METODOS Y TECNICAS DE MICROBIOLOGIA I

Clase 11

ENTEROBACTERIAS

• Gran familia de bacilos o cocobacilos Gram- Aerobios y/o Anaerobios facultativos.

CLASIFICACION

• Familia (Sección VIII): Enterobacteriaceae y Vibrionaceae, normalmente la clasificación esta en función de los caracteres en las pruebas bioquímicas.

• Así como su propiedades antigénicas.• Las CARACTERÍSTICAS mas importantes son:1. Bacilos o cocobacilos Gram –2. Aerobios y Anaerobios facultativos

3. De 1 a 4 micra de longitud.4. Pueden ser móviles (peritrica) o inmóviles5. No producen Citocromo Oxidasa6. Fermentan de los hidratos de carbono en todos los

casos, presentan metabolismo fermentativo-oxidativo.7. Reducen los nitratos a nitritos8. Fermentan otros azucares y alcoholes produciendo

acido y gas.9. Pueden producir algunos SH2 (Proteus)10. Otros producen Indol como la E. coli (Identificación)11. Semejante a las Vibrionaceae 12. Pueden producir gran cantidad de fermentos

(gelatinasas, descarboxilasas, ureasas, galactoxidasas y desaminasas).

Donde las encontramos: • Huéspedes normal del tracto gastrointestinal• Algunos son patógenos de virulencia variable • Son saprofitos de la flora gastrointestinal y

cuando el huésped se lo permite convirtiéndose en oportunistas.

• En algunas también se les puede encontrar en el agua, plantas y en el suelo.

CARACTERISTICAS ANTIGENAS

• Se sabe que existen distintos antígenos asociados.• Antígeno somático o antígeno O, son

termoestables ligados a la pared de la bacteria, esta es una endotoxina (poder antígeno)al igual que la parte lipídica responsable de la toxicidad.

• Antígeno capsular o antígeno K, se encuentra en la capsula con propiedades antifagocitarias

• Antígeno flagelar o antígeno H, en cepas móviles, de carácter proteico que le da el carácter bacteriano.

• ENDOTOXINA: Son productos toxicos que no son vertidos al medio externo pero son responsables en muchos casos de alteraciones vasculares y fiebre.

• ENTEROTOXINAS: Son productos tóxicos que son vertidos al medio externo ejerciendo una acción altamente toxica y directa sobre las células, ejm. Shigella y E. coli responsable a nivel de epitelio intestinal.

ESPECIE EFECTO PATOGENO HABITAT

Shigella sonnei Disentería bacilar Hombre

Escherichia coli Patógeno producción de diarrea

Hombre

Salmonella tiphy Fiebre tifoidea Hombre

Salmonella enteritidis Gastroenteritis Hombre

Klebsiella sp. Patógeno oportunista Hombre

Enterobacter aerogenes Patógeno oportunista Hombre

Citrobacter sp. Patógeno oportunista Hombre

Serratia Patógeno oportunista Hombre

FLORA ENTERICA: E. coli, Klebsiella, Proteus, Enterobacter.

PATOGENOS PRIMARIOS INFECCIONES SISTEMICAS: Yersenia pestis

Salmonella ENTERITIS: E. coli

Salmonella Shigella

INFECCIONES URINARIAS: E. coli, Klebsiella, Proteus HERIDAS: E. coli, Klebsiella RESPIRATORIAS: Klebsiella pneumoniae INFECCIONES NOCOSOMIALES: Enterobacter, Serratia

y E. coli.

CAPACIDAD DE LA FERMENTACION DE LA LACTOSA

ENTEROBACTERIAS FERMENTADORAS RAPIDAS (COLIFORMES) :

• Escherichia, Enterobacter y KlebsiellaENTEROBACTERIAS FERMENTADORAS LENTAS DE

LACTOSA (COLIFORMES)• Citrobacter, Yersenia, Hafnia y Shigella sonneiENTEROBACTERIAS NO FERMENTADORQS (NO

COLIFORMES)• Salmonella, Shigella, Proteus, Morganella,

Providencia y Edwardsiella.

MODOS DE IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS

• Es necesario partir de pruebas directas, un aislamiento en medio de cultivo y una identificación bacteriana a través de pruebas bioquímicas.

• Tras recoger la muestra se realiza una prueba directa como la TINCION GRAM que en caso sea positivo deberá ser Gram –

• Luego pasamos a cultivos específicos que incluye medios selectivos que inhiban el crecimiento de bacterias Gram +

MEDIOS USADOS PARA ENTEROBACTERIAS

a) Medio EMB (eosina azul de metileno)b) Medio agar o caldo de McCONKEYc) Medio XLD (xilosa-lisina-desoxicolato)

patógenosd) Medio Wilson-Blair para salmonellae) Medio SS (aislamiento de salmonella Shigella)f) Medio agar lactosado con purpura de

bromocresol (aislar coliformes)

g) Medio caldo bilis y verde brillante (aislar coliformes).

h) Medio agar desoxicolato-citrato-lactosa-sacarosa (DCLS) (aislar salmonella-shigella)

i) Agar desoxicolato-citrato para enterobacterias patógenas.

j) Medio agar endo y Medio agar Hektoen (aislar enterobacterias patogena).

k) Caldo selenito F, (aislar salmonella)

Agar Sulfito Bismuto :  SBAgar Salmonella-Shigella : SS

Agar Xilosa, Lisina, Desoxicolato:  XLD Agar XLD

Agar Eosina Azul de Metileno:  EMB.

Agar Rojo de Violeta con Bilis y Dextrosa,: VRBD.

Agar Mac Conkey: MC

Las pruebas bioquímicas de enterobacteriasoxidasa

Indol Rojo metilo

Citrato SH2 Ureasa Mov.22ºC

Gela-tina

Lisina

Argini-na

Escherichia - + + - - - +/- - d d

Shigella - +/- + - - - - - - +/-

Edwardsie lla - + + - + - + - + -

Salmonella - - + d + - + - + +

Arizona - - + + + - + + + +

Citrobacter - - + + +/- d + - - d

Klebsiella - +/- - + - + - - + -

Enterobacter - - - + - - + +/- + -

Serratia - - +/- + - d + + + -

Proteus vulgaris

- + + d + + + + - -

Ornitina

Fenila lanina

Gas Sorbi tol

Lacto sa

Inosi tol

Rafio sa

Ram nosa

Arabi nosa

Mani tol

Escherichia D - + + + - D D + +

Shigella D - - D - - D D D +/-

Edwardsiella + - + - - - - - - -

Salmonella + - + + - D - + + +

Arizona + - + + D - - + + +

Citrobacter D - + + D - D + + +

Klebsiella - - + + + + + + + +

Enterobacter + - + + + + + + + +

Serratia + - + + +/- D - - - -

Proteus vulgaris

- + +/- - - +/- - - - d

GENERO SALMONELLA

• Características: a) Son GRAM -b) Móviles con flagelación peritrica (no pertenece al grupo de

los coliformes)c) No fermenta la lactosad) No produce desaminasase) Carácter mas o menos patógeno.f) Forma bacilar.g) Provoca infecciones febriles de carácter entérico, tipo

gastrointestinal o enterocolitis , fiebre tifoidea o paratifoideas.

ACCION PATOGENA :• El genero Salmonella es característico el antígeno

de pared o antígeno O, al antígeno H o flagelar y el antígeno VI que es un antígeno termolábil de la S. typhy y s. paratyphi, le confiere un poder protector frente a los ácidos y antifagocitarias.

• Presentan ENDO Y EXO toxinas responsables de efecto irritante y citotóxico sobre el tracto intestinal.

• GENEROS SALMONELLA PATOGENOS AL HOMBRE:S. typhiS. Paratyphi A y BS. enteritidis QUE GENERAN:• Infecciones entéricas, tipo fiebres tifoideas o

paratifoideas, que pueden producir septicemias y se localizan en las vísceras.

• Infecciones gastrointestinales, tipo gastroenteritis o enterocolitis.

TEST DE WIDAL PARA SALMONELLA

• La reacción de Widal demuestra la presencia de anticuerpos aglutinantes (aglutininas) contra los antígenos H (flagelar) u O (somático) de la Salmonella typhi en el suero de los pacientes con fiebre tifoidea.

• Los anticuerpos contra el antígeno O aparecen luego de 6 a 8 días de iniciada la enfermedad y desaparecen posteriormente entre 3 y 6 meses.

• Los anticuerpos contra el antígeno H aparecen a los 8 a 12 días, alcanzando títulos más elevados con respecto a los anti-O y pueden persistir por más de 1 año. Los anticuerpos contra el antígeno Vi aparecen más tardíamente, a la tercera semana, sin embargo lo hacen en títulos bajos 1:10-1:20 con respecto a los previos

INTERPRETACIONES CLINICAS DE LAS REACCIONES DE WIDAL

• Un diagnóstico de fiebre tifoidea puede considerarse si los títulos iniciales se cuadruplican entre una y cuatro semanas. Sin embargo, el clínico no puede esperar este tiempo para establecer un tratamiento.

• En general, hay que tener en cuenta la fiebre tifoidea con títulos:

Anti-O≥1:160-200 y/o H≥160-200 en zonas endémicas;

Anti-O ≥1:50-100  en zonas no endémicas, se debe pensar con títulos más bajos .

REACCIONES SEROLOGICASReacciones bioquímicas

Reacciones serológicas

Interpretación

TIPICA Antígeno O, VI o H positivo

Cepas consideradas como salmonella

TIPICA Todas las reacciones positivas

TIPICA No probada Puede ser Salmonella

REACCIONES ATIPICAS Antígeno O, VI o H positivo

REACCIONES ATIPICAS Todas las reacciones negativas

No debe ser consideradas salmonella

ENREQUECIMIENTO SELECTIVO DE MEDIOS PARA SALMONELLA

• El enriquecimiento selectivo está destinado a inhibir la flora acompañante. Al estar adicionados de substancias químicas inhibidoras y sumado a los tiempos y temperatura de incubación óptimas permite su desarrollo por sobre otros microorganismos, lo que se confirma en los medios selectivos elegidos o por otras pruebas de identificación.

• Normalmente el rango de Tº de incubación va de 35ºC a 43ºC por períodos de 16 a 24 h. 

• Comúnmente los caldos selectivos usados son selenito con cistina (SC), verde brillante, tetrationato (TT), y el caldo cloruro de magnesio-verde malaquita (RV)

COLONIAS TIPICAS DE SALMONELLA EN MEDIOS SOLIDOS SELECTIVOS

MEDIO SELECTIVO COLOR ANTES DE LA INOCULACION

CARACTERISTICA DE LAS COLONIAS

Agar Verde Brillante (VB)

Oscuro, color marrón Rosas o rojas pueden ser transparentes, rodeadas de medio enrojecido. Las bacterias fermentadoras de lactosa son amarillas

Agar sulfito Bismuto (SB)

Opaco, verde pálido Café, grises o negras; con o sin brillo metálico . Algunas veces presencia de halo café o negro

Agar Xilosa Lisina (XLD)

Claro, color rojo brillante Rosas o rojas pueden ser transparentes, con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras

Agar para salmonella y Shigella (SS)

Claro, color rosa Translúcidas en ocasiones opacas. Algunas con centro negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojas.

Agar entérico de Hoktöen

Oscuro, color verde Verdes o azul verdes con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras

IDENTIFICACION

• En los procedimientos de identificación final es recomendable que los cultivos con colonias poco aisladas o con variedad de flora realizar un re-aislamiento en un agar nutritivo y posteriormente sembrar en TSI y LIA además de MIO.

• En general Salmonella es negativa a las pruebas de, ureasa, indol, lactosa y sacarosa y positiva a las pruebas de descarboxilación de lisina y ornitina,

• También como generalmente producen H2S, pero existen variantes atípicas con reacciones positivas a lactosa o no descarboxilación de lisina.

Identificación bioquímica de salmonellaMEDIO RESULTADO COLOR ANTES DE

INOCULAR/INCUBARCOLOR DUSPUES DE INOCULAR/INCUBAR

Klinger F. glucosa + NARANJA Fondo tubo amarillo crecimiento

Klinger F. Lactosa - NARANJA Pico de flauta naranja crecimiento

Klinger GAS + NARANJA Salvo S. typhi presencia de gas

Klinger SH2 + NARANJA Ennegrecimiento crecimiento

Agar Lia F.glucosa + PURPURA SUAVE Fondo tubo amarillo crecimiento

Agar Lia H2S + PURPURA SUAVE Ennegrecimiento crecimiento

Medio SIM: Indol - AMARILLO TENUEsemisólido translucido

Con reactivo de Kovac’s formación de anillo rojo superf.

Medio SIM: H2S + AMARILLO TENUEsemisólido translucido

Ennegrecimiento crecimiento

Medio SIM movilidad

+ AMARILLO TENUEsemisólido translucido

Crecimiento en superficie y picadura, turbiedad/difusion fuera de la picadura

MEDIO RESULTADO

COLOR ANTES DE INOCULAR/INCUBAR

COLOR DUSPUES DE INOCULAR/INCUBAR

TSI FERMENTACIONGLUCOSA

+ ROJO/ROSADO amarillo en el fondo por acidificación del medio

TSI FERMENTADORA LACTOSA

- ROJO/ROSADO Se observa un rojo mas intenso por la no fermentación

TSI FERMENTADORA SACAROSA

- ROJO/ROSADO Se observa un rojo mas intenso por la no fermentación

TSI H2S + ROJO/ROSADO Se observa cambio de color a amarillo con colora ennegrecida a lo largo de la punción

PRUEBA DE URERASA

+ ROJO/ROSADO Vire a purpura

FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO, MUERTE Y/O SOBREVIVENCIA DE

SALMONELLAS

El mínimo de pH es de 3.8. Cuando el pH excede el óptimo, el crecimiento disminuye.

SOBREVIVENCIA DE LA SALMONELLA

• Aún cuando no forman esporas ellas sobreviven largos períodos en alimentos y otros sustratos.

• En mantequilla mantenida entre temperatura de -23ºC puede sobrevivir más allá de 10 semanas.

• En leche almacenada a temperatura ambiente puede sobrevivir 6 meses.

• En vegetales sobrevive 28 días a 2º-4ºC y mucho más a temperatura ambiente.

• Su sobrevida en chocolate deshidratado con aw entre 0.32-0.41 puede prolongarse por meses y sobrevive bien en superficies como cerámica, vidrio y en la piel.

LACTOSA + Coliforme Prueba IMVIC

Enterobacterias:GRAM –

OXIDASA – LACTOSA - O/F +. Medio McConkey o SS

• KLINGER

• FAD(Fenilalanina-desaminasa)

ONPG - + PROTEUS (BETA GALACTOSIDASA)Posible salmonella

Estudien para que no se extingan