elisa

ELISADra Morella Bouchard Instituto de Inmunologa Clnica Universidad de Los Andes

ELISAEnzyme Linked Immuno Sorbent AssayDra Morella Bouchard Instituto de Inmunologa Clnica Universidad de Los Andes

Interaccin Antgeno Anticuerpo

ANTGENO

ANTICUERPO

Puentes de Hidrgeno Enlaces Inicos

Fuerzas que participan en la Interaccin Antgeno Anticuerpo

Interacciones hidrofbicas

Fuerzas de van der Waals

Enlaces Inicos

Caractersticas del Ac relacionadas con el reconocimiento del AgEspecificidad Diversidad Afinidad y Avidez

RESPUESTA HUMORAL

ELISA Descrita por Engvall y Perlman en 1971 Uno de los inmunorreactivos se absorbe a una fase slida y el otro se marca con una enzima. La enzima reacciona con un sustrato formando un producto coloreado

Ventajas del ELISAMuy sensible Gran nmero de muestras procesadas simultneamente. Resultados rpidos Utilizacin de reactivos menos txicos Menor costo Cuantificacin de sustancias diversas:hormonas frmacos citoquinas metabolitos mediadores de inflamacin agentes infecciosos, etc. toxinas protenas

Fundamento del ELISA

Ag o Ac Conjugado: Ag o Ac fijado a + en la + Ac unido a + SUSTRATO una fase ENZIMA muestra slida CAMBIO DE COLOR

Componentes del ELISAFASE SLIDA Antgeno o Anticuerpo Conjugado: ENZIMA SUSTRATO

SOPORTE SLIDOMaterial del Soporte Nitrocelulosa Formas disponibles Membranas, Lminas Placas, Lminas Unin No covalente

Polivinilo

Covalente

Poliestireno

Placas, Lminas, Perlas Membranas, Lminas, Perlas

Covalente

Ltex, nylon, celulosa y sefarosa

Covalente

ANTGENOCompleto Extracto total Fraccin Purificada Pptido sinttico Protena recombinante

Anticuerpos PoliclonalesHeterogneos Reconocen eptopes diferentes del Ag Producidos por numerosos clones de Linfocitos B

Anticuerpos MonoclonalesHomogneos Especificidad nica Producidos por un nico clon de Linfocitos B

BLOQUEOBuffer de bloqueoCasena

Composicin

DesventajasDeteriora rpidamente. Enmascara algunos antgenos Deteriora rpidamente. Enmascara algunos antgenos Podra generar algunos residuos

5% p/v leche sin grasa

Casena/Tween20 5% p/v leche sin grasa, O,2 %de Tween20

Tween 20 Gelatina BSA

O,2 %de Tween Gelatina 0.2% (2mg/ml) 3% de BSA,

Relativamente costoso

MUESTRASuero Orina

Saliva LCR Heces Otros

ENZIMASPeroxidasa Fosfatasa alcalina -galactosidasa Penicilinasa Ureasa Glucosa oxidasa

SUSTRATOSRequerimientos del sustratoSolubles en agua Fcil de manipular No txicos, no mutagnicos Bajo costo

Formacin de colores por la accin enzimtica sobre diferentes cromgenos-Nitrofenil Fosfato (NPP) Amarillo Prpura Rojo

Fosfatasa Alcalina

5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato / nitro azul de tetrazolium (BCIP / NBT)

Naftol AS-TR posfato /fast red RC2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6cido sulfnico)

Verde Naranja Azul Marrn Rojo Azul

-fenilendiamino (OPD)3,35,5-tetrametilbencidina base o Dihidrocloruro (TMB)

Peroxidasa

3,3-Diaminobencidina (DAB) 3-amino-9-Etilcarbazole (AEC) 4-cloro-1-Naftol (4C1N)

LavadosUtilizados para separar los componentes unidos de los libres Generalmente: De 3 a 6 lavados por cada etapa Duracin de 30 seg a 1 min c/u Se utiliza Buffer fosfato 0.01 a pH 7,2

Revelacin de la actividad enzimticaIncorporacin de cidos o bases fuertes para detener la reaccin La cantidad de producto enzimtico formado se determina leyendo la densidad ptica (DO) con un espectrofotmetro

FASES DEL ELISA1. Titulacin de la cantidad de Ag o Ac a utilizar para sensibilizar la placa. 2. Sensibilizacin 3. Lavado 4. Bloqueo 5. Lavado 6. Incubacin de las placas con las muestras y controles positivos y negativos 7. Lavado 8. Incubacin del conjugado 9. Lavado 10.Incubacin del sustrato 11.Detenimiento de la reaccin enzimtica 12.Lectura de las placas

TIPOS DE ELISADIRECTO INDIRECTO COMPETITIVO TIPO SANDWICH MTODO AVIDINA-BIOTINA

ELISA INDIRECTO

S

S

S

S

S

S

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

E

Antgeno Buffer de bloqueo Anticuerpo

Conjugado Anticuerpo-Enzima Sustrato

S

ELISA SANDWICHS

Anticuerpo fijado al pozo

ELISA SANDWICHSlavado


Adicin de la muestra con Antgeno a ser medido

ELISA SANDWICHSlavado lavado

E E E



Adicin del conjugado enzimaAnticuerpo secundario

ELISA SANDWICHS Slavado

lavado

lavado

E E E

E E E




Adicin del sustrato y medicin del color

ELISA SANDWICHS Slavado

lavado

lavado

E E E

E E E




Adicin del sustrato y medicin del color

INTERPRETACIN DE RESULTADOS

INTERPRETACIN DE RESULTADOSIncluir controles: Control del PBS (blanco) Control Negativo Control Positivo Bajo Control Positivo Alto

Paciente

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 A

2Control negativo

31/64 1/256 1/1024 1/4096 1/64

4

5

6

7

8

9 10 11 12 A B C D E F G H

B C D E F G H

B L A N C O S1

Control positivo

1/256 1/1024 1/4096

2

311

412

513

614

715

816

9 10 11 1217 18 19 20

Paciente

REPORTE DE RESULTADOSREPORTE CUALITATIVO Positivo Negativo REPORTE CUANTITATIVO ng o g/ ml Unidades internacionales de ELISA (EIU)

REPORTE DE RESULTADOS

Pruebas cuantitativas: Empleo de controles negativos, positivos bajos y positivos altos para construir curva de calibracin.

REPORTE DE RESULTADOSSemicuantitativaValor mnimo = positivo Promedio de los Controles Negativos

x

23 Desviaciones estndar

PRUEBAS QUE SE REALIZAN CON LA TCNICA DE ELISA EN EL IDICANTICUERPOS CONTRA AGENTES INFECCIOSOS Toxoplasma Cisticerco Amibas CMV Hepatitis A-B-C Helycobacter pylori Epstein Barr Rubeola HIV ANTGENOS TUMORALES ACE CA125 APS AFP AUTOANTICUERPOS ANA Anticuerpos antitiroideos PROTENAS PLASMTICAS PCR FR Anticardiolipinas

GRACIAS

elisa

Documents

Transcript of elisa