Ensayos Ensayos de Potencia Potencia para para …new.paho.org/hq/dmdocuments/2010/M Ibarz...
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EnsayosEnsayos de de PotenciaPotencia parapara VacunasVacunasempleandoempleando
CultivosCultivos CelularesCelulares
MSc.MARIAMSc.MARIA TERESA IBARZ M.TERESA IBARZ M.Jefe DivisiJefe Divisióón Control Nacional n Control Nacional
Productos BiolProductos Biolóógicosgicos
Se desarrollSe desarrollóó a finales del siglo XIX como una a finales del siglo XIX como una continuacicontinuacióón de las tn de las téécnicas de Embriologcnicas de Embriologííaa
Wilhem Roux mantuvo en el aWilhem Roux mantuvo en el añño 1885, o 1885, ccéélulas de embrilulas de embrióón de pollo en solucin de pollo en solucióón salina n salina durante unos ddurante unos dííasas
CultivosCultivos CelularesCelulares
El zoEl zoóólogo Americano logo Americano R.GR.G. Harrison (1907) es . Harrison (1907) es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animalesanimales
EEstablecimientostablecimiento de las primeras lde las primeras lííneas celulares neas celulares ((HeLaHeLa y cy céélulaslulas--L de ratL de ratóón)n)
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
Uno de los mayores problemas para el Uno de los mayores problemas para el establecimiento de los cultivos celulares es la establecimiento de los cultivos celulares es la
apariciaparicióón de mn de múúltiples contaminacionesltiples contaminaciones
Rous y Jones, 1916 emplearon por vez primera vez Rous y Jones, 1916 emplearon por vez primera vez tripsina para disociar las ctripsina para disociar las céélulas de embriones de lulas de embriones de
pollo, estableciendo el primer cultivo celular.pollo, estableciendo el primer cultivo celular.
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
Aplicaciones:- Diagnóstico- Virología y producción de vacunas virales- Investigación del cáncer- Producción de proteínas
- Estudios de toxicidad- Producción tejidos, piel para transplantes- Aplicaciones industriales y agrícolas
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
VIROLOGVIROLOGÍÍA A
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
Virus VIH
ProducciProduccióón Vacunas n Vacunas ViralesVirales
Fiebre AmarillaFiebre AmarillaSarampiSarampióónn
Animal completo O Cultivo Primario
SUSPENSION VIRALSUSPENSION VIRAL
ProducciProduccióón n Vacunas ViralesVacunas Virales
Línea Celular
SUSPENSION SUSPENSION VIRALVIRAL
PURIFICACIONPURIFICACION
FORMULACIONFORMULACION
AtenuadaInactivada/Inactivada/FraccionadaFraccionada
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
DIAGNOSTICODIAGNOSTICO
Cuantificación de virus
1) Microscopía Electrónica
2) Efecto sobre la célula hospedadora (Unidad vírica infectiva)
• Formación de placas de lisis
• Efecto Citopático
• Efecto no Visible:
• Hemaglutinación
• Inmunoflorescencia
• Tinción
Cuantificación de virus
POTENCIA VACUNA POTENCIA VACUNA VIRAL ATENUADAVIRAL ATENUADA
Cuantificación de Virus
POTENCIA VACUNA POTENCIA VACUNA VIRAL ATENUADAVIRAL ATENUADA
LINEA CELULAR LINEA CELULAR SUCEPTIBLESUCEPTIBLELIBRE DE AGENTESLIBRE DE AGENTESADVENTICIOSADVENTICIOS
Determinación del Efecto Citopático
Dosis Infectiva Cultivo Celular 50(DICC50)
Ventajas• Control del medio ambiente
• Homogeneidad. Morfología y Composición uniforme.
• Se pueden hacer réplicas idénticas, superando la heterogeneidad de animales de experimentación.
PRUEBAS EN CULTIVOS PRUEBAS EN CULTIVOS CELULARESCELULARES
• Economía en el uso de reactivos o Vacunas a estudiar. Emplea volúmenes reducidos
• Motivaciones Eticas
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
•• TTéécnica sensiblecnica sensible
•• Crecimiento cCrecimiento céélulas animales mucho mlulas animales mucho máás s lento que los contaminantes mlento que los contaminantes máás habituales s habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas,...) (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas,...)
•• OrganimosOrganimos pluricelulares requieren compleja pluricelulares requieren compleja mezcla de nutrientes, que simula el plasma o el mezcla de nutrientes, que simula el plasma o el fluido intersticial. fluido intersticial.
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
Desventajas
•• Condiciones de asepsia en todo Condiciones de asepsia en todo momentomomento
•• Instrumental y personal calificado para Instrumental y personal calificado para su manipulacisu manipulacióónn
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
• Cantidad y costo: 1 g Cultivo Celular es 10 veces más costoso que el animal.
• Inestabilidad.
Dotación cromosómica aneuploide
Diferencias significativas entre generaciones
Se emplean por determinado número de generaciones
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
Patron Regional de Vacuna Antiamarilica. Lote: 003Comportamiento año 2004
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Nº Determinaciones
Log
10D
L 50 /
0,5
ml
Log 10DL50 / 0,5ml
PATRPATRÓÓN VACUNA ANTIAMARILICAN VACUNA ANTIAMARILICA
MEDIAARITMETICA
LIMITE SUPERIOR
LIMITE INFERIOR
GRAFICAS DE CONTROL
CONTROL ESTADCONTROL ESTADÍÍSTICO DE PROCESOSSTICO DE PROCESOS
Patrón Regional de Vacuna Antipoliomielitica Oral. Lote: SVI/OPV 001 III/96.Comportamiento "Polio Total" año 2004
4,0
4,4
4,8
5,2
5,6
6,0
6,4
6,8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17Nº Determinaciones
log 1
0 DIC
C 50/ 0
,1m
l
DICC50 /0,1 mL LSC= 6,35 LIC=5,15 LC=5,75
CONTROL ESTADCONTROL ESTADÍÍSTICO DE PROCESOSSTICO DE PROCESOS
GRAFICAS DE CONTROL
Calificación de Analistas:
Guías emitidas por la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) documentos Q2A5 y Q2B6
RESULTADOS CALIFICACION ANALISTAS PRUEBA POTENCIA VAC. SARAMPION
• El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo'
CULTIVOS CELULARESCULTIVOS CELULARES
RESPUESTARESPUESTAINMUNEINMUNE
PROTECCIPROTECCIÓÓNN
DESAFDESAFÍÍO /O /
POTENCIAPOTENCIA
VACUNA ATENUADA VACUNA ATENUADA VACUNA INACTIVADAVACUNA INACTIVADA
VIRUS VIRUS ANIMALES CUANTIFICACION ANIMALES CUANTIFICACION DEL ANTDEL ANTÍÍGENOGENO
CULTIVO ANIMALES CULTIVO ANIMALES ELISA OTROSELISA OTROSCELULARCELULAR
DICC50 DL50 DICC50 DL50 DE50 mcgDE50 mcgUFPUFP UI UI UIUI
UNIDADES INTERNACIONALES UNIDADES INTERNACIONALESUNIDADES INTERNACIONALES UNIDADES INTERNACIONALES
RESUMEN PRUEBAS POTENCIA Y/O CUANTIFICACIRESUMEN PRUEBAS POTENCIA Y/O CUANTIFICACIÓÓN N AgAgEN VACUNASEN VACUNAS