ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE...

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

Estudio de las vesículas de membrana externa de

Brucella melitensis.

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

PRESENTA

QBP. ERIC DANIEL AVILA CALDERÓN

Directoras de Tesis: DRA. ARACELI CONTRERAS RODRÍGUEZ

DRA. AHIDÉ LÓPEZ MERINO

México, D. F. 2009

INDICE Abstract iii Resumen iv I. Introducción

I.1. Las vesículas de membrana externa (OMVs) y su importancia en las bacterias patógenas Gram negativas

1

I.2. La formación de las OMVs 3 I.3. La producción de OMVs durante la infección del hospedero 7 I.4. Regulación de la respuesta inmunológica del hospedero por medio de las OMVs

8

I. 5. La utilidad de las OMVs como vacunas acelulares 9 I. 6. Las OMVs como respuesta al estrés 10

II. Antecedentes II.1. OMVs en Brucella spp. 11

III. Justificación 13 IV. Objetivos

IV. 1. Objetivo general 14 IV. 2. Objetivos particulares 14

V. Material y métodos V. 1. Cepas bacterianas 16 V.2. Obtención y purificación de las OMVs 16 V. 3. Cuantificación de proteínas 16 V. 4. Microscopia electrónica 17 V. 5. Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)

17

V.6. Secuenciación de proteínas por LC-MS/MS 17 V. 7. Análisis in sílico de las proteínas identificadas 18 V. 8. Obtención de células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón (BMDC)

19

V. 9. Estimulación in vitro de BMDC, extracción de RNA y RT-PCR

19

V. 10. Real Time-PCR 20

V. 11. Western Blot 20

VI. Resultados VI. 1. Obtención y purificación de OMVs 21 VI. 2. Microscopia electrónica 21 VI. 3. SDS-PAGE y secuenciación de proteínas por LC-MS/MS 22 VI. 4. Análisis in sílico 25 VI. 5. Expresión de citocinas en BMDC 30 VI. 6. Western Blot 32

VII. Discusión 33 VIII. Conclusiones 43 XI. Bibliografía 44

INDICE DE TABLAS Tabla 1. Factores de virulencia asociados a OMVs liberadas por bacterias Gram negativas patógenas de humanos, plantas y animales.

2

Tabla 2. Proteínas identificadas por SDS-PAGE acoplada a LC-MS/MS de las OMVs de B. melitensis 16M.

24

Tabla 3. Proteínas identificadas de las vesículas de membrana externa aisladas de Brucella melitensis 16M por SDS-PAGE acoplado a LC-MS/MS y análisis in sílico.

28

Tabla A. Análisis In silico de las proteínas y anotación en base a la función hipotética basada en los programas de ProLinks y Gene Ontology.

29

INDICE DE FIGURAS Figura 1. Modelo representativo de los eventos sucesivos de secreción de componentes periplásmicos vía OMVs.

4

Figura 2. Modelos propuestos para la formación de OMVs

6

Figura 3. Formación, liberación y purificación de las OMVs en las cepas de B. melitensis 16M y B. melitensis VTRM1

22

Figura 4. PAGE-SDS de las proteínas de las OMVs de B. melitensis VTRM1 y B. melitensis 16M y escisión del gel para secuenciación por LC- MS/MS

23

Figura 5. Distribución celular de las proteínas identificadas en las OMVs de diferentes especies bacterianas mediante SDS-PAGE acoplada a LC-MS/MS (porcentaje de proteínas identificadas en las OMVs

26

Figura 6. Expresión de citocinas de las BMDC estimuladas con OMVs

31

Figura 7. Western blot de las proteínas de las OMVs de B. melitensis 16M

32

Resumen

Las bacterias Gram negativas liberan vesículas de membrana externa como

parte de su crecimiento normal. El mecanismo de producción de las vesículas

de membrana externa (OMVs) y la ventaja potencial ofrecida para la

supervivencia de la bacteria in vivo aun queda sin definir del todo. Empleando

un método de centrifugación diferencial se obtuvieron y purificaron las OMVs

de Brucella melitensis 16M una cepa lisa y B. melitensis VTRM1una cepa

mutante rugosa. Con el fin de observar la formación, liberación y obtención de

las OMVs se realizó la observación por medio de microscopía electrónica.

Empleando la electroforesis unidimensional acoplada a espectrometría de

masas, se identificaron 29 proteínas de B. melitensis 16M vesículas de

membrana externa. En base a la localización celular de las proteínas de las

OMVs fueron clasificadas como proteínas de membrana externa (51,7%),

periplásmicas (17%), citoplásmicas (20,6%), proteínas extracelulares (3,4%) y

proteínas de localización intermembrnal (6,8%). Estas mismas proteínas se

clasificaron de acuerdo al motif identificado en: i) proteínas estructurales y de

transporte, ii) proteínas antigénicas, iii) involucradas en procesos metabólicos,

y iv) proteínas de respuesta al estrés y, v) proteínas de invasión. OMVs

purificadas a partir de B. melitensis 16M y de B. melitensis VTRM1 indujeron

diferentes perfiles de citocinas en células dendríticas derivadas de médula ósea

de ratón. Se observó la inducción una respuesta de tipo Th1 por estimulación

con OMVs de la cepa rugosa, lo que indica un papel indirecto en la ausencia de

la cadena O del LPS en la inducción de la respuesta inmune. Por último se

identificaron proteínas antigénicas de 66, 30, 23 y 10 kDa presentes en las

OMVs de B. melitensis 16M por medio de Western blot.

Abstract

Gram negative bacteria release outer membrane vesicles as part of their normal

growth. The mechanism for outer membrane vesicles (OMVs) production as

well the potential advantage provided for bacterial survival in vivo remains to be

defined. Using a differential centrifugation method were extracted and purified

the OMVs of Brucella melitensis 16M smooth strain and B. melitensis VTRM1 a

rough mutant strain. To observe the formation, release and purification of

OMVs, observation was made by electron microscopy. A total of 29 proteins of

Brucella melitensis 16M outer membrane vesicles were identified using one-

dimensional electrophoresis coupled to mass spectrometry. Based on the

subcellular partition, OMVs proteins were localized in the outer membrane

(51.7%), periplasm (17%), cytoplasm (20.6%), extracellular (3.4%) and inner

membrane (6.8%). These proteins fell into several classes including: i)

structural proteins and transporters; ii) antigenic proteins; iii) metabolic

processes; iv) stress response proteins; and v) invasion proteins. OMVs purified

from B. melitensis smooth strain 16M and the rough strain VTRM1 induced

different cytokine profiles in murine bone marrow dendritic cells, inducing a Th1

response by OMVs from the rough strain indicating a indirect role to the

absence of O-side chain o f the LPS in the induction of the immune response.

Finally, we identified antigenic proteins of 66, 30, 23 and 10 kDa present in the

OMVs of B. melitensis 16M by Western blot.

I. INTRODUCCIÓN

I. INTRODUCCIÓN

- 1 -

I. 1. Las vesículas de membrana externa (OMVs) y su importancia en las

bacterias patógenas Gram negativas.

Los factores de virulencia de las bacterias patógenas Gram negativas, en la

mayoría de los casos son productos secretados que ayudan a la sobrevivencia

de la bacteria dentro del hospedero y ayudan a evadir la respuesta

inmunológica del mismo. La secreción de los factores de virulencia de las

bacterias Gram negativas es complicada por el hecho de tener que atravesar

las envolturas bacterianas, las membranas interna y externa y la pared celular

(Kuehn et al., 2005).

Las bacterias patógenas Gram negativas han desarrollado muchas estrategias

para liberar diferentes moléculas efectoras, algunas específicas de cada

género o especie tales como los sistemas de secreción, cuya finalidad es la de

ganar acceso a los tejidos del organismo hospedero (Filloux et al., 1990).

Además de los sistemas de secreción (sistemas de secreción I, II, III, IV, V, VI y

VII) que se han descrito en las bacterias Gram negativas patógenas y no

patógenas (Abdallah et al., 2007), se reportó la existencia de vesículas de

membrana externa (OMVs). Este fenómeno es exclusivo de este grupo de

bacterias que sirve como mecanismo de liberación de factores de virulencia y

complejos de proteínas (Mashburn-Warren et al., 2006; Beveridge, 1999). Además, las

OMVs liberadas por las bacterias Gram negativas aperentemente tienen otras

funciones como: la interacción con células eucarióticas, procarióticas y con el

medio exterior (Mashburn-Warren et al., 2006).

Algunas de las OMVs mejor caracterizadas son aquellas producidas por las

bacterias Gram negativas patógenas (Tabla 1).

I. INTRODUCCIÓN

- 2 -

El análisis bioquímico y funcional de las OMVs producidas por este grupo de

bacterias ha demostrado que esta ruta de secreción se especializó en estas

bacterias para el transporte de factores de virulencia hacia la célula hospedera

(Kuehn et al., 2005).

Las OMVs alcanzan su máxima producción al final de la fase log de

crecimiento, además las bacterias patógenas Gram negativas producen una

mayor cantidad de OMVs que las Gram negativas no patógenas (Horstman et al.,

2000).

Tabla 1. Factores de virulencia asociados a OMVs liberadas por bacterias

Gram negativas patógenas de humanos, plantas y animales.

Especie bacteriana Factor de virulencia Referencia

Porphyromonas gingivalis Proteasas Grenier at al., 1991

Borrelia burgdorferi OspA, OspB Whitmire et al.,1993

Pseudomonas aeruginosa Peptidoglicana hidrolasas (PGasa), fosfolipasa C, hemolisinas, fosfatasa alcalina, proteasas

Kadurugamuwa et al.,1995

Helicobacter pylori VacA, CagA, DnaK, HspB Cao et al., 1998; Ismail et al.,2003

Escherichia coli (EHEC y ETEC) Toxina de Shiga (ST) Enterotoxina termolábil (LT)

Kolling et al., 1999 Horstman et al., 2000

Actinobacillus pleuropneumoniae Proteasas, ApxI Negrete-Abascal et al., 2000

Neisseria spp. DNA, PorA, LPS, Dorward et al., 1989 Oftung et al., 1998 Mirlashari et al., 2002

Xenorhabdus nematophilus Quitinasas, toxinas y adhesinas Khandelwal et al., 2003

Salmonella typhi Citotoxina ClyA Wai et al., 2003

Shigella dysenteriae Toxina de Shiga Dutta et al., 2004

Actinobacillus seminis Proteínas antigénicas Núñez del Arco et al., 2005

Legionella pneumophila Proteasas, LPS, proteínas de invasión

Galka et al., 2008

Xanthomonas campestris OPMs, HreP, HrcV, HrcN, LPS Sidhu et al., 2008

Lysobacter sp.XL1 Endopeptidasa L5 Vasileyva et al., 2008

Vibrio anguillarum Metaloproteasas, hemolisisnas, OmpU

Hong et al., 2009

I. INTRODUCCIÓN

- 3 -

I. 2. La formación de las OMVs.

De manera natural las bacterias Gram negativas liberan de manera espontanea

al exterior OMVs durante su crecimiento (Kadurugamuwa et al., 1995).

En general las OMVs poseen una doble membrana, tienen un diámetro esférico

de 50 a 250 nm y están constituidas por fosfolípidos, proteínas de membrana

externa (Omp), lipopolisacárido (LPS) y componentes del espacio periplásmico

(Beveridge, 1999; Kadurugamuwa et al., 1995; Zhou et al., 1998).

También se ha reportado la presencia de DNA y RNA dentro de las OMVs e

incluso se ha encontrado que dicho material genético puede ser transformante

(Klieve et al., 2005; Kolling et al., 1999; Song et al., 2008).

Las OMVs son liberadas de la membrana externa (ME) por un proceso de

extrusión o ―blebbing‖ (proceso denominado para la formación y liberación de

OMVs) al medio exterior. Es importante remarcar que el proceso por el cual son

liberadas las OMVs de las bacterias Gram negativas no altera el arreglo natural

de la membrana externa, manteniéndola intacta (Beveridge, 1999; Khandelwal et al.,

2003; Li et al., 1998).

Se han descrito varios modelos y mecanismos para poder explicar la liberación

de las OMVs. Kadurugamuwa et al., en 1995 propusieron un modelo básico

representativo para explicar la formación y liberación de OMVs (Figura 1)

(Kadurugamuwa et al., 1995).

I. INTRODUCCIÓN

- 4 -

Figura 1. Modelo representativo de los eventos sucesivos de secreción de componentes

periplásmicos vía OMVs. C, citoplasma; CM, membrana citoplásmica; PG, peptidoglicana;

ME, membrana externa. A) Estado normal de las envolturas celulares antes de la formación de

OMVs. En B y C se observa la formación de OMVs de manera natural durante el crecimiento

de la bacteria, llevando dentro componentes periplásmicos y DNA presente en el periplasma.

D) muestra la formación de OMVs al ser perturbada la superficie celular con un antibiótico

como la gentamicina.

Más recientemente se han propuesto tres modelos para poder explicar la

formación de OMVs a nivel molecular, basados en experimentos genéticos y

bioquímicos en Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa (Mashburn-Warren et

al., 2006).

Modelo 1. Las OMVs son formadas cuando la ME se expande más rápido que

la capa de peptidoglicana. Esto ocasiona desuniones localizadas de la

peptidoglicana a la ME debido a la deficiencia de enlaces con lipoproteínas. Si

el crecimiento asimétrico continúa, las áreas que no se encuentran unidas se

abultan y son liberadas en forma de OMVs. Este modelo se basa en la

observación de que hay significativamente una menor cantidad de lipoproteínas

en las OMVs y en el hecho de que no se han encontrado dentro de las OMVs,

proteínas que se sabe interactúan con las lipoproteínas y que unen a la ME con

la peptidoglicana.

I. INTRODUCCIÓN

- 5 -

Modelo 2. Las OMVs se forman cuando los productos liberados por el recambio

de la capa de peptidoglicana, no son eficientemente internalizados por la

bacteria al citoplasma para ser degradados y reutilizados, lo que ocasiona que

se acumule y genere un abultamiento local de la ME. El movimiento mecánico

de la ME ocasiona la liberación de dichos productos en las OMVs. Este

modelo se sustenta en el hecho de que se han encontrado en las OMVs

fragmentos de peptidoglicana, además de autolisinas como la peptidoglicana

hidrolasa (PGasa) que ayuda a la síntesis y recambio de la pared celular

además de participar durante el crecimiento de la célula bacteriana (Li et al.,

1998; Zhou et al., 1998).

Modelo 3. Se ha propuesto que la composición química del LPS es un

importante mediador para la formación de las OMVs. En cepas de Salmonella

y P. aeruginosa, indican que cepas con un LPS incompleto exhiben una mayor

producción de OMVs. Las OMVs de P. aeruginosa se demostró que las OMVs

liberadas contienen principalmente LPS de tipo B que posee una carga neta

negativa, en lugar del tipo A que posee una carga neutra. Con esto se propuso

un modelo de formación de OMVs basado en la repulsión de cargas

ocasionada por la carga negativa del LPS B, lo que genera inestabilidad de la

membrana, y un abultamiento que daría inicio a la formación de OMVs. Esto

fue comprobado al cultivar a P. aeruginosa en medios que favorecen y

enriquecen el LPS B en la ME, incrementándose la vesiculación (Sabra et al.,

2003). Además de lo anteriormente descrito, estudios recientes sobre la

señalización por quinolonas de Pseudomonas (PQS), moléculas implicadas en

el Quórum sensing de la bacteria, también se relacionan con la formación de

OMVs. Las PQS promueven la formación de OMVs por medio de la

desestabilización de los puentes salinos formados entre las cargas negativas

de la ME y los iones divalentes como Mg+2 y Ca+2, ocasionando una repulsión

de cargas entre las moléculas de LPS.

I. INTRODUCCIÓN

- 6 -

Junto con lo anteriormente descrito, la señalización por quinolonas de

Pseudomonas (PQS), moléculas implicadas en el Quórum sensing, también se

han relacionado con la formación de OMVs. Las PQS actúan como

secuestradores de iones divalentes, incrementan la inestabilidad de la

membrana externa y por consecuente la vesiculación. Este hecho se soporta

por experimentos realizados en los que se adicionan agentes quelantes como

el EDTA que incrementan la formación de OMVs, por el contrario, la adición de

iones como el Mg+2 disminuyen la formación de OMVs(Mashburn-Warren et al.,

2006).

Figura 2. Modelos propuestos para la formación de OMVs. Modelo 1: OMVs originadas a

partir de regiones de la peptidoglicana no asociadas con la ME por medio de lipoproteínas.

Modelo 2: OMVs producidas por el acumulamiento de productos de degradación de la

peptidoglicana por procesos naturales. Modelo 3: Interacciones iónicas entre PQS y Mg+2

ocasionan una desestabilización en la membrana externa que promueve la formación de

OMVs.

I. INTRODUCCIÓN

- 7 -

I. 3. La producción de OMVs durante la infección del hospedero.

Las OMVs de bacterias Gram negativas patógenas intracelulares y

extracelulares han sido identificadas en diversos tejidos. Revelando la

capacidad de las vesículas de poder ingresar a cualquier tejido (Kuehn et al.,

2005).

Los estudios acerca de las OMVs de Helicobacter pylori han revelado una

variedad de funciones que pueden desempeñar dichas vesículas,

principalmente como factores de virulencia. También, se les atribuye un papel

en la apoptosis in vitro de células gástricas, lo cual es de suma importancia en

el desarrollo de úlceras pépticas en pacientes que presentan un estado

avanzado de la infección (Ayala et al., 2006).

En algunos casos estructuras similares a OMVs han sido detectados en la

placa dental de pacientes con periodontitis. Las OMVs de Porphyromonas

gingivalis, bacteria que ocasiona esta enfermedad, están implicadas en la

adhesión, destrucción dental, inflamación y diseminación (Fives-Taylor et al., 2000).

Salmonella spp., produce OMVs cuando se encuentra intracelularmente y en

medios de cultivo. Las OMVs ayudan a este patógeno a evadir la respuesta

inmunológica de la célula hospedera. Las OMVs de la bacteria poseen LPS, el

cual actúa conjuntamente con otros antígenos de superficie, que le ayudan a

evadir la respuesta inmune. Estos componentes están bajo la regulación del

sistema PhoP/PhoQ, que ocasiona cambios en dichos antígenos para evitar ser

reconocidos por el sistema inmunológico (Bergman et al., 2005; García-del Portillo et

al., 1997; Vesy et al., 2000).

En Legionella pneumophila, las OMVs pueden inhibir la fusión del fagosoma

con el lisosoma, lo que permitie el establecimiento intracelular y sobrevivencia

de la bacteria (Fernández-Moreira et al., 2006).

I. INTRODUCCIÓN

- 8 -

Las OMVs de E. coli uropatógena y Actinobacillus actinomycetemcomitans

contienen toxinas, que pueden alcanzar al citoplasma al fusionarse con células

in vitro, y así evadir a la respuesta inmunológica (Davis et al., 2006; Demuth et al.,

2003).

I. 4. Regulación de la respuesta inmunológica del hospedero por medio

de las OMVs.

Además de algunos factores de virulencia, las OMVs contienen componentes

que son reconocidos por las células eucarióticas durante la respuesta inmune

innata y/o adquirida.

Linfocitos B murinos pueden ser activados cuando se cultivan en presencia de

OMVs de Borrelia burgdorferi. También se ha observado que las OMVs de

Neisseria meningitidis provocan una respuesta inmunológica con la producción

de anticuerpos de tipo IgG y la activación de células B y T (Bakke et al., 2001;

Whitmire et al., 1993).

Ratones inoculados con Salmonella typhimurium inducen la producción de

linfocitos T CD4+ capaces de reconocer antígenos presentes en las OMVs de la

bacteria, lo que indica que las OMVs son reconocidas por la células

presentadoras de antígenos y son capaces de activar linfocitos. También se

han identificado como componentes de las OMVs a moléculas sometidas bajo

un sistema de regulación implicadas en el cambio de fase antigénica de la

misma bacteria, el cual es un mecanismo bien conocido para la evasión de la

respuesta imnunológica (Bergman et al., 2005).

Las OMVs de H. pylori inducen la producción de IL-8, en cultivos de células

gástricas, dicha citocina, promueve la activación y atracción de neutrófilos y por

lo tanto provoca inflamación en el tejido (Ismail et al., 2003). También se ha

observado que estas OMVs pueden inhibir la expresión de moléculas de

histocompatibilidad de clase II (MHC-II) en células epiteliales cultivadas in vitro,

lo que llevan a la evasión de la respuesta inmune del hospedero (Srisatjaluk et al.,

2001).

I. INTRODUCCIÓN

- 9 -

I. 5. La utilidad de las OMVs como vacunas acelulares.

Las OMVs de N. meningitidis del grupo B, regulan la expresión de moléculas de

adhesión de leucocitos ocasionando su agregación y por lo tanto una

inflamación del tejido donde se encuentra la bacteria (Mirlashari et al., 2002).

Las OMVs de N. meningitidis ya se han aplicado en la preparación de vacunas

para humanos que son capaces de proteger contra infecciones de

meningococo del grupo B. Se ha visto que las OMVs pueden inducir una

respuesta inmune protectora con la producción de anticuerpos IgG e IgA

cuando son inoculados intramuscular e intranasalmente (Bakke et al., 2001;

Norheim et al., 2005; Oftung et al., 1999). Estas vacunas ya se han probado en

humanos por vía intranasal y han inducido la producción de anticuerpos de

memoria y de tipo IgA. Además de mostrarse seguras y efectivas (Katial et al.,

2002).

Por tal motivo y debido al éxito que presenta la utilización de las OMVs como

vacunas acelulares, algunas proteínas que son transportadas dentro de las

vesículas y que han demostrado ser buenos inmunógenos se han

sobreexpreado con la finalidad de aumentar la respuesta protectora. Tal es el

caso la proteína GNA-1870 sobreexpresada en N. meningitidis del grupo B

(Hou et al., 2005; Koeberling et al., 2006).

En las OMVs de Bordetella pertussis también han encontrando las proteínas

inmunógenas previamente descritas, y han evaluado la capacidad protectora

de estas las vesículas en ratones (Roberts et al., 2008).

I. 6. Las OMVs como respuesta al estrés.

El aumento excesivo en la temperatura, así como otros factores que ocasionan

alteraciones en la conformación y procesamiento de las proteínas presentes en

las envolturas de las bacterias Gram negativas, son condiciones estresantes

para las bacterias.

I. INTRODUCCIÓN

- 10 -

El efecto desestabilizante del estrés en estas macromoléculas, desencadena

un gran número de señales que activan diversos mecanismos para eliminar las

proteínas mal conformadas, estas proteínas resultan ser productos tóxicos para

la bacteria que se acumulan en el espacio periplásmico. En respuesta al estrés

se libera una mayor cantidad de vesículas de membrana externa. El incremento

en la producción de OMVs tiene la finalidad de eliminar las proteínas dañadas.

Este proceso se realiza de forma que la mayoría de las proteínas dañadas se

eliminen por medio de las OMVs de manera selectiva incrementando la

efectividad y eficiencia del mismo (McBroom et al., 2007).

II. ANTECEDENTES

II. ANTECEDENTES

- 11 -

II. 1. OMVs en Brucella spp.

En el caso del género Brucella, las OMVs liberadas presentan un mayor

diámetro cuando son crecidas en medio sólido que cuando lo hacen en medio

líquido. Contienen LPS y proteínas de membrana externa, principalmente del

grupo 3 (proteínas de 25 a 34 kDa) y son liberadas tanto por cepas lisas y

rugosas (Gamazo et al., 1987).

Gamazo et al., en 1989 realizaron un estudio, en donde compararon las

proteínas de un extracto salino caliente y las proteínas de las OMVs de cepas

de B. melitensis y B. ovis aisladas de animales. Observaron 5 grupos de

proteínas antigénicas: grupo A (23-32 kDa), B (21-22 kDa), C (18-19 kDa), D

(13-15 kDa) y proteínas de 43 kDa (ausentes en las OMVs de algunas

especies de B. melitensis). Asimismo comprobaron que el perfil de proteínas

podía variar incluso entre cepas de la misma especie (Gamazo et al., 1989).

Experimentos realizados por Porte et al., en 1999 han demostrado que la

acidificación temprana (pH entre 4.0-4.5) del fagosoma o del autofagosoma, es

necesaria para el establecimiento de la infección por Brucella y que lejos de

afectar a la bacteria, el pH ácido actúa como un inductor que activa genes

necesarios para su sobrevivencia intracelular (Porte et al., 1999).

Más recientemente Boigegrain et al., en 2004, evaluaron la secreción de

proteínas B. suis al crecer en diversos medios y a diferentes pH como:

regulador de citratos y regulador de acetatos a un pH de 4, RPMI y PBS a un

pH neutro. Los investigadores encontraron una gran variedad de proteínas

secretadas al medio a pH de 4 preparado con regulador de acetatos. Se

observaron tanto proteínas solubles como proteínas asociadas a membrana

(proteínas componentes de las OMVs). En este estudio los autores lograron

identificar las proteínas Omp25 y Omp31 por medio de anticuerpos

monoclonales (Boigegrain et al., 2004).

II. ANTECEDENTES

- 12 -

Con estos antecedentes, Avila Calderón., en 2007, analizó el efecto del pH

4.5 y 7.2 sobre la liberación de OMVs en B. melitensis 16M y B. melitensis

VTRM1. La cepa VTRM1 es una mutante rugosa que carece de la cadena O

del LPS, y que es derivada de la cepa lisa de referencia 16M. La cepa rugosa

se empleó con la finalidad de observar si la integridad del LPS afectaba la

formación y liberación de las proteínas presentes en las OMVs. Los resultados

mostraron que la liberación y formación de las OMVs y los perfiles

electroforéticos de las proteínas fueron semejantes en ambos pHs. (Avila

Calderón., 2007).

III. JUSTIFICACIÓN

III.JUSTIFICACIÓN

- 13 -

A las vesículas de membrana externa de algunas bacterias Gram negativas se

les han atribuido diversas funciones, entre ellas como: factores de virulencia,

mecanismo de secreción de proteínas, mecanismo alternativo de

transformación, participación en el establecimiento y sobrevivencia de las

bacterias patógenas dentro del hospedero, señalización intercelular (procariote-

procariote y procariote-eucariote), respuesta ante diversos tipos de estrés y

acción bactericida contra otras bacterias.

Hasta la fecha se desconoce la composición completa de las proteínas de las

vesículas de membrana externa de Brucella y que pudieran estar relacionadas

tanto en los mecanismos de patogenicidad como en la sobrevivencia

intracelular como ya se ha reportado en otros microorganismos. Por lo cual en

este trabajo se pretende realizar la identificación de las proteínas presentes en

las vesículas de membrana externa de B. melitensis, así como evaluar la

respuesta inmunológica in vitro.

IV. OBJETIVOS

IV. OBJETIVOS

- 14 -

IV. 1. Objetivo general.

Identificar a las proteínas presentes en las vesículas de membrana

externa así como observar la respuesta inmunológica del hospedero al

estar en contacto con las OMVs producidas por las cepas de Brucella

melitensis 16M y VTRM1.

IV. 2. Objetivos particulares.

• Identificar las proteínas presentes en las vesículas de membrana de la

cepa de Brucella melitensis M16 por medio de la técnica de

cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas en tándem

(LC-MS/MS).

• Realizar el análisis in sílico de las secuencias aminoacídicas de las

proteínas identificadas y tratar de asignar una función putativa dentro de

los mecanismos de patogenicidad de la bacteria.

• Analizar la expresión de citocinas de células dendríticas derivadas de

médula ósea durante la estimulación con las vesículas de membrana

externa de B. melitensis, mediante qRT-PCR.

• Identificar las proteínas antigénicas presentes en las vesículas de

membrana externa de B. melitensis reconocidas por sueros de pacientes

con brucelosis mediante Western blot.

V. MATERIAL Y MÉTODOS


- 15 -

Diagrama general de trabajo.

Secuenciación, identificación y análisis in sílico de proteínas en OMVs.

Esquema general.

Estudio inmunológico.


- 16 -

V. 1. Cepas bacterianas.

Brucella melitensis 16M y la mutante rugosa B. melitensis VTRM1 (Winter et al.,

1996) se crecieron en medio de agar soya tripticaseína con extracto de levadura

(TSA-EL), y en caldo soya tripticaseína suplementado con extracto de levadura

(TSB-EL).

V. 2. Obtención y purificación de OMVs.

La obtención y purificación de OMVs se realizó a partir de un cultivo de

B. melitensis 16M sembrada a partir de una cepa conservada en glicerol a

-20ºC. La cepa se sembró en una placa de TSA-EL pH 7.2, incubada a 37°C

durante 36 h y bajo una atmósfera de CO2 al 5%.

Posteriormente se realizó una resiembra de la cepa en tubos inclinados y se

creció durante 48 h. A partir de este cultivo se realizó una siembra masiva en

placas de TSA-EL, y se incubaron a 37°C, bajo atmósfera de CO2 al 5%

durante 48 h. Las células se cosecharon con regulador de fosfatos salino (PBS

0.1M, pH 7.2). El paquete celular se obtuvo mediante centrifugación a 10, 000

x g, a 4°C durante 30 min. El sobrenadante se esterilizó por filtración a través

de una membrana de 0.22 m de diámetro y se realizó prueba de esterilidad al

filtrado.

El filtrado estéril se ultracentrifugó a 100, 000 x g, durante 2 horas y el

sedimento que contenía las OMVs se resuspendió en PBS 0.1 M, pH 7.3. La

muestra fue almacenada a -20°C hasta su utilización. De igual manera se

procedió para la obtención de OMVs de B. melitensis VTRM1. Durante todo el

procedimiento se realizó el control de calidad de la cepa por medio de tinción

de Gram y variación antigénica por medio de aglutinación con acriflavina al 1%

y suero anti-brucela policlonal.

V. 3. Cuantificación de proteínas.

La determinación de proteínas se realizó por el método de PIERCE- BCA en

microplaca empleando una curva estándar de albúmina sérica bovina (BSA).


- 17 -

V. 4. Microscopia electrónica.

Se realizó microscopía electrónica de un cultivo células completas de ambas

cepas así como de las vesículas purificadas. Se tomaron 20 L (25 g de

proteína) de OMVs y/o de cultivo bacteriano de incubado durante 48h, tal y

como se describió previamente y se colocaron de manera dosificada sobre una

rejilla de cobre recubierta de Formvar, y se dejó bajo luz UV hasta la completa

adsorción.

Posteriormente se realizó la tinción negativa colocando sobre la rejilla 20 L de

ácido fosfotúngstico al 1%, quitando el exceso con papel filtro y se dejó a

temperatura ambiente toda la noche.

Las preparaciones fueron observadas en la Central de Microscopía de la

ENCB-IPN empleando un microscopio electrónico de transmisión JEOL modelo

JEM 10-10, las micrografías fueron tomadas por el Dr. Oliver López Villegas.

V. 4. Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de

sodio (SDS-PAGE).

La electroforesis se realizó utilizando geles de poliacrilamida al 15 y 12.5% de

acuerdo al protocolo de Laemmli, 1970.

V. 5. Secuenciación de proteínas por LC-MS/MS.

Las OMVs de B. melitensis 16M se corrieron en un gel de poliacrialamida

desnaturalizante al 15% y el gel fue analizado para su secuenciación en el

Instituto de Biotecnología (IBT-UNAM) Campus Morelos mediante la técnica de

LC-MS/MS.


- 18 -

La huella peptídica de una de las proteínas obtenidas por LC-MS/MS fueron

analizadas con el programa Sequest software de Finnigan (Palo Alto, CA, USA)

y Mascot search engine de Matrix Science Ltd (Boston, MA, USA).

V. 6. Análisis in sílico de las proteínas identificadas.

Una vez identificadas las proteínas presentes en las OMVs se realizó el análisis

in sílico.

a) BLAST de las secuencia de aminoácidos con otras secuencias

aminoacídicas similares presentes en otras especies de Brucella y otras

bacterias relacionadas y no relacionadas filogenéticamente (http://www.

ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

b) La determinación del punto isoeléctrico y peso molecular, se realizaron con

el programa Antheprot 2000 V. 5.2.

c) La predicción de ―motifs‖ (secuencias de aminoácidos específicas dentro de

una proteína) se determinaron con la base de datos PROSITE, disponible en el

servidor http://www.expasy.org, la base de datos de Softberry disponible en

http://www.softberry.com y las bases de datos de My hits (http://hits.isb-

sib.ch/doc/dbmot.html) que emplea las bases de datos de PROSITE, Pfam

HMMS, InterPro, HAMAP profiles y TIGRfam HMMS.

d) La predicción de la localización celular de las proteínas se realizó en el

servidor PSORT (Prediction of protein sorting signal and localization sites in

aminoacid sequences) disponible en http://www.psort.org (Gardy et al., 2005) y la

base de datos de Softberry.

e) Los programas, ClustalX V. 1.83, Seaview y MatGAT V. 2. 02 (Campanella et

al., 2003), se utilizaron para la obtención de los índices de similitud e identidad

de las secuencias homólogas encontradas.

http://www/

http://www.expasy.org/

http://www.softberry.com/

http://hits.isb-sib.ch/doc/dbmot.html

http://hits.isb-sib.ch/doc/dbmot.html

http://www.psort.org/


- 19 -

f) Se emplearon los programas en línea de Gene Ontology

(http://www.geneontology.org) (Ashburner et al., 2000) y ProLinks (http://dip.doe-

mbi.ucla.edu/pronav) (Bowers et al., 2004) para determinar la función hipotética de

las proteínas identificadas en las OMVs.

V. 7. Obtención de células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón

(BMDC).

Se emplearon ratones hembras de 8 semanas de edad de la cepa BALB/c. Se

obtuvo la médula ósea de los huesos femorales y tibiales de los ratones, se

realizó una lisis de glóbulos rojos. La células se contaron y se cultivaron a

37°C con 5% de CO2 en medio RPMI 1640 suplementado de 10% de suero

fetal bovino, 50 g/mL de gentamicina , 50 mM de 2-ME y 20 ng/mL rGM-CSF

(factor recombinante estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos)

(BIOSOURCE®) para diferenciar a las células. Durante 6 días las células se

cultivaron empleando el mismo medio suplementado y se diferenciaron

adicionando rGM.CSF a la concentración indicada. Al séptimo día se

cosecharon las células, se realizó un conteo, se ajustó la concentración celular

y se colocaron en una placa de 6 pozos con 2.5x106 células/mL/ pozo.

V. 8. Estimulación in vitro de BMDC, extracción de RNA y RT-PCR.

Inicialmente se realizaron ensayos en los que se probaron diferentes

concentraciones de OMVs: 1, 10, 20, 30 y 40 g de proteína, con la finalidad de

determinar la concentración de trabajo en la cual se observara una mejor

respuesta inmunológica de las células. Para los ensayos posteriores se eligió la

concentración de 40 g de proteína de OMVs. Se emplearon OMVs purificadas

a la concentración mencionada de B. melitensis 16M y B. melitensis VTRM1.

http://www.geneontology.org/

http://dip.doe-mbi.ucla.edu/pronav

http://dip.doe-mbi.ucla.edu/pronav


- 20 -

Posteriormente se realizó la extracción de RNA total de las BMDC estimuladas

y no estimuladas (testigos negativos) a los tiempos de 1, 3, 6 y 12 h post-

estimulación y por triplicado empleando un kit de extracción de RNA (QIAGEN

RNAeasy Mini Kit). El DNA fue removido utilizando DNasa I (DNA-freeTM kit

Ambion).

Con la finalidad de evaluar la eliminación del DNA se realizó una PCR

empleando primers para amplificar el gen gapdh. Posteriormente se realizó la

síntesis de cDNA a partir de 1 g de RNA total mediante un kit comercial

(Promega® A2500 kit).

V. 9. Real Time-PCR

Las muestras de cDNA se emplearon para realizar el análisis de expresión de

los genes de las citocinas IL-2, IL-6, IL-12p40, IL-10, IL-17, IL-23, IFN , TGF y

TNF empleando primers y reactivos comerciales (RT2 SYBR

Green/fluoresceína qPCR Master Mix SABioscienes ®) en el Sistema iCycler

PCR (Bio-Rad ®). El protocolo de PCR se realizó de acuerdo a las

especificaciones del proveedor. Los cambios en la expresión génica se

calcularon utilizando el método ΔΔCt. La amplificación del gen gapdh se utilizó

para normalizar los cambios en la expresión de los genes de las citocinas

mencionadas.

V. 10. Western Blot.

Se determinó la presencia de anticuerpos en sueros de pacientes con

brucelosis y en individuos sanos contra las proteínas presentes en las OMVs

purificadas mediante Western blot (Towbin, 1979.).

Se realizó una dilución 1:20 del suero de pacientes con brucelosis y testigos

negativos (individuos clínicamente sanos). El anticuerpo conjugado a

peroxidasa se usó a una dilución de 1:500 y se utilizó diaminobencidina para

revelar la reacción antígeno anticuerpo.

VI. RESULTADOS

VI. RESULTADOS

- 21 -

VI. 1. Obtención y purificación de OMVs.

A partir de la siembra masiva de B. melitensis M16 realizada en 100 cajas de

Petri se obtuvieron 10.82 g de biomasa, de los cuales se obtuvieron 1, 302 g

de proteínas en OMVs con un rendimiento de 120 g de proteínas de OMVs/g

de células. Para la cepa de B. melitensis VTRM1, se obtuvieron 9.82 g de

biomasa y 1, 071 g de proteínas en OMVs con un rendimiento de 109 g de

proteínas/ g de células.

VI. 2. Microscopia electrónica.

Para confirmar la obtención y pureza de las OMVs se analizaron por medio de

microscopía electrónica empleando una tinción negativa con ácido

fosfotúngstico al 1%.

En las micrografías (Figura 3.) se puede apreciar la formación y liberación de

las OMVs de la superficie bacteriana. Además, se puede apreciar la morfología

característica que presentan: una forma esférica, con doble membrana y un

diámetro promedio entre los 60 a 90 nm como ya había sido descrito

previamente (Gamazo et al., 1989). Las micrografías empleando la tinción negativa

permiten apreciar la doble membrana de las vesículas, que es una

característica particular de las OMVs y que demuestra claramente que son

liberadas de la superficie de las células y no como un producto de lisis celular.

VI. RESULTADOS

- 22 -

Figura 3. Formación, liberación y purificación de las OMVs en las cepas de

B. melitensis 16M y B. melitensis VTRM1. Tinción negativa. En las figuras 3A y 3B se

observa la formación y liberación de las OMVs de la superficie de las cepas de B. melitensis

VTRM1 y B. melitensis 16M respectivamente. En las figuras 3C y 3D se pueden apreciar las

OMVs purificadas de B. melitensis VTRM1 y B. melitensis 16M respectivamente.

VI. 3. SDS-PAGE y secuenciación de proteínas por LC-MS/MS.

Los perfiles electroforéticos observados y los pesos moleculares calculados

con el programa SigmaGel V. 1.0 de las proteínas obtenidas de vesículas de

membrana de B. melitensis VTRM1 y B. melitensis 16M, se muestran en la

figura 4. En la figura 4, también se puede observar el esquema que se siguió

para la disección del gel para la secuenciación por medio de LC-MS/MS.

A B

C D

VI. RESULTADOS

- 23 -

Figura 4. PAGE-SDS de las proteínas de las OMVs de B. melitensis VTRM1 y B.

melitensis 16M y escisión del gel para secuenciación por LC- MS/MS. A) Corrimiento

electroforético en gel de poliacrilamida al 15%. Carril 1, Marcador de peso molecular; carril 2,

OMVs de B. melitensis 16M (80 g); carril 3, OMVs de B. melitensis VTRM1 (80 g). B)

Esquema que muestra los fragmentos en que fue seccionado el gel para ser sometidos a la

secuenciación por la técnica de LC-MS/MS.

Para optimizar los esfuerzos de secuenciación sólo las proteínas que se

observaron en las OMVs de la cepa lisa fueron secuenciadas. Después de la

separación electroforética de las proteínas de las OMVs de B. melitensis 16M,

los fragmentos correspondientes a 60-88, 26, 23, 18-20 y 6-10 kDa fueron

cortados y digeridos con tripsina.

Los péptidos trípticos, así como sus iones fragmentados, fueron analizados por

LC-MS/MS. Las secuencias de los péptidos resultantes se utilizaron para

consultar las bases de datos (Sequest software y Mascot search engine) lo que

condujo a la identificación de 29 proteínas específicas (Tabla 1).

VI. RESULTADOS

- 24 -

La identidad de las proteínas sólo se consideró como significativa si el

porcentaje de identificación fue mayor de 25%, si más de dos péptidos, así

como sus iones fragmentados correspondían a las proteínas y el peso

molecular calculado corresponde a la sección de gel donde fueron

identificadas.

Tabla 1. Proteínas identificadas por SDS-PAGE acoplada a LC-MS/MS de las OMVs

de B. melitensis 16M.

ND. No designado.

*El porcentaje de identificación es el valor asignado por el programa respecto a la identidad de una proteína. El

porcentaje de cobertura corresponde al valor asignado por el programa para el número de aminoácidos identificados

en una secuencia.

Sección

del gel

Proteína Gen Número de

acceso (a.a)

Puntaje de

identificación

(%)

Cobertura

(%)

1 Antígeno de superficie bacteriana ND YP_221860 71 4

Proteína de membrana externa reguladora de

hierro FRPB

frpB NP_541082 100 13

Proteína acarreadora de metales de membrana

externa

ND NP_539574 90 3

2 Proteína de unión a azúcares Sp39 NP_541568 90 7

Proteína de superficie externa ND YP_223106 91 18

Precursor de la proteína periplásmica de

unión a D-Ribosa

rbsB NP_541413 99 50

Proteína hipotética BMEI0542 ND NP_539459 99 42

3 Precursor de la proteína inmunogénica de

membrana externa de 25 kDa

omp25b NP_539924 99 28

Precursor de la proteína inmunogénica de


omp25 NP_540166 100 19



Omp25c NP_540746 96 18



Omp25d NP_540747 99 50



omp31 NP_541822 99 32

BP26 bp26 ABC17803 91 10

Precursor de la proteína YBIS ND AAL52550. 100 22

Proteína de la familia OmpA ompA NP_698208 99 17

4 Factor de reciclaje de ribosomas Frr NP_698164 100 38

Precursor de la proteína inmunógenica de


omp22 NP_539634 100 43

Proteína de protección del DNA en la fase

estacionaria/inanición Dps

dps NP_699124 100 25

Lipoproteína hipotética ND YP_221909 90 14

5 Proteína hipotética asociada a membrana

BMEII0692

ialB

NP_541670 90 14

Proteína de invasión B invB YP_221125 53 12

Lipoproteína asociada a peptidoglicana omp16 NP_539257 99 40

Cadena A de la superóxido dismutasa Cu-Zn sodC 2AQM_A 100 48

Co-chaperonina GroES groES NP_542025 99 42

Tioredoxina C-1 trxC NP_540939 98 16

6 Lipoproteína de membrana externa omp19 NP_539053 97 26

Proteína HU de unión a DNA hu YP_221813 95 20

Lipoproteína hipotética ND YP_221486 100 43

Proteína hipotética BMEI0287 ND NP_539204 100 50

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=17989189

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=17983365

VI. RESULTADOS

- 25 -

VI. 4. Análisis in sílico.

Los resultados de la caracterización proteómica de las proteínas presentes en

las OMVs de B. melitensis 16M se resumen en la Tabla 2. Además, los

resultados complementarios del análisis in sílico se muestran en la tabla A.

Además de la identificación de las proteínas de cada sección del gel y la

predicción de sus características bioquímicas básicas como punto isoeléctrico y

peso molecular, también se obtuvieron por medio de los análisis: la localización

celular, los sitios motifs, las regiones inmunogénicas, la predicción de péptido

señal y la asignación de un posible función de las proteínas.

De las 29 proteínas identificadas, aproximadamente el 51.7% pertenecieron a

la membrana externa, el 17% de localización periplásmica, 20.7% de

citoplasma, 6.8% de localización intermembranal y el 3.4% fueron proteínas

extracelulares. Con base en los motifs encontrados en las proteínas podríamos

clasificarlas en cinco grupos: i) estructurales y las proteínas de transporte

(Omp25 y proteína de unión a azúcares), ii) proteínas antigénicas (BP26 y

SodC), iii) relacionadas a procesos metabólicos (co-chaperona GroES y

proteína HU de unión a DNA), iv) proteínas de respuesta al estrés (proteínas

Dps y tioredoxina C-1); y v) proteínas de invasión (invasina B y proteína de

invasión asociada al locus B).

En base a los estudios que se han realzado en base a la identificación y

anotación de las proteínas identificadas en las OMVs en base a su localización

celular, se realizó una comparación con las proteínas identificadas en las

OMVs de B. melitensis 16M (Figura 5).

VI. RESULTADOS

- 26 -

Figura 5. Distribución celular de las proteínas identificadas en las OMVs de diferentes especies bacterianas mediante SDS-PAGE acoplada a LC-MS/MS (porcentaje de proteínas identificadas en las OMVs). (A) B. melitensis 16M, este trabajo; (B) Xanthomonas

campestris, Sidhu, et al. 2008;(C) Escherichia coli DH5 , Lee, et al. 2007; (D) Neisseria

meningitidis gna33-NZ98/254, Ferrari, et al. 2006. ME, membrana externa; P, periplasma; C, citoplasma; InM, intermembranal; EC, extracelular; MI, membrana interna; FV, factores de virulencia; ST-III, proteínas del sistema de secreción tipo III; PC-AS, proteínas citoplásmicas asociadas a superficie.

En alrededor del 60% de las proteínas se logró predecir la presencia de

péptidos señal, y por lo tanto la capacidad de ser exportados hacia alguna de

las membranas de la bacteria. Sólo doce de las proteínas no contenían

péptidos señal y cinco de ellas fueron catalogadas como citoplasmáticas.

Además, utilizando ProLinks y los términos de Gene Ontology, se predijo la

posible función de 27 proteínas, exceptuando a dos. Además la mitad (14/29)

de las proteínas, parecen estar involucradas en el transporte y la integridad o

de la membrana (Tabla A).

VI. RESULTADOS

- 27 -

También como resultado del análisis de las secuencias mostró que todas las

proteínas identificadas en las OMVs de B. melitensis se encuentran altamente

conservadas en otras especies de Brucella (88 a 100% de similitud, datos no

mostrados), exceptuando a la tioredoxina C-1 (BMEI2022) y la lipoproteína

asociada a peptidoglicana (BMEI0340) cuyo valor de similitud fue más alto con

Ochrobactrum. Por otro lado, se observó que las secuencias de las proteínas

identificadas también presentaron un porcentaje de similitud alto al compararlas

con otras especies de la familia de los Rhizobiales, como Rhizobium y

Bartonella con alrededor del 50% a 90% de similitud). Curiosamente, cuatro

homólogos se observaron con un alto valor de similitud con Escherichia coli: La

proteína de membrana externa reguladora de hierro FRPB, Proteína

acarreadora de metales de membrana externa, proteína Dps (implicadas en la

protección de DNA durante la inanición o la fase estacionaria), y SOD

(superóxido dismutasa dependiente de Cu/Zn).

VI. RESULTADOS

- 28 -

Tabla 1. Proteínas identificadas de las vesículas de membrana externa aisladas de Brucella melitensis 16M por SDS-

PAGE acoplado a LC-MS/MS y análisis in sílico.

ME, membrana externa; IM, intermembranal; P, periplásmica; C, Citoplásmica; EC, extracelular.

Proteína Denominación

en B. melitensis

PM

(kDa)

Motif, localización celular Secuencias con alto valor de porcentaje en

especies diferentes de Brucella (%Similitud)

Antígeno de superficie bacteriana BMEI0830 85.90 Antígeno superficial, ME Proteína de membrana externa

Bartonella henselae str. Houston-1, (75.3%)

Proteína de membrana externa

reguladora de hierro FRPB

BMEII0105 72.05 Receptor Plug dependiente de

TonB, ME

Receptor dependiente de TonB

Escherichia coli, (41.3%)

Proteína acarreadora de metales de

membrana externa

BMEI0657 64.80 Receptor Plug dependiente de

TonB, ME

Cadena A del transportador de membrana

externa de cobalamina (Btub) Escherichia coli, (46.2%)

Proteína de unión a azúcares BMEII0590 43.20 Proteína extracelular bacteriana

de unión a azúcares, P

Probable proteína transportadora de azúcares

ABC Rhizobium etli, (75.7%)

Proteína de superficie externa BMEII0376 31.55 Aglutinina resistente al calor,

ME

Proteína aglutinina 1 resistente al calor

Rhizobium leguminosarum bv.viciae, (54.9%)

Precursor de la proteína periplásmica de unión a D-Ribosa

BMEII0435 30.99 Dominio de unión a azúcares de la familia LacI, P

Porina Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, (59.2%)

Proteína hipotética BMEI0542 BMEI0542 30.04 Desconocida, EC

Proteína hipotética

Rhizoium sp., (48.3%}

Precursor de la proteína inmunogénica de membrana externa de 25 kDa

BMEI1007 25.24 Porina tipo 2, ME

Proteína de unión a hemina C Bartonella tricoborum, (58.7%)

Precursor de la proteína inmunogénica

de membrana externa de 25 kDa

BMEI1249 23.18 Porina tipo 2,ME Proteína de unión a hemina B

Bartonella henselae str. Houston-1, (58.7%)


BMEI1829 24.58 Porina tipo 2, ME Porina Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, (59.2%)



BMEI1830 24.74 Porina tipo 2, ME Proteína de membrana externa

Rhizobium etli, (60.1%)


BMEII0844 23.27 Perfil de dominio tipo OmpA, ME

Porina Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, (52.5%)

BP26 BMEI0536 24.77 Familia de función desconocida

DUF541, P

Proteína de función desconocida DUF541

Rhizobium leguminosarum bv.trifolii, (64.9%)

Precursor de la proteína YBIS BMEI1369 23.51 Dominio YkuD, C


Rhizobium leguminosarum bv. viciae, (67.2%)

Proteína de la familia OmpA BMEI0786 22.96 Dominio tipo OmpA, ME

Proteína de la familia OmpA


Lipoproteína hipotética BMEI0785 21.91 Perfil de lipoproteína procariótica de membrana de

unión a lípidos, IM

Proteína hipotética Rhizobium leguminosarum bv. viciae, (74.7%)

Factor de reciclaje de ribosomas BMEI0826 20.66 Factor de reciclaje de ribosomas, C

Factor de reciclaje de ribosomas Bartonella henselae str. Houston-1, (90.3%)

Proteína hipotética asociada a membrana

BMEII0692

BMEII0692 20.42 Proteína de invasión al locus B

(IalB), IM

Proteína de la familia de invasión asociada al

locus B

Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, (62.4%)



BMEI0717 19.44 Desconocido, ME

Precursor putativo de la proteína de membrana

externa


Proteína de protección del DNA en la fase estacionaria/inanición Dps

BMEI1980 18.25 Dominio tipo ferritina Proteína Dps, C



Lipoproteína asociada a peptidoglicana BMEI0340

18.23 Perfil de unión a lípidos, ME

Lipoproteína de membrana externa Rhizobium etli, (82.6%)

Proteína de invasión B BMEI1584 18.03 Invasina B, P

Proteína de invasión asociada al locus B

Bartonella quintana str. Tolouse, (55.4%)

Lipoproteína de membrana externa BMEI0135 17.60 Perfil de lipoproteína procariótica de membrana de

unión a lípidos , ME

Lipoproteína de membrane externa Bartonella henselae str. Houston-1, (59.6%)

Superóxido dismutasa dependiente de

Cu-Zn

BMEII0581 16.07 Superóxido dismutasa

dependiente de Cu-Zu, P

Superóxido dismutasa Cu-Zn


Tioredoxina C-1 BMEI2022 11.42 Sitio activo de tioredoxina, C

Tioredoxina putativa


Co-chaperonina GroES BMEII1047 10.39 Proteína chaperona de 10 kDa

Cnp10, C

Co-chaperonina GroES

Bartonella tricoborum, (91.8%)

Proteína HU de unión a DNA BMEI0877 9.07 Proteína bacteriana de unión a

DNA tipo histona, C

Proteína de unión a DNA

Rhizobium sp., (83.5%)

Lipoproteína hipotética No determinado 8.286 Perfil de lipoproteína de membrana procariótica de unión

a lípidos, ME

Antígeno de superficie de 17 kDa Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, (61.2%)

Proteína hipotética BMEI0287 BMEI0287 8.596 Perfil de lipoproteína

procariótica de membrana de unión a lípidos, ME


Rhizobium etli, (56.8%)

VI. RESULTADOS

- 29 -

Tabla A. Análisis In silico de las proteínas y anotación en base a la función hipotética basada en

los programas de ProLinks y Gene Ontology.

** Región antigénica única dentro de la secuencia.

*SignaIP software empleado.

Proteína identificada Región antigénica

P. I. Péptido

señal*

Relacionado a

(with ProLinks)

Términos en Gene Ontology

(Proceso o función)

Antígeno de superficie bacteriana [ +7.627]:SGRRLRDVI; [ +5.862]:ETLRRFYYN;

[ +4.107]:LSAGFDVFR

5.37 Si Proteína de

membrana

Membrana, transmembranal, membrana

externa

Proteína de membrana externa reguladora

de hierro FRPB

[ +6.969]:PGKTFGARI; [ +3.994]:AGASRTWLG

[ +4.461]:APGRTFTFQ

5.54 Si Proteína de

membrana


externa

Proteína acarreadora de metales de

membrana externa

[ +6.223]: RTASATSGS; [ +6.164]: LQGSFNFAL

[ +5.277]: QYDATAPAF;[ +8.431]: TIDYDETGR

5.00 No Proteína de

membrana

Receptor, transportador, membrana

Proteína de unión a azúcares [ +5.349]:IESPAFQSA; [+11.014]: AIYDVVTRQ 4.97 Si Transporte de azúcares

Transporte de azúcares

Proteína de superficie externa [ +5.263]:GAGIGAAYV; [+4.550]:YGYDEQDRQ [ +4.643]:VINQYGQGA

5.28 Si Membrana, transmembranal, membrana externa

Precursor de la proteína periplásmica de

unión a D-Ribosa

[+10.821]:AANIPVFLI; [ +4.572]:ANIPVFLIN

[+2.382]:ANWDRTQGH

5.60 No Transporte de

azúcares

Transporte de D-ribosa, en espacio

periplásmico unido a membrana externa,

unión de azúcares

Proteína hipotética BMEI0542 [ +3.159]:SKVEWTDPF; [ +3.446]:DINDRWNIF [ +4.666]:DIGGFGAGT

4.83 Si


[ +5.837]:GVDSKLRWS;[ +3.644]:DFSVVDGDL 4.72 Si Proteína de membrana

Membrana, transmembranal, membrana externa



[+3.213]:WAGGYTGLY;[+12.005]:NYDLAGTTV 8.58 Si Membrana, transmembranal, membrana

externa



[ +2.813]:ATGANAADA;[ +2.005]:APVVVAPTF 4.78 Si Proteína de

membrana


externa



[ +4.891]:EPAPIAIAP; [ +4.062]:NNLKKSRDF 9.28 Si Proteína de

membrana


externa



[ +5.082]:KHPFSSFDK;[ +4.300]: RLGYTATER 5.21 Si Proteína de

membrana


externa

BP26 [ +1.069]: TMLAAAPDN** 7.93 Si Espacio periplásmico

Precursor de la proteína YBIS [+2.858]:KRQWPRWP;[ +8.867]:ALYIFKDGK 8.49 No

Proteína de la familia OmpA [ +4.455]:GAGIGALGG;[ +2.212]:DTDQDQVKS 9.55 Si Componente de la membrana externa, transmembranal

Lipoproteína hipotética [+6.979]: RGGWFNNQ; [ +7.882]: DAIHFIGWY [ +5.847]ADAIHFIGW

10.48 Si Actividad de endotransglicosilasa lítica

Factor de reciclaje de ribosomas [ +4.144]:RIAARHVRR 5.98 No Traducción Traducción, terminación de la traducción

Proteína hipotética asociada a membrana

BMEII0692

[ +2.166]: MLASATMPA;[ +2.363]: PNPIPVALT 9.00 No


[ +7.382]: QVNGIEQRN 8.59 No Proteína de membrana

Membrana, transmembranal, membrana externa


[ +7.137]: ITKQAHWNL;[ +8.278]: RLKPYPTDI [ +4.828]: LKPYPTDIY

5.25 No Transporte de aminoácidos

Unión de metales iónicos, actividad redox, unión de iones férricos

Lipoproteína asociada a peptidoglicana [ +8.084]: ASKKNLPNN;[ +3.394]: RTISYGNER 9.92 Si

Transporte de tolueno


externa

Proteína de invasión B [ +4.700]:KIDDTAGPN;[+2.813]:QETYQDWTV

8.98 Si Membrana

Cadena A de la superóxido dismutasa

Cu-Zn

[ +5.631]: ASAPDLTPG;[ +4.541]: ISKASLLSL

[ +4.923] : LLSLAAAGI

8.91 Si Membrana, transmembranal, membrana

externa

Co-chaperonina GroES [ +1.343]: TGPGKEVGT** 6.11 No Unión de iones, actividad redox

Tioredoxina C-1 [+10.205]:WAEWCGPK; [ +3.554]: MFKDGELA 4.53 No Transcetolasa Proteína de procesos metabólicos celulares, generación de mtabolitos precursores y

energía, proceso metabólico de nucleótidos

Lipoproteína de membrana externa [ +4.231]:VRRVESEAK 5.41 No Doblamiento de proteínas, chaperona de

unión, chaperona de actividad reguladora

Proteína HU de unión a DNA [ +1.540]: AEKGGLTKA** 9.77 No El primosoma Unión de DNA

Lipoproteína hipotética [ +2.847]: AGGAIIGGI 10.50 Si

Proteína hipotética BMEI0287 [+2.729]: RTAGYGVGG 9.02 Si

VI. RESULTADOS

- 30 -

VI. 5. Expresión de citocinas en BMDC.

Con el fin de explorar la posible función de las OMVs y la respuesta

inmunológica de las células del hospedero, se evaluó la expresión de citocinas

en BMDC inducidas por OMVs de la cepa lisa o rugosa de B. melitensis.

Los perfiles de citocinas estimuladas con OMVs de B. melitensis 16M

alcanzaron un máximo a las 12 horas post-estimulación con la mayor

producción de IL-6, IL-4, IL-10 e IL-17 (Figura 6A). En cambio, las citocinas

inducidas por las OMVs de la cepa rugosa alcanzaron una producción máxima

tempranamente a 1h post-infección y disminuyeron con respecto al tiempo a

excepción de IL-10 cuyo pico máximo de producción fue a las 3h post-

estimulación y para TNF cuya producción mantuvo en un nivel elevado a lo

largo del tiempo(Figura 6B).

Utilizando el análisis estadístico (Two-Way-análisis ANOVA), se determinó que

hay diferencias significativas entre el perfil de citocinas inducidas por las OMVs

entre ambas cepas. Se pudo comprobar que tres grupos de las citocinas fueron

significativamente más inducidas por las OMVs B. melitensis VTRM1 que por

las OMVs de la cepa lisa, que fueron IFN , TNF y la IL-12 (p <0.05, p <0.05 y

p <0.001, respectivamente).

VI. RESULTADOS

- 31 -

Figura 6. Expresión de citocinas de las BMDC estimuladas con OMVs. A) BMDC estimuladas con OMVs de B. melitensis 16M. B). BMDC estimuladas con OMVs de B. melitensis VTRM1. Se realizó el análisis de Two-Way- ANOVA para comparar los resultados. Gropos significativamente diferentes. * (p<0.05); ** (p<0.01); *** (p<0.001).

VI. RESULTADOS

- 32 -

VI. 6. Western Blot.

Se realizó el ensayó de Western Blot utilizando OMVs de B. melitensis 16M y el

suero de un paciente con brucelosis aguda y 1 suero de un individuo sano

como testigo negativo. Los resultados mostraron proteínas antigénicas de 10,

23, 30 y 66 kDa reconocidas por el paciente con brucelosis mientras que el

testigo negativo fue seronegativo (Figura 7) .

Figura 7. Western blot de las proteínas de las OMVs de B. melitensis 16M. Carril 1,

marcador de peso molecular preteñido; carril 2, OMVs de B. melitensis 16M empleando suero

de un paciente positivo a brucelosis; carril 3, testigo negativo empleando un suero de un

individuo sano.

VII. DISCUSIÓN

VII. DISCUSIÓN

- 33 -

Como previamente se había reportado, las OMVs son liberadas por cepas lisas

y rugosas de Brucella spp., en este trabajo reportamos el estudio de OMVs de

Brucella melitensis 16M, cepa lisa y VTRM1, cepa rugosa (Beveridge, 1999;

Gamazo et al., 1987; 1989.).

Como se puede observar en la micrografía de la figura 3, el blebbing o la

formación de las OMVs de Brucella, comienza con una curvatura en la

membrana externa, que aumenta de manera abrupta da lugar a la formación de

la vesícula y finalmente termina con su liberación al medio externo. Esta

observanción es congruente con lo propuesto por el modelo de formación y

liberación de las vesículas de membrana en las bacterias Gram negativas

propuesto por Kadurugamuwa et al., 1995. En las figuras 3C y 3D, podemos

observar que las vesículas liberadas por ambas cepas presentan la morfología

característica de las OMVs; forma esférica, con un diámetro entre 60 y 90 nm y

poseen una doble membrana que demuestra que estas son liberadas

directamente de la membrana externa y no como resultado de lisis celular. Los

resultados de la microscopía electrónica permitieron además comprobar que el

método de purificación empleado en este trabajo es adecuado para la

obtención de las vesículas de Brucella (Beveridge, 1999; Gamazo et al., 1989;

Kadurugamuwa et al., 1995; Khandelwal et al., 2003).

En los últimos años muchos de los reportes sobre OMVs se han enfocado en

el estudio de su composición, sin embargo, sobre el mecanismo de formación

y selección de proteínas que son transportadas por OMVS así como las

funciones fisiopatológicas, no se ha profundizado. La composición de las OMVs

provenientes de diferentes cepas bacterianas no es idéntico, por lo tanto los

elementos que intervienen en la formación y las diferentes que tienen la OMVs

es específico para cada una de estas bacterias.

VII. DISCUSIÓN

- 34 -

Para abordar estas observaciones, la identificación de las proteínas en las

OMVs es indispensable. La electroforesis unidimensional acoplada a

espectrometría de masas ofrece un enfoque de gran alcance para identificar los

componentes de la proteína en las OMVs. Sin embargo, sólo unos pocos

estudios de identificación de proteínas de OMVs utilizando esta metodología se

han reportado (Bauman et al., 2006, Ferrari et al., 2006; Lee et al., 2007; Nevot et al., 2006;

Post et al., 2005; Sidhu et al., 2008).

Por lo tanto, los estudios enfocados al análisis de la composición proteíca de

OMVs utilizando proteómica resultan de gran utilidad.

La electroforesis bidimensional (2D-PAGE) acoplada a espectrometría de masa

(EM) es una poderosa herramienta para dilucidar proteomas de una gran

variedad de muestras. Uno de los principales problemas encontrados en los

estudios de las proteínas de la membrana es la dificultad para solubilizar las

proteínas hidrofóbicas mediante soluciones incompatibles con la sub-secuente

separación y digestión del análisis de EM. Mientras que las proteínas

asociadas a membrana que pueden ser removidas a través de cambios en la

fuerza iónica o pH, la extracción de proteínas integrales de membrana con

múltiples dominios transmembranales requiere de una fuerte solubilización con

soluciones, ya que tienden a agregarse y precipitar en solución acuosa. Una

limitante que presenta la 2D-PAGE es el no poder resolver proteínas con alto

peso molecular, puntos isoeléctricos muy básicos o de las proteínas muy

hidrofóbicas (Lee et al., 2008; Tan et al., 2008).

En este trabajo nosotros utilizamos la electroforesis convencional

desnaturalizante (SDS-PAGE), acoplada a la cromatografía líquida y

espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Con lo cual se logró la

identificación de un total de 29 proteínas.

Dos de éstas fueron las pertenecientes a familia Omp25/Omp31 que son

proteínas principales de la membrana externa (Salhi et al., 2003).

VII. DISCUSIÓN

- 35 -

Boigegrain et al., identificó a la Om25 y a la Omp31 en OMVs de B. suis

mediante anticuerpos monoclonales. Se ha demostrado que Omp25 inhibe la

producción de TNF en macrófagos humanos y también participa en la

permeabilidad de la membrana de Brucella (Salhi et al., 2003). Si Brucella es

capaz de exportar Omp’s en las OMVs, entonces esto podría representa una

ventaja para evitar la secreción de algunas citocinas antes de interactuar con la

célula huésped y de esta manera facilitar la invasión (Caro-Hernández et al., 2007;

Guzmán-Verri et al., 2002).

Las proteínas de la familia Omp25/Omp31 del género Brucella mostraron

similitud con la proteínas de unión a hemina (Hpb), presentes en especies de

Bartonella; las proteínas Hpb desempeñan un papel en la capacidad del

organismo para la captura de hemina y del grupo hemo de su entorno (Carroll et

al., 2000). La expresión del gen hpbA de B. henselae en mutantes auxótrofas de

hierro de E. coli, permitió el transporte de grupos hemo abatiendo la auxotrofía

(Zimmerman et al., 2003). Sin embargo, el papel de la proteína de la familia

Omp25/Omp31 en la utilización del grupo hemo no se ha descrito.

Por otra parte, se ha visto que la Omp25 y Omp25c desempeñan un papel

Importante en la virulencia de B. ovis, y que la Omp31 desempeña un papel

importante la permeabilidad de la membrana externa. También se ha

demostrado que la Opm25d y Omp22 (presentes en las OMVs de B. melitensis)

podrían estar involucrados en la penetración y la supervivencia dentro de la

célula del hospedero. (Caro-Hernández et al., 2007; Guzmán Verri et al., 2002).

Otras proteína que se encontraron en las OMVs de Brucella fueron algunas

citoplásmicas, entre ella el factor de reciclaje de ribosomas (también llamado

antígeno CP24), chaperonas y proteínas de unión al DNA. La replicación del

DNA es un evento que involucra la unión de proteínas a la membrana. Por otro

lado-la traducción de los mRNA que codifican para las proteínas de membrana

externa se produce de manera simultánea con su integración dicha estructura

(Lee et al., 2008); esto puede explicar que dichas proteínas se encuentren en la

OMVs (Dorward , et al., 1989; Lee et al., 2007; Kadurugamuwa et al., 1995, Song et al.,

2008).

VII. DISCUSIÓN

- 36 -

Previamente se ha reportado que el antígeno CP24 fue reconocido por

anticuerpos presentes en sueros de ovinos infectados experimentalmente con

B. melitensis y se propuso que esta proteína podría ser utilizada para el

diagnóstico de brucelosis humana (Cassataro et al., 2002). En este caso en

particular, la exportación de esta proteína dentro de la OMVs podría ser una

razón por la cual esta proteína citoplasmática es reconocida por el suero de los

pacientes positivos para la brucelosis.

En nuestro estudio identificamos una proteína de membrana externa con motifs

de OmpA de la cual se ha reportado que posee actividades

inmunoestimulantes y es capaz de inducir la migración leucocitaria (Prasadarao et

al., 1996). La presencia de receptores dependientes de TonB como parte de las

OMVs indicaría que las vesículas podrían desempeñar un papel en la detección

de los nutrientes para importarlos hacia la bacteria. La presencia de la proteína

de la familia de receptores dependientes de TonB puede ser un mecanismo

alternativo para la supervivencia en condiciones de limitación de nutrientes (Lee

et al., 2008; Nevot et al., 2006).

En un estudio reciente en el que utilizaron macrófagos murinos infectados con

Brucella se demostró que en las primeras horas de infección, la disponibilidad

de sustratos es baja y que las proteínas asociadas con el metabolismo central

del carbono, el metabolismo del azúcar y los transportadores de tipo ABC

disminuyen su expresión. A las 20 h post-infección horas los transportadores

y las proteínas asociadas a transporte de nutrientes de la membrana interna y

externa incrementaron su expresión, indicando una movilización activa de las

moléculas a través de la envoltura celular. También se observó un aumento de

las proteínas receptoras dependientes de TonB que han sido implicados en la

internalización de sideróforos. Esto sugiere que la síntesis activa de sideróforos

y la captura de hierro no se produjo inicialmente sino poco después de la

invasión bacteriana, en una fase tardía, una vez que la bacteria había

comenzado a reproducirse en el retículo endoplásmico (Lamontagne et al., 2009).

VII. DISCUSIÓN

- 37 -

Basándose en estas conclusiones se puede especular que la continua

secreción de la OMVs antes y durante el proceso de infección, así como

durante su estancia dentro de la célula hospedera, puede proporcionar una

ventaja para la captura y la internalización de los nutrientes esenciales, tales

como azúcares y hierro que son limitado en el medio intracelular (Ko et al., 2003).

La proteína de invasión asociada al locus B (IalB) de Bartonella baciliformis, ha

demostrado tener un papel directo en la virulencia de dicha bacteria y se ha

demostrado que existen proteínas homólogas en otros grupos bacterianos

patógenos como lo es la proteína de invasión B (InvB) de B. melitensis. La

proteína InvB encontrada en las OMVs de B. melitensis muestra un alto valor

de similitud con la proteína IalB de B. quintana str. Tolouse (55.4%). Además,

también se encontró la proteína hipotética asociada a membrana (BMEII0692)

la cual se describe como una proteína de invasión asociada al locus B (también

identificada como parte de las OMVs de B. melitensis), y que presenta un alto

valor de similitud (62.4%) con la proteína IalB de Rhizobium leguminosarum

biovar trifolii, por lo que estas proteínas podrían contribuir a la invasión del

hospedero. (Coleman et al., 2001, 2003; Teixeira-Gómes et al., 2000).

En B. baciliformis la proteína IalB fue encontrada en la membrana interna, sin

embargo con el análisis in sílico realizado no se pudo establecer la localización

celular de InvB ni de la proteína hipotética asociada a membrana (Coleman et al.,

2001).

La Omp16 y la Omp19 son lipoproteínas que inducen protección inmunológica

muy similar a la provocada por la vacuna viva de B. abortus S19 con la

inducción de IFN y células TCD4+ y TCD8+ (Pasquevich et al., 2009). Asimismo,

la Omp16 muestra una similitud significativa con la lipoproteína asociada a

peptidoglicana (PAL) de muchas bacterias Gram negativas (Tibor et al., 1999). Por

lo que podríamos sugerir que la Omp16 está involucrada en la biogénesis de la

OMVs, ya que se ha demostrado que la producción de las OMVs se ve

afectada (aumenta de manera significativa) en bacterias en donde se realiza la

mutación de las proteínas PAL (Bernadac et al., 1998; McBroom et al., 2006).

VII. DISCUSIÓN

- 38 -

Las OMVs de B. melitensis 16M contienen a la superóxido dismutasa

dependiente de Cu-Zn (SOD), la proteína Dps y GroES, proteínas que forman

parte del sistema de defensa antioxidante que protege a las bacterias de los

efectos tóxicos de la radicales libres del oxígeno (RLO). La presencia de la

SOD en las OMVs podría representar otra ventaja para el agente patógeno

intracelular. Se ha descrito la incapacidad de algunos de los intermediarios

reactivos del oxígeno como O2- de eliminar a algunos patógenos, y tomando en

consideración que SOD es de localización periplásmica, sería posible que la

enzima protegiera a las bacterias del superóxido de origen exógeno (Gee et al.

2005; Ko et al., 2003).

Por otra parte el papel de la proteína de Dps no es del todo claro, sin embargo

se ha reportado, en otros patógenos como Escherichia coli y Campylobacter

jejuni, así como en Salmonella enterica, como una proteína de estrés oxidativo,

con capacidad de proteger el DNA en contra de RLO. Esta proteína presenta

un dominio de tipo ferritina (Tabla 2) y se cree que puede anular la combinación

tóxica de Fe (II) con el peróxido (Halsey et al., 2004; Ishikawa et al., 2003).

GroES es una proteína chaperona (proteína de choque térmico) que participa

en el plegamiento de proteínas. También ha sido descrita como una proteína

antigénica que produce la inducción de las células TCD4+ y la producción de

IL-2 e IFN en un modelo animal (Oliveira et al., 1996).

En general se ha observado que las OMVs están enriquecidas de proteínas de

membrana externa y periplásmicas, mientras que las proteínas de membrana

interna y de las citoplasmáticas se encuentran en menor proporción o ausentes

(Lee et al., 2007; Post et al., 2005). En este sentido, nosotros realizamos una

comparación de los porcentajes de proteínas presentes en OMVs de diferentes

bacterias Gram negativas, incluidos los resultados de las OMVs de B.

melitensis (Figura 5).

VII. DISCUSIÓN

- 39 -

La observación más general es que existen diferencias en la composición de

proteínas de las OMVs de las diferentes bacterias. La inclusión de

determinadas proteínas en las OMVs no parece estar en función de su

abundancia, por ejemplo en el caso de Escherichia coli varias proteínas de baja

abundancia fueron identificadas en OMVs, mientras que algunas de las

proteínas que expresan de forma abundante no estuvieron presentes (Lee, et al.

2008). En el caso del patógeno de plantas, Xanthomonas campestris, un

número importante de factores de virulencia se expresan en la membrana

externa, pero sorprendentemente no todos ellos se encuentran en las OMVs

(Sidhu et al., 2008). Cuando se compara la composición de OMVs de diferentes

bacterias Gram negativas, es interesante observar que existen diferencias en el

tipo de estas proteínas. Como otros autores han sugerido, se puede especular

que existe un mecanismo de selección que regula que proteínas serán

transportadas en las OMVs y que probablementes dirija la producción de OMVs

en sitios específicos.

Estudios recientes muestran que las OMVs de Salmonella poseen importantes

propiedades proinflamatorias y antigénicas similares a los que ha mostrado la

bacteria completa. Las OMVs de Salmonella fueron capaces de estimular

macrófagos y células dendríticas aumentando la expresión de MHC-II y CD86

así como la producción mediadores proinflamatorios como NO (óxido nítrico),

TNF e IL-12 (Alaniz et al., 2006). Basándose en estos resultados, se utilizaron

OMVs purificadas de Brucella melitensis 16M una cepa lisa y B. melitensis

VTRM1, una cepa mutante rugosa. Se examinó la capacidad de las OMVs

para estimular la respuesta inmunológica en células dendríticas derivadas de

médula ósea de ratón (BMDC). Los resultados mostraron que el perfil de

citocinas inducidas por la OMVs de B. melitensis VTRM1 (IFN , TNF y la IL-

12) fue significativamente diferente del perfil observado por BMDC estimuladas

por OMVs de la cepa lisa. Las citocinas producidas por OMVs de la cepa

rugosa se indujeron en una fase temprana de la estimulación y corresponden a

citocinas de las respuesta de tipo Th1, responsables para la eliminación de la

bacteria (Dornand et al., 2002).

VII. DISCUSIÓN

- 40 -

Los resultados demostraron una producción de la IL-12, IFN y TNF por

OMVs de la cepa mutante rugosa (Figura 6B).

El TNF es necesario para la completa expresión de las actividades

macrofágicas anti-Brucella. También juega un papel importante en la activación

de la inmunidad específica contra varios patógenos intracelulares y controla

positivamente la producción temprana de IL-12 e IFN en ratones infectados

por Brucella (Oliveira et al., 2008). Es evidente que el TNF participa en el

establecimiento de la inmunidad adquirida de la respuesta Th1, con la

generación de IFN reclutando y activando células CD4+ y CD8+ citotóxicas,

ambos mecanismos son fundamentales para la muerte completa de Brucella.

También se ha demostrado que el TNF produce un efecto sinérgico en

presencia de IFN para la liquidación definitiva de la infección (Dornand et al.,

2002).

Por otro lado, también se puede apreciar la inducción temprana de IL-6, IL-23 y

TGF en BMDC estimuladas con la OMVs de B. melitensis VTRM1, mientras

que las mismas citocinas en el caso de BMDC estimuladas con OMVs de B.

melitensis 16M se produjeron en una fase tardía alcanzando un pico máximo a

las 12h post-estimulación. Podríamos especular que estas diferencias

significativas podría ser el efecto de la cadena O en el LPS presente en la

OMVs de la cepa lisa, y ausentes las OMVs de B. melitensis VTRM1. En este

sentido se ha reportado de que el LPS actúa como un modulador de la

respuesta inmune (Fugier et al., 2007).

Las células dendríticas (DC) son componentes críticos de la inmunidad

adaptativa y son altamente susceptibles a la infección por Brucella, la bacteria

evita el proceso de maduración y entorpece su capacidad de presentar

antígenos. En contraste con la infección con bacterias lisas y LPS purificado, la

infección de DC con cepas rugosas de Brucella conduce a la maduración y al

fenotipo funcional de las DC.

VII. DISCUSIÓN

- 41 -

Las DC infectadas con cepas rugosas de Brucella adquieren la capacidad de

producir IL-12 y estimular células TCD4+,lo que sugiere una intervención del

LPS en el proceso de activación y maduración de las DC (Billard et al., 2007).

También es posible que la ausencia de LPS de la cepa rugosa permita una

mejor exposición de las proteínas de la membrana externa, por ejemplo, es

bien sabido que Omp19 y Omp16 las cuales fueron identificadas como

componentes de las OMVs de B. melitensis, interactúan con el receptor de tipo

TLR2 de la célula del hospedero e inducir la producción de IL-12, la cual es

importante para el control de la infección (Oliveira et al., 2008).

El perfil de citocinas expresado por las BMDC en presencia de OMVs de la

cepa rugosa, con una tendencia a una respuesta de tipo Th1 nos sugiere que

muy probablemente estas OMVs podrían ser un buen candidato para la

preparación de vacunas, como ya lo han reportado en otras bacterias Gram

negativas (Katial et. Al., 2002).

Por último se realizó la identificación de las proteínas antigénicas presentes en

las OMVs de B. melitensis, observando proteínas que van de 66 a 10 kDa

(Figura 7). En base a los pesos moleculares de las proteínas antigénicas

identificadas se podría inferir cuales son las proteínas que son reconocidas por

los sueros de los pacientes y son las responsables de la antigenicidad (Tabla

A). Esto puede ser de gran utilidad en el desarrollo de nuevas pruebas para el

diagnóstico de la brucelosis, tal como el uso de la proteína BP26 empleada en

el diagnóstico de la brucelosis caprina (Seco-Mediavilla et al., 2003)

VII. DISCUSIÓN

- 42 -

Este es el primer estudio que utiliza la electroforesis unidimensional acoplado a

espectrometría de masas para identificar las proteína presentes en las OMVs

liberadas por la bacteria intracelular, Brucella, que no sólo puede ayudar a

aclarar los mecanismos que dan lugar a estas vesículas, sino también las

posibles interacciones entre bacterias y las células del hospedero.

VIII.CONCLUSIONES

VIII.CONCLUSIONES

-43-

Por medio del SDS-PAGE acoplado a LC-MS/MS, se lograron identificar

29 proteínas presentes en las OMVs de B .melitensis 16M.

Se identificaron proteínas de membrana externa, proteínas del

periplasma, intermembranales, extracelulares y proteínas citoplásmicas.

De acuerdo a los motifs identificados las proteínas de las OMVs se

clasificaron como proteínas de: transporte, involucradas en laintegridad

de la membrana, involucradas en procesos metabólicos, respuesta ante

el estrés y proteínas de invasión.

La expresión de citocinas de las BMDC estimuladas con las OMVs de B.

melitensis VTRM1 se dio en una fase temprana post-estimulación en

comparación con las céluas estimuladas con las OMVs de la cepa lisa,

por lo que se puede inferir una participación del LPS en la regulación de

la respuesta inmune.

Se observó que las OMVs de B. melitenis VTRM1 indujeron la expresión

de citocinas de tipo Th1.

Se identificaron algunas de las proteínas antigénicas presentes en las

OMVs de B. melitensis 16M cuyos pesos moleculares fueron de 66, 30,

23 y 10 kDa.

IX. BIBLIOGRAFÍA

IX. BILIOGRAFÍA

- 44 -

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