l género Aeromonas, es posible que puedan explicar los resultados que se han obtenido previamente, o bien puedan proporcionar los modelos para contestar la siguiente pregunta: ¿Qué mecanismos intervienen en el establecimiento de plásmidos en cepas bacterianas específicas?.

3

JUSTIFICA CIÓN

Aunque el proceso de transferencia horizontal de plásmidos parece estar determinado fundamentalmente por los genes codificados en estas estructuras, existen algunos estudios que sugieren que el fondo genético del hospedero puede influenciar y regular la transferencia o permanencia del material genético extracromosomal; este tipo de información es nula cuando se habla del género Aeromonas, por lo que este trabajo explorará los mecanismos que impiden el establecimiento de pRAS1 en A. hydrophila 65 y en general ahondará mas en la relación donador-receptor-plásmido, específicamente entre A. salmonicida 718 y A. hydrophila 65. HIPÓTESIS

Algunas cepas de A. hydrophila carecen de sistemas o elementos que permiten el establecimiento del plásmido pRAS1 o cuentan con elementos que lo impiden. OBJETIVO GENERAL

Determinar las causas por las que el plásmido pRAS1 no puede establecerse en algunas cepas de A. hydrophila.

OBJETIVOS PARTICULARES

Establecer si la deficiencia de A. hydrophila 65 para actuar como receptora del

plásmido pRAS1 esta en función de su reconocimiento especifico con A. salmonicida 718.

Determinar si pRAS1 puede establecerse por electroporación en A. hydrophila 65. Establecer si existe incompatibilidad tipo U entre un elemento cromosomal de A.

hydrophila 65.y el plásmido pRAS1 Determinar si el establecimiento de pRAS1 en A. hydrophila 65 es impedido por

sistemas de restricción. Determinar la estabilidad de pRAS1 en A. hydrophila 65 al introducirle un origen

de replicación promiscuo. Determinar si existe complementación del defecto conjugacional en A. hydrophila

65 con la biblioteca genómica de una receptora de pRAS1 (A. hydrophila 839). Establecer la posible existencia de elementos genéticos desestabilizadores de

pRAS1 en A. hydrophila.

4

MATERIALES Y METODOS

RECONOCIMIENTO DEL DONA DOR

Antes de montar las matrizes de conjugación se llevará a cabo una mutagenesis por transposición con el

pUTminiTn5lux CDABEKm2 en A. salmonicida 896 y A. hydrophila 839.

INTRODUCCIÓN DE GEN REPORTERO Y SELECTOR POR MUTA GÉNESIS CON EL TRA NSPOSÓN

miniTn5LuxCDABE EN A. hydrophila POR CONJUGA CIÓN CON E. coli S17-1 pir.

AMPLIFICA CIÓN DE luxE-nptII MEDIA NTE PCR

Para la amplificación mediante PCR de gen luxE-nptII se sometieron a la amplificación

aproximadamente 200-300 ng del DNA genómico, en un volumen final de 50 μL. La mezcla de reacción contenía: Tris-HCl 20 mM (pH8.4), KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM,, desoxirribonucleósidos trifosfato dNTP´s (dATP, dCTP, dGTP y dTTP ) 0.3 mM de cada uno, iniciadores Fwd y Rev 10 µM de cada uno y 1 U de Taq polimerasa. Las condiciones para cada ciclo de reacción programada fueron: Desnaturalización inicial a 94°C durante 3 min y 35 ciclos en las siguientes condiciones: 94°C durante 1 min (Desnaturalización), 52°C durante 1 min (Alineamiento), 74°C durante 1.30 min (Extensión). Al finalizar se efectuó una última extensión a 74°C durante 10 min Las secuencias de los iniciadores diseñados para este propósito se muestran en el siguiente cuadro.

Iniciadores empleados para la amplificación del fragmento luxE-nptII.

CONJUGA CIÓN in vitro ENTRE A. hydrophila 65 Y VARIOS DONA DORES DE pRAS1.

A continuación se muestran las matrices de conjugación que se llevaron a cabo entre A. hydrophila 65 y varios donadores de pRAS1, así como los antibióticos de selección de transconjugantes y receptoras.

Matrices de conjugación entre diferentes donadores de pRA S1.

Donadora Receptora Posibles transconjugantes Antibióticos de selección

A. salmonicida 718

A. hydrophila 65

A. hydrophila 65-pRAS1

Tet25Amp100

A. hydrophila 839Tn5lux –pRAS1a

A. hydrophila 65

A. hydrophila 65-pRAS1

Tet25Amp100Kan30

A. salmonicida 896Tn5lux –pRAS1a

A. hydrophila 65

A. hydrophila 65-pRAS1

Tet25Amp100Kan30

Región Secuencia 5´3´ Tamaño del amplicón

luxE-nptII.

FW 5` CTT TCT TTG AGG ATG AAA TGC´3 1100 pb

RV 5` GTC GGT CTT GAC AAA AAG AAC´3

5

E. coli J53-1-pRAS1a

A. hydrophila 65

A. hydrophila 65-pRAS1

Tet25Amp100Nal20

aPara generar a A. salmonicida 896Tn5l ux–pRAS1, A. hydrophila 839Tn5lux–pRAS1, E. coli J53-1-pRAS1 se siguió el protocolo recomendado por Bello y cols., 2008.

ELECTROPORACIÓN DE pRAS1- ori V / KAN-2 EN E. coli INV F´.

La electroporación de E. coli INV F´ se llevó a cabo utilizando el protocolo mencionado

anteriormente a excepción de que se utilizó tetraciclina (25 µg/mL) y kanamicina (50 µg/mL) para la selección clonas de E. coli INV F´ (pRAS1/oriV) transformantes/transposantes.

EXTRACCIÓN DE pRAS1- ori V / KAN-2

La extracción de pRAS1- ori V / KAN-2 se llevó de acuerdo al protocolo de extracción de plásmidos descrito anteriormente.

ELECTROPORACIÓN DE pRAS1- ori V / KAN-2 EN A. hydrophila 65

La electroporación de pRAS1- ori V / KAN-2 en A. hydrophila 65 y 839 se llevó acuerdo al protocolo que se mencionó anteriormente.

CONJUGA CIÓN ENTRE E. coli pRAS1- ori V / KAN-2 Y A. hydrophila 65

ENSAYO DE COMPLEMENTA CION DEL DEFECTO CONJUGA CIONA L.

Construcción de la biblioteca genómica de A. hydrophila 839

Extracción de DNA genómico de A. hydrophila 839

Integridad del DNA genómico de A. hydrophila 839

Para determinar la integridad de DNA genómico de A. hydrophila 65 este fue sometido a electroforesis en gel de agarosa al 0.8% como esta descrito anteriormente.

Macrorestricción del DNA genómico de A. hydrophila 839 con BfcUI (0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 y

1 U/µg de DNA genómico)

Antes de realizar la macrorestricción del DNA, este fue ajustado a 5µg/mL con agua

destilada estéril. La macrorestricción del DNA genómico de A. hydrophila 839 se llevó a cabo de acuerdo

al siguiente protocolo.

1. Las mezclas de restricción se incubaron durante una hora a 37oC en baño de agua 2. Se inactivó la enzima a 65oC durante 20 min en baño de María. 3. La mezcla de reacción se concentraron a 15 µl en un concentrador. 4. Las muestras concentradas se someten a electroforesis en geles de agarosa al 0.8%. 5. Las muestras se tiñen en bromuro de etidio a una concentración de un mg/ mL. 6. Se documenta la imagen en un documentador con luz UV.

6

7. La muestra que presente un perfil de restricción con fragmentos de aproximadamente de 10 kb (comparado con el perfil de λ/HindIII), será elegida para la restricción de 100 µg totales de DNA genómico.

8. La restricción de los 100 µg de DNA genómico de A. hydrophila 839 serán purificados mediante precipitaciones con isopropanol absoluto y etanol al 70%.

9. Los fragmentos de DNA son clonados en pRANGER-BTB3cat.

RESTRICCIÓN DE pRA NGER-BTB3cat A GRA N ESCALA CON BamHI

Se sometieron a la restricción 25 µg de DNA plasmídico de pRANGER-BTB3cat. La matriz de restricción de pRANGER-BTB3cat a gran escala se llevó a cabo siguiendo el siguiente protocolo.

Matriz de restricción de pRA NGER-BTB3cat con BamHI

Mezcla de restricción

Cantidad

pRANGER-BTB3cat 25 µg

Regulador 10X 150 µL

Agua destilada estéril 990µL

HindIII (10U/µL) 20 µL

Volumen final 1210µL

1. La mezcla de reacción se incubó a 37 OC durante 1 hora en baño de María. 2. Transcurrido el tiempo de incubación, la mezcla de restricción se inactiva en baño María

durante 20 minutos a 65 OC. 3. Se elimina el buffer de restricción por precipitación con isopropanol absoluto frio y 1/9 de

NaCl 5M como se mencionó anteriormente. PCR DIRIGIDA A LA REGION CENTRA L DE recA DE A. hydrophila 65.

Para la amplificación mediante PCR de gen recA, se someten a la amplificación aproximadamente 200-300 ng del DNA genómico (previamente cuantificado espectrofotométricamente de acuerdo al protocolo descrito anteriormente), en un volumen final de 50 μL. La mezcla de reacción contenía: Tris-HCl 20 mM (pH8.4), KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM,, desoxirribonucleósidos trifosfato dNTP´s (dATP, dCTP, dGTP y dTTP ) 0.3 mM de cada uno, iniciadores Fwd y Rev 10 µM de cada uno y 1 U de Taq polimerasa. Las condiciones para cada ciclo de reacción programada fueron: Desnaturalización inicial a 94°C durante 3 min y 30 ciclos en las siguientes condiciones: 94°C durante 1 min (Desnaturalización), 58°C durante 1 min (Alineamiento), 74°C durante 30 seg (Extensión). Al finalizar se efectuó una última extensión a 74°C durante 10 min Las secuencias de los iniciadores diseñados para este propósito se muestran a continuación.

Iniciadores empleados para la amplificación del gen recA .

7

RESULTA DOS

RECONOCIMIENTO DEL DONA DOR

INTRODUCCIÓN DE GEN REPORTERO Y SELECTOR POR MUTA GÉNESIS CON EL TRA NSPOSÓN

miniTn5LuxCDABE POR CONJUGA CIÓN CON E. coli S17-1 pir.

La generación de las mutantes luminiscentes (resistentes a kanamicina) de A. hydrophila Tn5luxCDABE 839 y A. salmonicida 896 Tn5luxCDABE fue con el objetivo de introducir un gen selector y un gen reportero para la selección de transconjugantes (siendo estas donadoras de pRAS1), para así poder determinar si pRAS1 es capaz de transferirse a A. hydrophila 65, si es que el problema de conjugación este asociado al no reconocimiento del donador original (A. salmonicida 718).

Para contar con una evidencia adicional de la mutagénesis generada en A. hydrophila

839 Tn5luxCDABE y A. salmonicida 896 Tn5luxCDABE, se diseñaron iniciadores específicos que permitieron demostrar por PCR la presencia del transposón en las mutantes generadas.

Estos iniciadores amplificaron un fragmento que va desde una región del gen luxE; el

cual codifica para la sintetasa encargada de la biosíntesis del sustrato de la enzima luciferasa, hasta otro fragmento gen nptII el cual codifica la enzima neomicina fosfotransferasa, la cual confiere resistencia a kanamicina. El producto de PCR de 1100 pb, información necesaria para saber si el transposón se encontraba insertado en el cromosoma de los huéspedes. AMPLIFICA CIÓN DE luxE-nptII MEDIA NTE REACCIÓN EN CA DENA DE LA POLIMERASA (PCR)

En todos los casos se identificó un amplicón de la talla molecular esperada (1100pb), lo

cual indica que está presente el transposón miniTn5luxCDABE que se utilizó para mutar a A. hydrophila 839 y A. salmonicida Tn5luxCDABE.

Región Amplificada

Secuencia 5´3´ Tamaño del amplicón

recA

F 5`TGA CCG CCA ACA TCA AGA A´3

198 pb´s

R 5`ACG CGG GTC TCG TTA CCG´3

Amplificación mediante PCR del elemento genético

LuxE-nptII de las dos mutantes de A.hy drophila 839 y

A. salmonicida 896. C arril: M: Marcador de peso

molecular fago ФX174/HaeIII. C arril 1-2: A . hy drophila 839 miniTn5LuxDABE, A . salmonicida 896

miniTn5luxC DABE. 3: Testigo positiv o; Escherichia coli S17-1 λpir miniTn5LuxC DABE. Testigo negativ o;

A eromonas hy drophila 839.

8

GENERACION DE LOS DIFERENTES DONA DORES DE pRAS1 PARA LAS MATRICES DE

CONJUGA CIÓN CON A. hydrophila 65.

Si el establecimiento del plásmido pRAS1 está en función del reconocimiento del donador original, generando diferentes transconjugantes (donadores), existe la posibilidad de que el receptor (A. hydrophila 65) pueda así reconocer al donador del plásmido y así este pueda establecerse. Para lograr lo anterior se montaron diferentes matrices de conjugación (entre ellas las mutantes generadas) para así recuperar transconjugantes que servirían como donadores de pRAS1. Las matrices montadas se muestran a continuación. Matrices de conjugaciones pa ra la generación de diferentes donadores de pRA S1 para los ensay os de conjugación de reconocimiento del donador en A .

hy drophila 65.

Donador Receptor Antibióticos de

selección Transconjugante generado

(Donador de pRAS1)

A. salmonicida 718

A. hydrophila 839Tn5lux –pRAS1

Tet25Amp100Kan30

A. hydrophila 839Tn5lux –pRAS1

A. salmonicida 718 A. salmonicida 896Tn5lux –pRAS1 Tet25Amp100Kan30 A. salmonicida 896Tn5lux –pRAS1

A. salmonicida 718 E. coli J53-1-pRAS1 Tet25Amp100Nal20 E. coli J53-1-pRAS1

Conjugación entre A. hydrophila 65 y varios donadores de pRAS1.

Bajo el antecedente de que el plásmido pRAS1 es incapaz de establecerse en A.

hydrophila 65. La primera pregunta que se abordo fue la siguiente: A. hydrophila 65 es incapaz de reconocer a A. salmonicida 718 (donador original de pRAS1)? Para abordar esta pregunta se montaron diferentes matrices de conjugación entre los diferentes donadores de pRAS1 (generados previamente) y A. hydrophila 65.

A continuación se muestran las matrices de conjugación que se llevaron a cabo entre A. hydrophila 65 y varios donadores de pRAS1, así como los antibióticos de selección de transconjugantes y receptoras.

Resultados de las conjugaciones entre A. hydrophila 65 y diferentes donadores de pRAS1.

Como se puede observar en el cuadro anterior, el plásmido pRAS1 es incapaz de

transferirse aun siendo diferentes los donadores, aun cuando se utilizó toda la mezcla de conjugación para la selección de transconjugantes.

Donadora Receptora Antibióticos de

selección Recuperación de

transconjugantes

A. salmonicida 718

A. hydrophila 65

Tet25Amp100

NO

A. hydrophila 839Tn5lux –pRAS1

A. hydrophila 65

Tet25Amp100Kan30

NO

A. salmonicida 896Tn5lux –pRAS1

A. hydrophila 65

Tet25Amp100Kan30

NO

E. coli J53-1-pRAS1

A. hydrophila 65

Tet25Amp100Nal20

NO

9

INCOMPA TIBILIDA D

PCR dirigida a la región repB del replicón IncU en pRAS1, pAr-32 y DNA genómico de A. hydrophila 65.

Estudios previos indican que la incapacidad de recibir plásmidos por el receptor esta relacionado con un fenómeno perfectamente descrito denominado Incompatibilidad (Inc), esto por la presencia de plásmidos en el huésped que compartan el mismo sistema de replicación o sistema de partición, los cuales pueden estar de forma autónoma o como cointegrados en el genoma bacteriano. Bajo este antecedente se podría suponer que A. hydrophila 65 cuenta con plásmidos o replicones cointegrados en su genoma que pertenezcan al grupo de incompatibilidad U (replicón presente en pRAS1), y así explicara la incapacidad conjugativa de pRAS1.

Preparaciones plasmídicas y de DNA genómico de A. hydrophila 65 (problema), A. hydrophila 839 (testigo negativo), A. salmonicida 718 (pRAS1) y E. coli W3102, fueron sometidas a la amplificación por PCR con iniciadores específicos para un fragmento de 598 pb s que corresponde al gen RepB, replicón del grupo de incompatibilidad U.

ESTABILIDA D

Electroporación de pRAS1 y pAr-32 en A. hydrophila 65 y E. coli J53-1

Para abordar el problema de estabilidad, el plásmido pRAS1 (obtenido a partir de una transconjugante), fue electroporado a A. hydrophila 839 (silvestre), A. hydrophila 65, y E. coli J53-1. Con el objetivo de forzar por otros medios la introducción de este plásmido, incluyendo a otro plásmido (pAr-32), como control en las demás cepas electroporadas.

Gel de electroforesis de los productos de PCR del fragmento RepB del grupo del replicon de Incompatibilidad U (IncU). Carriles 1 y 6: marcador de peso molecular 100 pb. 2 y 3: plásmidos pRAS1 y pAr-32 (testigos positivos). 4: Aeromonas hydrophila 65 (problema). 5: A. hydrophila 839 (testigo positivo).

10

Resultados en los ensayos de electroporación en A. hydrophila 65, 839, E. coli INV F´y J53-1.

Especie a electroporar Voltaje pRAS1 pAr-32

A. hydrophila 839 1250 √ √

A. hydrophila 65 1250 √

E. coli INV F´ 1800 √ √

E. coli J53-1 1800 √ √

En la cuadro anterior se pueden observar los resultados generados a partir de los ensayos de electroporación de pRAS1 y pAr-32 en diferentes cepas de Aeromonas (incluyendo la receptora natural de pRAS1 y la NO receptora) y diferentes cepas de E. coli (con diferentes fondos genéticos). En esta se puede observar claramente que ambos plásmidos pueden ser incorporados y mantenerse en ambos tipos de cepas (Aeromonas y Escherichia).

Sin embargo A. hydrophila 65 no logra mantener el plásmido aun cuando este fue

introducido por electroporación, suponiendo que la transferencia v ía conjugación no es suficiente para la incorporación y establecimiento del plásmido, por lo que pensando que forzando al plásmido a entrar por electroporación tendríamos éxito, sin embargo eso no fue así. Aunque pRAS1 es un plásmido de gran tamaño (44 Kb), este logra ser electroporado aun en baja eficiencia (aproximadamente 100 transformantes por cada microgramo de DNA plasmídico) Inducción de estrés en A. hydrophila 65 antes del cruce con A. salmonicida 718.

Trabajos previos con Corynebacterium glutamicum y Pseudomonas aeruginosa indican que, sometiendo a estas especies microbianas a estrés inducido con diferentes concentraciones de etanol, SDS entre otros factores productores de estrés antes del cruce con la cepa donadora del plásmido, la fertilidad de estas se ve aumentado hasta en 5 logaritmos después de su exposición a estrés.

Con este antecedente se montaron ensayos de estrés con diferentes concentraciones de etanol y SDS en A. hydrophila 65 para determinar si esta una vez expuesta a estrés pudiera ser receptiva al cruce con A. salmonicida 718 (donadora original). Los resultados de estas pruebas se muestran a continuación:

Resultados en la inducción de estrés en A. hydrophila 65 y A. hydrophila 839 antes del cruce con A. salmonicida 718.

RECEPTOR Tipo de estrés Concentraciones (mM) Num. transconjugantes

A. hydrophila 839 SDS

0 1.54 X 105 1 8.64 X 106

3 7.35 X 105 4 1.15 X 107

7 5.9 X 107 10 1.46 X 107

11

A. hydrophila 839 ETANOL

0 2.17 X 105 50 1.24 X 105

100 7.15 X 105 150 4.70 X 106

200 1.56 X 107 500 4.85 X 107

A. hydrophila 65 SDS

0 - 1 - 3 -

4 - 7 -

10 -

A. hydrophila 65 ETANOL

0 -

50 - 100 -

150 - 200 -

500 -

En el cuadro anterior se puede observar claramente que la fertilidad en A. hydrophila

839 se ve incrementada de manera importante cuando esta es sometida a diferentes concentraciones de etanol y SDS antes del cruce con A. salmonicida 718. Por el contrario para A. hydrophila 65 ningún tipo de estrés inducido en ella logran hacer que logre recibir el plásmido pRAS1. Sistemas de restricción-modificación

Ensayo de infección en A. hydrophila 65, 839, 5794, 5881 con el fago ΦAeh1

Resultados obtenidos en los ensayos de infección y/o titulación del fago ΦAeh1 en varias cepas de A. hydrophila.

Cepa Propiedad conjugativa UFP/mL

A. hydrophila 65 No conjugativa 2.32 X 1012

A. hydrophila 405 No conjugativa 4.48 X 1012

A. hydrophila 3801 No conjugativa 6.86X 1012

A. hydrophila 5974 Conjugativa 1.63 X 1012

A. hydrophila 839 Conjugativa 1.34 X 1012

A. hydrophila 6492 Conjugativa 2.45 X 1012

Reconocimiento de otro origen de replicación

La inestabilidad de pRAS1 también puede estar asociada a que no hay reconocimiento de

su origen de replicación lo que impide su permanencia en el huésped. Es por esto que se pensó que posiblemente al introducir un nuevo origen del replicac ión (promiscuo), este fuera

12

reconocido y así pRAS1 pudiera replicarse de forma estable en el huésped A. hydrophila 65. La estrategia seguida para abordar lo anterior se detalla a continuación:

Extracción y purificación pRAS1 de A. hydrophila 839-pRAS1.

A. salmonicida 718 (donadora original de pRAS1), alberga a mas plásmidos

(aproximadamente 5) de menor tamaño, los cuales hasta el momento no se ha demostrado que logren ser transferidos por conjugación cepas de A. hydrophila.

Para obtener preparaciones de pRAS1 sin que los demás plásmidos estuvieran presentes, se

generó una cepa transconjugante de A. hydrophila 839 (una muy buena receptora natural de este plásmido). A continuación se muestra el perfil de los plásmidos de la cepa donadora original de pRAS1 y de la transconjugantes de A. hydrophila 839 generada.

INSERCIÓN DE OTRO ORIGEN DE REPLICA CIÓN EN A. hydrophila 65 POR TRA NSPOSICIÓN CON EL EZ-Tn5™ <ori

V / KAN-2> TRANSPOSÓN (EPICENTRE/TECHNOLOGIES).

La mezcla de transposición fue electroporada a E. coli INV F , para así amplificar el plásmido

pRAS1/oriVKAN2 y utilizarlo para electroporar a A. hydrophila 65, o bien para utilizar a E. coli INV F´ como donadora de pRAS1/oriVKAN2 en conjugación con A. hydrophila 65.

Una forma de confirmación de la transposición del origen de replicación Tn5oriV en

pRAS1, además de la resistencia a kanamicina adquirida por E. coli INV F después de su

electroporación, es el perfil de restricción que muestre el plásmido después de ser digerido con SacI y HindIII (Experimento pendiente). A continuación se muestra un perfil de plásmidos de el

plásmido nativo, de una transconjugante y con el origen de replicación.

Comparación del tamaño de pRAS1 VS pRAS1/oriV. Carriles 1 y 5: E. coli V517. Carril 2: A. salmonicida 718 (pRAS1), 3: A. hydrophila 839, 4: E. coli INV F´.

DNA plasmídico de A. hydrophila 839 transconjugante con A. salmonicida 718 (pRSA1). Carriles: M: Marcador de peso molecular de DNA superenrrollado. Carril 1: A. salmonicida 718. Carriles: 2, A. hydrophila 839 receptora; 2, A. hydrophila 839 transconjugantes.

13

En la figura anterior se puede observar claramente que aun cuando el plásmido pRAS1

tiene el nuevo origen de replicación oriV (1.8 Kb) no se logra observar un cambio aparente en la talla molecular (comparado con la talla de pRAS1 de A. salmonicida 718 y de A. hydrophila 839 transconjugante).

CARACTERIZA CION DE pRAS1/oriVKan2 MEDIA NTE ENSAYOS DE RESTRICCIÓN.

(Experimento pendiente)

CONJUGA CIÓN ENTRE E. coli pRAS1- ori V / KAN-2 Y A. hydrophila 65

Para verificar si la inserción del oriVKAN2 en pRAS1 permitía que este se estableciera en A. hydrophila 65, se montaron matrices de conjugación entre la donadora que se generó por electroporación (E. coli INV F´ (pRAS1/oriV)) con A. hydrophila 65 y A. hydrophila 839 como

control positivo de conjugación. Los resultados generados a partir de estas pruebas se muestran a continuación.

Resultados de frecuencia de conjugación entre A. hydrophila 65/A. salmonicida 718, A. hydrophila 839/A. salmonicida 718, A.

hydrophila 65/E. coli INV F´(pRAS1/oriV) y A. hydrophila 839/E. coli INV F´(pRAS1/oriV)

En el cuadro anterior se puede observar que después del cruce entre A. hydrophila 65/E.

coli INV F´ (pRAS1/oriV), hay recuperación de transconjugantes. Esto sugiere que la inserción

del nuevo origen de replicación en este plásmido esta participando activamente en la replicación del mismo y a su vez su mantenimiento en el huésped (aunque la frecuencia de conjugación es menor con comparación con la frecuencia obtenida del cruce entre A. hydrophila 839/A. salmonicida 718 (pRAS1).

Matriz de conjugación Frecuencia de conjugación

A. hydrophila 65/A. salmonicida 718 (pRAS1) -

A. hydrophila 839/A. salmonicida 718 (pRAS1)

9.05 X 10-2

A. hydrophila 65/E. coli INV F´(pRAS1/oriV) 6.65 X 10-7

A. hydrophila 839/E. coli INV F´(pRAS1/oriV) 4.48 X 10 -3

14

En base a estos resultados se implementará una metodología para determinar cuales son

los mecanismos o eventos que se generaron después de la inserción del nuevo origen de replicación en pRAS1 que permite su establecimiento en A. hydrophila 65. También se encuentra pendiente determinar la estabilidad (% de segregación) de pRAS1/oriV en A. hydrophila 65 mediante cultivos seriales. ANALISIS DE ESTA BILIDAD POR CULTIVOS SERIA LES DE pRAS1/oriV Kan2 EN DIFERENTES

RECEPTORES. En cuanto a estabilidad de plásmidos, se sabe que estos pueden perderse o bien segregarse depuse de numero de generaciones, esto es por la ausencia de presión de selección, lo cual deriva en el rompimiento o delesiones en estas estructuras en las regiones que codifican la resistencia, tal es el caso de los plásmidos pHN32, pCOM69 y pFEC59, los cuales son estables en S. typhi con y sin presión de selección, pero cuando estos son transferidos a E. coli y se elimina la presión, sobreviene la inestabilidad lo cual resulta en la segregación de los mismos.

Bajo es premisa se montaron ensayos de segregación mediante el análisis por cultivo serial a las transconjugantes generadas por conjugación entre E. coli INV F’ pRAS1/oriVKan2,

es decir, dos clonas de A. hydrophila 65 pRAS1/oriVKan2 (las cuales se designaron como A y B) y A. hydrophila 839 pRAS1 obtenida de la conjugación con A. salmonicida 718 (donadora original), para determinar si pRAS1 con y sin el nuevo origen de replicación era capaz de mantenerse estable durante varios días de subcultivos serial en ausencia de presión selectiva. En el siguiente cuadro se muestran los resultados obtenidos de este experimento y la grafica de interpretación del mismo.

En la tabla y grafica anterior se pueden observar los resultados obtenidos de los ensayos de segregación de pRAS1/oriVKan2 y pRAS1 en diferentes receptores mediante cultivo serial. Como se puede observar la clona A y B de A. hydrophila 65 pRAS1/oriVKan2 en comparación con la clona de A. hydrophila 839 pRAS1 (receptora natural), tienen un mismo comportamiento segregacional, esto es, a 20 días de subcultivos en medio libre de antibiótico el porcentaje de sobrevivencia de la población de A. hydrophila 65 A y B es de 3.3 y 30.6% respectivamente.

Suponiendo que las dos clonas utilizadas de A. hydrophila 65 (A y B) en los ensayos de

segregación de pRAS1 tienen el nuevo origen de replicación en un sitio diferente (ya que el evento de transposición es al azar), el comportamiento segregacional podría ser diferente (eso dependería del lugar de inserción).

La inserción de un nuevo origen de replicación en pRAS1 permitió el establecimiento de

este en A. hydrophila 65 vía electroporación y conjugación utilizando a E. coli INV F . La

inestabilidad de pRAS1/oriVKan2 en la clona A de A. hydrophila 65 se logro hacer evidente desde el primer día de subcultivos, habiendo un porcentaje de sobrevivencia de 68.04%, por otro lado para la clona B hubo un porcentaje de sobrevivencia de 97.7% en el primer día de

15

subcultivos serial. No hubo una diferencia importante entre el comportamiento segregacional de las dos clonas de A. hydrophila 65 y 839.

ENSAYO DE COMPLEMENTA CION DEL DEFECTO CONJUGA CIONA L.

Construcción de la biblioteca genómica de A. hydrophila 839

Para la construcción de la biblioteca genómica de A. hydrophila 839, se montaron macro restricciones de DNA genómico con una enzima de alta frecuencia de corte (BfuCI), isoesquisomero de Sau3AI a diferentes concentraciones de enzima (0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 y 1.0 U). Con este ensayo se determinó que 5µg de DNA genómico logra ser digerido parcialmente (con fragmentos de aproximadamente 6-10 kb), para así clonar estos fragmentos en pRANGER-BTB3CAT.

RESTRICCIÓN DE pRA NGER-BTB3cat A GRA N ESCALA CON BamHI Y PURIFICA CION DEL

FRA GMENTO DE INTERES MEDIA NTE DIGESTION ENZIMA TICA CON -AGARASA.

La estrategia que se utilizará para la construcción de la biblioteca genómica de A. hydrophila 839 (receptora natural de pRAS1), es la clonación de los fragmentos generados (aproximadamente 10 kb) del genoma de A. hydrophila 839 en un vector que se utiliza ampliamente para el análisis de replicones en Gram negativos (pRANGER BTB3cat). Para que este vector fuera utilizado con el propósito que nos planteamos, fue cortado en dos fragmentos, utilizando BamHI.

El fragmento pequeño generado contenía un terminador denominado T2, el gen

completo de arabinosa denominado arac, que participa como gen metabólico de selección y un promotor denominado P1, el segundo fragmento (el de interés para la construcción de la biblioteca) contiene un segundo terminador denominado T1, el gen rep que participa en la replicación del vector y un gen de selección denominado cat, el cual codifica para una cloranfenicol acetil transferasa, la cual confiere resistencia a cloranfenicol.

Ensayos de macrorestricción del genoma de A. hydrophila 839 con BfuCI a diferentes concentraciones. Carril 1 y 8: Marcador de peso molecular λ/HindIII. Carril 2: 0.01 U. 3: 0.05 U. 4: 0.1 U. 5: 0.3 U. 6: 0.5. 7: 1.0 U.

16

GENERACIÓN DE LA MUTA NTE DE A. hydrophila 65 RecA- MEDIA NTE MUTA CIÓN INSERCIÓN

DUPLICA CIÓN.

PCR DIRIGIDA A LA REGION CENTRA L DE recA DE A. hydrophila 65 Y CLONA CIÓN EN pCR2.1

Se amplificó por PCR un fragmento de la talla molecular esperada (198 pb), el cual fue purificado por kit, para que posteriormente este fuera clonado en el vector pCR2.1. La mezcla de ligación (pCR2.1/recA) fue electroporado en E. coli INV F , el criterio de selección fue la

resistencia adquirida a kanamicina. Se recuperaron 15 clonas resistentes a kanamicina, las cuales fueron sometidas a la extracción de plásmidos para así determinar si hubo o no recombinación del plásmido en el genoma del huésped.

CARACTERIZA CIÓN FENOTIPICA DE LA

MUTA NTE GENERA DA DE A. hydrophila 65 recA-

A) CONFIRMACIÓN DE LA RECOMBINA CIÓN

DE pCR2.1/recA -.

Se procedió a la extracción de plásmidos por la técnica de Birboin y Doly (MODIFICADA). El análisis de las preparaciones se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 0.8%, de acuerdo al protocolo descrito anteriormente, además de que un criterio adicional fue la resistencia adquirida a kanamicina. En la siguiente figura se puede observar la ausencia del plásmidos recombinantes en las 15 clonas sometidas a la extracción de los mismos. La extracción se llevó a cabo junto con otros plásmidos de tamaños conocidos (E. coli V51), como control de extracción.

B) INDUCCIÓN A LA FILAMENTA CÍON A 42OC DE LAS CLONAS DE A. hydrophila 65 recA -.

Estudios previos indican que la filamentación inducida a 42OC en cepas de E. coli con el genotipo recA-, es una de las pruebas que se utilizan para caracterizar fenotípicamente este tipo de mutantes. De las 15 clonas resistentes a kanamicina que se recuperaron y que presentaron ausencia del plásmido recombinante pCR2.1/recA, solo 3 de ellas lograron crecer a 42oC, estas fueron teñidas por la técnica de Gram y observadas al microscopio con el objetivo de inmersión (100X).

Amplificación por PCR del fragmento recA de A. hydrophila 65 para la construcción de la mutante recA-

17

Las tres clonas que fueron teñidas por la técnica de Gram, exhibieron morfológicamente abundantes bacilos cortos Gram negativos (típicos de este género bacteriano), pero con diferentes niveles de filamentación con el mismo comportamiento tintorial. La filamentación inducida en este tipo de clonas fue comparada con una mutante de E. coli INV F´ y con una

cepa silvese (recA) de E. coli. En las siguientes figuras se logran ver las imágenes generadas después de la incubación a

42oCde cada una de las mutantes generadas por mutación iserción-duplicación. En ellas se logra observar que la clona que designamos como B presenta una mayor filamentación en comparación con las demás clonas A y C, y con la cepa control de E. coli INV F . La siguiente

prueba de caracterización fenotípica fue la determinación de sensibilidad a luz UV.

C) SENSIBILIDA D A LUZ UV A DIFERENTES TIEMPOS DE EXPOSICIÓN.Las tres clonas que fueron resistentes a kanamicina, que no presentaron el plásmido recombinante pCR2.1/recA y que filamentaron a 42oC, se sometieron a una prueba final de sensibilidad a luz UV a diferentes tiempos de exposición. La sensibilidad a luz ultravioleta se ha reportado como una prueba en la caracterización fenotípica de mutantes recA-, siendo estas mucho mas sensibles que las cepas wild type de E. coli.

En la grafica anterior se puede observar que el menor porcentaje de sobrevivencia en el

menor tiempo de exposición (en comparación con E. coli INV F-recA-), es la que corresponde a

la clona B, en esta se observa un porcentaje de sobrevivencia de 13.92% en un tiempo de exposición de 15 segundos. Por otro lado en las clonas A y C se muestra un porcentaje de sobrevivencia mayor a mayores tiempos de exposición.

IMPACTO Los resultados obtenidos hasta ahora nos indican que la cepa A hydrophila 65 es incapaz de

reconocer el origen de replicación del plásmido pRAS1. Los experimentos de complementación con genes de una receptora habitual del plásmido nos permitirán conocer la razón de esta limitación y entender mejor los requerimientos del hospedero para el establecimiento de plásmidos.