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OTema.

OEl aumento de la capacidad

metabólica de Escherichiacoli para la producción de

hidrógeno.

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INTRODUCCIÓN.O la producción de hidrógeno fermentativo es un

medio atractivo para la producción sostenible deeste portador de energía en el futuro, pero se veobstaculizado por sus bajos rendimientos.

O POSIBLE SOLUCIÓN A ESTE PROBLEMA.

O Crear cepas que pueden eludir los límites

metabólicos normales al sustrato conversión ahidrógeno, por medio de la ingeniería metabólica.

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INTRODUCCIÓN.(continuación)

O Escherichia coli puede

degradar una variedad

de azúcares a

hidrógeno, pero sólo

puede convertirelectrones disponibles

en el modo de piruvato a

hidrógeno, y es incapaz

de utilizar los electronesdisponibles en NADH

generado durante la

glucólisis.

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O Mediante la producción de hidrógeno en vivo

mostró que varias cepas manipuladas

metabólicamente eran capaces de utilizar la

hidrogenasa SH para derivar 2 mol H2 por mol de

glucosa consumida, cerca del máximo teórico.

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Antecedentes: 

El hidrógeno tiene

el mayor contenido

de energía por

unidad de masa de

cualquier

combustible

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Muchos microorganismos pueden obtener energía

metabólicamente por acoplamiento de la oxidación de

hidrógeno para un varios tipos de aceptores de

electrones tales como fumarato, sulfato, monóxido de

carbono y oxígeno

Otros organismos, lo hacen llevando a cabo una

fermentación en ambientes anaerobios, reduciendo

protones a hidrógeno como un medio de eliminación de

exceso, reduciendo equivalentes de rutas de oxidación

metabólica.

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Hay dos enzimas principales, [FeFe] y [NiFe] el hidrogenasas,

conteniendo sitios activos complejos formado de iones metálicos y

monóxido de carbono y cianuro ligados, responsable de la

producción de hidrógeno a través del reducción de protones

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 2 mol H2 / mol glucosa para bacterias entéricas, tal como

Escherichia coli

4 mol H2 / mol glucosa para anaerobios estrictos de genero

lostridial

En este estudio han intentado conducir la evolución de hidrógeno de NADH

generado por metabolismo celular a través de la expresión de [NiFe] hidrogenasa

soluble, reversible, NAD-unido Los SH-H2ase) operon de Ralstonia eutropha

examinando los rendimientos de hidrógeno en ingeniería metabólicamente de

epas de e. coli alteradas geneticamente para producir potencialmente niveles más

altos de NADH.

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Resultados y discusión

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EL CRECIMIENTO ANAERÓBICO DEMUTANTES QUE LLEVAN adhE

PJWPH5 (HIDROGENASA SH) EN M9GLUCOSA EN PRESENCIA DE NÍQUEL

 Y HIERRO 

La hipótesis de que la baja actividad observadapodría ser debido a la insuficiente suministro deníquel y hierro, por lo que se evaluó el efecto deníquel y hierro añadido en la formación dehidrogenasa SH activa.

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Razonando que el crecimiento podríarestaurarse si se introduce un medio de

NADH re oxidar, estos mutantes fueronprobados por el rescate de anaeróbicoel crecimiento en glucosa por la

introducción de pJWPH5, plásmido quelleva el operón SH bajo el control delpromotor trc. De hecho, en estas

condiciones de crecimiento, M9-glucosa+ IPTG + Ni + Fe, estos derivadosfueron capaces de tener crecimiento.

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LA REDUCCIÓN DE NAD+ IN

VITRO 

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Materiales y métodos.O Diseño y construcción de sistema de expresión.

O El plásmido pJWPH5 para la expresión del operón SH enE. coli bajo el control del promotor TRC inducible delvector pTRC99A se construyó como sigue:

1. 2,6 kb fragmento del extremo 5 'del operón SH conteníaen el plásmido pCH455.

2. se amplificó por PCR usando un cebador que introdujoun sitio XbaI aguas arriba, y se clonó en los sitios XbaI /BamHI de pBluescript, dando pAB3.

3. El Operón SH se reconstituyó por ligación de BamHI-HindIII digerido pCH455 y pAB3, dando plásmidopAB13.

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Materiales y métodos

(continuación).O 4. Por último, la digestión de pAB13 con XbaI - HindIII

dio un Fragmento de 14,2 kb que contiene el operón

SH, menos secuencia promotora, que se clonó en

pTRC99A, dando pJWPH5.

O Las Construcciones fueron verificadas por restricción

de reacciones y PCR.

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PREPARACIÓN DE CEPAS DE E. COLI

MANIPULADAS METABÓLICAMENTE.O Cepas de Escherichia coli JW135 y

FTD147 se utilizaron como el anfitrión,cepas de alteraciones vía metabólica.

O FTD147 carece de la evolución dehidrógeno, así como Hyd3 el hidrógenoconsume Hyd1 y Hyd2, y

espectácularmente hay evolución dehidrógeno bajo las condiciones empleadasen este estudio (E. coli Hyd4 está inactivobajo estas condiciones).

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PREPARACIÓN DE CEPAS DE E. COLI MANIPULADASMETABÓLICAMENTE(CONTINUACION).

O Se hicieron varias alteraciones metabólicas queharía potencialmente aumentar los niveles deNADH y así proporcionar sustrato para lahidrogenasa SH.

O la utilización de las vías fueron bloqueadas pormutación; adhE, ldhA, and/or mdh.

O Las mutaciones se introdujeron en P1transducciónde bacteriófago (DC1048- ΔadhE::Tn10 TcR,SE1752- ΔldhA::Tn10 TcR, JW3205-1- Δmdh::Tn10kanR, QC2575- ΔarcA::TcR).

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PREPARACIÓN DE CEPAS DE E. COLI MANIPULADASMETABÓLICAMENTE(CONTINUACIÒN).

O Los mutantes son típicamente designadocomo collie. coli FTGH2 (ÄldhA, ÄadhE,

 Ämdh); FTJWDC3 (ÄadhE, Ämdh); DG2

(ÄldhA, ÄadhE, ÄarcA), FTDPH10 (ÄldhA, ÄadhE.

O Para hacer que las cepas llevaran múltiplesmutaciones, el marcador de resistencia tetfue eliminado por su cultivo en un medio deMaloy Nunn.

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PREPARACIÓN DE CEPAS DE E. COLIMANIPULADAS

METABÓLICAMENTE(CONTINUACIÒN).

O Los fenotipos fueron confirmados por un alto

rendimiento en cromatografía de líquidos y el

crecimiento se puntuó en un Medio M9-Sorbitol en

condiciones anaeróbicas.

O pJWPH5 que lleva el SH operón se introdujo en las

diversas cepas por transformación química.

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LA EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE SH ENMETABÓLICAMENTE LAS CEPAS DE E. COLI

MODIFICADAS.1. Todas las cepas de E. coli se cultivaron durante la

noche aeróbicamente a 37 °  C en 5 ml de medio LBcon los antibióticos apropiados; ampicilina (100 mg /ml), tetraciclina (15 mg / ml), y kanamicina (25 mg / ml).

2. Concentraciones de antibióticos fueron utilizados en lamitad de sus concentraciones estándar en M9 (1X)medio mínimo.

3. Pre inocular, se prepararon por el creciento losmutantes en medio modificado M9 que contieneglucosa-;ampicilina (50 mg / ml), 100 mM FeCl3, 25mM y NiSO4 0,05 mM IPTG en condicionesanaeróbicas.

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LA EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE SH ENMETABÓLICAMENTE LAS CEPAS DE E. COLI

MODIFICADAS.

O Los ensayos de producción de hidrogeno se

llevaron a cabo mediante la inoculación del

mismo medio contenido en tubos sellados contapones de caucho butilo y la incubación bajo

condiciones anaeróbicas condición con glucosa

como única fuente de carbono (0,4% w / v y 0,2%

w / v).