Enzimas de estricción
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Digestión de ADN usando Enzimas de Restricción
Dr. Jesús Lee-Borges
Dra. Liza Jiménez
Dr. José M. Planas
Dr, Jose A. Carde-SerranoUniversidad de Puerto Rico - Aguadilla
Objetivos
Repasar conceptos basicos de enzimologia Conocer sobre enzimas de restriccion Usar enzimas de restricción para cortar el ADN. Electroforesis. Separar los fragmentos usando electroforésis. Analizarán un gel con ADN cortado con diferentes
enzimas de restricción.
Historia
1968 – Descubiertas por Werner Arber
1969 – Enzimas de restricción tipo II identificadas por Hamilton O. Smith. Daniel Nathans, ayudo avanzar la técnica de recombinación del ADN (primer mapa genético usando enzimas de restricción).
Premio Nobel en Fisiología/Medicina 1978.
Enzimas de Restricción
Diferentes tipos– Tipo I – Reconoce secuencias especificas y cortan el DNA
en sitios no específicos > de 1,000 pb– Tipo II – Reconoce secuencias palindrómicas y cortan
dentro de la secuencia– Tipo III – Reconocen secuencias especificas de 5-7 pb y
cortan de 24-27 pb “down stream” del sitio Las enzimas de restricción Tipo II son las mas utilizadas en la
biotecnología ya que reconocen y cortan dentro de las secuencias especificas
Enzimas de restricción
También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a partir de una secuencia que reconocen.(exonucleasas?)
La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica (secuencia que se lee igual en ambas direcciones).
Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre en la célula.
Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII, EcoRI, y Kpn I toman el nombre de las bacterias que la producen:
– EcoRI: E = género Escherichia. co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Enzimas de Restriccion
•Llamadas enzimas de restricción porque restringen la Llamadas enzimas de restricción porque restringen la actividad de bacteriófagos actividad de bacteriófagos •““Sistema inmunológico” de las bacterias Sistema inmunológico” de las bacterias •Metilasa reconoce la misma secuencia en el DNA de la bacteria y lo metila•enzimas de restricción solo atacan secuencias no metiladas (“restriction/modification systems”)
Enzimas de Restricción
• Se han identificado cientos de enzimas de restricción.
• Mayoría reconocen secuencias palindrómicas
• Pueden producir cortes abruptos o pegajosos.
Las enzimas de restricción al cortar DNA pueden producir dos tipos de cortes:
Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada en dos puntos diferentes.
Abruptos o truncados: cortan en un sólo punto.
Algunas enzimas de restricción
Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTTSac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGG
Xma I 5'-C | CCGGG Bam HI I 5'-G | GATCC Pst I I 5'-CTGCA | G
Bases Teóricas de enzimas de restricción
La actividad de las enzimas de restricción depende de unas condiciones precisas :
pH Temperatura Concentración de sal Iones
Una unidad enzimática (u) se define como la cantidad de una enzima requerida para digerir 1 ug de DNA bajo condiciones optimas:
3-5 u/ug de ADN genómico 1 u/ug de ADN plasmico
Reacción enzimática
Buffer (10X) 2 μL DNA (1 μg) 1 μL Enzimas 2 unidades H2O _________
20 μL Volumen total
Enzimas: BAM HI, ECO RI, HIN DIII, KPN I,
¿Qué es la electroforesis de gelatina?
Es un proceso para separar una mezcla de moléculas a través de un material estacionario (“gel”) en un campo eléctrico.
Historia
1933 - la técnica fue introducida por Tiselius 1959 - el “gel” policridamida fue introducido
por Raymond y Weintraub 1975 - la electroforesis de dos dimensiones
fue anunciada por P. H. O’Farrell
Geles comúnmente usados:
Agarosa: polisacárido extraído de algas. – No tóxico. – Poco poder de resolución pero alto grado de separación. – Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb.
Poliacrilamida: polímero de acrilamida. – Tóxico. – Menor grado de separación pero alto poder de resolución. – Usado para fragmentos de DNA de 500 pb.– Usado para separar mezclas de proteínas.
Marcadores de Peso Molecular
Son usualmente una mezcla de ADN con pesos moleculares conocidos.
Son usados para estimar los tamaños de los fragmentos de ADN en una muestra de ADN.
Sistema de Amortiguadores
TBE vs TAE– TBE: DNA < 1kb
Mejor resolucion Alta capacidad de amortiguador
– TAE: DNA > 12 kb Menor capacidad amortiguador Para DNA q se va a recobrar
Continúa. Discontinúa.
Preparación del “gel” Agarosa (Cont.)
Tiene que pesarse y ser mezclada con el disolvente– Gel agarosa 1%
1.0 g agarosa 99.0 ml 1X TAE
Preparación del “gel” Agarosa (Cont.)
Como la agarosa no es soluble con el amortiguador a temperatura ambiente tiene que ser hervida.
Preparación de gel:
La mezcla de agarosa y buffer tiene que ponerse a calentar, agitando frecuentemente hasta que llegue al punto donde comience a hervir.
Una vez que el frasco con la agarosa ya pueda tocarse sin quemarse, servir con cuidado la mezcla en la bandeja.
Dejar que se torne opaco y sólido.
Preparación de gel:
Cuando el gel solidifique y se torne opaco, sacar la peinilla y poner gel en cámara de electroforésis con fosas del lado del polo negativo.
Proceder a pipetear las muestras en las fosas.
Correr gel. Teñir.
Aparato de “gel” (Cont.)
Práctica de uso de micropipetas:
Apoye brazo que esté agarrando micropipeta en superficie firme.
Utilice la mano contraria para apoyar la micropipeta
Introduzca punta de micropipeta dentro de fosa, sin tocar el gel
Vierta el contenido en fosa, presionando botón de la pipeta hasta primer punto de resistencia
Organización del gel cargado con λ ADN/Enzimas de restricción
Mar
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A B C D E FMarcador λ DNA/Eco RI