Tesis para aspirar al Título de

Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biotecnología

Efecto modulador de agonistas de GnRH en los procesos de

apoptosis en las células de la granulosa del ovario de la gallina

doméstica (Gallus gallus domesticus)

Cátedra de Histología y Embriología - Facultad de Ciencias Veterinarias

Universidad de Buenos Aires – UBA

Autora/Tesista: MVZ María Revelo

Director: Dr. Juan A. Claver

Co-Director: Dr. Daniel M. Lombardo

2014

II

AGRADECIMIENTOS

Al finalizar un trabajo tan arduo y lleno de dificultades como el desarrollo de una tesis,

es indispensable tratar de recordar a todos aquellos que directa o indirectamente ayudaron en su

elaboración. Aunque se requiere más que palabras para reconocer su apoyo, es necesario

expresar gratitud para todas esas personas e instituciones que opinando, corrigiendo, teniendo

paciencia, dando ánimo, y facilitando equipos y/o materiales lograron que se culmine con éxito

el trabajo planificado.

Entre los profesionales que colaboraron en la realización del presente trabajo destacan sin

duda los doctores Juan Claver, Daniel Lombardo, Clara Carou, Alejandro Maruri y Cristina

Soñez. El doctor Juan Claver, en su rol como director de tesis, no sólo estuvo presto para orientar

y corregir, sino también para dar una guía idónea y un acompañamiento en los momentos

difíciles, aún a expensas de su tiempo. El doctor Daniel Lombardo, quien como codirector,

brindó de manera permanentemente e incondicional el apoyo técnico, científico y económico

requerido para solucionar problemas. La doctora Clara Carou, el doctor Alejandro Maruri y la

doctora Cristina Soñez, que aún sin formar parte directa del proyecto, tomaron bajo su cobijo

muchas instancias y gracias a sus opiniones y tiempo se logró los resultados de la tesis.

El apoyo brindado por el personal de la cátedra de Histología y Embriología de la

Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Buenos Aires fue indispensable; por lo

tanto, es importante expresar la influencia que tuvieron la magister Fernanda Tello, la magister

Patricia Germano, la doctora Leonor Gauna, el doctor Juan Boviez, la señora Mónica López, la

señora Natalia Cataneo, el técnico Pablo Gazzaneo y el señor Maximiliano Revilla.

También se quiere agradecer el tiempo y asesoramiento brindado por la doctora Mariana

Gambarotta para concretar el análisis estadístico realizado. De igual forma, se agradece por la

ayuda en la edición de imágenes al Señor José Luis Cueva.

Lógicamente sin la materia prima de la cual obtener las células de la granulosa, el

proyecto no se hubiera realizado. En consecuencia, la ayuda para la obtención y alojamiento de

las aves empleadas en la tesis debe reconocerse al Señor Víctor Casado, pequeño criador de aves

de la zona de Merlo de la Provincia de Buenos Aires. También se reconoce la ayuda

incondicional brindada por parte del Ingeniero Daniel Musi y los doctores Ezequiel Romano y

III

Ariel Demarco, quienes integran la cátedra de Genética de la Facultad de Medicina Veterinaria

de la UBA; y el doctor Pablo Köhler, perteneciente al proyecto BIOINNOVO de INTA-Castelar.

Finalmente, es imprescindible agradecer a la Secretaria Nacional de Educación Superior,

Ciencia, Tecnología e Innovación - SENESCYT, que en nombre de mi país Ecuador, tuvo a bien

otorgarme una beca de estudios de posgrado, y que lógicamente ha hecho posible que se ejecute

la presente tesis de maestría.

IV

DEDICATORIA

A mi consuelo de vida y dador de bendiciones DIOS, que tuvo la gracia de

poner en mi vida a mis padres, familia y esposo, a quienes amo con todo mi

corazón.

V

ÍNDICE DE TEMAS

ÍNDICE DE TEMAS ..................................................................................................................... V

ÍNDICE DE FIGURAS.............................................................................................................. VIII

ÍNDICE DE GRÁFICOS ............................................................................................................... X

ABREVIATURAS ........................................................................................................................ XI

RESUMEN ................................................................................................................................ XVI

SUMMARY ............................................................................................................................. XVIII

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 1

1. ANATOMÍA HISTOLOGÍA Y FISIOLOGÍA DEL APARATO REPRODUCTOR DE LA

GALLINA DOMÉSTICA ........................................................................................................... 2

1.1 Estructura anatómica e histológica del aparato reproductivo ............................................ 2

1.2 Endocrinología del sistema reproductor femenino de las aves. ....................................... 14

1.3 La GnRH como factor de liberación hormonal. .............................................................. 19

2. El Proceso de la apoptosis ..................................................................................................... 31

2.1 Definición de apoptosis ................................................................................................... 31

2.2 Características morfológicas y bioquímicas diferenciales entre necrosis y apoptosis. ... 31

2.3 Mecanismos y moléculas implicadas en la apoptosis. ..................................................... 34

2.4 Apoptosis y atresia en el ovario de las aves. ................................................................... 44

3. MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE APOPTOSIS ..................................................... 50

3.1 Métodos de estudio de apoptosis que se basan en las alteraciones morfológicas de las

células. ................................................................................................................................... 50

3.2 Métodos de estudio de apoptosis basados en la fragmentación de ADN ........................ 51

3.3 Métodos de estudio de apoptosis basados en alteraciones de la membrana celular. ....... 53

3.4 Métodos de detección de apoptosis en base a la expresión de activadores, efectores y

reguladores de la cascada apoptótica. .................................................................................... 54

VI

OBJETIVOS ................................................................................................................................. 56

OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................ 56

Objetivos particulares:............................................................................................................... 56

HIPOTESIS GENERAL ............................................................................................................... 57

Hipótesis particulares: ............................................................................................................... 57

MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 58

1. DISEÑO EXPERIMENTAL Y TRATAMIENTOS............................................................. 58

2. CULTIVOS CELULARES ................................................................................................... 61

2.1 Cultivo Primario de Células de la Granulosa de Gallina (CPGG). ................................. 61

2.2 Obtención de Células de la Granulosa de Gallina de pasaje 1 (CGG-P1). ..................... 63

3. CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS DE LA GRANULOSA DE LA GALLINA DE

PASAJE 1 (CGG - P1). ............................................................................................................. 65

3.1 Determinación de la curva de crecimiento. ..................................................................... 65

3.2 Caracterización de CGG-P1 mediante tinción con Aceite Rojo O (ARO). ..................... 66

3.3 Determinación de GnRH-R-I en CGG-P1 mediante inmunocitoquímica. ...................... 68

4. EVALUACIÓN DE APOPTOSIS. ....................................................................................... 72

4.1 Evaluación Morfológica - Determinación de apoptosis por tinción con hematoxilina. . 72

4.2 Determinación de apoptosis a través de la técnica TUNEL. ........................................... 73

4.3 Inmunocitoquímica para proteínas Bax, Bcl-2 y Caspasa-3 activa. ................................ 76

4.4 Evaluación de Apoptosis a través de FACS para Anexina V/Ioduro de Propidio .......... 79

5. ESTADÍSTICA. .................................................................................................................... 83

RESULTADOS............................................................................................................................. 84

1. CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS DE GRANULOSA DE GALLINA (CPGG). ....... 84

2. CARACTERIZACIÓN DEL PASAJE 1 DE CÉLULAS DE LA GRANULOSA DE

GALLINA (CGG-P1) ............................................................................................................... 85

VII

2.1 Características morfológicas de las CGG-P1. ................................................................. 85

2.2 Curva de crecimiento de CGG-P1. .................................................................................. 87

2.3 Presencia de lípidos intracelulares por tinción con Aceite Rojo O (ARO). .................... 87

2.4 Caracterización de CGG-P1 por inmunohistoquímica para GnRH-R-I. ......................... 88

3. EVALUACIÓN DE APOPTOSIS ...................................................................................... 100

3.1 Análisis morfológico de la apoptosis por tinción con hematoxilina. ............................ 100

3.2 Evaluación de Apoptosis tardía a través de TUNEL para CGG - P1. ........................... 101

3.3 Evaluación de apoptosis mediante ICQ para Bax, Bcl-2 y Caspasa-3 clivada .............. 102

3.4 Evaluación apoptosis temprana con citometría de flujo para AV/IP: ........................... 105

DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 119

1. Sobre la obtención, comportamiento y morfología de los cultivos primarios y subcultivos de

CGG. ....................................................................................................................................... 119

2. Sobre la caracterización molecular de las CGG-P1. La expresión del receptor de GnRH

tipo I. ....................................................................................................................................... 123

3. Sobre la modulación de la apoptosis por efecto de análogos agonistas de GnRH. ............ 125

CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 132

1. Sobre el cultivo y la caracterización de las de CGG-P1 ..................................................... 132

2. Sobre el receptor de GnRH tipo I ........................................................................................ 133

3. Sobre la modulación de la apoptosis por parte de un análogo agonista de GnRH, el acetato

de leuprolide (LA). .................................................................................................................. 133

BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................ 135

VIII

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Componentes del Aparato Reproductivo de la Gallina doméstica .................................. 3

Figura 2. Organización de los folículos del ovario de la gallina doméstica durante su

desarrollo......................................................................................................................................... 8

Figura 3. Relación de las capas de tejido del folículo pre-ovulatorio que rodean inmediatamente

al ovocito ......................................................................................................................................... 9

Figura 4. Síntesis de esteroides por parte de las células de la granulosa y de la teca de folículos

pre-jerárquicos y pre-ovulatorios (jerárquicos) en el ovario de la gallina ponedora ................... 10

Figura 5. Esquema de la formación del huevo en la gallina ......................................................... 12

Figura 6. Estructura genómica de la pro-hormona GnRH-I mostrando las cuatro estructuras que

la componen .................................................................................................................................. 19

Figura 7. Esquema de la estructura de la hormona GnRH ............................................................ 20

Figura 8. Estructura molecular de la hormona GnRH .................................................................. 22

Figura 9. Representación bidimensional del receptor de GnRH para el ratón .............................. 23

Figura 10. Estructura molecular de GnRH versus los análogos más frecuentemente usados ...... 29

Figura 11. Ilustración de las características morfológicas de la muerte celular por necrosis y

apoptosis ....................................................................................................................................... 33

Figura 12. Vía extrínseca de la apoptosis .................................................................................... 36

Figura 13. Vía intrínseca de la apoptosis ..................................................................................... 37

Figura 14. Clasificación de las caspasas ....................................................................................... 40

Figura 15. Proteínas de la Familia Bcl-2 ...................................................................................... 43

Figura 16. Atresia folicular explosiva en el Gallus gallus domesticus ......................................... 47

Figura 17. Atresia folicular en aves silvestres. ............................................................................. 48

Figura 18. Esquema de la secuencia experimental ...................................................................... 60

Figura 19. Interpretación de la distribución gráfica de eventos detectados por su unión a AV o

IP. .................................................................................................................................................. 82

IX

Figura 20. Fotografías de material de cultivo ............................................................................... 90

Figura 21. CGG-P1, crecimiento sobre cubre objetos con y sin Poli-L-lisina a las 96 horas de

cultivo ........................................................................................................................................... 91

Figura 22. Fotografías representativas de CGG-P1 ...................................................................... 92

Figura 23. CGG-P1 con tinción H/E ............................................................................................. 93

Figura 24. Fotografías de células de cuerpo lúteo bovino y CGG-P1 teñidas c on Aceite

Rojo-O........................................................................................................................................... 95

Figura 25. Inmunohistoquímica para GnRH-R-I en hipófisis de gallina. ..................................... 96

Figura 26. Inmunohistoquímica para GnRH-R-I en tejido ovárico de gallina. ............................ 97

Figura 27. Inmunohistoquímica para anticuerpo anti-receptor de GnRH tipo I en folículos pre-

ovulatorios..................................................................................................................................... 98

Figura 28. Inmunocitoquímica para anticuerpo anti-receptor de GnRH tipo I en CGG-P1. ........ 99

Figura 29. Fotos representativas de evaluación morfológica de apoptosis con Tinción

Hematoxilina-Eosina................................................................................................................... 108

Figura 30. Fotos representativas de Inmunocitoquímica (técnica LSAB) para proteína Bax .... 112

Figura 31. Alineamiento de secuencias aminoacídicas para Bcl-2 humana y Bcl-2 del Gallus

gallus domesticus ........................................................................................................................ 113

Figura 32. Alineamiento de secuencias aminoacídicas para caspasa 3 de humanos y de la gallina

doméstica .................................................................................................................................... 113

Figura 33. Fotos representativas de Inmunocitoquímica (técnica LSAB) para caspasa-3 activa ... 116

X

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Curva de crecimiento para CGG-P1 ............................................................................ 94

Gráfico 2. Gráfico de barras para evaluación de apoptosis a través de morfología con tinción de

Hematoxilina (grupo control versus tratamiento con LA por 24 horas). .................................... 106

Gráfico 3. Gráfico de barras para las proporciones de cuerpos apoptóticos (CA) y células totales

encontrados en cultivos con LA 100nM por 48 horas y cultivos control. ................................. 107

Gráfico 4. Diagrama de cajas y bigotes para evaluación morfológica de la apoptosis por tinción

con hematoxilina en CGG-P1 tratadas por 48 horas ................................................................... 107

Gráfico 5. Diagrama de cajas y bigotes para evaluación morfológica de la apoptosis mediante

TUNEL en CGG-P1 tratadas por 48 horas ................................................................................. 109

Gráfico 6. Índice de Cuerpos Apoptóticos Positivos a TUNEL en CGG-P1 ............................ 109

Gráfico 7. Porcentaje de área marcado contra proteína Bax en CGG-P1 tratadas por 48 horas 111

Gráfico 8. Inversa de la densidad óptica integrada para proteína Bax en CGG-P1 tratadas por 48

horas. ........................................................................................................................................... 111

Gráfico 9. Porcentaje de área marcado para proteína Bcl-2 en CGG-P1 .................................... 114

Gráfico 10. Inversa de la densidad óptica integrada en CGG-P1 para proteína Bcl-2. .............. 114

Gráfico 11. Porcentaje de área marcado para Caspasa-3 activa en CGG-P1 .............................. 115

Gráfico 12. Inversa de la densidad óptica integrada en CGG-P1 para Caspasa-3 activa. .......... 115

Gráfico 13. Dot Plots representativos de CGG-P1 tratadas con LA 100nM y sin tratar (marcados

con AV/IP por FACS) ................................................................................................................. 117

Gráfico 14. Representación gráfica de las variaciones en los porcentajes de células por los cuatro

cuadrantes, de acuerdo a su marcación Anexina V/Ioduro de Propidio ..................................... 117

Gráfico 15. Gráfico de barras y bigotes para evaluación de Apoptosis Temprana con FACS

(AV/IP) ....................................................................................................................................... 118

Gráfico 16. Gráfico de barras y bigotes para evaluación de Apoptosis Tardía con FACS (AV/IP)

..................................................................................................................................................... 118

XI

ABREVIATURAS

ADN: Ácido desoxirribonucleico

AIF: Apoptosis Inductor Factor (factor inductor de la apoptosis). Según traducción literal del

término en inglés.

IAPs: Inhibitors of Apoptosis Proteins. Tomado de traducción literal del inglés.

Apaf-1: Apoptotic Protease Activating Factor 1. Traducción literal del inglés.

AMH: Anti-Müllerian hormone. Tomado de traducción literal del inglés.

APO1: Apoptosis antigen-1

ARO: Aceite Rojo O.

ATP: Adenosin Trifosfato

AV: Anexina V.

Bak: Bcl-2 antagonist/killer. Tomado de traducción literal del inglés.

Bax: Bcl-2 associated X protein. Según traducción literal del inglés.

Bcl-2: B-cell lymphoma-2. Tomado de traducción literal del inglés

Bcl-xL/Bad: Bcl-2 associated death promoter. Según traducción literal del inglés

BH: Bcl-2 Homologuos domains. Traducción del inglés.

Bid: BH3-interacting domain death agonist. Tomado de traducción literal del inglés.

Bim: Bcl-2- interacting mediator of cell death. Según traducción literal del inglés

Bmf: Bcl2-modifying factor. Tomado de traducción literal del inglés.

Bok: Bcl-2-related ovarian killer. Según traducción literal del inglés.

CA: Cuerpos Apoptóticos

CAD: Caspase-Activated DNase. Tomado de traducción literal del inglés

CARD: Caspase Recruitment Domain. Tomado de traducción literal del inglés

XII

CGG: Células de la granulosa de gallina.

CGG-P1: Células de la Granulosa de Gallina de Pasaje 1.

CPGG: Cultivo primario de granulosa de gallina.

DAB: Diaminobencidina

DAG: 1,2-diacilglicerol

ddH2O: Agua didestilada

DED: Death Efector Domain. Según traducción literal del término en inglés.

DHT: 5α-dihidrotestosterona

DISC: Death Induction Signal Complex (Complejo de señal inductora de muerte). Según

traducción literal del término en inglés.

DMSO: Dimetilsulfóxido

E1: Estrona

E2: 17β Estradiol

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid. Según traducción literal del inglés.

ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas)

FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter (Análisis de citometría de flujo). Según traducción

literal del término en inglés.

FADD: Fas Associated Death Domain. Tomado de traducción del inglés.

FAK: Focal Adhesion Kinase. Traducción literal del inglés.

FITC: Fluorescein isothiocyanate (isotiocianato de fluoresceína). Según traducción literal del

término en inglés.

FLIP: FLICE Inhibitor Protein (Proteína Inhibidora de FLICE). Según traducción literal del

término en inglés.

FSH: Follicle Stimulating Hormone (Hormona folículo estimulante). Según traducción literal del

término en inglés.

XIII

GAP: GnRH-associated protein. Según traducción literal del término en inglés.

GDP: Guanosín difosfato

GnRH: Hormona liberadora de las gonadotropinas.

GnRH-I: Hormona liberadora de las gonadotropinas tipo I (también designada como mGnRH:

Hormona liberadora de las gonadotropinas tipo mamífero).

GnRH-II: Hormona liberadora de las gonadotropinas tipo II (también designada como cGnRH:

Hormona liberadora de las gonadotropinas tipo pollo).

GnRH-III: Hormona liberadora de las gonadotropinas tipo III.

GnRH-R: GnRH Receptor (Receptor de GnRH). Tomado de traducción literal del término en

inglés.

GTP: Guanosín trifosfato

HE: Hematoxilina-Eosina

HPR: Horseradish Peroxidase traducida al español como Peroxidasa picante de rábano.

HtrA2/Omi: High Temperature Requirement Serine proteasa

IAPs: Inhibition Apoptotic Proteins (Proteínas inhibidoras de la apoptosis). Según traducción

literal del término en inglés.

ICQ: Inmunocitoquímica.

IF: Inmunofluorescencia.

Ig: Inmunoglobulina

IP3: inositol-1, 4, 5 trifosfato

LA: Leuprolide Acetate (Acetato de leuprolide). Según traducción literal del término en inglés.

LH: Luteinizing Hormone (Hormona luteinizante). Tomado de traducción literal del término en

ingles

MCP: Muerte Celular Programada.

MN: Micronúcleos

XIV

ON: Over night (durante la noche)

P4: Progesterona

Pb: Pares de bases

PCR: Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la polimerasa).

PBS: Phosphate Buffered Saline (solución salina tamponada con fosfato). Según traducción

literal del término en inglés.

PIP2: Fosfatidilinositol 4,5 difosfato

PKC: Protein-quinasa C

PLC: Fosfolipasa C

POF: Postovulatory follicle (Folículo pos-ovulatorio).

Puma: p53 upregulated modulator of apoptosis. Según traducción literal del término en inglés.

SMAC/DIABLO: Second Mitochondrial Activator of Caspases / Direct IAP Binding protein

with Low PI. Traducción del inglés.

SFB: Suero Fetal Bovino

T: Testosterona

T3: Triyodotironina

T4: Tiroxina

TA: Temperatura ambiente.

TEM: Transmission Electron Microscopy (microscopía electrónica de transmisión).

TRADD: TNFR-Associated Death Domain. Traducción literal del inglés.

TNF: Tumour Necrosis Factor (factor de necrosis tumoral). Según traducción literal del término

en inglés.

TNFR-1: Receptor del Factor de Necrosis Tumoral 1. Según traducción literal del término en

inglés.

XV

TNFRSF: Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily, tomado literalmente del inglés.

TRAILR-1: TNF-Related Apoptosis Inducing Ligan Receptor 1. Según traducción del inglés.

TSH: Thyroid stimulating hormone (Hormona estimulante de la tiroides). Según traducción del

inglés.

TUNEL: Terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP end labeling. Según traducción

del inglés.

VLDL: Very Low Density Lipoprotein. Según traducción del inglés.

XVI

RESUMEN

La atresia folicular (reabsorción de un folículo ovárico antes de alcanzar la madurez y la

ovulación) se inicia en la capa granulosa y es orquestada a través de procesos de apoptosis (Tilly

et al. 1991). El estudio de los mecanismos que controlan la apoptosis de la granulosa puede

contribuir al mejor entendimiento de la fisiología ovárica de la gallina doméstica.

En los vertebrados los procesos apoptóticos en la granulosa son regulados por varios

factores (Johnson, 2000b). En esta regulación participan hormonas esteroideas sexuales, factores

de crecimiento, diversas citocinas y gonadotrofinas (Asselin et. al., 2000; Flores et. al., 2005).

Además, se ha comprobado que la hormona GnRH actúa regulando esteroidogénesis ovárica y

ejerciendo efecto tanto estimulatorio como inhibitorio sobre la producción de hormonas

esteroideas y apoptosis folicular (Ramakrishnappa et. al., 2005; Srivastava et. al., 1995). La

GnRH tiene estas funciones autocrinas y/o paracrinas, gracias a la presencia de receptores en la

granulosa, células luteales y células del epitelio superficial del ovario de los mamíferos (In-Sun

Hong, 2011; Leung et. al., 2003; Ortmann & Diedrich, 1999).

En la gallina doméstica, no existía evidencia de la presencia del receptor de GnRH a

nivel ovárico y menos de la influencia directa de la hormona sobre los procesos apoptóticos de

granulosa de los folículos ováricos. Con el trabajo realizado se puso de manifiesto a través de

IHQ, que el receptor de GnRH tipo I se expresa en las células de la granulosa de los folículos

pre-ovulatorios tanto en tejido ovárico como en cultivo celular.

Mediante el uso de un modelo in vitro con células de la granulosa derivadas de folículos

pre-ovulatorios de gallinas domésticas se buscó evaluar si el agonista de GnRH, acetato de

leuprolide (LA), era capaz de modular la apoptosis en estas células a través de la unión directa

con el receptor de GnRH tipo I. Para alcanzar este objetivo se obtuvieron en primera instancia

cultivos primarios y a partir de ellos, células de la granulosa de gallina de pasaje 1 (CGG-P1) que

se utilizaron como modelo experimental.

Las células del pasaje I fueron capaces de crecer empleando medio de cultivo

DMEN+F12 suplementado con 5% de SFB en un ambiente de 38,5°C y 5% de CO2. Bajo estas

condiciones las células mostraron una curva de crecimiento clásica, alcanzando la confluencia

XVII

celular a las 96 horas de cultivo. Las CGG-P1 se caracterizaron por presentar una morfología

fibroblástica y abundantes vacuolas citoplasmáticas con contenido lipídico.

El análisis de la fase efectora de la apoptosis, a través del estudio de la expresión de

proteínas de la familia Bcl-2 (Bax y Bcl-2), reveló la ausencia de modulación de la apoptosis por

parte del acetato de leuprolide, en la dosis 100 nM. De igual manera, no se encontró variación en

la inmunomarcación para la proteína caspasa-3 activa; así como tampoco en la expresión de la

fosfatidilserina (determinada por la marcación con AV/IP y analizado por FACS) entre los

tratamientos, mostrando que LA 100 nM no modula el proceso de apoptosis temprana en las

CGG-P1 provenientes de folículos pre-ovulatorios.

Los resultados del estudio morfológico mediante tinción con hematoxilina demuestran

que la inducción con acetato de leuprolide (LA) 100 nM no aumenta la proporción de cuerpos

apoptóticos en las CGG-P1 con respecto a los controles. El análisis morfológico empleando

hematoxilina, e ICQ para Bax y caspasa-3 activa permitió observar la fagocitosis de cuerpos

apoptóticos por parte de CGG-P1 viables, mostrando que en el sistema podrían operar

fenómenos de fagocitosis homóloga.

La evaluación de la apoptosis tardía mediante el empleo de la técnica TUNEL tampoco

presentó diferencias significativas entre tratamientos. A pesar, de esta ausencia de diferencias

significativas entre las células tratadas con LA 100 nM y las cultivadas tan sólo con 5% de SFB

(control experimental), se encontró un incremento en la fragmentación oligonucleosomal de

ADN frente a la inducción con peróxido de hidrógeno, confirmándose que el sistema es sensible

a la inducción de la apoptosis, pero no con el agonista de GnRH estudiado, sino con su control

positivo de fragmentación de ADN. Sin embargo, considerando las particularidades del modelo

en estudio no se descarta la modulación del proceso de apoptosis por parte de otras isoformas

GnRH y/o por la unión a otro tipo de receptor de GnRH, o bien sobre células de granulosa

provenientes de otros tipos de folículos (folículos prejerárquicos).

XVIII

SUMMARY

The follicular atresia (reabsorption of an ovarian follicle before reaching maturity and

ovulation) starts in the granulosa layer and is performed through apoptosis processes (Tilly et al.

1991). The study of the mechanisms that control the granulosa apoptosis can contribute to the

better understanding of the ovarian physiology of the domestic hen.

In vertebrates, the granulosa apoptotic processes are regulated by several factors

(Johnson, 2000b). Sexual steroid hormones, growth factors, several different cytokines and

gonadotropins participate in its regulation (Asselin et. al., 2000; Flores et. al., 2005).

Additionally, it has been proved, that the GnRH hormone acts regulating the ovarian

steroidogenesis producing inhibitory and stimulatory effects on the production of steroid

hormones and follicular apoptosis (Ramakrishnappa et. al., 2005; Srivastava et. al., 1995). GnRH

has these autocrine and/or paracrine functions thanks to the presence of receptors in the

granulosa, luteal cells and cells of the ovary’s superficial epithelium of mammals (In-Sun Hong,

2011; Leung et. al., 2003; Ortmann & Diedrich, 1999).

In domestic hen, there was no evidence of the presence of the GnRH receptors at an

ovarian level and less of the direct influence of the hormone on the granulosa apoptotic processes

of the ovarian follicles. In the investigation performed, it was shown through IHQ that the

GnRH receptor type I is expressed in granulosa cells of the preovulatory follicles in the ovarian

tissue, as well as in the cell culture.

Through the use of an in vitro model of with granulosa cells derived from preovulatory

follicles of domestic hens, the purpose was to evaluate whether the GnRH agonist, leuprolide

acetate (LA), was able to modulate the apoptosis in these cells by direct union with the type-1

gonadotrophin releasing hormone (GnRH) receptor. To achieve this objective, in the first

instance primary cultures were obtained and from them, hen's granulosa cells from passage 1

(CGG-P1), which were used as experimental model.

The hen's granulosa cells from passage 1 (CGG-P1) were able to grow, using a

DMEN+F12 culture medium, supplemented with 5% of SFB in an environment of 38,5°C and

5% of CO2. .Under these conditions, the cells showed a classic growth curve, reaching a cell

XIX

confluence at 96 hours of culture. The CGG-P1 were characterized by presenting a fibroblastic

morphology and plenty of cytoplasmic vacuoles with lipid content.

The analysis of the effector phase of apoptosis, through the study of protein expression of

the Bcl-2 family (Bax and Bcl-2), revealed the absence of modulation of apoptosis by the

leuprolide acetate for, in a dose of 100 nM. Similarly, no variation was found in the immune

staining for active caspase 3; as well as in the expression of phosphatidylserine (determined by

dialing against AV/IP and analyzed by FACS) among the treatments, showing that LA 100 nM

does not modulate the process of early apoptosis in the CGG-P1 from pre-ovulatory follicles.

The morphologic study using hematoxylin staining show that the induction with

leuprolide acetate (LA) 100 nM does not increase the proportion of apoptotic bodies in CGG-P1

regarding to controls. The morphological analysis using hematoxylin, and ICQ against Bax and

active caspase 3 allowed observing the phagocytosis of apoptotic bodies by viable CGG-P1. This

fact shows that the system could experiment phenomena of homologous phagocytosis.

The evaluation of the late apoptosis using the TUNEL technique didn’t present either

significant difference among treatments. In spite of the lack of significant differences between

cells treated with LA 100 nM and those cultivated with only 5% of SFB (experimental control),

it was found an increase in the DNA oligonucleosomal fragmentation, against the induction with

hydrogen peroxide, confirming that the system is sensitive to the induction of apoptosis, but not

with the studied GnRH agonist, but with its DNA positive control fragmentation. Nevertheless,

considering the peculiarities of the model under study, it does not discard the apoptosis

modulation process by other GnRH isoforms and/or by the union to another type of GnRH

receptor, or on cells of granulosa originated from other types of follicles (prehierarchic follicles).

1

INTRODUCCIÓN

La avicultura, fue uno de los sectores que quedó debilitado y diezmado tras la recesión

económica que sufrió la república Argentina entre los años 1998 y 2001 (Rossi, 2011). Aunque

el panorama era difícil, la elaboración de un plan de desarrollo sectorial permitió impulsar el

crecimiento sostenido del sector avícola (Rossi, 2011). Actualmente, la Argentina es el octavo

país productor y quinto exportador de carne de pollo en el mundo (El sitio avícola, 2012; Mair,

Beczkowski & Lamelas, 2011). El crecimiento promedio anual de la avicultura es del 6.7% y ha

habido un cambio conceptual en la población, que mira a los productos derivados de la actividad,

como una alternativa nutritiva y de buena calidad (El sitio avícola, 2012; Rossi, 2011).

La importancia que ha adquirido la avicultura implica contar con elementos para hacer

frente a los nuevos desafíos (Rossi, 2011). Lógicamente, se hace imprescindible llevar a cabo

investigaciones que permitan el mejor entendimiento de la fisiología de la gallina doméstica

(Gallus gallus domesticus). Dentro de la fisiología aviar, los mecanismos relacionados con la

reproducción son de especial interés para obtener un mayor beneficio del potencial genético de

las aves.

Lograr un conocimiento profundo de la fisiología del ovario de la gallina doméstica

resulta vital para optimizar su eficiencia y evitar pérdidas económicas derivadas de alteraciones o

disfunciones. Si bien la gallina posee solo el ovario izquierdo funcional, el patrón de crecimiento

y maduración folicular se produce con gran precisión (Sharp, 1998). Adicionalmente, el ovario

de la gallina contiene en un mismo momento folículos en distinto estadio de desarrollo, desde

folículos pre-jerárquicos hasta folículos atrésicos, todos ellos visibles a simple vista (Lovell et.

al., 2002; Lovell et. al 2006). Entonces, el gran tamaño de los folículos, la fácil disponibilidad de

muestras tisulares, y la ajustada predictibilidad del momento de la ovulación, ofrecen ventajas

metodológicas que justifican trabajar con el ovario de la gallina doméstica como un excelente

modelo para el estudio de la foliculogénesis, ovulación y la atresia folicular (Bahr, 2008;

Decuypere et. al., 1999; Lovell et. al., 2002; Lovell et. al., 2006).

2

1. ANATOMÍA, HISTOLOGÍA Y FISIOLOGÍA DEL APARATO REPRODUCTOR DE

LA GALLINA DOMÉSTICA

1.1 Estructura anatómica e histológica del aparato reproductivo

El aparato reproductivo de las aves es muy diferente al de los mamíferos, y algunas de

estas particularidades provienen de las necesidades adaptativas y evolutivas. El Gallus gallus

domesticus es una especie que está casi al final de la cadena alimenticia y de este hecho derivan

sus características reproductivas (Jacob et. al., 2011; UK-Ag Extensión, 2011). Las gallinas

producen descendencia múltiple y sus crías se desarrollan fuera del cuerpo de la hembra en

huevos, que cuentan con nutrientes suficientes para permitir el crecimiento de los polluelos

(Jacob et. al., 2011; UK-Ag Extensión, 2011).

El sistema reproductivo de la gallina está compuesto por el ovario y el oviducto

izquierdos (figura 1). Los órganos reproductivos del lado derecho involucionan luego del

nacimiento (Ferreyra, 2002a; Jacob et. al., 2011; Johnson, 2000a; McDonald, 2011). La

involución del ovario y del tracto genital derecho (conducto de Müller derecho) empieza al

octavo día de incubación (Jacob & Bakst, 2007).

A diferencia de los mamíferos, en las aves el sexo es determinado por la hembra (Johnson

& Woods, 2007; McDonald, 2011). Las hembras son heterogaméticos, con cromosomas sexuales

denominados ZW, mientras que los machos son homogaméticos con cromosomas ZZ (Johnson

& Woods, 2007; McDonald, 2011). Un cromosoma W funcional permite la regulación de la

enzima aromatasa y por ende de la síntesis de estrógenos durante la embriogénesis temprana. Los

efectos de los estrógenos sobre receptores específicos presentes en la gónada izquierda son los

que permiten el desarrollo de un ovario izquierdo funcional. En el ovario derecho no se expresan

receptores específicos para estrógenos durante estas etapas tempranas de incubación (5 a 7 días)

(Johnson & Woods, 2007).

3

1.1.a Ovario de la gallina doméstica

El ovario de la gallina doméstica es un órgano de consistencia friable y forma irregular,

que está dividido en lóbulos (Ferreyra, 2002). Se ubica a nivel del lóbulo craneal del riñón

izquierdo, junto a la glándula adrenal y fijado al techo de la cavidad abdominal por un fino

ligamento denominado mesovario (McDonald, 2011; Johnson, 2000a). Antes de la pubertad, el

ovario es pequeño, aplanado, con numerosos surcos y circunvoluciones que le dan aspecto de

cerebro (McDonald, 2011). En las aves adultas reproductivamente activas, el ovario adopta la

apariencia de un racimo de uvas debido a la presencia de grandes folículos ováricos que

protruyen desde la superficie ovárica, suspendidos por un fino tallo folicular o pedículo (figura

1) (McDonald, 2011; Johnson & Woods, 2007).

Figura 1. Componentes del Aparato Reproductivo de la Gallina doméstica

(Jacob et. al., 2011)

4

El suministro sanguíneo al ovario se hace a través de la arteria ovárica y dos venas

ováricas se encargan de drenar la sangre directamente dentro de la vena cava caudal (Ángulo,

2009; Bowles, 2006; Johnson & Woods, 2007; Sturkie, 1968). A simple vista se observa que dos

o cuatro arterias más pequeñas penetran en los folículos mayores a través del pedículo (Johnson

& Woods, 2007; Sturkie, 1968). De esas pequeñas arterias derivan arteriolas que se extienden a

lo largo de una de las membranas que envuelve al folículo, la teca. (Johnson & Woods, 2007).

El ovario está inervado por fibras adrenérgicas y colinérgicas. La inervación proporciona

al ovario y folículos en crecimiento varios neurotransmisores (como, catecolaminas) y factores

neurohormonales (por ejemplo, péptido intestinal vasoactivo y sustancia P) (Johnson, 2000a;

Johnson & Woods, 2007).

Exteriormente el ovario está tapizado por un epitelio cúbico simple, en continuidad con el

mesotelio peritoneal, por debajo del cual subyace una fina albugínea de tejido conectivo denso.

Desde el punto de vista histológico el ovario está formado por una corteza y una médula

(McDonald, 2011).

La corteza es externa y en ella se encuentran los folículos en sus diferentes estados de

desarrollo y regresión. Los folículos que se encuentran en la corteza ovárica contienen a los

ovocitos. Los ovocitos derivan de las oogonias a través del proceso de ovogénesis. Los folículos

están formados por el ovocito y capas concéntricas tisulares (granulosa y tecas) que van

determinando su crecimiento y diferenciación en varias clases de folículos (Johnson, 2000a;

McDonald, 2011).

La médula contiene tejido conectivo, nervios, músculo liso, vasos sanguíneos y un sistema

lacunar (Johnson & Woods, 2007; McDonald, 2011). El sistema lacunar permite la eliminación

de la yema de los folículos grandes que sufren destrucción y regresión a través de un proceso

conocido como atresia explosiva. Este sistema proporciona espacios lo suficientemente grandes

en los que fagocitos pueden degradar la yema en unidades más simples que pueden ser

reabsorbidas y metabolizadas más fácilmente (Nili & Kelly, 1996). Se postula que las células

epiteliales que limitan el sistema lacunar se hipertrofian y adquieren propiedades fagocíticas para

reciclar la materia que había sido utilizada para la síntesis de vitelo (Claver et. al., 2008; Nili &

Kelly, 1996).

5

1.1.b Ovogénesis.

Las ovogonias son las células precursoras que forman los ovocitos (McDonald, 2011).

Durante el desarrollo embrionario, las oogonias sufren repetidas, pero finitas divisiones

mitóticas, dando lugar a un número disponible de células precursoras en el momento de la

eclosión del ave (McDonald, 2011). Las células resultantes de las divisiones mitóticas progresan

a la primera profase de la meiosis para convertirse en ovocitos primarios (Johnson & Woods,

2007). El número total de ovocitos primarios dentro del ovario de un embrión de pollo se

incrementa de aproximadamente 28.000 en el noveno día de incubación a 680.000 a los

diecisiete días. Luego el número de ovocitos primarios disminuye a 480.000 en el momento de

su nacimiento, y de estos sólo una pequeña fracción (200 a 500) desarrolla hasta la etapa pre-

ovulatoria (Johnson, 2000a; Johnson & Woods, 2007).

Los ovocitos primarios, permanecen en arresto meiótico desde el nacimiento del ave

hasta la pubertad (Johnson & Woods, 2007). La división reduccional para dar lugar al ovocito

secundario y a la expulsión del primer corpúsculo polar se da 24 horas antes de la ovulación y

culmina 2,5 a 1 hora antes de la ovulación (Johnson & Woods, 2007; Peralta & Miazzo, 2002).

Al momento de la ovulación, es el ovocito secundario el que pasa al oviducto. La segunda

división de la meiosis con la consecuente formación del óvulo y el segundo cuerpo polar se

produce en la primera porción del oviducto (McDonald, 2011).

1.1.c Crecimiento folicular y vitelogénesis.

El crecimiento progresivo de los folículos se debe a la acumulación creciente de vitelo

(yema) en el citoplasma del ovocito. El vitelo que se acumula proveerá todos los nutrientes

requeridos para el desarrollo del embrión. La deposición de proteínas y lípidos en el interior del

folículo ovárico (vitelogénesis), se inicia en la pollita cuando es muy joven y concluye justo

antes de la ovulación (24 horas antes de la ovulación) (Johnson, 2000a; Peralta & Miazzo, 2002).

La hormona FSH es la principal responsable del crecimiento y selección folicular (McDonald,

2011).

6

El hígado es el órgano donde se producen los precursores de las proteínas y lípidos del

vitelo que luego son transportados a través de la sangre hacia el ovario (Johnson, 2000a). La

formación de proteínas de la yema está regulada por gonadotropinas y hormonas esteroideas

(Johnson, 2000a; Johnson & Woods, 2007). El crecimiento folicular puede dividirse en tres

fases:

Fase inicial de crecimiento lento: Atañe al crecimiento inicial de los folículos

de 0,05 a 1mm de diámetro, es decir, tiene lugar en la transición de los folículos primordiales a

folículos primarios (Decuypere et. al., 1999; Johnson & Woods, 2007). Esta fase puede durar

desde meses hasta años (Decuypere et. al., 1999; Johnson, 2000a) y en este período se

depositan gotitas de lípidos en el ovocito (Peralta & Miazzo, 2002).

Fase intermedia de crecimiento: Corresponde a un período de varios meses de

cada vez más rápido crecimiento y se caracteriza por el depósito de gran cantidad de proteínas

(constituyentes del vitelo blanco) y pocos lípidos en el folículo (Decuypere et. al., 1999;

Johnson, 2000a; Peralta & Miazzo, 2002). El tamaño de los folículo por este depósito de

proteínas se incrementa hasta en un 400 % (Peralta & Miazzo, 2002).

Fase de crecimiento rápido: Se da durante los 7 a 11 días que preceden a la

ovulación y es cuando se produce el mayor depósito de lípidos y proteínas (Decuypere et. al.,

1999; Johnson, 2000a; Johnson & Woods, 2007; Peralta & Miazzo, 2002). El depósito de

lípidos y proteínas se realiza en capas concéntricas que desplazan a la célula germinal (ovocito

primario) hacia uno de los polos del folículo (Ángulo, 2009). En las gallinas se acumula un

promedio de 2 gramos de proteínas por día en el folículo, lo que le permite incrementar su

diámetro de 8 a 37 mm y su peso de 0,08 a 18 gramos (Decuypere et. al., 1999; Johnson,

2000a).

7

1.1.d Estructura y clasificación de folículos en la gallina doméstica.

El ovario de la gallina en postura contiene folículos en todas las etapas del desarrollo.

Los folículos se clasifican en: folículos primordiales en reposo; folículos primarios de

crecimiento lento; folículos pre-jerárquicos, folículos pre-ovulatorios, y folículos pos-ovulatorios

(figura 2) (Johnson, 2011).

Folículos primordiales y primarios: Son los más pequeños y se denominan

folículos pre-vitelogénicos pues aún no ha comenzado la acumulación de vitelo. Estos folículos

no protruyen desde la superficie y se encuentran inmersos en la corteza ovárica. Los folículos

primordiales poseen un ovocito en arresto meiótico rodeado por epitelio simple cuboidal

(membrana granulosa). En cambio, el ovocito de un folículo primario supera el arresto meiótico

y comienza un crecimiento lento que es independiente de la influencia de las gonadotropinas

(Johnson & Woods, 2007).

Los folículos primarios aparecen rodeados también por la granulosa formada por un

epitelio cúbico o cilíndrico simple. En el folículo primario factores secretados por la granulosa

reclutan células mesenquimales para formar las tecas. La granulosa y las tecas están separadas

por la membrana basal (figura 2) (Johnson & Woods, 2007). La membrana basal contiene

colágeno y fibronectina, y el depósito de estos componentes es regulado por hormonas

esteroideas y gonadotropinas (Johnson, 2000a).

Folículos prejerárquicos: Son más grandes (2-8 mm de diámetro) y algunos

pueden visualizarse a simple vista porque al ir aumentando de tamaño quedan suspendidos del

ovario. En estos folículos comienza la incorporación de vitelo, tomando inicialmente el nombre

de pequeños folículos blancos. A medida que los folículos acumulan más yema y aumentan

tamaño se convierten en pequeños folículos amarillos (Johnson & Woods, 2007).

Estructuralmente los folículos pre-jerárquicos poseen una capa acelular que rodea la

membrana plasmática del ovocito, llamada membrana perivitelina; la capa granulosa; la

membrana basal; y las tecas interna y externa (Johnson & Woods, 2007). La teca interna es la

zona vascularizada e inervada del folículo, mientras que la teca externa forma el soporte

8

estructural del folículo y está formada por fibras de colágeno, fibroblastos y células musculares

lisas (Johnson & Woods, 2007; Robinson & Renema, 2003).

La teca en su conjunto expresa niveles elevados de receptores para LH y FSH, y es

esteroidogénicamente activa (Johnson, 2000a; Johnson & Woods, 2007). En cambio, las células

de la granulosa de folículos pre-jerárquicos expresan gran cantidad de receptores para FSH,

pero poca cantidad de receptores de la hormona luteinizante (LH), y son esteroidogénicamente

inactivas (figura 4) (Johnson, 2000b; Johnson & Woods, 2007).

Figura 2. Organización de los folículos del ovario de la gallina doméstica durante su

desarrollo

(Johnson & Woods, 2007)

Folículos preovulatorios o jerárquicos: Son los folículos más grandes, también

denominados jerárquicos por ordenarse en un rango basado en el tamaño. El ovario de una

gallina en postura contiene 5 a 6 folículos preovulatorios grandes, llenos de vitelo. Se designan

como F1, F2, F3, F4, F5 y F6, siendo F1 el de mayor tamaño y el que está más próximo a

ovular. Los folículos preovulatorios constan de varias capas de tejido que rodean

inmediatamente al ovocito. De adentro hacia afuera las capas que poseen los folículos

preovulatorios son: la membrana plasmática del ovocito; la membrana perivitelina; la

granulosa; la membrana basal, y la teca interna y externa (figura 3) (Johnson, 2000a).

9

El folículo está rodeado también por epitelio ovárico y tejido conjuntivo que forman una

pared muy vascularizada excepto en la zona del estigma, una región avascular por donde se

romperá el folículo en la ovulación (Ángulo, 2009).

Figura 3. Relación de las capas de tejido del folículo pre-ovulatorio que rodean

inmediatamente al ovocito

(Cátedra Histología y Embriología, FCV-UBA)

Las células de la granulosa de los folículos preovulatorios expresan altos niveles de

receptores de LH, pero muy bajos niveles de receptores de FSH y además producen abundante

cantidad de esteroides sexuales, especialmente de progesterona (Johnson, 2000b). La

progesterona es el precursor de los andrógenos producidos en la teca interna y éstos, de los

estrógenos, producidos por la teca externa (figura 4) (Johnson, 2000a). La producción de

esteroides por parte de la granulosa y de la teca de los folículos preovulatorios es controlada

básicamente por la hormona LH (Johnson, 2000a).

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Figura 4. Síntesis de esteroides por parte de las células de la granulosa y de la teca de

folículos pre-jerárquicos y pre-ovulatorios (jerárquicos) en el ovario de la gallina ponedora

Nótese el modelo de tres células propuesto para la esteroidogénesis en los folículos preovulatorios y la

ausencia de actividad esteroidogénica en la granulosa de los folículos pre-jerárquicos (Johnson, 2000a)

(17α-OH-ase, citocromo P450 17α-hidrolasa; 3β-HSD, 3β-Hidroxiesteroide deshidrogenasa; FSH-R,

Receptor de la hormona FSH; LDL, Lipoproteína de baja densidad; LH-R; Receptor de la hormona LH;

SCC, complejo multienzimático dependiente del citocromo P-450 que escinde la cadena lateral del

colesterol; VIP-R, Receptor para Péptido intestinal vasoactivo) (Johnson, 2000a). .

11

Folículos postovulatorios (POFs): Después de la acción de LH y la ruptura del

folículo a lo largo del estigma, el ovocito primario ingresa al oviducto para completar su

división y posterior fecundación. En la ovulación, el ovocito sale rodeado sólo por la membrana

perivitelina. La estructura remanente de la ovulación está formada por la granulosa y la teca, y

constituye el folículo postovulatorio (Johnson & Woods, 2007). La capacidad para producir

esteroides por parte de la granulosa y la teca de un POF permanece por pocos días luego de la

ovulación, aunque el contenido de progesterona declina durante las primeras 15 horas (Johnson,

2000a; Johnson & Woods, 2007)

1.1.e Oviducto.

En las hembras que no han llegado a la madurez sexual, el oviducto es un tubo estrecho y

uniforme en diámetro. En el ave sexualmente activa, el oviducto se diferencia en cinco regiones:

infundíbulo, magnum, istmo, útero y vagina (figura 5) (McDonald, 2011):

Infundíbulo: Es la primera porción del oviducto mide alrededor de 9 cm (Sturkie,

1968). El infundíbulo capta el ovocito y éste permanece ahí por al menos 18 a 20 minutos (figura

5) (González, 2008; Johnson, 2000a). La capa chalacífera o primera capa de albúmina es

agregada al ovocito por las glándulas infundibulares (González, 2008; Johnson, 2000a). El

ovocito es fertilizado a nivel del infundíbulo (Johnson, 2000a).

Magnum: Es la porción más larga el oviducto y mide alrededor de 33 cm de

longitud (Johnson, 2000a; Sturkie, 1978). El epitelio superficial que tapiza la mucosa posee dos

tipos de células, ciliadas y secretorias. Las células secretorias producen avidina. El magnum

posee una mucosa bien desarrollada, rica glándulas tubulares. Las glándulas tubulares aportan la

mayor proporción de albúmina que formará la clara del huevo. El depósito de la albúmina en esta

parte del oviducto está regulado por estradiol (Ottinger & Bakst, 1995). El huevo permanece en

el magnum aproximadamente por 2 a 3 horas (figura 5) (González, 2008; Johnson, 2000a).

12

Figura 5. Esquema de la formación del huevo en la gallina

(http://www.huevo.org.es/el_huevo_formacion.asp)

13

Istmo: mide unos 10 cm de longitud y sus pliegues son más pequeños y finos que

los del magnum (Johnson, 2000a; Sturkie, 1978). Las glándulas del istmo forman las membranas

externa e interna de la cáscara (González 2008; Johnson, 2000a; Ottinger & Bakst, 1995). El

óvulo permanece en el istmo por 1 a 2 horas (figura 5) (Johnson, 2000a; Sturkie, 1978).

Útero: también llamado glándula cascarógena porque es donde se forma la

cáscara que rodea al huevo (Johnson, 2000a). Agua, sales y los pigmentos que le dan el color a la

cáscara son depositados por las glándulas uterinas en el huevo (González, 2008). La formación

de la cáscara se produce a través de un proceso de cristalización de calcita bajo el control de

progesterona (Ottinger & Bakst, 1995). El huevo permanece en el útero por 18-26 horas (figura

5) (Johnson, 2000a).

Vagina: es la porción terminal del oviducto que conduce el huevo hasta la cloaca

(Sturkie, 1968). Mide 10 a 12 cm de longitud (Sturkie, 1978) y no participa en la formación del

huevo, pero coordina su expulsión (figura 5) (González, 2008). En la unión con el útero, la

vagina presenta criptas glandulares donde se almacenan espermatozoides viables que son

gradualmente liberados durante 7 a 14 días (González, 2008; Johnson, 2000; Ottinger & Bakst,

1995).

Todo el epitelio del oviducto está cubierto por células ciliadas que facilitan el transporte

de espermatozoides (Johnson, 2000a). Mientras que la musculatura del oviducto facilita el

movimiento del huevo desde la ovulación hasta la puesta (Johnson, 2000a).

Basados en la descripción y caracterización realizada en los párrafos anteriores se

concluye que las funciones del ovario son producir hormonas sexuales femeninas y originar los

gametos sexuales (óvulos) (McDonald, 2011; UDEL, 2010). En tanto que la función del oviducto

es permitir la fecundación del óvulo y formar el huevo. Lógicamente, para que el ovario y

oviducto puedan cumplir con su rol reproductivo se requiere toda una cadena de procesos

neuroendócrinos.

14

1.2 Endocrinología del sistema reproductor femenino de las aves.

El sistema endócrino que permite que los componentes del aparato reproductivo de la

gallina funcionen de manera integral es el eje hipotálamo-hipófisis-ovario (Ottinger & Bakst,

1995). Las neuronas del hipotálamo integran tanto los estímulos externos (luz, temperatura,

otros) como los internos (agua, nutrición y demás) y así regulan la fisiología reproductiva

(Ubuka & Bentley, 2011). La luz es un factor determinante sobre la fisiología de la gallina, ya

que son reproductoras estacionales que responden a las variaciones de la longitud del día

(fotoperiodo) e intensidad lumínica (Armel, 2008).

La regulación del fotoperiodo en las gallinas está dada básicamente por receptores

ubicados en el hipotálamo. Cuando la duración del día es suficiente para iniciar el desarrollo

reproductor, la energía lumínica pasa a través del cráneo y se convierte en impulsos nerviosos

gracias a fotoreceptores localizados en la región medio-basal del hipotálamo (MBH) (Foster &

Kreitzman, 2005; Renema & Robinson, 2003; Robinson & Renema, 1999). Los fotoreceptores

del hipotálamo comprenden una población de neuronas que poseen un pigmento sensible a la luz

(Chicken VA (vertebrate ancient) opsina, cVA opsina) (Davies et. al., 2011). Estos

fotopigmentos tienen una sensibilidad espectral (490 nm) que coincide con el pico de

absorbancia de la respuesta fotoperiódica del ave (492 nm), permitiendo la máxima captura de

fotones dentro del hipotálamo (Davies et. al., 2011). Las neuronas que poseen el pigmento cVA

opsina, emiten proyecciones axonales que llegan a la pars tuberalis de la pituitaria anterior y

estimulan la secreción de la hormona tirotropina u hormona estimulante de la tiroides (TSH)

(Halford et. al., 2009). La TSH actúa sobre células epidendimarias especializadas, denominadas

tanicitos (localizados en la pared del tercer ventrículo), que poseen la enzima desyodasa tipo 2,

la cual convierte la prohormona T4 (Tiroxina) en hormona bioactiva T3 (Triyodotironida). La T3

permite la liberación de la hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH) desde la eminencia

media de la hipófisis (Halford et. al., 2009). Al igual que en mamíferos, la GnRH es el regulador

primario que a su vez permite la liberación de hormonas desde la hipófisis (Ubuka & Bentley,

2011).

En la hipófisis se sintetizan la hormona luteinizante (LH) y la hormona folículo

estimulante (FSH). Las hormonas LH y FSH regulan la función ovárica. Mientras la FSH

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controla el desarrollo y diferenciación folicular, la ovulación es regulada básicamente por la LH

(Decuypere et. al., 1996). Tanto la FSH como la LH actúan sobre receptores de la granulosa y la

teca de los folículos, influyendo en la producción de esteroides sexuales (estrógenos y

progesterona) (Ubuca & Bentley, 2011). A su vez las hormonas producidas por los folículos

ováricos regulan la síntesis de GnRH a través de retroalimentación vía sanguínea (Ottinger &

Bakst, 1995).

La ovulación es un proceso altamente complejo en las gallinas (Ubuka & Bentley, 2011).

En condiciones normales la ovulación conduce a la oviposición, por lo que estos dos procesos

fisiológicos están estrechamente ligados y coordinados. En la gallina doméstica, un ciclo de

ovulación-ovoposición (el tiempo entre la ovulación de un óvulo y la oviposición) oscila entre 24

a 28 horas (Johnson, 2000a). Con un régimen de luz clásico de 8 horas de oscuridad y 16 de luz,

la gallina pone un huevo al día durante varios días seguidos, pero como el periodo de formación

del huevo es superior a un día, la puesta se irá retrasando en el tiempo (Robinson & Renema,

1999). Además, hay variación en el tiempo entre la oviposición y la siguiente ovulación. La

ovulación del siguiente huevo ocurre 15 a 45 minutos después de la oviposición (Johnson,

2000a; Robinson & Renema, 2003). La estrecha relación entre la postura y la ovulación permite

emplear el tiempo de oviposición como un índice para determinar el tiempo de ovulación

(Ubuka & Bentley, 2011).

La “secuencia de puesta” es el número de huevos que produce una gallina de forma

continua. Cada secuencia se separa por uno o más días de pausa en los que el ave no pone ningún

huevo (Johnson, 2000a). Varias secuencias pueden proseguir sin interrupción a largo de un año o

más constituyendo el periodo de puesta de la gallina (Johnson, 2000a; Sturkie, 1978).

1.2.a Hormonas y Ovulación.

La ovulación consiste en la rotura a nivel del estigma del folículo preovulatorio más

grande (F1) y la captación por parte del infundíbulo del ovocito. El proceso de ovulación en las

gallinas en etapa reproductiva se da diariamente por un período prolongado de tiempo

(Decuypere et. al., 1999; Johnson, 2000a).

16

La hormona LH controla el proceso de ovulación (Decuypere et. al., 1999). Diez horas

antes de la ovulación se produce un pico crepuscular (que ocurre en el inicio de la oscuridad) de

LH, que tiene una periodicidad de 24 horas y actúa como una señal de temporización para un

aumento posterior y más marcado de la LH (Johnson & Van Tienhoven, 1980). Luego de este

primer pico de LH se genera un mínimo aumento de progesterona (P4) (Decuypere et. al., 1999).

La progesterona es sintetizada por los folículos preovulatorios y tiene un efecto de

retroalimentación positiva que permite se produzca un segundo y significativo aumento del nivel

plasmático de LH, pico preovulatorio, cuatro a seis horas antes de la ovulación (Decuypere et.

al., 1999; Etches & Cunningham, 1977; Johnson & van Tienhoven, 1980; Ottinger & Bakst,

1995).

Las concentraciones plasmáticas preovulatorias de LH alcanzan su punto máximo al

mismo tiempo o sólo un poco antes que los niveles máximos de P4 (Johnson & van Tienhoven,

1980; Johnson, 2000a). El pico de LH estimula la ruptura del folículo preovulatorio a lo largo del

estigma y la subsecuente ovulación (Johnson, 2000a).

La regulación de la ovulación por parte de las hormonas LH y progesterona, depende a su

vez de la liberación de GnRH desde el hipotálamo. Cerca de 6 horas antes que ocurra la

ovulación se presenta un aumento de la GnRH (Robinson & Renema, 2003). Los niveles

elevados de GnRH sumando a la retroalimentación positiva por parte de la progesterona se

traducen en el aumento de la LH preovulatorio (Johnson, 2000a; Robinson & Renema, 2003).

Un pico de 17β estradiol (E2) se produce conjuntamente con el pico preovulatorio de LH;

sin embargo la ovulación puede ocurrir en ausencia de E2 (Laguë et. al., 1975). La concentración

de otros esteroides ha sido estudiada durante el ciclo ovulatorio de la gallina, llegando a la

conclusión que la estrona (E1) y la 5α dihidrotestosterona (DHT) están más elevadas en sangre

seis horas antes de la ovulación, mientras que el pico de testosterona (T) precede en 8 horas a la

ovulación (Johnson & van Tienhoven, 1980).

Si bien hay un incremento de la concentración plasmática de FSH, 15 horas antes de la

ovulación, su papel en la ovulación está relacionado indirectamente con de la inducción de la

esteroidogénesis en las células de la granulosa de los folículos prejerárquicos (Johnson, 2000a;

Ubuka & Bentley, 2011).

17

1.2.b Hormonas y Oviposición.

La oviposición es el proceso por el cual el huevo es expulsado desde la vagina al medio

externo, luego de que se ha formado por más de 24 horas en el oviducto (Ubuka & Bentley,

2011). La expulsión del huevo requiere de la relajación de los músculos abdominales y de la

contracción de la musculatura de la pared uterina (Johnson, 2000a). La oviposición está regulada

por la arginina vasotocina (AVT), la mesotocina (MST), las hormonas ováricas y las

prostaglandinas (PG) (Johnson, 2000a; Ubuka & Bentley, 2011).

La MST es el homólogo no mamífero de la hormona oxitocina; sin embargo, es la AVT,

la que genera mayores efectos similares a la oxitocina en los procesos de contracción implicados

en la ovulación (Saito & Koike, 1992; Ubuka & Bentley, 2011; Ubuka & Bentley, 2011).

En el momento de oviposición, la concentración plasmática de AVT aumenta, mientras

su concentración en la neurohipófisis disminuye (Sasaki, Shimada & Saito, 1998). La elevación

de la AVT en plasma en el momento de la oviposición estimula la contracción uterina (Shimada

et. al., 1986).

Las prostaglandinas son otro factor endócrino que influencia directamente la oviposición

(Johnson, 2000a). La prostaglandina F2α (PG F2α) estimula por un lado la contracción de útero

y por otro la relajación de la vagina (Shimada & Asai, 1979). Las prostaglandinas E1 y E2

suprimen la motilidad vaginal (Wechsung & Houvenaghel, 1978).

1.2.c Función endócrina de los folículos.

La secreción endocrina de los folículos en las gallinas domésticas se da sólo en los

folículos vitelogénicos. Los esteroides sexuales producidos por los folículos tienen una variedad

de funciones relacionadas con la reproducción:

Los estrógenos: Son los responsables de estimular el desarrollo de las

características sexuales secundarias como, enrojecimiento y crecimiento de la cresta y las

barbillas; muda y cambio de color del plumaje, y estimulación del comportamiento sexual y de

anidación (Johnson, 2000a; McDonald, 2011; Robinson & Renema, 2003). Adicionalmente, los

18

estrógenos a nivel hepático estimulan la producción de proteínas de la yema (vitelogenina y

apolipoproteína), acompañado de un cambio significativo en el color y el tamaño del hígado

(Deely et. al., 1975; Johnson, 2000a; Robinson & Renema, 2003).

Los estrógenos participan en el mantenimiento del oviducto, dado que favorecen la

diferenciación del epitelio, y convierten al oviducto en un órgano secretor (Johnson, 2000a;

Robinson & Renema, 2003). Los estrógenos promueven la formación de glándulas tubulares

productoras de albúmina y regulan el metabolismo del calcio para la formación de la cáscara del

huevo, a través de la formación del hueso medular (Johnson, 2000a).

Los andrógenos: Producidos por el ovario de la gallina son responsables

conjuntamente con los estrógenos del crecimiento y coloración de la cresta y barbillas; así como

de la renovación del plumaje al llegar a la época de madurez sexual (Johnson, 2000a; Robinson

& Renema, 2003). Los andrógenos también regulan el metabolismo del calcio en el hueso

medular en conjunto con los estrógenos (Johnson, 2000a).

La progesterona: Es necesaria para la ovulación, pero también sirve como

precursor para la síntesis de andrógenos y testosterona por parte de la teca. Además participa en

la producción de albúmina en el oviducto, y para la formación de la cáscara del huevo (Johnson,

2000a; Johnson & Woods, 2007; Robinson & Renema, 2003)

Otros factores, hormonas y sustancias regulan la función reproductiva de las gallinas,

pero sin duda la fisiología reproductiva y el comportamiento sexual están gobernados

primordialmente por el control que ejerce la hormona GnRH sobre la secreción de las hormonas

hipofisarias (Ubuka & Bentley, 2011).

19

1.3 La GnRH como factor de liberación hormonal.

1.3.a Características principales de la hormona GnRH.

La hormona liberadora de gonadotropinas o GnRH (por sus siglas del inglés,

Gonadotrophin Realeasing Hormone) es un decapéptido que se sintetiza en el hipotálamo como

una pro-hormona de 92 aminoácidos (figura 6) (Flanagan et. al., 1997; Ortmann & Diedrich,

1999; Wetsel & Srinavasan, 2002).

La prohormona se cliva proteolíticamente para generar cuatro estructuras: péptido señal

(secuencia de 23 aminoácidos que dirige su incorporación al REG); la hormona GnRH de diez

aminoácidos; un sitio de procesamiento proteolítico de tres aminoácidos (Gly-Lys-Arg); y una

proteína asociada a GnRH (GAP), que posee 56 aminoácidos y cuya función se cree está

relacionada con el soporte conformacional de la GnRH (Chan et. al., 2009; Millar et. al., 2004;

Quintana & Flores, 2011; Wetsel & Srinavasan, 2002).

Figura 6. Estructura genómica de la pro-hormona GnRH-I mostrando las cuatro

estructuras que la componen.

(A) Diagrama de exones e intrones: regiones de codificación de los exones (cajas rosa); regiones no

codificantes de los exones (cajas verdes); intrones (líneas azules estrechas); intrón variante dentro del

primer exón (línea azul gruesa). (B) Alineación de las secuencias de aminoácidos de la pre-hormona de

GnRH-I a partir de 4 especies de mamíferos: péptido señal (zona delimitada en rojo); región para producir

el decapéptido de GnRH (zona amarilla); sitio de procesamiento proteolítico (zona delimitada en verde);

región que da lugar a la proteína GAP (región marcada en gris) (Chan et. al., 2009).

20

La disposición espacial del péptido correspondiente a GnRH, separado de la proteína

GAP por un sitio de procesamiento proteolítico sugiere que las enzimas que procesan la pro-

GnRH pueden ser similares en todas las especies (Wetsel & Srinavasan, 2002).

La forma biológicamente activa de la GnRH se supone contiene una curvatura en la

porción media de la molécula que facilitaría que los extremos carboxi terminal y amino terminal

se acerquen y activen el receptor de GnRH (figura 7) (Flanagan et. al., 1997, Karten y Rivier,

1986; Prieto & Velásquez, 2002).

Figura 7. Esquema de la estructura de la hormona GnRH

El extremo amino-terminal (azul) tiene un papel en la activación del receptor, mientras que el extremo

carboxi-terminal (rosa) es requerido para la especificidad y la alta afinidad de unión al receptor de GnRH

(Flanagan et. al. 1997).

1.3.b Tipos de GnRH.

La hormona GnRH fue aislada por primera vez en el hipotálamo de cerdos y ovejas

(Ammos et. al., 1971; Schally et. al., 1971). Este primer tipo de GnRH se denominó GnRH de

mamíferos o mGnRH, para diferenciarla de la segunda forma que fue aislada a partir de pollos y

es llamada “GnRH of chickens” o cGnRH (Miyamoto et. al., 1984). En la actualidad, se

conocen tres formas diferentes de GnRH con 14 variantes estructurales o isoformas

21

(Ramakrishnappa et. al. 2005; Kuo et. al., 2005). La mayoría de las especies animales posee dos

o tres isoformas de GnRH a la vez. Los tipos de GnRH son nombradas como, GnRH-I, GnRH-II

y GnRH-III (Flanagan et. al., 1997; Millar et. al., 2004).

La forma GnRH-I, es llamada también GnRH hipotalámica y corresponde a la aislada

inicialmente en mamíferos, por lo que también se la suele mencionar como mGnRH

(Ramakrishnappa et. al. 2005). Esta primera forma de mamíferos y sus contrapartes en no

mamíferos tiene una función predominante en la regulación de la pituitaria (Sealfon et. al.,

1997). El principal papel de la GnRH-I es estimular las células gonadotropas de la hipófisis para

producir hormonas gonadotrofinas (Ehlers & Halvorson, 2013). La estructura molecular de la

GnRH que originalmente se aisló de mamíferos es pEHWSYGLRPG-NH2 (Ubuka & Bentley,

2011).

La segunda forma de GnRH (GnRH-II) es aquella que fue identificada inicialmente en el

cerebro de pollo, por lo que se denomina también cGnRH. La cGnRH difiere en su estructura

molecular de la GnRH-I por tres aminoácidos en las posiciones cinco, siete y ocho (figura 8)

(Ubuka & Bentley, 2011). La hormona GnRH tipo II es la forma más común en vertebrados y

posee una estructura altamente conservada (Flanagan et. al., 1997; Ramakrishnappa et. al. 2005;

Sealfon et. al., 1997). Esta forma de GnRH tiene una distribución extrahipotalámica,

expresándose predominantemente en otros tejidos como, riñón, próstata, endometrio, ovario,

placenta y glándula mamaria (Sealfon et. al., 1997; White et. al., 1998; Millar, 2003; Skinner et.

al., 2009). La presencia de GnRH-II en otros tejidos presupone que tendría un papel como

neuromodulador (Jones, 1987; Ramakrishnappa et. al. 2005; Sealfon et. al., 1997).

La GnRH-III o telencefálica se encuentra mayormente en la porción terminal del nervio

olfatorio (Ramakrishnappa et. al. 2005). Esta tercera forma de GnRH fue descubierta en el

salmón y está presente en varias especies de peces (White et. al., 1998; Somoza et. al., 2002;

Yahalom et. al., 1999).

En el pollo (Gallus galllus domesticus) se han identificado dos isoformas de GnRH:

cGnRH-I y cGnRH-II (Sharp et. al., 1990). La isoforma cGnRH-I difiere sólo en el aminoácido

de la posición 8 con respecto a la mGnRH (figura 8) (Ubuka & Bentley, 2011)

22

Figura 8. Estructura molecular de la hormona GnRH

(Flanagan et. al., 1997; Wetsel & Srinavasan, 2002).

a Los aminoácidos están abreviados con tres letras; pGlu hace referencia a piroglutamo, Gly-NH2 es

amino glicina b Destacado en azul los aminoácidos que difieren de la GnRH de mamíferos.

c mGnRH: Forma de GnRH de mamíferos aislado por Matsuo et. al., 1971; cGnRH-I: descrita en pollos

por King & Millar, 1986; cGnRH-II: aislada por Miyamoto et. al., 1984.

1.3.c El receptor para GnRH.

El receptor para GnRH, GnRH-R, es miembro de la familia de receptores acoplados a

proteína G (GPCR). Estos receptores se componen de un única cadena de aminoácidos que

poseen un dominio amino terminal extracelular y siete segmentos hidrofóbicos (siete dominios

transmembrana) que forman un conjunto de α hélices que atraviesan la membrana y se conectan

por bucles extra e intracelulares (figura 9) (Flanagan et. al. 1997; Ortmann & Diedrich, 1999;

Ramakrishnappa et. al. 2005).

La hormona GnRH actúa principalmente a nivel de receptores hipofisarios, pero en

humanos, se han encontrado receptores de GnRH (GnRH-R) en otros tejidos como placenta,

endometrio, oviducto, testículos, próstata, glándulas mamarias y sistema nervioso central (Prieto

& Velásquez, 2002; Ramakrishnappa et al., 2005). Además, hay expresión de la hormona GnRH

y sus receptores en la granulosa, células luteales y células del epitelio superficial del ovario de

ratas, cerdos y humanos (In-Sun Hong, 2011; Jones et. al., 1980; Leung et. al., 2003; Ortmann &

Diedrich, 1999).

23

Figura 9. Representación bidimensional del receptor de GnRH para el ratón

Se puede observar los siete dominios transmembrana característicos de los GPCR, y los tres dominios

extracelulares e tres intracelulares (Flanagan et. al. 1997).

En concordancia con la existencia de varias formas de la hormona GnRH, se supone la

existencia de varios tipos de receptores para GnRH, que han evolucionado en conjunto con las

tres clases de ligandos presentes en los vertebrados (Troskie et. al., 1998). De las numerosas

formas disponibles para nombrar a los receptores para GnRH, a continuación se menciona la

clasificación filogenética que divide a los receptores presentes en los vertebrados en tres tipos

diferentes:

GnRH-R tipo I.- Están presentes en teleósteos, anfibios, reptiles, aves y

mamíferos (Millar, 2005). El receptor de GnRH tipo I contiene residuos conservados y

secuencias típicas para los miembros de la familia GPCR; sin embargo, en los mamíferos

carece de la cola carboxi-terminal citoplasmática que se encuentran en los otros GPCR

(Flanagan et. al. 1997; Naor et. al., 1998). La ausencia de la cola carboxiterminal conduce a

una lenta internalización y a una falla en la desensibilización del receptor (McArdle et. al.,

1995). Este tipo de receptor en los mamíferos es más sensible para la GnRH-I; en cambio en

los no-mamíferos el GnRH-R-I responde mejor a la GnRH-II (Millar, et. al., 2001; Wang et.

24

al., 2004). GnRH-R-I se expresa principalmente en las células gonadotropas de la pituitaria

(Ijzerman & Heitman, 2014).

GnRH-R tipo II.- Dentro de este grupo están receptores de los anfibios, reptiles y

mamíferos. Sin embargo, el GnRH-R tipo II no es funcional como GPCR en ciertos

mamíferos como los hombres, los simios y los ratones de laboratorio (Millar, 2005; Sower,

et. al. 2012). Los GnRH-R-II poseen colas carboxi-terminales y responden mejor ante la

GnRH II (Millar, 2003; Wang et. al., 2004). Por lo tanto, en los mamíferos donde el receptor

tipo II es inactivo, la GnRH II es capaz de unirse el receptor de tipo I. La unión de la GnRH

II con el GnRH-R-I genera una respuesta fisiológica pero a través de un mecanismos de

señalización diferente a la de GnRH I (Millar, 2005). Los receptores tipo II tienen una

distribución similar a la GnRH II en el sistema nervioso y, en particular, en áreas asociadas

con el comportamiento sexual, así como en tejidos reproductivos (Millar, 2003).

GnRH tipo III.- En este grupo se incluyen receptores de teleósteos, peces,

anfibios, reptiles y aves (Sower, et. al. 2012).

A partir de comparaciones de homología, la clasificación de los tipos de GnRH-R

parecería incorrecta. Así los receptores tipo I no mamíferos alcanzan un identidad aminoacídica

máxima de 58-67%, y el porcentaje de identidad para las secuencias entre los receptores no

mamíferos y mamíferos llega a 42-47%. Las similitudes en las micro-dominios (especialmente,

en el loop externo, EC3) son las que apoyan y definen la clasificación (Millar, 2005).

La gallina doméstica posee dos subtipos de receptores para GnRH, cGnRH-R-I y

cGnRH-R-III (Joseph et. al., 2009). El subtipo cGnRH-R-I pertenece al tipo I, mientras que el

cGnRH-R-III está incluido dentro del tipo III de GnRH-Rs.

La clonación del cGnRH-R-I se llevó a cabo por Dunn y colaboradores (1993) a partir

ARN del hipotálamo de pollos. El papel de los dos tipos de receptores, fue luego diferenciado

por clonación y comparación de estructuras y propiedades farmacológicas. Los resultados de esta

25

última investigación proponen que el cGnRH-R-III es probablemente el principal mediador de la

función de la GnRH en la pituitaria del pollo (Joseph et. al., 2009).

A nivel del ovario de las aves, existen muy pocas referencias sobre la presencia de GnRH

y sus receptores. El único trabajo encontrado al respecto determinó la presencia de la hormona

GnRH-I y su receptor (GnRH-R-I) por inmuhistoquímica, slot/western blot e inmunoblotting, en

las células de la granulosa y teca de los folículos previtelogénicos y vitelógenicos del Bengalí

rojo (Amandava amandava), paseriforme de la familia Estrildidae (Padmasana et. al., 2007).

1.3.c Fisiología de la hormona GnRH.

El sistema básico de control reproductivo es el eje hipotálamo-hipófisis-gonadal (Ottinger

& Bakst, 1995). La hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH) se secreta de manera

pulsátil y, como ya se mencionó, actúa principalmente a nivel de receptores hipofisarios. Los

receptores están distribuidos en forma regular sobre la superficie de células especializadas en

producir gonadotropinas y por tanto denominadas gonadotropos. La unión de la GnRH con su

receptor provoca la liberación de las gonadotrofinas (Prieto & Velásquez, 2002).

La unión de la hormona GnRH con su receptor origina invaginaciones en la membrana

plasmática a través de las que se da la internalización del complejo hormona receptor (Edwards

& Brody, 1995; Terán et. al., 2008). El complejo hormona-receptor es disociado por endosomas

en el interior de la célula y gran número de receptores regresa a la superficie celular para ser

reutilizados (retroalimentación positiva). Si la exposición a la GnRH es continua, los receptores

"internalizados" no retornan a la superficie, produciendo una retroalimentación negativa

(Edwards & Brody, 1995; Terán et. al., 2008).

La acción de la GnRH sobre los gonadotropos está mediada por mecanismos

dependientes de calcio/calmodulina (Calderón & Tresguerres, 2008). En primera instancia, la

GnRH es reconocida por su receptor y este complejo interactúa con una proteína G de la

membrana celular. La proteína G permite el intercambio de difosfato de guanosina (GDP) a

trifosfato de guanosina (GTP). La proteína G al unirse al GTP activa la enzima fosfolipasa C

(PLC) que hidroliza el fosfatidilinositol 4,5 difosfato (PIP2) (Edwards & Brody, 1995; Terán et.

al., 2008). Tras la fosforilación se generan dos segundos mensajeros, el inositol-1, 4,5 trifosfato

26

(IP3) y el 1,2-diacilglicerol (DAG). El primer mensajero aumenta el calcio intracelular y

desencadena la liberación por exocitosis de las gonadotropinas preformadas. El diacilglicerol

activa la proteína quinasa C (PKC), lo cual induce los genes específicos para la síntesis de las

gonadotropinas (Edwards & Brody, 1995; Terán et. al., 2008). En resumen, la hormona GnRH

se une a su receptor en las gonadotropas y esto activa fosfolipasas, calmodulina y proteína

quinasa C para producir y liberar gonadotropinas (Husulak, 2012).

La GnRH en las aves, tal y como en los mamíferos, estimula la secreción de

gonadotrofinas a nivel hipofisario (Ottinger & Bakst, 1995; Millar et. al., 1986; Padmasana et.

al., 2007). Las hormonas producidas en la hipófisis, la hormona FSH y la hormona LH, regulan

la esteroidogénesis y gametogénesis (Yu et. al., 2011; Ottinger & Bakst, 1995; Padmasana et.

al., 2007; Prieto & Velásquez, 2002). En consecuencia, la GnRH es el principal regulador de las

funciones reproductivas, debido a que controla indirectamente la secreción de las hormonas

esteroidales y la producción de gametos (Yu et. al., 2011; Ottinger & Bakst, 1995; Padmasana

et. al., 2007; Prieto & Velásquez, 2002).

La secreción de LH aumenta por acción de la GnRH tanto in vivo como in vitro.

Inyecciones de GnRH aumentan los niveles de LH en el plasma del gorrión de corona blanca

(Zonotrichia leucophrys) y del estornino pinto (Sturnus vulgaris) (McNaughton et. al., 1995;

Osugi et. al., 2004; Wingfield et. al, 1979). La inyección de cGnRH-I o cGnRH-II en pavas

también estimula un aumento en los niveles plasmáticos de LH. En los cultivos de células de

hipófisis provenientes de pavos y codornices, la secreción de LH aumenta luego de la

incorporación en el cultivo de la hormona GnRH (Connolly & Callard, 1987; You et. al., 1995).

La hormona GnRH también incrementa la liberación de la hormona FSH. En las

codornices, tanto cGnRH-I como GnRH-II pueden estimular la liberación de FSH in vivo e in

vitro, pero esta capacidad de estimulación es menos marcada comparada con la liberación de LH

(Hattori et al., 1985; Hattori et. al., 1986).

En el Gallus gallus domesticus también se han investigado las funciones de cGnRH-I y

GnRH-II. La GnRH-II tiene una mayor afinidad de unión por los receptores presentes en la

especie y es más potente en la estimulación de la acumulación de inositol trifosfato previa la

liberación de las gonadotrofinas (Sun et. al, 2001a; 2001b). Sin embargo, se sugiere que la

secreción de gonadotrofinas es regulada mayormente por la cGnRH-I, mientras que GnRH-II no

27

promueve directamente la secreción de LH y FSH (Sharp et. al., 1990). Esta hipótesis surgió al

observarse que la inmunización de gallinas ponedoras contra cGnRH-I, pero no contra GnRH-II,

producía una disminución en la concentración plasmática de LH que se acompañaba de la

regresión completa del sistema reproductor (Sharp et. al., 1990). Así también, cuando cGnRH-I

se administra en gallos, las concentraciones plasmáticas de FSH no se afectan, pero si se

estimula significativamente la secreción de LH (Krishnan et al., 1993). In vitro, también se ha

comprobado que la isoforma cGnRH-I actúa sobre células de la pituitaria anterior de los pollos

para estimular la liberación de LH y FSH (Liu et. al, 1995; Millar & King, 1983; Soñez et. al.,

2009).

A pesar que la actividad fisiológica de la cGnRH-I, se correlaciona con una mayor

concentración de esta isoforma en cortes de cerebros de pollos analizados mediante

radioinmunoensayos (RIA), la GnRH-II es producida por el cerebro pero en cantidades bajas

(Sharp et. al., 1990; Ubuka & Bentley, 2011). Por lo tanto, no es de extrañar que las dos

isoformas de GnRH (cGnRH -I y GnRH-II), puedan estimular la liberación de LH y FSH en

cultivos de células provenientes de pituitaria de pollos (Millar et. al., 1986). Sin embargo,

investigaciones realizadas con el gorrión de corona blanca sugieren que la función de la cGnRH-

II estaría relacionada con el comportamiento sexual de las hembras. La hipótesis surgió al

observar que cGnRH-II mejoraba el comportamiento femenino de cortejo, mientras que cGnRH-

I no mostraba efecto sobre dicho comportamiento (Maney et. al, 1997).

La regulación de la biosíntesis de gonadotropinas por parte de la GnRH, incluye la

intervención de varias hormonas ováricas como, inhibina, activina y esteroides sexuales. Dicha

intervención, induce cambios en la expresión de los genes de las subunidades α y β de la FSH y

LH (Terán et. al., 2008).

La presencia de receptores de GnRH en otros órganos y tejidos permite suponer una

regulación paracrina o autocrina, dado que la hormona tiene una vida media muy corta y sus

concentraciones plasmáticas son bajas (Padmasana et. al., 2007; Prieto & Velásquez, 2002). Las

funciones biológicas que la hormona GnRH tiene a nivel ovárico son diversas (Leung et. al.,

2003). En ratas se probó que, tras inyectar agonistas de GnRH, esas funciones se relacionaban

con la jerarquización folicular, la producción de hormonas esteroideas y la apoptosis de los

folículos (Srivastava et. al., 1995). Además se ha demostrado que la GnRH modula la

28

esteroidogénesis (Leung et. al., 2003) y que sus agonistas inducen directamente la apoptosis en

las células de la granulosa de los humanos y ratas (Kogo et. al., 1999; In-Sun Hong, 2011).

En las aves, la eliminación de folículos en vías de desarrollo (atresia folicular), así como

la reabsorción de folículos postovulatorios, se dan también a través de procesos de apoptosis

(Johnson, 2000a; Mussche, 2004; Tilly et al., 1991); sin embargo, se desconoce la influencia

directa de GnRH sobre procesos apoptóticos de la granulosa aviar. Aunque cabe mencionar que

se verificó una mayor producción de fibronectina en cultivos primarios de células de la

granulosa luego de la adición de cGnRH-I y/o cGnRH-II (Asem & Novero, 1993). Se considera

dado este aumento de fibronectina que los dos tipos de cGnRH son capaces de modular

directamente la fisiología del ovario aviar (Asem, & Novero, 1993). Además, en cultivos de

células de la granulosa de folículos F1 y F2, la producción de progesterona en respuesta a LH se

incrementa significativamente si se realiza una incubación previa con la hormona GnRH-I

(Hertelendy et al., 1982).

1.3.d Análogos de la GnRH.

El conocimiento de la secuencia peptídica de la GnRH ha permitido desarrollar

compuestos químicos cuya estructura semejante a dicha hormona (análogos) les permite tener

una acción similar a la originada naturalmente por la hormona (agonistas) o un efecto opuesto

(antagonistas).

Los agonistas de GnRH tienen un D-aminoácido en la posición 6 y/o 10 que aumenta la

estabilidad frente a la degradación enzimática, incrementado además su vida media y afinidad al

receptor (Husulak, 2012). La afinidad de los agonistas de GnRH aumenta gracias a la

introducción en el sexto aminoácido de residuos hidrofóbicos; mientras más hidrófobo es el

aminoácido, mayor es la afinidad al receptor (Karten & Rivier, 1986). Dentro de los agonistas

más comúnmente utilizados está el acetato de leuprolide (LA), que presenta D-Leucina en la

posición 6 y etilamina en la posición 10 (figura 10).

29

Figura 10. Estructura molecular de GnRH versus los análogos más frecuentemente usados

(Husulak, 2012).

En la práctica veterinaria, la versatilidad de las propiedades funcionales de los agonistas

de GnRH ha sido explotada para el manejo de una variedad de desórdenes reproductivos con

varios grados de éxito (D’Occhio & Aspden, 1999; Rajamahndran et. al., 2001; Thatcher et. al.,

1993). Los agonistas de GnRH se emplean rutinariamente en varios regímenes de tratamiento

que incluyen la sincronización de estro y ovulación, inducción de ovulación postparto y la

supresión reversible de la actividad ovárica por períodos extendidos (D’Occhio & Aspden,

1999).

Uno de los inconvenientes potenciales de la utilización de agonistas de la GnRH es el

llamado "efecto bengala". El efecto bengala se refiere al aumento transitorio en la liberación de

LH y FSH a partir de gránulos secretores en respuesta inicial al tratamiento, luego de lo cual la

saturación de los GnRH-Rs produce una caída dramática de las concentraciones de FSH y LH

(Ehlers & Halvorson, 2013).

Los antagonistas de GnRH se caracterizan por la modificación de los extremos

piroglutámico y glicínico (posiciones 1 y 10) (Yen, 2001). También se trabaja con la deleción y

la sustitución de las D-aminoácidos hidrófobos de las posiciones 1, 2 y 3, que son los

aminoácidos responsables de la activación de los receptores de GnRH (Quintana & Flores, 2011;

Yen, 2001). Estos análogos actúan mediante la unión y bloqueo competitivo con los receptores

de GnRH (Quintana & Flores, 2011). Los antagonistas de GnRH tienen la ventaja de poseer una

rápida acción (Ehlers & Halvorson, 2013). En humanos los antagonistas de la GnRH se han

usado principalmente para tratar la infertilidad y el cáncer de próstata en estadios avanzados (Tan

& Bukulmez, 2011).

30

Bajo su forma comercial el leuprolide (Lupron®) es empleado para tratar la puesta

crónica de huevos de las aves ornamentales. El Lupron, como agonista de GnRH, ayuda a

disminuir el nivel de las hormonas de la reproducción y por tanto detiene la producción de

huevos (Molenda, 2006).

Los análogos de GnRH se han usado para generar la muda forzada en gallinas ponedoras

y reproductoras (Attia et. al., 1993; Burke & Attia, 1994; Dickerman & Bahr, 1989). La muda o

replume es la fase del ciclo reproductivo de las aves en el cual se produce la involución del

aparato reproductor; éste evento se caracteriza por el cese de postura y la pérdida de plumaje

(Galeano et. al., 2010).

El uso de acetato de leuprolide ha sido comparado con el método tradicional de

restricción alimentaria para inducir muda forzada en gallinas ponedoras. Los resultados

mostraron que el leuprolide, ya sea bajo la forma de implantes subcutáneos o a través de

inyecciones intramusculares producía el cese de la postura mucho antes que el método

tradicional (Burke & Attia, 1994; Dickerman & Bahr, 1989). Adicionalmente, las aves tratadas

con leuprolide, como inductor de muda forzada, no sufren una pérdida excesiva de peso corporal

y alcanzan niveles similares de producción de huevos en la etapa pos-muda (Burke & Attia,

1994; Dickerman & Bahr, 1989). El empleo de leuprolide en las gallinas ponedoras es capaz de

originar una adecuada regresión ovárica y oviductual manifestada por la correspondiente

disminución del peso de dichos órganos (Dickerman & Bahr, 1989).

Los estudios realizados con en gallinas ponedoras demuestran el uso potencial de

leuprolide como un método eficiente y apegado al bienestar animal para producir la muda. Sin

embargo, su empleo está limitado en parte por los costos relativos de este enfoque farmacológico

versus las técnicas de privación alimentaria (Burke & Attia, 1994).

No existen referencias bibliográficas que mencionen la influencia directa de los análogos

de GnRH sobre el proceso de regresión ovárica observado durante su empleo para inducir muda

forzada. Tampoco se encontró información que vincule los agonistas de GnRH o la propia GnRH

con la apoptosis fisiológica normal del ovario del Gallus gallus domesticus.

31

2. EL PROCESO DE LA APOPTOSIS

2.1 Definición de apoptosis

El término apoptosis fue tomado del griego “αποπτοσισ”, apo (aparte) y ptosis (caído),

que describe la caída de las hojas de los árboles o de los pétalos marchitos de una flor (Arango

et. al, 1997; Ávila, 2000; Gómez & Zentella, 2010). La apoptosis suele mencionarse como

suicidio celular porque las células se auto eliminan sin dejar cicatrices ni dañar al tejido

circundante (Jordán, 2003; Villamor, 2006).

La apoptosis se define como un proceso de muerte celular fisiológica dependiente de un

programa genético, controlado por mecanismos moleculares complejos, y donde la célula

participa de forma activa (Arango et. al., 1997; Ramírez et. al., 1999; Dubin & Sttopani, 2000;

Hall, 1999; Pérez et. al., 2005).

Se considera que la apoptosis está gobernada genéticamente porque todas las células

poseen genes que pueden inducir señales de muerte en respuesta a determinadas condiciones

fisiológicas o factores externos (Arango et. al., 1997).

2.2 Características morfológicas y bioquímicas diferenciales entre necrosis y

apoptosis.

La muerte celular puede ocurrir a través de tres formas, necrosis, autofagia o apoptosis

(Ávila, 2000). Existen características funcionales y morfológicas diferentes entre los tipos de

muerte celular (Ramírez et. al., 1999).

La autofagia consiste en una serie de procesos catabólicos en los que distintos materiales

citoplasmáticos (proteínas, orgánulos, entre otros) son secuestrados en autofagosomas y

degradados mediante la fusión con lisosomas y su digestión por las hidrolasas que contienen

(Gasco, 2011). La característica básica de la autofagia es la masiva acumulación de vacuolas de

doble membrana conteniendo orgánulos o material citoplasmático parcialmente degrado (Levine

32

& Kroemer, 2008). A pesar que la autofagia es morfológica y metabólicamente diferente de la

apoptosis, se pone especial atención en las diferencias que hay entre la apoptosis y necrosis.

La primera diferencia entre necrosis y apoptosis radica en el origen del proceso. De este

modo, la necrosis ocurre por anomalías no fisiológicas, es decir, frente a determinadas injurias

como por ejemplo, altas dosis de compuestos tóxicos, hipertermia, privación de oxígeno o ataque

de gérmenes. Las mencionadas anomalías exceden la capacidad de la célula para regenerarse y

originan la muerte por necrosis (Ramírez et. al., 1999; Frago et. al., 2001; Roseto & Brenner,

1999). Por otra parte, la apoptosis es una muerte fisiológica, que se activa para eliminar células

dañadas o permitir la remodelación y crecimiento de tejidos (Ávila, 2000; Gasión et. al., 2005;

Alfaro et. al., 2000).

Desde el punto de vista bioquímico, tanto el suministro de energía como la síntesis de

proteínas difieren entre apoptosis y necrosis (Gasión et. al., 2005). La necrosis es pasiva, y en

consecuencia, hay una depleción súbita del requerimiento o simplemente no hay requerimiento

de energía en forma de ATP (trifosfato de adenosina) (Berrera & Pimienta, 2009; Jordán, 2003).

Al contrario, la apoptosis requiere, por su carácter activo, de un aporte permanente ATP (Berrera

& Pimienta, 2009). En cuanto a síntesis de proteínas, la apoptosis es un proceso dependiente de

ellas, mientras que en la necrosis la síntesis de proteínas se interrumpe (Gasión et. al., 2005).

Los cambios morfológicos que presentan las células también difieren entre los dos tipos

de muerte celular. La necrosis se caracteriza por el edema o hinchamiento celular, generado tras

la pérdida de la permeabilidad de la membrana celular, y el ingreso de fluidos que terminan por

romper la membrana celular y liberar el citoplasma e hidrolasas en sus alrededores (figura 11).

La liberación del contenido celular afecta a las células adyacentes y propicia la aparición de una

reacción inflamatoria (Berrera & Pimienta, 2009; Frago et. al., 2001; Jordán, 2003; Alfaro et. al.,

2000; Ramírez et. al., 1999). En la apoptosis, se preserva la integridad de la membrana hasta el

final del proceso de muerte celular. In vivo, no se puede apreciar ésta lisis membranosa porque

las células son eliminadas por fagocitosis luego de la formación de cuerpos apoptóticos y antes

de la desintegración de la membrana celular (figura 11). Como consecuencia de la no liberación

del contenido celular, en la apoptosis no se induce respuesta inflamatoria (Berrera & Pimienta,

2009; Frago et. al., 2001; Gasión et. al., 2005; Alfaro et. al., 2000). Algunas divergencias

33

morfológicas y bioquímicas existentes entre la necrosis y apoptosis están relacionadas con las

alteraciones a nivel nuclear y de orgánulos citoplasmáticos:

Alteraciones nucleares: La cromatina en la célula apoptótica se condensa

formando grumos densos que se desplazan hacia la superficie de la membrana nuclear (figura

11) (Ramírez et. al., 1999). A pesar que la membrana nuclear se fragmenta en diversas

estructuras con contenido variable de cromatina, la estructura de estos fragmentos nucleares

permanece intacta (Gómez & Zentella, 2010; Ramírez et. al., 1999). A nivel bioquímico, en los

procesos de apoptosis tanto la topoisomerasa como las láminas están afectadas (Ramírez et. al.,

1999). Por otro lado, si bien en la necrosis también se presentan agregaciones de cromatina, la

condensación es laxa y de localización difusa (Gómez & Zentella, 2010).

Figura 11. Ilustración de las características morfológicas de la muerte celular por necrosis

y apoptosis

(http://retina.umh.es/docencia/confsvivos/temas/apoptosis/apoptosis.html)

34

La fragmentación o destrucción del ADN: En la apoptosis es ordenada y

producida por endonucleasas que originan fragmentos de un tamaño definido (fragmentos de 180

a 200 pares de bases o múltiplos de los mismos) (Casadelvalle, 2006; Gómez & Zentella, 2000;

Ramírez et. al., 1999). Dichos fragmentos son característicos desde el punto de vista molecular

para el proceso apoptótico (Casadelvalle, 2006). En la necrosis, la fragmentación del ADN es

desordenada e irregular (fragmentos de ADN de diversos tamaños, patrón de barrido) y

gestionada por nucleasas lisosomales (Dubin & Stoppani, 2000; Gómez & Zentella, 2010).

Integridad de orgánulos citoplasmáticos: En los procesos de necrosis celular

hay daño de los orgánulos citoplasmáticos, incluyendo la dilatación de mitocondrias y retículo

endoplasmático, más la formación de vacuolas (Frago et. al., 2001; Gómez & Zentella, 2010).

Por su parte, en la apoptosis las mitocondrias se muestran sin modificaciones visibles, aunque

hay una pérdida de su potencial transmembrana (Ramírez et. al., 1999). Además, en la apoptosis

el retículo endoplasmático luego de un engrosamiento termina por desestructurarse (Dubin &

Stoppani, 2000; Ramírez et. al., 1999).

2.3 Mecanismos y moléculas implicadas en la apoptosis.

Los cambios morfológicos semejantes entre los distintos tipos de células, así como el alto

grado de conservación de los genes implicados en la apoptosis, sugieren que los mecanismos

relacionados con dicho proceso se basan fundamentalmente en enzimas que, una vez activadas,

inician el programa de muerte celular (Casadelvalle, 2006; Gómez & Zentella, 2010). La

apoptosis es por lo tanto un proceso conservado en el cual la célula recibe una señal que

desencadena la muerte (Casadelvalle, 2006; Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

El estímulo puede ser externo o producido en el interior de la célula (Casadelvalle, 2006).

Los estímulos apoptogénicos extracelulares pueden ser drogas citotóxicas, glucocorticoides,

inmunoglobulinas, entre otros (Casadelvalle, 2006; Dubin & Sttopani, 2000). Estas señales

extracelulares originan apoptosis tras la unión de un ligando a su respectivo receptor en la

membrana celular; a esto se lo denomina apoptosis mediada por la vía extrínseca (Sánchez-

Torres & Vargas, 2003). En tanto que, las señales intracelulares median su acción

35

independientemente de receptores y se relacionan mayormente con la ausencia de ciertos factores

de crecimiento, estrés biológico o daño del ADN, que desencadenan la liberación de sustancias

apoptóticas desde las mitocondrias, y a esto se lo llama apoptosis por vía intrínseca

(Casadelvalle, 2006; Roseto & Brenner, 1999; Salazar, 2009; Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

Vía extrínseca: La activación de receptores en la membrana citoplasmática se da

a través de su unión a ligandos específicos. Existen dos tipos de receptores de membrana que

participan en el proceso de apoptosis. Los receptores de muerte (death receptors, DR), cuya

activación siempre lleva a la muerte de la célula; y los receptores que poseen otra función

fisiológica, pero cuya sobre activación puede conducir también a la apoptosis (por ejemplo los

receptores de glutamato y trombina) (Jordán, 2003). Los DR pertenecen a la superfamilia de

receptores del factor de necrosis tumoral o TNF (Frago et. al., 2001; Gasco, 2011). Entre los

principales DR se tiene, TNFR-1 (receptor del factor de necrosis tumoral 1); APO1/FAS/CD95

(Apoptosis antigen-1), y TRAILR-1 (TNF-related apoptosis inducing ligan receptor 1) (García,

2007). Los receptores de muerte se caracterizan por poseer un dominio extracelular rico en

cisteína, un dominio transmembrana simple y un domino intracelular (Frago et. al., 2001; Jordán,

2003). El dominio citoplasmático se conoce como “dominio de muerte” y es el que tras la unión

ligando receptor, permite el reclutamiento de proteínas adaptadoras que desencadenan la

apoptosis (Frago et. al., 2001; Jordán, 2003; Roseto & Brenner, 1999).

Las proteínas adaptadoras aseguran que la unión ligando receptor genere una cascada

proteolítica (Frago et. al., 2001). APO1/Fas/CD95 y TRAILR-1 interaccionan directamente con

la proteína adaptadora FADD (Fas Associated Death Domain) (García, 2007). El receptor

TNFR-1 se conecta con la proteína adaptadora TRADD (TNFR-Associated Death Domain)

(García, 2007). Estas proteínas adaptadoras se asocian ya sea con un dominio DED (Death

Efector Domain), o bien con un dominio CARD (Caspase Recruitment Domain), que se

encuentra presentes solo en el extremo N-terminal largo de las caspasas iniciadoras (figura 12)

(Frago et. al., 2001).

Al unirse FADD o TRADD a las caspasas iniciadoras (como por ejemplo la caspasa 8) se

forma una compleja multiproteína de alto peso molecular conocida como complejo DISC

(Death-Inducing Signaling Complex) (figura 12) (Vázquez-Nin et. al., 2011). DISC es un

complejo de señalización para la oligomerización y autoclivaje de la caspasa 8 (Vázquez-Nin et.

36

al., 2011). Luego de este proceso autocatalítico, la caspasa 8 se libera del DISC y es capaz de

cortar y activar a las caspasas efectoras, caspasa 3, 6 y 7 (figura 12) (Frago et. al., 2001;

Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

La acción de las caspasas efectoras sobre sustratos específicos lleva al desarrollo de la

mayor parte de cambios morfológicos y bioquímicos característicos de la apoptosis (García,

2007; Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

Figura 12. Vía extrínseca de la apoptosis

(García, 2007)

Como alternativa, la caspasa 8 una vez activa puede proteolizar Bid, que es una proteína

proapoptótica perteneciente a la familia Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) y que se encuentra

normalmente inactiva en el citosol (García, 2007; Frago et. al., 2001). La proteína Bid al ser

lisada forma un fragmento truncado (tBid) que hace disminuir el potencial de membrana

mitocondrial (García, 2007). En consecuencia, la membrana mitocondrial se permeabiliza y

permite la salida de citocromo C que activa Apaf-1 (Apoptotic Protease Activating Factor 1) y a

la vez activa la vía intrínseca (figura 12) (García, 2007; Frago et. al., 2001; Sánchez-Torres &

Vargas, 2003).

37

Vía Intrínseca: Varios estímulos que alteran la homeostasis intracelular pueden

afectar la estructura de la membrana mitocondrial originando un incremento de su permeabilidad

(García, 2007; Gasco, 2011). La alteración de ésta membrana permite la liberación, desde el

espacio intermembrana de las mitocondrias, al citoplasma de sustancias proapoptóticas (figura

13) (García, 2007; Martínez, 2009). Entre las proteínas que son liberadas al citosol destacan,

Citocromo C; SMAC/DIABLO (Second Mitochondrial Activator of Caspases/Direct IAP

Binding protein with Low PI); serina proteasa HtrA2/Omi (High Temperature Requirement

Serine proteasa), AIF (Apoptosis Inducing Factor), ENDOG (endonucleasa G) y CAD (Caspase-

Activated DNase) (García, 2007; Martínez, 2009).

El Citocromo C se une a la proteína Apaf 1 para en presencia de ATP, reclutar y activar a

la procaspasa 9 (Sánchez-Torres & Vargas, 2003). El complejo formado por Citocromo C/Apaf-

1/caspasa 9 es conocido como apoptosoma y es el encargado de activar la caspasa efectora 3

(figura 13) (García, 2003). La caspasa-3 hidroliza sustratos específicos y desencadena la

apoptosis celular.

Figura 13. Vía intrínseca de la apoptosis

(http://www2.uah.es/daviddiaz/Apoptosis/viaintrinseca.htm)

Las proteínas SMAC/DIABLO y HtrA2/Omi promueven la apoptosis mediada por

caspasas al bloquear IAPs (Inhibidores de Proteínas Apoptóticas) (García, 2007; Martínez,

2009). AIF, ENDOG y CAD una vez liberados al citoplasma, entran en el núcleo y permiten la

38

activación de endonucleasas (García, 2007; Martínez, 2009). Entonces, estas proteínas median

los mecanismos de apoptosis de manera independiente de las caspasas (García, 2007).

Los linfocitos T citotóxicos son capaces de matar las células diana a través de la vía

extrínseca y la interacción FasL/FasR es su manera habitual de inducir apoptosis (Brunner et. al.

2003). Sin embargo, estos linfocitos pueden ejercer sus efectos citotóxicos en las células

tumorales o infectadas por virus a través de una vía que implica la secreción de una molécula

transmembrana formadora de poros, la perforina (Trapani & Smyth, 2002).

Vía perfonina/granzimas: La perforina permite la liberación (a través del poro

formado por dicha molécula) del contenido de gránulos citoplasmáticos hacia la célula diana

(Trapani & Smyth, 2002). Los componentes más importantes dentro de los gránulos son las

serina proteasas y las granzimas A y B (Pardo et. al., 2004). La granzima A induce apoptosis a

través de la generación de radicales libres y por la vía mitocondrial, pero en ausencia de

activación de caspasas (Pardo et. al., 2004). La granzima B cliva proteínas en residuos de

aspartato de la misma forma que las caspasas, resultando en una cascada tipo caspasa con los

cambios morfológicos característicos (Martin & Green, 1995).

2.3.a Moléculas implicadas en la fase de ejecución de la apoptosis.

Las vías por las cuales se puede activar la apoptosis son diferentes, pero confluyen en la

misma fase efectora mediada principalmente por las enzimas denominadas caspasas (Gasco,

2011; Sánchez-Torres & Vargas, 2003). Las caspasas tienen una participación destacada sobre el

proceso de apoptosis al actuar sobre otros sustratos celulares y desencadenar la apoptosis (Frago

et. al., 2001).

Familia de las Caspasas: Las caspasas son proteasas de cisteína que muestran alta

especificidad para la hidrólisis de péptidos o proteínas a través del reconocimiento de la

presencia de ácido áspartico en la vencidad del sitio de ruptura (Dubin & Sttopani, 2000;

Sánchez-Torres & Vargas, 2003). En el término “caspasa”, la “c” hace referencia al residuo

cisteína del sitio activo de la enzima y “aspasa” se relaciona con los residuos aspárticos

39

existentes en el sustrato de la enzima (Dubin & Sttopani, 2000). La digestión proteíca coordinada

y dirigida que tiene lugar en la apoptosis se debe a la especificiadad proteolítica de las caspasas

(Roseto & Brenner, 1999; Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

Las caspasas se sintetizan como zimógenos (proenzimas o procaspasas), forma bajo la

cual poseen tres dominios: un prodominio N-terminal; una subunidad grande (p20) y una

subunidad pequeña (p10) (García, 2007; Sánchez-Torres & Vargas, 2003). Las procaspasas se

activan por la acción de otra enzima o por autocatálisis (Roseto & Brenner, 1999). En su forma

madura, las caspasas son heterodiméricas (formadas por dos dímeros de p20/p10) (García, 2007;

Sánchez-Torres & Vargas, 2003). Actualmente, se conocen 14 diferentes caspasas en mamíferos

(García, 2007; Sánchez-Torres & Vargas, 2003), clasificadas por su función en tres grupos

principales: caspasas inflamatorias, caspasas iniciadoras y caspasas efectoras (Jordán, 2003;

Martínez, 2009):

En el grupo de caspasas inflamatorias se encuentran las caspasas 1, 4 y 5

(Jordán, 2003; Martínez, 2009) que cuentan con un dominio CARD en su prodominio N-terminal

(figura 14). Este tipo de caspasas están relacionadas con la producción de citocinas (García,

2007; Jordán, 2003).

Las caspasas iniciadoras incluyen a las caspasas 2, 8, 9 y 10 y están relacionadas

con el comienzo de la cascada apoptótica luego de su dimerización y autoactivación en respuesta

a un estímulo apoptogénico (García, 2007; Gasco, 2011). Las caspasas iniciadoras tienen en sus

largos prodominios N-terminales, los dominios DED y CARD, que permienten su asociacion con

las proteínas adaptadoras de la vía extrínseca (figura 14) (García 2007).

Las caspasas 3, 6 y 7 constituyen el grupo de caspasas efectoras y son las

responsables principales de la fase de ejecución de la apoptosis (Gasco, 2011; Jordán, 2003). Las

proenzimas efectoras poseen prodominios muy cortos y son proteolizadas para su activación,

básicamente por las caspasas iniciadoras (figura 14) (García, 2007).

40

Figura 14. Clasificación de las caspasas

S: subunidad pequeña; L: subunidad grande; DED: Death Efector Domain; CARD: Caspase

Recruitment Domain. (Escobar et. al., 2011)

Otras Proteínas y enzimas implicados en la fase de ejecución: Las caspasas efectoras

actúan sobre sustratos específicos, que se convierten en los elementos fundamentales de la fase

de ejecución de la apoptosis, dado que al modificarse promueven las alteraciones morfológicas y

bioquímicas características de la apoptosis (Dubin & Sttopani, 2000; Gasco, 2011). Así por

ejemplo, la degradación masiva de proteínas celulares esenciales, que es una característica

bioquímica relevante de la apoptosis, se genera principalmente por la activación de las caspasas

efectoras 3, 6 y 7 (Dubin & Sttopani, 2000; Frago et. al., 2001; Martínez, 2009). Los sustratos de

estas caspasas son, proteínas del citoesqueleto y membrana nuclear (como actina, α-fodrina,

gelsolina, catenina, laminas nucleares). La acción sobre éstos sustratos contribuye al

encogimiento de la célula, la formación de las burbujas de la membrana plasmática, la rotura

nuclear y citólisis final (Frago et. al., 2001).

41

La fragmentación de ADN celular es otro fenómeno bioquímico que ocurre en la

apoptosis (Dubin & Sttopani, 2000; Frago et. al., 2001). La caspasa-3 que es activada por el

citocromo C, tanto por vía intrínseca como extrínseca, activa una endonucleasa que degrada

ADN (Dubin & Sttopani, 2000).

Además, AIF y CAD son proteínas liberadas por las mitocondrias, tras un estímulo de

apoptosis y que permiten también la degradación del ADN (Dubin & Sttopani, 2000).

Específicamente CAD, lo hace mediante la activación de endonucleasas dependientes de Ca2+

y

Mg2+

(García, 2007; Martínez, 2009).

Tanto caspasa-3, como AIF y CAD contribuyen a la condensación de la cromatina y la

fragmentación típica del ADN (fragmentos de 180 a 200 pb y múltiplos de ellos) en una célula

en apoptosis (García, 2007). Adicionalmente, la proteína quinasa ADN dependiente, enzima que

interviene en la reparación de la doble hélice del ADN, es degradada por la caspasa 5 (Dubin &

Sttopani, 2000). Obviamente, la degradación de quinasa ADN dependiente reduce la capacidad

de la célula para reparar el ADN y facilita la degradación de la cromatina del núcleo (Dubin &

Sttopani, 2000).

En las células en apoptosis las caspasas efectoras producen además la activación de

proteínas de membrana traslocasas, que facilitan la translocación de fostatidilserina desde la cara

interna hacia la cara externa de la membrana citoplasmática (Martínez, 2009). Este fenómeno de

expresión de fosfatidilserina en la superficie externa celular se considera particular para la

apoptosis (Martínez, 2009) y es una señal de marcación que permite la fagocitosis de la célula

que experimenta el proceso de apoptosis (Roseto & Brenner, 1999; Sánchez-Torres & Vargas,

2003).

Las procaspasas que, como se mencionó anteriormente constituyen el pilar de la fase de

ejecución de apoptosis, están constitutivamente presentes en todos los tipos celulares, pero su

potencial apoptogénico se mantiene bajo control para permitir la supervivencia celular.

Una serie de cofactores e inhibidores son los encargados de regular el momento en que

puede activarse la cascada enzimática en respuesta a los estímulos apropiados (García, 2007;

Roseto & Brenner, 1999).

42

2.3.b Sustancias involucradas en la regulación de la apoptosis.

La decisión de que la célula ejecute o no apoptosis tras una señal específica, está determinada

básicamente por tres tipos de moléculas: las IAPs (Inhibitors of Apoptosis Proteins), las FLIP

(FLICE caspasa-8 Inhibitory proteins) y las proteínas de la familia Bcl-2 (Sánchez-Torres &

Vargas, 2003).

Familia de las IAPs: Las IAPs son proteínas que actúan como inhibidores directos de las

caspasas (Frago et. al., 2001; Sánchez-Torres & Vargas, 2003). Pertenecen a este grupo XIAP, c-

IAP y c-IAP2. Las IAPs tienen afinidad por el dominio DD de las caspasas por lo que pueden

unirse a ellas y bloquear directamente su actividad (Sánchez-Torres & Vargas, 2003). A su vez

las proteínas Smac/DIABLO regulan negativamente a las IAPs al unirse a estas moléculas luego

de ser liberadas al citosol por la mitocondria, dejando libres las caspasas para cumplir su función

enzimática (Martínez, 2009; Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

Familia de las FLIPs: Estas proteínas tienen dos dominios efectores de muerte y un

dominio de la caspasa inactiva (Kataoka et. al., 1998). FLIP gracias a sus dominios se une al

complejo Fas-FADD de la cascada extrínseca de activación e inhibe la activación de la pro-

caspasa 8. Las proteínas que forman parte de este grupo, como v-FLIP y c-FLIP, impiden

la apoptosis inducia por receptores (Sánchez-Torres & Vargas, 2003), pero no afectan la

apoptosis inducida por la vía perforina/granzima B (Kataoka et. al., 1998).

2.3.c Proteínas de la familia Bcl-2.

El nombre de esta superfamilia de proteínas deriva del primer miembro que fue descrito,

el Bcl-2 (B-cell Lymphoma-2) (García, 2007). Esta familia de reguladores está constituida por

más de 30 miembros y dividida en tres subfamilias según la composición de sus dominios de

homología con Bcl-2 (BH) y según su capacidad de inhibir o producir apoptosis (Escobar et. al.,

2011; Roseto & Brenner, 1999).

43

Proteínas antiapoptóticas: Las proteínas de esta subfamilia conservan los cuatro

dominios homólogos a Bcl-2 (BH1 a BH4) (figura 15). Las proteínas antiapoptóticas están

ancladas normalmente en orgánulos como retículo endoplasmático y mitocondria (Escobar et. al.,

2011; García, 2007). Algunas de las proteínas antiapoptóticas son: Bcl-2, Bcl-x, Bcl-xL, Bcl-xS,

Bcl-w y BAG (Gasco, 2011). Bcl-2 y Bcl-xL previenen la despolarización de la membrana

interna mitocondrial, inhiben la liberación de citocromo C y la consecuente apoptosis (Dubin &

Sttopani, 2000; Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

Proteínas multidominio proapoptóticas: Son otro grupo de proteínas Bcl-2 y se

caracterizan por poseer tres dominios BH (BH1, BH2, and BH3) (figura 15) (Escobar et. al.,

2011; García, 2007). Los miembros proapoptóticos son Bax (Bcl-2- associated X protein), Bak

(Bcl-2 antagonist/killer) y Bok (Bcl-2-related ovarian killer) (Escobar et. al., 2011). Bak se

localiza constitutivamente en la mitocondria, mientras que Bax se localiza básicamente en el

citosol (García, 2007). Las proteínas multidominio Bax y Bak participan en la permeabilización

de la membrana externa mitocondrial, lo que permite la liberación de citocromo C y consecutiva

activación de caspasa-3 (Dubin & Sttopani, 2000; Escobar et. al., 2011; García, 2007).

Figura 15. Proteínas de la Familia Bcl-2

(García, 2007)

44

Proteínas proapoptóticas “solo-BH3” o BH3 only: Como su nombre lo indica

está última subfamilia de proteínas Bcl-2 contienen solamente un dominio de homología, el BH3

(figura 15) (Escobar et. al., 2011; García, 2007). Bcl-xL/Bad (Bcl-2 associated death promoter);

Bim (Bcl-2- interacting mediator of cell death); Bik/Nbk/Blk; Bid (BH3-interacting domain

death agonist); Bmf (Bcl2-modifying factor); Puma (p53 upregulated modulator of apoptosis);

Noxa; Spike; BNIP3; Nix; Hrk/DP5 y Beclin-1, pertenecen a la subfamilia proapoptótica BH3

only (Escobar et. al., 2011).

Las proteínas solo BH3 se unen a las proteínas antiapoptóticos para inducir la apoptosis

(Escobar et. al., 2011); sin embargo los dos tipos de proteínas proapoptóticas son necesarios

porque las BH3-only predisponen a la célula, pero la muerte celular no se puede ejecutar sin Bax

y Bak (Escobar et. al., 2011; García, 2007).

2.4 Apoptosis y atresia en el ovario de las aves.

La apoptosis, es un proceso fisiológico fundamental tanto en la etapa prenatal como

posnatal (Irusta, 2008). La tasa de apoptosis varía en los distintos tipos de tejidos y órganos. En

condiciones fisiológicas, en tejidos como el músculo la tasa de apoptosis es mínima; en tanto

que, en otros órganos como el intestino, útero y ovario es elevada (Irusta, 2008).

En el ovario de las aves, ocurren procesos de apoptosis relacionados con: la regresión del

ovario derecho temprano en la ontogenia; la reducción del número de células germinales en el

momento de la eclosión; la selección de un número limitado de folículos viables para la

ovulación; la rápida eliminación de tejidos postovulatorios, y la reducción de la masa ovárica que

acompaña a la época no reproductiva (Johnson & Woods, 2007). Aunque todos los procesos

mencionados son fundamentales para la correcta función reproductiva, los procesos de atresia

folicular y más concretamente la apoptosis de las células de la granulosa se han convertido en el

centro de atención de la mayoría de los estudios (Flores et. al., 2005; Tilly, 1996).

45

2.4.a Atresia Folicular en las aves.

El término atresia proviene del griego y significa a (no) y tresos (perforación) (Flores et.

al., 2005). La atresia se define como la involución de folículos que ocurre en cualquier estadio de

su desarrollo, desde la fase primordial hasta la fase ovulatoria (Johnson & Woods, 2007;

Johnson, 2011). El tiempo en el cual se produce la atresia folicular difieren según las estrategias

reproductivas de los vertebrados (Johnson & Woods, 2007). Entre reptiles, aves y mamíferos,

hay una diferencia significativa; en reptiles y aves, la atresia folicular ocurre antes de la selección

de los folículos preovulatorios, mientras que en los mamíferos la atresia de los folículos

subdominantes ocurre luego de la selección del folículo dominante (Johnson y Woods, 2007).

La atresia de los folículos ováricos en todos los vertebrados estudiados hasta la fecha es

mediada a través de procesos de apoptosis (Johnson, 2000b). La primera evidencia del vínculo

entre la apoptosis y la atresia folicular en el ovario de la gallina fue revelada tras encontrar en

células de la granulosa de folículos atrésicos niveles significativos de escisión internucleosomal,

característica que se manifiesta en todos los procesos de apoptosis (Tilly et. al., 1991)

Numerosos folículos inician su crecimiento y diferenciación pero sólo pocos son

seleccionados para ovular (Gilbert et. al., 1983; Bulfon & Bee de Speroni, 2009; Tilly et. al.,

1991). Se estima que en la gallina más del 90% de todos los folículos primordiales y en

crecimiento sufrirán atresia (Johnson, 2011).

Un aspecto notable de la atresia folicular en la gallina doméstica es la resistencia a la

apoptosis de tipo desarrollo dependiente (Johnson et al, 1996; Johnson, 2000b). Los folículos

prejerárquicos son susceptibles de sufrir atresia. Los folículos preovulatorios, durante el período

de puesta y en condiciones fisiológicas normales, están destinados a la ovulación, por lo que son

más resistentes a la atresia. Sin embargo, cabe señalar que los folículos preovulatorios pueden

desencadenar el proceso de atresia bajo condiciones de estrés o al final del ciclo de puesta

(Decuypere et. al., 1999; Gilbert et. al., 1983; Johnson, 2000a, b).

El proceso de atresia folicular mediado por la apoptosis, comienza en las células de la

granulosa (Johnson et. al., 1996; Johnson, 2000b). La apoptosis se observa primero en células

aisladas de la granulosa y luego progresa rápidamente a través de toda la capa celular. La

46

progresión del proceso de apoptosis por la granulosa se da gracias al incremento del número de

uniones de nexo (gap) que facilitan la transmisión de factores inductores de apoptosis entre las

células (Johnson & Woods, 2007; Krysko et. al., 2004). A medida que la atresia continúa, la

apoptosis progresa hasta llegar a la teca (Johnson & Woods, 2007).

2.4. b Tipos de Atresia en las aves

La atresia en el ovario de las gallinas de acuerdo con la etapa de desarrollo o el tamaño

del folículo se presenta de dos maneras (Gupta et. al., 1988). Los folículos más pequeños con un

diámetro inferior a 1mm, se someten a una atresia no explosiva o “no bursting”; mientras que

todos los folículos con diámetro mayor a 1mm sufren atresia de tipo explosiva o “bursting”

(Gupta et. al., 1988).

Atresia no explosiva o “no bursting”: Los folículos que sufren este tipo de

atresia se caracterizan histológicamente por la no ruptura de la pared folicular y por poseer un

ovocito contraído e irregular. También se presenta un amplio espacio vacío entre las células de la

granulosa y de la teca. Además, mientras la granulosa se pliega de forma irregular, los elementos

de la teca se aprecian sueltos pero no hipertrofiados (Gupta et. al., 1988).

Atresia explosiva o “bursting”: Los folículos de más de 1mm de diámetro que

experimentan atresia se distinguen histológicamente por la ruptura de la pared folicular y la

extrusión de los contenidos ooplásmicos a través de la zona de abertura en el estroma ovárico. Es

la ruptura y extrusión manifiesta, la que origina el nombre de este tipo de atresia, que además se

identifica por la presencia de varios tipos de células (de la granulosa, tecales y sanguíneas) en el

ooplasma y por la degeneración del núcleo del ovocito. Una marcada desorganización de la

yema, de la capa perivitelina, de la granulosa y de la teca interna también se puede observar en

los folículos que experimentan atresia explosiva (figura 16) (Gupta et. al., 1988).

47

Figura 16. Atresia folicular explosiva en el Gallus gallus domesticus

Parte de un folículo en atresia explosiva mostrando granulosa desorganizada y la presencia de varias

células en el ooplasma (O). También se nota la hipertrofia y vacuolización tecal (T)

(Cátedra de Histología y Embriología–FCV–UBA)

Los folículos prejerárquicos y preovulatorios que contienen una gran cantidad de yema

experimentan atresia de tipo explosivo (Nili & Kelly, 1996). Las grandes cantidades de yema de

estos folículos se reabsorben rápidamente a través de lagunas o espacios lacunares ubicados en la

médula del ovario (ayudado por los macrófagos y células epiteliales fagocíticas) seguido de un

desglose de la lámina basal (Claver et. al., 2008; Nili & Kelly, 1996).

En el ovario de las aves silvestres la atresia se da básicamente por mecanismos similares

(Bee de Speroni & Bulfon, 2012). En aves como la perdiz común (Nothura maculosa), se tiene

el mismo patrón de atresia no explosiva o involutiva para folículos pequeños; mientras que la

atresia explosiva se presenta en los folículos preovulatorios (Claver et. al., 2008). La atresia

explosiva que sufren los folículos en la fase reproductiva de la perdiz se caracteriza por la

ruptura de la pared folicular y el escape del vitelo hacia el sistema lacunar vecino (figura 17).

Además, las proyecciones en la pared folicular interna que se observan en la atresia explosiva de

los folículos de Nothura maculosa no se han descrito en otras especies de aves (Claver et. al.,

2008).

O

T

48

Figura 17. Atresia folicular en aves silvestres.

Atresia explosiva en ovario de perdiz común. La flecha señala la ruptura de la pared folicular y se observa

lagunas intersticiales con gránulos de vitelo (L) (Claver et. al., 2008).

Poco se sabe sobre las características ultramicroscópicas que caracterizan al proceso de

atresia en las aves. A través de microscopía electrónica de ovarios de gansos domésticos, se

encontró que folículos en estado avanzado de atresia presentan en las células de la granulosa

profundas depresiones en la membrana nuclear; acumulación de gotitas de lípidos

frecuentemente rodeadas por espirales de membrana; hinchazón de las mitocondrias, y la

acumulación de densas masas irregulares de origen desconocido en el citoplasma (Kóvacas et.

al., 1991).

2.4.c Particularidades de la regulación de la atresia folicular en la granulosa aviar.

La apoptosis en las células de la granulosa es el evento más destacado y estudiado de los

procesos de atresia folicular en las aves (Johnson & Woods, 2007). La apoptosis en las células

de la granulosa puede ser inducida por vía intrínseca o extrínseca (Johnson & Woods, 2007;

Johnson, 2011).

En las células de la granulosa activadas por vía intrínseca, tal y como en todas las células,

la liberación de citocromo C desde las mitocondrias inicia la compleja cascada de señalización

intracelular que conduce a la activación de las caspasas efectoras (Johnson & Woods, 2007). En

los mamíferos se conocen 14 homólogos para las proteínas caspasas, pero en las aves hasta el

49

momento sólo se han caracterizado cuatro homólogos: caspasa 1, 2, 3 y 6 (Gurtu et. al., 1997;

Johnson & Bridgham, 2000). De éstas homólogos, las caspasas 3 y 6, son las más importantes y

las que permiten la activación de apoptosis espontánea o inducida en las células de la granulosa

cultivadas in vitro (Johnson & Bridgham, 2000).

La activación de apoptosis por vía extrínseca implica la unión a receptores de muerte que

pertenecen a la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral. Al menos cinco

receptores de la superfamilia de receptores TNF son expresados por las células de la granulosa

de gallina: TNFRSF1 (TNF receptor tipo 1); TNFRSF6 (Fas); TNFRSF10B (DR5); TNFRSF16

(p75 Receptor del Factor de Crecimiento), y TNFRSF23 (Bridghan & Johnson, 2004; Johnson &

Woods, 2007). Los ligandos que son producidos por células dentro del ovario incluyen: Factor de

necrosis tumoral alfa (TNF-α; se une a TNFRSF1); ligando inductor de la apoptosis relacionado

con TNF (TRAIL; se une a TNFRSF10B), y el ligando Fas (se une a TNFRSF6) (Johnson &

Woods, 2007). El TNF-α es capaz de promover la apoptosis en células de la granulosa recogidas

de folículos prejerárquicos, pero no en las de folículos pre-ovulatorios, y dicha activación se hace

a través de la síntesis de ceramida (Witty et. al., 1996).

Entre los factores que regulan la apoptosis en la granulosa aviar están las proteínas de la

familia Bcl-2, las proteínas inhibidoras de apoptosis (IAP) y los protooncogenes (Johnson,

2000a; Johnson and Woods, 2007). Las células de la granulosa de las gallinas expresan Bcl-

xlong, Bcl-2, MCL-1 y Nr-13 (Johnson et. al., 1996; Johnson & y Bridgham, 1997). Tanto Bcl-

xlong, Bcl-2 e IAP se expresan mayormente en células de la granulosa de folículos

preovulatorios, lo que es coherente con el aumento de la resistencia a la atresia de estos folículos

(Johnson et. al., 1996; Johnson et. al., 1997). Se detecta la proteína Bcl-xshort en la teca de los

folículos de la gallina, pero no en la capa de células de la granulosa (Johnson et. al., 1999). Se

ha probado por inmunoreactividad la expresión de la proteína Bax en tejido folicular de gallinas

y codornices (Johnson, 2000b).

Los métodos de detección de apoptosis permiten suponer que hay múltiples similitudes

tanto en la expresión de proteínas y enzimas reguladoras, así como en las vías y señales que

median la apoptosis entre las células de la granulosa de aves y mamíferos (Johnson, 2000b).

50

3. MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE APOPTOSIS

La apoptosis es un mecanismo altamente refinado y secuencial, que se puede detectar a

través del reconocimiento de las modificaciones morfológicas y bioquímicas particulares que

aparecen en las células durante diferentes momentos del proceso. Para confirmar que la muerte

celular se está produciendo mediante apoptosis es necesario emplear al menos dos o más ensayos

que evalúen eventos diferentes y que se basen en principios diferentes. Así por ejemplo, un

ensayo puede detectar en forma temprana (iniciación) eventos apoptóticos y otro ensayo puede

dirigirse a eventos tardíos de apoptosis (ejecución) (Elmore, 2007; Sánchez-Torres & Vargas,

2003).

En general, las técnicas empleadas para detección de apoptosis se clasifican considerando

las alteraciones citomorfológicas, la fragmentación del ADN, las alteraciones de la membrana

celular y la expresión de las diferentes moléculas activadoras, efectoras y reguladoras de la

cascada apoptótica (Elmore, 2007; Martínez, 2009; Moreno et. al., 2000):

3.1 Métodos de estudio de apoptosis que se basan en las alteraciones morfológicas de

las células.

Para determinar las alteraciones morfológicas de las células en proceso de apoptosis, se

puede utilizar la microscopia de luz (campo claro, fluorescencia) o la microscopia electrónica de

transmisión (TEM por sus siglas del inglés, transmission electron microscopy) (Moreno et. al.,

2000; Elmore, 2007).

Para la microscopia de luz con campo claro, las coloraciones de rutina como la

Hematoxilina y Eosina (HE) son de utilidad para apreciar alteraciones morfológicas generales

como, condensación nuclear y citoplasmática, así como la aparición de cuerpos apoptóticos

(Elmore, 2007; Moreno et. al., 2000). Con esta metodología sólo se puede detectar estados

tardíos de apoptosis, los cuerpos apoptóticos más pequeños pueden no ser detectados y células

51

sanas con grandes gránulos densos intracelulares pueden confundirse con restos apoptóticos

(Elmore, 2007; Martínez, 2009).

La técnica de evaluación morfológica a través de microscopia de luz es rápida y

económica en reactivos y equipos; sin embargo es altamente cualitativa y subjetiva, y dado que

la tinción empleada no es específica para apoptosis, requiere que se complemente con otras

pruebas (Casadelvalle, 2006; Elmore, 2007; Martínez, 2009).

La microscopia electrónica de transmisión es la prueba más importante para comprobar

apoptosis (Elmore, 2007). La visualización de alteraciones ultraestructurales características

confirma de manera irrefutable que una célula está sufriendo un proceso de apoptosis (Elmore,

2007). Las características que se deben observar en una célula apoptótica a través de TEM son:

núcleo electrodenso, fragmentación nuclear, membrana celular intacta, desorganización de

orgánulos citoplasmáticos y formación de blebs (vesiculizaciones o gemación citoplasmática) en

la superficie celular (Elmore, 2007, Moreno et. al., 2007).

Emplear TEM para el estudio de apoptosis tiene las ventajas de permitir: a) acceder a una

determinación altamente específica; b) apreciar la fagocitosis de cuerpos apoptóticos, y c)

observar en detalle la cromatina sin necesidad de tinción específica (Elmore, 2007; Jordán,

2003). Las desventajas del uso de TEM para la evaluación de la apoptosis, son su alto costo y la

inversión de gran cantidad de tiempo en el análisis de varias muestras. Además la microscopía

electrónica es una prueba cualitativa, subjetiva y al igual que la microscopia de luz sólo permite

detectar estadios tardíos de apoptosis (Elmore, 2007, Huerta et. al., 2007; Moreno et. al., 2007).

3.2 Métodos de estudio de apoptosis basados en la fragmentación de ADN

La degradación de ADN por endonucleasas en fragmentos de 180 a 200 pb y múltiplos de

ellos, es un fenómeno que se aprovecha para detectar apoptosis (Elmore, 2007; Sánchez-Torres

& Vargas, 2003). La técnica se basa en la extracción de ADN a partir de células lisadas y la

separación de los fragmentos por electroforesis en geles de agarosa (Casadelvalle, 2006; Elmore,

2007; Martínez, 2009). La electroforesis permite visualizar un patrón de ADN en escalera o

52

ladder de ADN, que se considera característico para la apoptosis (Casadelvalle, 2006; Elmore,

2007; Moreno et. al. 2007; Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

La determinación del patrón “ladder” permite la distinción entre apoptosis y necrosis, ya

que en esta última la fragmentación de ADN es al azar y se observa un patrón de barrido en los

geles de agarosa (Casadelvalle, 2006; Elmore, 2007; Sánchez-Torres & Vargas, 2003). La

principal desventaja de esta técnica radica en que la aparición del patrón en escalera de ADN es

un proceso tardío de apoptosis por lo que, la ausencia de una escalera de ADN no elimina la

posibilidad de que las células estén en una fase temprana de apoptosis (Elmore, 2007; Moreno et.

al., 2007).

La detección de la degradación del ADN, producida en el proceso de la apoptosis, se

puede también realizar en células individuales por medio de marcaje del ADN (Moreno et. al.,

2007). Uno de los métodos más utilizados es el de marcaje de ADN a través de la técnica de

TUNEL. El TUNEL (del inglés: Terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP End

Labelling), es una técnica que utiliza la desoxinucleotidil Transferasa Terminal (TdT) (Moreno

et. al., 2000; Schinoni & Paraná, 2006).

La TdT es una polimerasa que incorpora nucleótidos al azar, pero que necesita un primer

iniciador con un extremo 3’OH terminal (Frattinni, 2010). El fundamento de la técnica es

detectar extremos libres o “nicks” que se generan por la acción de endonucleasas durante la

fragmentación de ADN en la muerte apoptótica. Con la ayuda de la TdT se adicionan nucleótidos

marcados con fluorescencia (Isocianato de Fluoresceína, FICT) al extremo 3’ OH libre (Moreno

et. al., 2000; Casadelvalle, 2006; Frattinni, 2010; Salazar, 2009; Sánchez-Torres & Vargas,

2003). Los resultados se pueden evaluar con microscopía fluorescencia o de campo claro, tras

añadir un anticuerpo secundario anti-FICT (fragmento Fab) conjugado con peroxidasa (POD),

que reaccionará con el sustrato correspondiente (Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

El TUNEL es una técnica sensible (detección de una sola célula a través de microscopía),

rápida y que permite la cuantificación de los procesos apoptóticos (Casadelvalle, 2006; Elmore,

2007). Adicionalmente, los reactivos están disponibles como kits comerciales y pueden ser

adquiridos fácilmente a través de varias empresas (Elmore, 2007). Las desventajas que deben

53

tenerse en cuenta de la técnica son su alto costo y la detección de fragmentos de ADN de células

necróticas y células en proceso de reparación (Elmore, 2007).

3.3 Métodos de estudio de apoptosis basados en alteraciones de la membrana

celular.

Hay varios métodos que identifican procesos de apoptosis a través de la citometría de

flujo, los cuales detectan diversas moléculas involucradas en la muerte por apoptosis

(Casadelvalle, 2006). De todas estas técnicas, la más aceptada y estandariza es la que reconoce

los cambios de fosfolípidos de membrana que aparecen de forma temprana en las células

apoptóticas (Ramírez et. al., 1999). En las células con procesos apoptóticos se expresan

marcadores de superficie celular para el reconocimiento fagocítico temprano. La fosfatidilserina,

es uno de los fosfolípido que se exterioriza en la membrana celular como ligando para fagocitos

(Elmore, 2007).

La fosfatidilserina se une fuerte y específicamente con la proteína recombinante Anexina

V (Elmore, 2007; Flores, 2002; Salazar, 2009; Schrevens et. al., 1998). La Anexina V se marca

con fluorocromos (Isocianato de Fluoresceína, FICT), para a través del porcentaje de células

fluorescentes cuantificar de forma simple las células apoptóticas presentes en una muestra

(Ramírez et. al., 1999).

La detección de Anexina V se acompaña de una tinción con el marcador catiónico ioduro

de propidio (IP). El análisis FACS (por sus siglas del inglés, Fluorescence Activated Cell Sorter)

con Anexina V-FICT/IP, facilita diferenciar: células no apoptóticas, que resultan negativas para

Anexina V-FICT y para IP; células en apoptosis temprana que son positivas para Anexina V-

FICT y negativas para IP; y las células necróticas que se marcan con Anexina V-FICT e IP

(Moreno et. al., 2000; Elmore, 2007; Martínez, 2009; Pozarowski et. al., 2003).

La metodología de Anexina V-FITCT permite la cuantificación del proceso apoptótico de

manera objetiva y rápida por citometría de flujo (Martínez, 2009). Asimismo, la técnica requiere

del empleo de células íntegras, por lo que se recomienda para estudios in vitro (Moreno et. al.,

54

2000). Este es un método sensible a través del cual se analizan grandes cantidades de células

(Flores, 2002).

3.4 Métodos de detección de apoptosis en base a la expresión de activadores,

efectores y reguladores de la cascada apoptótica.

Existen varias técnicas que permiten determinar apoptosis a través de la detección de las

sustancias involucradas en el proceso. La inmunocitoquímica es una herramienta que emplea

anticuerpos específicos y permite la detección de moléculas como: Fas (CD95), FasL (CD95-L),

miembros de la familia Bcl-2, caspasas, entre otras (Casadelvalle, 2006; Sánchez-Torres &

Vargas, 2003). Los anticuerpos pueden demostrar la presencia de las mencionadas proteínas

mediante una conjugación enzimática y revelado sobre sustrato o pueden estar acoplados a

fluorocromos y ser detectados en el citómetro de flujo (Casadelvalle, 2006; Sánchez-Torres &

Vargas, 2003).

También hay ensayos de inmunohistoquímica que pueden detectar el fraccionamiento de

sustratos implicados en la apoptosis. Por ejemplo, la enzima poli ADP-ribosa (PARP) es

escindida por la caspasa-3 en dos fragmentos de 24 y 89 kDa, detectables por

inmunohistoquímica con el anticuerpo PARP-p89 (Martínez, 2009; Zhivotowsky & Orrenius,

2001). En la actualidad, existen anticuerpos comerciales que garantizan el reconocimiento de

sustancias como Bax, Bid y Bcl-2 (Merkis et. al., 2008; Martínez, 2009).

Un método que permite la cuantificación rápida y consistente de células apoptóticas es la

medición de actividad de caspasas por citometría de flujo (Casadelvalle, 2009; Elmore, 2007).

Este método requiere la lisis celular con el fin de liberar las enzimas caspasas en una solución y

emplear el sustrato específico unido a un fluorocromo. En el caso que la caspasa esté activa, ésta

puede actuar sobre el sustrato y liberar la molécula fluorogénica, volviéndose detectable en el

citómetro de flujo (Casadelvalle, 2009; Elmore, 2007; Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

Las principales desventajas del uso del reconocimiento de la actividad de caspasas por

citometría de flujo es que la integridad de la muestra se destruye eliminando así la posibilidad de

55

determinar el tipo de célula y que la superposición en las preferencias de sustrato de los

miembros de la familia de las caspasas afecta a la especificidad del ensayo (Elmore, 2007).

Existen otros métodos que permiten evaluar apoptosis, como ELISA y varios tipos de

PCR; sin embargo, los métodos que se elijan para estudiar el fenómeno de apoptosis dependerán

del modelo de estudio, del tipo de células, de las características posibles de inducción, de las

limitaciones técnicas, y del presupuesto e infraestructura disponibles (Casadelvalle, 2006;

Martínez, 2009; Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

56

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Determinar si el acetato de leuprolide (agonista GnRH) modula la apoptosis in vitro de

células de la granulosa de gallina (CGG).

OBJETIVOS PARTICULARES:

Obtener cultivos primarios y cultivos de pasaje 1 a partir de folículos preovulatorios de

ovarios de gallinas comerciales en ciclo de postura.

Caracterizar cultivos de células de granulosa de pasaje uno mediante el establecimiento de la

curva de crecimiento, la realización de la tinción de Aceite Rojo O (ARO) e

inmunocitoquímica para el receptor de GnRH tipo I (GnRH-R-I).

Evaluar el proceso de apoptosis en los diferentes experimentos a través de los métodos

semicuantivativos de morfología celular con tinción de hematoxilina, técnica TUNEL e

inmunocitoquíca (ICQ) para Bax, Bcl-2 y caspasa-3 activa; así como mediante el estudio

cuantativo de citometría de flujo para Anexina/Ioduro de Propidio.

57

HIPOTESIS GENERAL

El acetato de leuprolide modula in vitro el proceso apoptótico en células de la granulosa del

ovario del Gallus gallus domesticus.

HIPÓTESIS PARTICULARES:

El cultivo primario y el subcultivo de células de la granulosa, procedentes de folículos

preovulatorios de ovarios de gallinas domésticas, es un modelo viable para estudios in

vitro de apoptosis.

Las células de granulosa de pasaje uno se caracterizan por mantenerse en crecimiento por un

tiempo adecuado para su estudio y por poseer vacuolas citoplasmáticas con contenido

lipídico, además de receptores de GnRH tipo I (GnRH-R-I).

El proceso de apoptosis en las CGG-P1 se puede evaluar semicuantiva y cuantitativamente a

través de análisis de morfología celular con tinción de hematoxilina; técnica de TUNEL;

inmunocitoquíca (ICQ) para Bax, Bcl-2 y caspasa-3 activa, y citometría de flujo para

Anexina/Ioduro de Propidio.

.

58

MATERIALES Y MÉTODOS

1. DISEÑO EXPERIMENTAL Y TRATAMIENTOS.

Para los experimentos desarrollados en la investigación se utilizaron gallinas comerciales

de postura que fueron obtenidas del criadero avícola del Instituto BIOINNOVO de INTA

Castelar y del criadero “Casado” de la localidad de Merlo. Los animales fueron alojados en

jaulas individuales en el galpón de producción de la cátedra de Genética de la Facultad de

Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires y recibieron agua y alimento ad

limitum. El régimen de iluminación fue de 16 h luz / 8 h oscuridad.

Las gallinas empleadas en el estudio estaban en la fase 2 de postura (desde que las

gallinas alcanzan su peso máximo, 42 semanas, hasta que el porcentaje de postura es menor a

65%, 62semanas) y pertenecían a la misma línea genética (H & N). Trabajar con una población

similar de aves, permitió en cierta forma reducir las variaciones e influencia que tienen sobre el

ovario diversos factores que afectan el desarrollo folicular (Flores et. al., 2005; Johnson, 2000b).

Los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical, tal como lo indican varios

estudios realizados con granulosa y teca de gallinas (Lovell et. al. 2003; Schmierer et. al. 2002;

Singh, et. al. 2007), y como lo sugieren las regulaciones del Comité Institucional de Cuidado y

Uso de Animales de Experimentación (CICUAL) de la Facultad de Ciencias Veterinarias.

En la investigación se emplearon folículos preovulatorios (F1 - F5) que fueron removidos

del ovario utilizando pinzas planas y estériles incluyéndose el pedículo de los mismos. Los

folículos fueron conservados en un vaso de precipitado con solución fría de PBS estéril (solución

salina tamponada con fosfatos 10mM) y antibióticos (Penicilina 100U/ml-Estreptomicina 100

µg/ml, Pen Strep, referencia 15140-122, Gibco), para luego separar manualmente bajo lupa la

capa de células de la granulosa.

A partir de las células de la granulosa obtenidas por disección y digestión enzimática se

obtuvieron cultivos primarios de células de la granulosa. Al llegar los cultivos a confluencia se

congelaron las células. Posteriormente, las células fueron descongeladas y subcultivadas. Sobre

estas células de granulosa de gallina pasaje 1 (CGG-P1) se realizaron una serie de ensayos para

59

probar el posible efecto modulador de la apoptosis por parte de un agonista de la GnRH, el

acetato de leuprolide (LA) (figura 18).

En un primer ensayo, la evaluación morfológica de la compactación cromatínica y la

presencia de cuerpos apoptóticos (mediante tinción con Hematoxilina), se realizó con tiempos de

incubación de 24 y 48 horas para una dosis de acetato de leuprolide de 100 nM. Para cada tiempo

de incubación se realizaron ensayos por separado de acuerdo al siguiente esquema:

a) SFB 5% control

b) SFB 5% + LA 100 nM por 24 horas.

d) SFB 5 % + LA 100 nM por 48 horas.

En función de los resultados obtenidos en el primer ensayo y tomando en consideración

que en el modelo bovino (células de línea de granulosa bovina, BGC-1) estudiado en el

laboratorio de la Cátedra de Histología y Embriología de la Facultad de Ciencias Veterinarias, el

LA tiene acción apoptótica a las 48 horas de inducción (Carou, 2012); se decidió trabajar con el

modelo estándar de LA a una concentración de 100 nM con un tiempo de inducción de 48 h.

a) SFB 5 % control

b) SFB 5 % + LA 100 nM por 48 horas.

Los experimentos realizados con inducción por 48 horas se emplearon para las

evaluaciones subsiguientes de los procesos de apoptosis en las CGG-P1, a través de TUNEL;

Inmunocitoquímica (ICQ) para Bax, Bcl-2 y caspasa-3 activa, y para citometría de flujo con

Anexina V/ Ioduro de Propidio. Para la técnica TUNEL y la ICQ para caspasa-3 activa se

realizaron dos repeticiones con tres réplicas cada una. Por su parte, para la ICQ para Bax y Bcl-2,

y para el análisis FACS de AV/IP se efectuaron tres repeticiones con las tres réplicas

correspondientes.

60

Figura 18. Esquema de la secuencia experimental

Gallinas

Folículos pre-ovulatorios

CULTIVOS CELULARES

Cultivo primario de Células de la Granulosa

Cultivo de Células de la Granulosa de Gallina Pasaje 1 (CGG-

P1)

CARACTERIZACIÓN EVALUACIÓN DE APOPTOSIS

Apoptosis

Temprana

Apoptosis Tardía

Morfología

mediante Tinción

con Hematoxilina

TUNEL Anexina V- Ioduro

de Propidio

Tinción con Aceite Rojo O

(ARO)

Curva de crecimiento

Inmunocitoquímica

(GnRH-R-I)

Fase efectora de

Apoptosis

Inmunocitoquímica para

BAX y Bcl-2

Inmunocitoquímica

para Caspasa-3 activa

61

2. CULTIVOS CELULARES

2.1 Cultivo Primario de Células de la Granulosa de Gallina (CPGG).

La separación de la granulosa se realizó a través de la técnica descrita por Gilbert y

colaboradores (1977). La técnica ha sido empleada en varios trabajos relacionados con la

granulosa del Gallus gallus domesticus (Al-Musawi, 2007; Gómez, et. al., 1998; Lovell et. al.,

2002; Lovell et. al. 2003; Wang et. al., 2012). En la presente investigación se siguieron los

mismos lineamientos pero con mínimas modificaciones.

Bajo campana previamente esterilizada con UV, se realizó con una tijera fina estéril una

incisión de no más de 1cm de longitud a lo largo del estigma de cada folículo. A continuación,

con una maniobra rápida, los folículos fueron sostenidos con una pinza plana en el tercio distal al

corte, para luego a través de un movimiento de barrido eliminar la yema.

Posteriormente con la ayuda de dos pinzas rectas finas se evirtieron los folículos sobre

cajas petri estériles, de tal modo que la membrana granulosa quedó expuesta por fuera de la teca.

Una vez evertidos, se lavaron los folículos con solución de PBS más antibiótico, a fin de remover

los residuos de yema.

Cada folículo evertido y lavado fue colocado en una caja petri con PBS estéril y limpio.

La capa granulosa (evidenciada como una finísima membrana semitransparente) se separó de la

teca empleando pinzas de relojero estériles y bajo observación en una lupa de disección (marca

Wild, modelo M3) con fondo (“back-ground”) negro.

El pool de membranas así obtenidas se lavó tres veces con PBS suplementado con

Penicilina 100U/ml, Estreptomicina 100 µg/ml (Pen Strep, referencia 15140-122, Gibco). El

material obtenido se conservó en medio de cultivo DMEM+F12 suplementado con Penicilina

100 U/ml, Estreptomicina 100 µg/ml. La cantidad de medio suplementado empleado fue de 2ml

por cada cuatro folículos procesados.

A continuación se disgregaron las membranas con el empleo de una solución de digestión

con Tripsina (Trypsin from porcine pancreas, código T4 799-5G, Sigma) al 0,25% más EDTA

0,02 % en PBS (pH: 7,4). La relación empleada fue de 20 ml de solución de tripsina por cada 2

ml de granulosa sumergida en medio DMEN+F12+antibiótico.

62

La incubación del material de cultivo con la solución de digestión enzimática se realizó

en baño térmico (marca Julabo, modelo U3) a 37ºC por 15 minutos bajo agitación constante.

Posteriormente, se neutralizó la enzima con 5% de suero fetal bovino (SFB calidad

biotecnológico de Internegocios S.A.).

El material obtenido se filtró por gasa estéril y se distribuyó en tubos Falcon de 15 ml. Se

centrifugó (centrífuga marca Rolco, modelo RB 350T) por 10 minutos a 2000 rpm.. Se descartó

el sobrenadante y se repitió el proceso de centrifugación dos veces más empleando DMEM+F12

como medio de suspensión.

El pellet celular final fue resuspendido en medio de cultivo DMEM+F12 (código D8900,

Sigma) suplementado con 2,4 g de bicarbonato de sodio (pH: 7,4); 5% SFB (suero fetal bovino

calidad biotecnológico de Internegocios S.A.); L-glutamina 2 nM (código G8540, Sigma);

fungizona 250 µg/ml (Anphotericin B, referencia 15 290-018, Gibco), y Penicilina 100 U/ml-

Estreptomicina 100 µg/ml (Pen Strep, referencia 15140-122, Gibco).

La evaluación de la viabilidad celular se efectuó por el método de exclusión celular de

azul Tripán al 0,4% (referencia 15250-061, Gibco). Las células se cultivaron en frascos de

cultivo celular de 75 cm2 (flask T75) con una densidad de siembra de 75.000 células/cm

2. Se

realizó una homogenización de las células sobre la superficie de cultivo a través de ligeros

movimientos laterales del frasco de cultivo.

El cultivo primario de células permaneció en un ambiente de 38,5ºC con una atmósfera

de 95% aire, 5% CO2, ambiente empleado en varias investigaciones realizadas con células de

granulosa aviar (Schmierer et. al., 2002; Sirotkin & Grossmann, 2008; Wang et. al., 2012), con

cambio de medio suplementado cada 48 horas.

Para efectuar el congelamiento de las células se esperó su confluencia, por lo que cada 48

horas se observaron los cultivos con un microscopio de luz invertida (Leica, modelo CMS

GmbH). Una vez verificada visualmente la confluencia celular se procedió al levantamiento de

las células del cultivo primario.

Para el levantamiento de las células, primero se descartó el medio de cultivo de las

botellas T75 y se lavó dos veces con PBS. Se adicionaron 5ml de tripsina (Trypsin from porcine

pancreas, código T4 799-5G, Sigma) al 0,25% más EDTA 0,02 % en PBS (pH: 7,4) en cada

frasco de cultivo. Luego de incubar por 5 minutos a 38,5ºC, se neutralizó la reacción con SFB.

63

Se colocó la suspensión de células en tubos Falcon de 15 ml y se centrifugaron por 10 minutos a

2000 rpm.

El pellet celular se resuspendió en un pequeño volumen de medio de congelación: medio

DMEM+F12 (código D8900, Sigma) suplementado con 2,4 g de bicarbonato de sodio (pH: 7,4);

30% SFB (suero fetal bovino calidad biotecnológico de Internegocios S.A.); L-glutamina 2 nM

(código G8540, Sigma); DMS0 (código D8418, Sigma) al 7,5%, y Penicilina 100 U/ml,

Estreptomicina 100 µg/ml (Pen Strep, referencia 15140-122, Gibco).

Después de confirmar la viabilidad de las células (viabilidad mayor al 90%) en cámara de

Neubauer mediante la técnica de exclusión con azul Tripán 0,4% (código 15250-061, Gibco), se

agregó a la suspensión celular un volumen adecuado del medio de congelación. Las células se

almacenaron en crioviales de 1,5 ml a razón de 1x106

células/ml. El congelado se realizó de

forma lenta: 1 hora a 4ºC; 2horas a –20ºC y luego conservación a –80ºC por al menos una

semana.

2.2 Obtención de Células de la Granulosa de Gallina de pasaje 1 (CGG-P1).

Los crioviales con células de cultivo primario de la granulosa de gallina (CPGG) se

sacaron de –80ºC y se colocaron rápidamente en baño térmico a 37ºC. Una vez descongelados,

los crioviales se centrifugaron por 10 minutos a 2000 rpm. Luego se desinfectaron los crioviales

con alcohol 70º y se trabajó en cabina de seguridad tipo II. El pellet celular obtenido se

resuspendió en medio de cultivo DMEN+F12 (código D8900, Sigma) suplementado con 2,4 g de

bicarbonato de sodio (pH: 7,4), 5% SFB (suero fetal bovino calidad biotecnológico de

Internegocios S.A.), L-glutamina 2 nM (código G8540, Sigma); fungizona 250 µg/ml

(Anphotericin B, referencia 15 290-018, Gibco), y Penicilina 100U/ml-Estreptomicina 100 µg/ml

(Pen Strep, referencia 15140-122, Gibco).

El número y viabilidad de las células descongeladas se determinó por conteo en cámara

de Neubauer mediante la técnica de exclusión con azul Tripán al 0,4% (código 15250-061,

Gibco). La densidad celular de siembra fue de 1x105 células/cm

2, que es la densidad de

referencia dada por Schmierer y colaboradores (2002) y además por Sirotkin & Grossmann

(2008).

64

Para evaluar apoptosis a través de morfología con tinción de hematoxilina y con las

técnicas de TUNEL e ICQ (para GnRH-R; Bax; Bcl-2, y caspasa-3 clivada), las células fueron

sembradas sobre cubreobjetos de 18 x 18 mm (0.3 ml por cubre) en placas de 6 pocillos (P6).

Para facilitar la adherencia de las células a los cubreobjetos, éstos fueron sometidos a un

pre-tratamiento con ácido clorhídrico y alcohol 96°, y luego de su esterilización se recubrió su

superficie con Poli-L-lisina al 0,01% (Poly-L-lysine, código P 4707, Sigma). Las placas de 6

pocillos, que contenían los cubre objetos preparados, se almacenaron envueltas con papel

aluminio y parafilm a una temperatura de a 4ºC, por al menos 12 horas hasta su uso.

Para realizar la curva de crecimiento y el análisis FACS de Anexina V/Ioduro de

Propidio, se utilizaron placas de 12 pocillos (P12). Las células fueron colocadas en los

respectivos pocillos y luego se realizó una homogeneización con movimientos laterales para

facilitar la mejor distribución de las células sobre la superficie de crecimiento.

Las células crecieron a 38,5ºC con una atmósfera de 95% aire, 5% CO2 por 72 horas

hasta semiconfluencia, previo a los experimentos de inducción con leuprolide (LA) 100 nM.

65

3. CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS DE LA GRANULOSA DE LA GALLINA DE

PASAJE 1 (CGG - P1).

3.1 Determinación de la curva de crecimiento.

El establecimiento de la curva de crecimiento fue necesario para determinar en qué

momento del crecimiento poblacional, las células alcanzan el “plateau” de la curva. De esta

forma, se podía aplicar la inducción con el agonista (Leuprolide) de GnRH en esta fase del

crecimiento de la población celular, reduciendo la interferencia que la capacidad mitótica de las

células podría tener sobre los resultados.

3.1.a Protocolo para realización de la curva de crecimiento.

Los crioviales que contenían las células de cultivo primario de granulosa de gallina

(CPGG) se descongelaron de manera rápida en baño térmico a 37ºC por 1 min. Luego se

centrifugaron a 2000 rpm por 10 minutos. El pellet celular obtenido de cada criovial, se

resuspendió en un volumen pequeño de DMEN + F12 (código D8900, Sigma) suplementado con

bicarbonato de sodio, 5% SFB biotecnológico, L-glutamina, fungizona y penicilina-

estreptomicina.

Empleando Azul tripán (código 15250-061, Gibco), se realizó la estimación de la

cantidad de células, mismas que fueron sembradas sobre placas de 12 pocillos, a una densidad de

1x105 células/cm

2 con medio de crecimiento (2 ml por pocillo).

Cada 48 horas se efectúo cambio de medio de cultivo. En tanto que, cada 24 horas se

despegaron las células de tres pocillos empleando solución de tripsina (Trypsin from porcine

páncreas, código T4 799-5G, Sigma) al 0,25% + EDTA 0,02 % en PBS (pH: 7,4), en forma

semejante a lo descrito para la congelación del cultivo primario, pero empleando 500 µl de

tripsina por pocillo.

Se realizó el recuento de células viables, para lo cual se mezcló la suspensión celular con

solución de azul Tripán en proporción 1:1, y se realizó el conteo celular en cámara de Neubauer.

El número de células viables se graficó en función del tiempo de crecimiento del cultivo. La

66

curva de crecimiento se construyó durante 8 días, lapso en el cual los cultivos no recibieron

tratamiento hormonal.

La determinación de la curva de crecimiento del pasaje 1 de las CGG se construyó

graficando los puntos experimentales. Cada punto experimental corresponde al recuento

promedio de tres pocillos (triplicados) por día.

3.2 Caracterización de CGG-P1 mediante tinción con Aceite Rojo O (ARO).

El Aceite Rojo O es un lisocromo lipofílico (Mehlem et. al., 2013). Se utiliza para estimar

el contenido y distribución de lípidos neutros y esteres de colesterol en cortes de tejidos y en

cultivos celulares (Clavijo et. al., 2007; Mehlem et. al., 2013; Ramírez et. al., 1992).

La tinción con ARO se basa en la propiedad hidrofóbica del colorante y por tanto, al

disolverse en un reactivo que contiene agua se mueve desde el disolvente y penetra en los lípidos

de las secciones de tejido o células (Beaudoin, 2004; Mehlem et. al., 2013; Ramírez et. al.,

1992).

Las células de la granulosa son productoras de esteroides sexuales, consecuentemente

poseen en su interior precursores esteroidales. Para identificar vacuolas citoplasmáticas con

contenido lipídico en las CGG-P1 se procedió a la utilización de Aceite rojo O. Se consideró el

empleo de la tinción con ARO por ser un método que permite revelar los lípidos presentes en una

muestra determinada de una forma rápida y con el empleo de equipo y materiales básicos de

laboratorio (Mehlem et. al., 2013). Además el Aceite Rojo O produce un color rojo mucho más

profundo y por lo tanto, mucho más fácil de ver que aquel producido por parte del Sudán III y

Sudán IV (Beaudoin, 2004).

3.2.a Protocolo de la Tinción con Aceite Rojo O.

Las CGG-P1 sembradas sobre cubreobjetos de 18 x 18mm sin tratamiento hormonal,

luego de haberse eliminado el medio de cultivo, fueron lavadas con PBS y posteriormente fijadas

con formol buferado al 10% (formol puro diluido al 10% en PBS) por 10 minutos.

67

Previo el proceso de tinción se preparó la solución saturada de Aceite Rojo-O con 0,5

gramos de Aceite Rojo-O (artículo 967402, Biopack) en 100 ml de isopropanol 99%. La solución

se colocó en un baño térmico a 60ºC y fue agitada cada 15 minutos por el lapso de una hora.

Luego se almacenó la solución “stock” en botellas de vidrio color ámbar.

A partir de ésta solución madre se preparó la solución de trabajo 3:2, colocando 3 ml de

solución saturada de Aceite rojo O más 2 ml de ddH2O. La solución de trabajo se filtró a través

de dos capas de papel filtro Whatman. Se dejó reposar 10 minutos la solución filtrada antes de

empezar con el procedimiento.

Las células fijadas se lavaron con PBS dos veces y se dejaron secar por 15 minutos. Los

cubreobjetos se tiñeron con la solución de trabajo de Aceite Rojo O por 10 minutos. Luego se

lavaron con alcohol etílico 70º por 5 segundos y posteriormente tres veces con ddH2O.

Se realizó tinción para contraste nuclear con hematoxilina de Mayer (artículo 161503,

Hematoxilina cristal de Biopack) por 10 minutos y se viró con agua tibia corriente. El montaje se

realizó con glicerol-PBS (9:1) y se sellaron los bordes de los cubreobjetos con esmalte.

Las observaciones de los preparados se realizaron en microscopio óptico de campo claro

modelo DMLS de Leica Inc. y las imágenes se capturaron por medio de una cámara modelo

ICC50 HD de Leica con la ayuda del programa LAS EZ (Leica Application Suite EZ).

3.2.b Control de la técnica e interpretación de resultados.

Como control positivo de la técnica se usaron células de cuerpo lúteo bovino que según

estudios realizados en el laboratorio de la Cátedra de Histología y Embriología-Facultad de

Ciencias Veterinarias-UBA, poseen pequeñas gotas lipídicas positivas para ARO (Germano,

2013).

Los lípidos presentes en el citoplasma de las células se marcaron de color rojo. Los

núcleos celulares se presentaron de color violeta claro gracias al contraste con hematoxilina.

68

3.3 Determinación de GnRH-R-I en CGG-P1 mediante inmunocitoquímica.

En virtud, de que se busca evidenciar el efecto de agonistas GnRH en cultivos de

granulosa de gallina, se hizo necesario establecer la presencia del receptor para GnRH tipo I en

las células del cultivo. La inmunocitoquímica es un procedimiento que reconoce con certeza la

presencia o no de un antígeno en cultivo de células (García et. al., 2005).

La técnica de inmunohistoquímica tiene como fundamento identificar un antígeno en

células o tejidos por medio del uso de un anticuerpo específico contra el antígeno buscado. En el

presente trabajo se empleó una técnica de inmuhistoquímica indirecta para identificar no sólo

GnRH-R-I, sino proteínas como Bax, Bcl-2 y caspasa-3 que se relacionan con el proceso de

apoptosis.

El método usado fue un kit comercial, LSAB+sistema-HRP (Referencia K0690, Dako),

que emplea el sistema Streptoavidina-Biotina marcada (LSAB: Labeled Streptavidin - Biotin). El

sistema LSAB posee una mayor sensibilidad. Esta mayor sensibilidad se debe a la amplificación

de la identificación del antígeno tras el uso de un anticuerpo primario no marcado que se une a

un anticuerpo secundario marcado. El anticuerpo secundario anti la especie en que se produjo el

anticuerpo primario está ligado a biotina. A su vez la biotina por su alta afinidad por la

estreptoavidina se une al complejo estreptoavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP). La

peroxidasa reacciona con su sustrato, el peróxido de hidrógeno, y origina un complejo que

precipita la DAB (3,3´ diaminobencina) produciendo una reacción cromogénica detectable.

Para determinar la presencia del receptor para GnRH tipo I se utilizó un anticuerpo

policlonal. El anticuerpo fue elaborado en cabra, purificado por afinidad y generado contra un

mapeo de péptidos cercano del extremo N-terminal de GnRH-R de origen humano (GnRHR (N-

20): sc-8682, Santa Cruz Biotechnology).

Debido a que el anticuerpo policlonal está recomendado para la detección de GnRH-R de

ratón, rata, humano, canino y porcino, se usó el marcaje inmunohistoquímico en preparados de

tejido ovárico e hipófisis de gallinas domésticas para observar el cruce con esta especie y

determinar la ubicación in situ del receptor; posteriormente se probó la inmunocitoquímica sobre

CGG-P1.

69

3.3.a Inmunohistoquímica para GnRH-R-I sobre preparados de tejido ovárico de gallinas

domésticas.

Protocolo de Inmunohistoquímica sobre tejido ovárico: Los ovarios de las gallinas de

las cuales se obtuvieron los cultivos primarios de células de la granulosa, se fijaron en Bouin

(solución saturada de ácido pícrico 75 ml; formol al 40% 25 ml, y ácido acético glacial 5 ml) por

12 horas. Luego las piezas fijadas se deshidrataron a través de soluciones crecientes de alcohol

etílico (70º, 96º y 100º). Se aclararon en xilol y se incluyeron en parafina.

Para la realización de la técnica de inmunohistoquímica para GnRH-R-I se utilizaron

cortes de 5µ montados en portaobjetos con adhesivo (3-aminopropyl) triethoxysilane (A3648,

Sigma-Aldrich). Los cortes fueron desparafinados e hidratados por medio de pasajes en xilol y

alcohol en graduaciones decrecientes (100°, 96° y 70°). Finalmente se realizaron dos lavados de

10 minutos cada uno con PBS.

Los cortes se permeabilizaron con Tritón X-100 (código 1001628047, Sigma) al 1% en

PBS por 5 minutos. Se lavó con PBS dos veces y para bloquear las peroxidasas endógenas se

agregó una solución de H202 al 3% durante 30 minutos. Luego se realizaron dos lavados de 10

minutos con PBS.

Se efectuó la inhibición de antígenos inespecíficos con leche descremada al 5% durante

30 minutos. Se lavó dos veces con solución de PBS por 10 minutos. Se adicionó el anticuerpo

anti GnRH-R-I (en una dilución 1:50) sobre cada preparado y se dejó incubar en cámara húmeda,

durante toda la noche (O.N, “over night”) a 4 ºC.

Tras la incubación con el anticuerpo primario, se lavó dos veces con PBS y se empleó el

kit comercial LSAB+sistema-HRP (Referencia K0690, Dako) para revelar la unión o no del

anticuerpo sobre estructuras específicos en los cortes de ovarios e hipófisis.

Se incubó a TA por 15 minutos con el anticuerpo secundario conjugado con Biotina

(Biotinylated Link Universal, Dako). Se lavó con PBS dos veces por 10 minutos.

Inmediatamente se procedió a incubar con la estreptoavidina conjugada a la Peroxidasa de

Rábano Picante (Streptoavidin-HRP, Dako), durante 15 min a TA. Se hicieron dos lavados de 10

minutos con PBS y se reveló la peroxidasa aplicando DAB (Kit Liquid DAB+substrate

chromogen system, código K3468, Dako) por 10 segundos a TA en cámara húmeda. La acción

70

de la DAB se interrumpió agregando agua destilada y se utilizó hematoxilina de Mayer (artículo

161503, Hematoxilina cristal de Biopack) por 20 minutos como coloración de contraste nuclear.

Luego de virar la Hematoxilina con agua tibia por 10 minutos, los preparados se

deshidrataron con graduaciones crecientes de alcohol (70º, 96º, y dos pasajes de 100º) y Xilol.

El montaje se realizó con DPX (código 06522, Sigma).

Controles de la técnica: Para validar la inmunohistoquímica se utilizó un “control

negativo”, el cual fue sometido a todos los pasos de la metodología señalada excepto por su

exposición al anticuerpo primario contra GnRH-R-I, sustituyéndolo por PBS.

Adicionalmente, se empleó como “control positivo” cortes de hipófisis de gallina que

lógicamente debían presentar receptores para GnRH y de esta manera se ayudó a verificar que el

anticuerpo policlonal cruza con la especie en estudio.

3.3.b Inmunocitoquímica para GnRH-R sobre CGG-P1.

Protocolo de Inmunocitoquímica para CGG-P1: Luego de retirar el medio

suplementado de las placas de 6 pocillos (P6,) que contenían los cubreobjetos de 18x18 mm

sembrados con las células de pasaje 1, se lavó con PBS y se fijó con paraformaldehído al 4%

durante 15 minutos. En seguida se realizaron dos lavados con PBS y se lavó por 20 minutos con

alcohol isopropílico 99%. Se realizaron tres lavados con PBS y se permeabilizó con Tritón X-

100 (código 1001628047, Sigma) al 0,1% por 5 minutos.

A continuación, se lavó con PBS, 5 minutos, dos veces. Para bloquear las peroxidasas

endógenas se agregó una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 45 minutos. Luego se

lavó con PBS y la inhibición de antígenos inespecíficos se realizó con SFB (suero fetal bovino de

Internegocios S.A) durante 20 minutos. No se realizó ningún lavado antes de la adición de 20 µl

del anticuerpo primario (GnRH-R (N-20): sc-8682, Santa Cruz Biotechnology) en una dilución

de 1:25 por cada cubreobjeto. Se dejó incubar en cámara húmeda durante toda la noche (O.N,

“over night”) a 4 ºC.

71

Después de lavar dos veces con PBS, se procedió a emplear el kit comercial

LSAB+sistema-HRP (Referencia K0690, Dako). Se incubó a TA por 10 min con el anticuerpo

secundario conjugado con Biotina y se lavó con PBS por dos ocasiones durante 5 minutos cada

una. Enseguida, se incubó con la estreptoavidina conjugada a la Peroxidasa de Rábano picante

durante 10 min a TA. Se lavó con PBS dos veces y se reveló la peroxidasa con el uso de DAB

(código K3468, Dako) a TA por 10 segundos. La acción de la DAB se cortó con agua destilada y

se utilizó como coloración de contraste hematoxilina de Mayer. Posteriormente, se dejaron secar

los preparados a 37ºC por tres horas. El montaje se hizo con DPX (código 06522, Sigma).

La captura de las imágenes para el análisis de presencia de GnRH-R-I tanto en las

preparaciones de tejido ovárico como sobre las CGG-P1 se realizaron con un microscopio

trinocular modelo DMLS de Leica Inc y una cámara modelo ICC50 HD de Leica Inc. El

programa informático que soportó la toma de imágenes fue el LAS EZ (Leica Application Suite

EZ).

Control de la técnica: El “control negativo” de la técnica fueron las mismas CGG-P1

sobre las que se aplicaron todos los pasos de la técnica, excepto la adición e incubación con el

primario anti GnRH-R-I.

72

4. EVALUACIÓN DE APOPTOSIS.

Las evaluaciones de apoptosis tardía (a través de la tinción con hematoxilina y la técnica

TUNEL), de apoptosis temprana (mediante ICQ para caspasa-3 activa), y de la fase efectora de

apoptosis (con inmunocitoquímica para Bax, Bcl-2), requieren de la observación de las células

fijadas y sometidas a las diferentes técnicas. La visualización de las características y fenómenos

buscados para su mejor y más fácil análisis deben capturarse en imágenes fotográficas.

Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio trinocular modelo DMLS de

Leica Inc. y una cámara modelo ICC50 HD de Leica Inc. El sistema que facilitó la captura de

imágenes fue el programa LAS EZ (Leica Application Suite EZ).

4.1 Evaluación Morfológica - Determinación de apoptosis por tinción con

hematoxilina.

La tinción con hematoxilina/eosina (H/E), o simplemente hematoxilina, y la observación

bajo un microscopio de campo claro puede revelar la presencia de células apoptóticas según

criterios morfológicos generales (Salazar, 2009).

Las características morfológicas distintivas de la apoptosis son la condensación de la

cromatina manifestada de color púrpura intenso, formación de ampollas o “blebs” en la

membrana plasmática, y la aparición de cuerpos apoptóticos (Ávila, 2000; Elmore, 2007).

La tinción de hematoxilina se utilizó porque es un colorante básico con afinidad

(basofilia) por el ADN celular que brinda imágenes de muy buen detalle para evaluar apoptosis

tardía, cuerpos apoptóticos y células en mitosis (Carou, 2012).

4.1.a Protocolo de Tinción com Hematoxilina para CGG-P1.

Las células de pasaje 1 crecieron sobre cubreobjetos de 18 x 18 mm hasta llegar a

semiconfluencia (72 horas de cultivo) y fueron inducidas con Leuprolide 100 nM durante 24 y

48 horas. Los tratamientos contaban con sus respectivos controles suplementados sólo con 5% de

SFB (suero fetal bovino calidad biotecnológico de Internegocios S.A). Se realizaron 2

73

experimentos sobre CGG-P1 para 24 horas de inducción y 4 repeticiones para 48 horas de

inducción. Se efectuaron tres replicas por cada experimento o repetición.

Transcurridos los tiempos estipulados, se retiró el medio de cultivo de los pocillos donde

se encontraban los cubreobjetos y se realizó un lavado con PBS. Luego, los experimentos fueron

frenados por fijación con metanol absoluto durante 10 minutos.

Las células fijadas fueron teñidas con hematoxilina de Mayer (artículo 161503,

Hematoxilina cristal de Biopack) durante 20 minutos y viradas con agua corriente tibia por 10

minutos. Las células se secaron al aire por 5 horas y se efectúo el montaje con DPX (código

06522, Sigma).

El análisis de imágenes se hizo bajo microscopio de campo claro y se tomaron

aproximadamente 50 imágenes por cubreobjeto (al menos 500 células) a una magnificación de

x1000, con la ayuda del programa LAS EZ.

4.2 Determinación de apoptosis a través de la técnica TUNEL.

El TUNEL (Terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP end labelling) se

utiliza para analizar los productos de degradación formados por endonucleasas durante la

apoptosis. El fundamento de la técnica es permitir que los extremos 3´-OH libres del ADN se

unan con dUTPs marcados con estreptoavidina-HRP o con un flourocromo. La enzima Terminal

deoxynucleotidyl transferasa (TdT) cataliza la adición de los dUTPs marcados al ADN

fragmentado durante el proceso de apoptosis (Moreno et. al., 2000; Casadelvalle, 2006; Frattinni,

2010; Salazar, 2009; Sánchez-Torres & Vargas, 2003).

La evaluación de apoptosis tardía a través de TUNEL permite la detección individual de

los núcleos de las células apoptóticas con el sólo empleo de un microscopio de campo claro o

fluorescencia. En este caso se utilizó la microscopía de campo claro y se agregó hematoxilina

como tinción de contraste para facilitar la identificación de todas las estructuras nucleares no

afectadas y así generar un índice de apoptosis. También se consideró que TUNEL es una prueba

rápida que se puede completar en 3 horas y está disponible de manera comercial.

74

Se trabajaron dos experimentos con tres replicas tanto para los cultivos crecidos sólo con

5% SFB, como para los cultivos inducidos con Leuprolide 100 nM por 48 horas.

4.2.a Protocolo de la técnica TUNEL.

Luego de eliminarse el medio de cultivo de los pocillos que contenían los cubreobjetos

con CGG-P1, se realizó un lavado con PBS. A continuación, las células se fijaron durante 30

minutos a temperatura ambiente con una solución de Paraformaldehído al 4% y se lavaron tres

veces con PBS. Se conservaron las células en PBS a 4ºC hasta la realización de la técnica de

TUNEL.

El primer paso de la técnica de TUNEL fue realizar el bloqueo de peroxidasas endógenas

a través de la incubación durante 20 minutos con solución de H2O2 al 3% en metanol. Luego de

lavar dos veces con PBS, se permeabilizaron las membranas celulares con solución de Tritón X-

100 (código 23,472-9, Sigma-Aldrich) al 0,1% en Citrato de sodio, durante 2 minutos sobre

hielo. Se realizaron dos lavados con PBS y se dejó reposar a TA.

Posteriormente, se prepararon los reactivos para la reacción de TUNEL

(aproximadamente 20 μl para cada una de las muestras y para el control positivo), empleándose

para el efecto los viales que el kit “In situ Cell Death Detection, POD (Roche)” provee.

Se preparó en una proporción 1/10 del vial 1 (solución de la enzima, Desoxinucleotidil

Transferasa Terminal (TdT) de timo de ternero, recombinante en E. coli, 10X) versus el vial 2

(solución Label, mezcla de nucleótidos marcados 1X en buffer de reacción).

Los “controles negativo y positivo” de la técnica se incubaron con 20 µl de DNAsa

(Deoxyribonucleasa I 0.1 U/μl, código D7291, Sigma) por 10 minutos en cámara húmeda a

37ºC y se lavaron dos veces con PBS.

Luego se escurrió completamente el líquido de todas las muestras. Se agregó la mezcla

de reacción TUNEL a todas los cubreobjetos, menos al control negativo al que se adicionó solo

la solución del vial 2. Se procedió a incubar una hora en cámara húmeda a 37ºC. Se lavó con

PBS y se adicionó el convertidor POD (Anticuerpos anti fluoresceína, (fragmento Fab de oveja)

75

conjugados con Peroxidasa de rábano picante). Se incubó durante 30 minutos a 37ºC y se lavó

con PBS.

Finalmente, se agregó el substrato DAB (código K3468, DAKO) hasta ver la reacción de

coloración (aproximadamente por 10 segundos) y se frenó la reacción con agua destilada. El

contraste se efectuó con hematoxilina de Mayer, se dejó secar a 37ºC por 3 horas y se hizo el

montaje con medio DPX.

4.2.b Controles de la técnica.

La validación del método TUNEL requiere de dos controles:

a) Control positivo: Son las células fijadas y permeabilizadas en las que se provocó

la fragmentación del ADN a través de un tratamiento con DNAsa. Ésta enzima, digiere a cadenas

simples y dobles de ADN, obteniéndose una mezcla de mono y oligonucleótidos que llevan

extremos terminales 3`OH. Los extremos son reconocidos por los nucleótidos marcados (vial 2)

y unidos a ellos por la acción de enzima TdT (vial 1).

b) Control negativo: Corresponde a las células fijadas y permeabilizadas tratadas

con DNAsa y la solución con los nucleótidos marcados (vial 2), pero no sometidos a la acción de

la enzima TdT (vial 1). Consecuentemente aunque hubo fragmentación de ADN no se produce el

marcaje en los núcleos del preparado.

También fue necesario crear un control positivo de apoptosis. Para ello se realizó un

tratamiento con una solución de H2O2 5 mM por 15 minutos a 38,5°C antes de fijar las células y

proseguir con el protocolo de la técnica de TUNEL. Se eligió este inductor debido a que en el

laboratorio donde se realizó la investigación, se ha comprobado que el tratamiento con H2O2

induce la fragmentación de ADN y los cambios morfológicos clásicos de la apoptosis en células

de cuerpo lúteo bovino y en Complejos Ovocitos Cumulus de cerdo (Germano, 2013; Tello,

2012).

76

4.3 Inmunocitoquímica para proteínas Bax, Bcl-2 y Caspasa-3 activa.

Las proteínas de la familia Bcl-2 regulan los procesos apoptóticos. Algunos miembros de

esta familia pueden actuar como supresores de apoptosis (Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-l, Bfl-l, Bcl-W), y

otros como promotores de apoptosis (Bax, Bak, Bok y Bid) (Basu & Haldar, 1998; Luna et. al.,

2008; Rojas et. al., 2009).

La proteína Bcl-2 como tal, es la más conocida y fue seleccionada para la evaluación de

la apoptosis, porque se sabe que el aumento en la expresión de Bcl-2 en la célula, bloquea la

apoptosis en la mayor parte de los modelos experimentales estudiados (Ramírez, 1999).

Bax, en contraste a Bcl-2, es un miembro proapoptótico de la familia de proteínas Bcl-2

(Basu & Haldar, 1998; Ramírez, 1999). Bax se empleó para detección de apoptosis, dado que se

ha verificado que la expresión de Bax aumenta con la inducción de apoptosis en células de la

granulosa de animales tanto in vivo como in vitro (Carou, 2012; Tilly et. al., 1995).

Se decidió realizar la detección de Bax y Bcl-2 porque en conjunto son un indicador de

gran confianza de la activación del proceso apoptótico por la vía intrínseca (Salazar, 2009). El

estudio de Bax y Bcl-2 se efectúo a través de inmunocitoquímica dada la existencia de

anticuerpos comerciales que garantizan su reconocimiento y observación (Merkis et. al., 2008;

Salazar, 2009). Además, existe una serie de kits comerciales que permiten estos estudios y que

son relativamente fáciles de implementar e interpretar (Salazar, 2009).

El grupo de las proteínas caspasas son también requeridas para inducir la apoptosis

(Rojas et. al., 2009), consecuentemente su determinación es uno de los métodos que resulta más

confiables para la detección de la misma (Alfaro et. al., 2000). Dada la relevancia de la caspasa 3

como punto de convergencia de las diferentes vías de señalización de apoptosis (Biosciences,

2012), se utilizó un anticuerpo contra esta caspasa activada para verificar la modulación de

apoptosis en CGG-P1.

La técnica inmonohistoquímica para reconocer la expresión de las proteínas Bax, Bcl-2 y

caspasa-3 clivada se efectuó sobre células crecidas sólo con 5% de SFB y células con inducción

de LA 100 nM por 48 horas.

El procedimiento empleado fue el mismo que el ya mencionado para la identificación de

GnRH-R-I, pero se detallan los materiales empleados: PBS; alcohol etílico de varias

77

graduaciones (100º, 96º, 70º); Tritón X-100 (código 23,472-9, Sigma-Aldrich) al 0,1%; H202 al

3%; SFB; Kit Dako LSAB + System-HRP (Referencia K0690, Dako) para inmunocitoquímica;

Kit Liquid DAB + substrate chromogen system (código K3468, Dako) como cromógeno o dador

de electrones que colorea la reacción; hematoxilina (artículo 161503, Hematoxilina cristal de

Biopack); nevera a 4ºC; micropipetas y tips correspondientes; cámara húmeda; DPX (código

06522, Sigma); agua destilada; agua corriente. Además, se emplearon anticuerpos contra las

proteínas buscadas; las características propias de los anticuerpos y las diluciones usadas son las

que se mencionan a continuación:

El anticuerpo anticaspasa 3 activa (código C8487, Sigma Aldrich) fue producido

en conejo utilizando como inmunógeno un péptido sintético correspondiente al sitio de escisión

de caspasa 3 humana (aminoácidos167-175). La dilución de trabajo empleada fue de 1:800.

El anticuerpo anti Bax Clon 6A7 (Sigma - Aldrich) es un anticuerpo monoclonal

hecho en ratón contra la región de aminoácidos 12-24 de la secuencia correspondiente a la

proteína Bax del humano. Se usó la dilución 1:400 para CGG-P1.

El anticuerpo anti Bcl-2 (C21) SC-783 (Santa Cruz Biotechnology) policlonal

tiene origen en conejo y actúa contra los aminoácidos 1 - 205 de la Bcl-2 humana. Para las ICQ

de CGG-P1 se usó la dilución de trabajo de 1:100.

4.3.a Alineamiento de proteínas.

A los fines de garantizar que los anticuerpos utilizados (contra proteínas humanas) tienen

reactividad cruzada entre especies y así poder utilizarlos en el modelo objeto de estudio (gallina

doméstica) e identificar de esta manera las proteínas apoptóticas, se procedió a realizar los

respectivos alineamientos entre las secuencias humanas y de la gallina doméstica.

Las secuencias de las proteínas fueron tomadas del GenBank y los correspondientes

alineamientos múltiples se realizaron con la herramienta bioinformática ClustalW2. También se

78

realizó una revisión de literatura relacionada con la intervención de las proteínas citadas en los

procesos de apoptosis en el Galllus gallus domesticus.

El grado de identidad entre las proteínas fue verificado, poniéndose interés en que exista

una identidad consistente en las regiones que detectan los anticuerpos empleados.

4.3.b Controles de la técnica e interpretación de resultados.

En todas las ICQ realizadas se efectuaron “controles negativos”, en los que se prescindió

de la colocación del anticuerpo primario, realizándose todo el procesamiento de la misma manera

que con las muestras problema.

Las células con marcación positiva para una proteína determinada se observaron con un

color marrón en su citoplasma; mientras que las células negativas a la presencia de la proteína

activa en el citoplasma se observaron del color violeta otorgado por la hematoxilina.

Para evitar la subjetividad que se genera mediante la valoración visual de la intensidad de

la marca en el citoplasma de las células, se realizó de forma digital la medición de la densidad

óptica integrada (DOI) y del porcentaje de área de marcación positiva (% área). Estas

herramientas forman parte del software de análisis morfométrico digital QWin Plus de Leica Co.

La medición de la DOI se efectúo sobre cada una de las fotos obtenidas a partir de las

preparaciones de inmunocitoquímica de cada proteína (Bax, Bcl-2, y Caspasa-3 activa). Para

cada una de las proteínas estudiadas se analizaron 150 campos por repetición (tanto para los

tratamientos como los controles), originando un total de 450 imágenes analizadas para Bax y

Bcl-2, y de 300 imágenes para Caspasa-3 activa.

Los valores de DOI de las fotografías se generaron con el empleo de la función intensidad

de grises – DOI. Sobre la base de una imagen con distintas intensidades de marcación se realizó

una curva de calibración. Los valores máximos de DOI corresponden a las zonas negativas y los

valores más bajos representan a las zonas de mayor intensidad de marca. La curva de calibración

constó de 8 valores arbitrarios designados por la medición digital de la DOI y se estableció para

cada tipo de proteína por separado. Luego de obtener valores de DOI para cada uno de las

79

imágenes, los valores promedio para los tres canales digitales que componen la imagen digital

policromática (azul, rojo y verde) se usaron para cuantificar y comparar los tratamientos.

El porcentaje de área se realizó empleando la función de detección y medición de campo

del programa QWin Plus. Previamente, sobre una imagen dada se estableció la intensidad de

marcación y se ejecutó con el programa la detección de cantidad de área sombreada con relación

al total de área de la imagen. Los valores arrojados por el programa fueron directamente

porcentajes de área, mismos que se emplearon para realizar la comparación estadística entre

controles y tratamientos. Por cada réplica experimental se analizaron 50 campos, originando por

cada repetición un total de 150 campos para grupos control y 150 para grupos tratados con LA.

El total de imágenes analizadas para las proteínas Bax y Bcl-2 mediante porcentaje de área,

corresponde a 450 para el tratamiento y 450 para el control. En el estudio de porcentaje de área

marcado para la proteína caspasa-3 activa se emplearon 300 imágenes por cada grupo estudiado.

4.4 Evaluación de Apoptosis a través de FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter)

para Anexina V/Ioduro de Propidio

La fosfatidilserina es un fosfolípido de membrana que se encuentra en la cara interna de

la membrana plasmática y se trasloca quedando expuesto en la cara externa de dicha membrana

cuando comienza el proceso de apoptosis. La Anexina es una proteína que se une

específicamente a la fosfatidilserina. La conjugación de la Anexina con diferentes fluorocromos,

como son Alexa fluo- 488, FITC (verde) o R-ficoeritrina (rojo), permite la detección de las

células apoptóticas por citometría de flujo, microscopia confocal o de fluorescencia (Elmore,

2007; Flores, 2002; Salazar, 2009; Schrevens et. al., 1998).

Con el fin de evaluar la apoptosis temprana, se usó el kit comercial Annexin V Conjugate

(Recombinant) de Invitrogen (PHN1008). El kit permite revelar la expresión de fosfatidilserina

en la superficie de las células apoptóticas a través de la marcación específica con Anexina V

(AV) recombinante conjugada a FITC. Se empleó está técnica dada su alta sensibilidad, ya que

puede detectar una célula apoptótica individual y arrojar resultados cuantitativos objetivos.

80

La Anexina V es capaz de atravesar la membrana plasmática en células muertas, que han

perdido la integridad de membrana y unirse a la fosfatidilserina que se encuentra en la cara

interna de la membrana. En consecuencia, para discriminar entre células muertas y células

apoptóticas se emplea una tinción rápida con el colorante ioduro de propidio (IP). El ioduro de

propidio (IP) solo tiñe las células cuando éstas han perdido la integridad de su membrana, es

decir, marca sólo células muertas o aquellas en las últimas fases de apoptosis (Bustamante 2007;

Mora, 2009)

4.4.a Protocolo Anexina V – IP.

Luego de culminadas las 48 horas de tratamiento con LA 100 nM, tanto los controles

como tratamientos se lavaron con PBS. Se levantaron las células del sustrato con tripsina

(Trypsin from porcine páncreas, código T4 799-5G, Sigma) al 0,25% más EDTA 0,02% en PBS

(pH: 7,4) y después de 5 minutos se frenó la actividad enzimática agregando SFB (Suero Fetal

Bovino de Internegocios S.A.). La suspensión celular se centrifugó a 2000 rpm por 10 minutos.

El sedimento celular se resuspendió en 1ml de PBS utilizando 100.000 células para cada

replica y para la respectiva determinación de AV/PI. Se realizó una nueva centrifugación a 2000

rpm por 10 minutos y el pellet celular obtenido se resuspendió en 100 µl de buffer de unión a la

Anexina (10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2).

La tinción con anexina se realizó adicionando 4 μl a la suspensión celular formada con

los 100 μl de buffer de unión. Se incubó durante 15 minutos a TA en oscuridad.

Como paso previo a la medición por FACS se agregó 1μl de PI (P3566 Invitrogen) en

cada una de las muestras. Luego por requerimientos del citómetro de flujo (BD, modelo FACS-

Canto II) se llevaron todos los tubos a un volumen de 300 µl con solución fisiológica.

Las determinaciones de intensidad de fluorescencia se realizaron sobre 10.000 a 15.000

células/muestra analizadas por FACS en un citómetro marca BD modelo FACS-Canto II de dos

láseres y seis colores.

81

4.4.b Controles de la técnica e interpretación de resultados.

La técnica de citometría de flujo para AV/PI se trabajó con tres controles:

a) Control de autoflorescencia: Suspensión de células vivas sin tratamiento, sólo

SFB al 5% y sin ninguna marcación.

b) Control positivo de Anexina: Suspensión de células fijadas con formol puro en

una relación 1:3 y marcadas sólo con Anexina.

c) Control positivo de IP: Suspensión celular fijada con formol puro (1:3) marcada

exclusivamente con IP.

Los datos proporcionados por el análisis mediante citometría de flujo fueron analizados

con el programa WinMD 2.8, obteniéndose gráficos de PI (eje Y) en función de AV (eje X),

especificando en cada uno de ellos 4 cuadrantes (gráfico de Dot Plot para citometría de flujo)

(figura 19):

I. Superior Izquierdo: Células muertas sin Anexina (AV negativas; IP

positivas)

II. Superior Derecho: Apoptosis tardía (AV positivas; IP positivas)

III. Inferior Izquierdo: Células vivas (AV negativas; IP negativas)

IV. Inferior Derecho: Células con apoptosis temprana (AV positivas; IP

negativas).

Los cuadrantes se determinaron arbitrariamente teniendo en cuenta los controles positivos

para PI y AV, así como el control de autofluorescencia. Una vez fijados los ejes de los

cuadrantes se obtuvieron los porcentajes de células encontradas en cada uno de ellos, con

respecto al total. Estos valores relativos se usaron para verificar si las muestras tratadas con LA

100 nM eran diferentes de los no tratados.

82

Figura 19. Interpretación de la distribución gráfica de eventos detectados por su unión a

AV o IP.

En cuadrante I: células AV (-) y IP (+); cuadrante II: células AV (+) y IP (+); cuadrante III: células

negativas para AV y IP; cuadrante IV: células AV (+) y IP (-).

4.4.c Interpretación.

Si la nube de puntos se corre hacia la derecha en el hemisferio inferior del Dot Plot

(cuadrantes), hacia arriba en el hemisferio derecho y hacia la izquierda en el hemisferio superior

formando una espiral antihoraria, estamos en presencia de una cinética propia de la apoptosis; si

la nube de puntos en el Dot Plot, se corre hacia arriba en el hemisferio izquierdo se trata de

necrosis. Por lo tanto, el aumento en el número de eventos en el cuadrante superior izquierdo

puede indicar apoptosis muy tardía (necrosis secundaria, asociada a la apoptosis) o necrosis,

dependiendo de la dirección del desplazamiento de los puntos.

83

5. ESTADÍSTICA.

Dada la naturaleza de los datos obtenidos, para el estudio morfológico y la técnica

TUNEL se empleó un análisis de proporciones y luego en base al índice de cuerpos apoptóticos

se realizaron los respectivos gráficos. El índice de cuerpos apoptóticos se definió como el

número de cuerpos apoptóticos respecto al número de células totales observadas por campo de

observación.

Para los resultados conseguidos a partir de la inmunocitoquímica y de la citometría de

flujo, se realizaron pruebas de normalidad (Shapiro Wilks) e igualdad de varianzas (Prueba F).

Luego para las ICQ se empleó la prueba “t” para comparar y verificar la diferencia entre el

control (células cultivadas con 5% de SFB) y el tratamiento (células inducidas con LA 100 nM).

La prueba de varianza (ANOVA) de un factor se empleó para comparar los resultados de los

respectivos tratamientos obtenidos con FACS.

Todos los análisis estadísticos se realizaron empleando el programa Infostat 2008/L y se

consideraron diferencias altamente significativas si p <0,05.

84

RESULTADOS

1. CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS DE GRANULOSA DE GALLINA (CPGG).

La técnica desarrollada por Gilbert y colaboradores (1977) para separar células de

granulosa a partir de folículos preovulatorios permitió conseguir cultivos primarios de manera

sencilla. Sin embargo, dentro del procedimiento se detectaron pasos claves que permitieron

eliminar la yema y conseguir una disgregación celular adecuada.

Para evitar contaminaciones innecesarias con la yema de los folículos, fue necesario

considerar dos aspectos. Primero que la incisión realizada a lo largo del estigma de cada folículo

nunca fuera mayor a 1 cm de longitud y se acompañara de una maniobra rápida de barrido.

Segundo, que luego de la separación de las tecas, así como luego de la disgregación celular con

tripsina se realizaran tres lavados con PBS estéril.

Para la elección de la solución enzimática de digestión se ensayaron tres concentraciones

de Tripsina de páncreas porcino: 0,25%, 0,5% y 1%. Las concentraciones de tripsina al 1% y

0,5% producían viabilidad celular más baja (65% y 75%, respectivamente) con respecto a la

concentración de 0,25%. La concentración de 0,25% conseguía mejores resultados en la

recuperación celular (95% de vialidad celular promedio) y por eso se decidió utilizar esta

concentración.

La solución de tripsina permitió separar las células de la granulosa de las membranas

basales y perivitelinas, sin dejar residuos contaminantes que pudieran alterar los resultados. La

eliminación de dichas membranas se comprobó luego de efectuarse la filtración del material,

sembrarlo, y verificar la ausencia visual de cualquier estructura adicional a las células.

La comprobación de la obtención de cultivos de células de granulosa se realizó a través

de la elaboración de tacos de parafina con el material de cultivo luego de efectuarse la separación

total de las tecas y previo a los lavados para eliminar la yema. Los cortes teñidos con

hematoxilina-eosina muestran de forma inequívoca que el material con el cual se realizó los

cultivos corresponde a las células de granulosa (figura 20 b y c).

85

El rendimiento por cada gallina ponedora fluctuó entre 2 x 106 a 5 x 10

6 células de

granulosa. La fluctuación de la cantidad de células conseguidas, sumada a la heterogeneidad

implícita del cultivo primario, dificultó la realización de experimentos secuenciales tanto para la

caracterización del cultivo primario, como para la evaluación de apoptosis. En consecuencia, se

decidió trabajar con pasaje 1 de células de la granulosa de gallina (CGG-P1), que son células

obtenidas a partir de cultivos primarios que llegan a confluencia, se levantan por tripsinización y

se congelan hasta su uso en el experimento. Luego las células se descongelan y se siembran

denominándoselas entonces células de pasaje 1.

El subcultivo facilitó la realización de una investigación mejor estructurada al obtenerse

células con comportamiento más homogéneo, realizar experimentos secuenciales y permitir de

esta manera efectuar comparaciones entre las observaciones experimentales.

2. CARACTERIZACIÓN DEL PASAJE 1 DE CÉLULAS DE LA GRANULOSA DE

GALLINA (CGG-P1)

2.1 Características morfológicas de las CGG-P1.

Inicialmente las células sembradas sobre cubreobjetos no tratados tuvieron dificultades

para dispersarse y formar una monocapa homogénea, dado que mostraban dificultades en la

adhesión al sustrato de vidrio y en hacer “spread out” (estiramiento adhesivo en superficies). El

problema se manifestó con la formación de conglomerados o “racimos” celulares sobre la

superficie de los cubre objetos (figura 21 a y b). Debido a esto se decidió emplear un potenciador

de adherencia por carga, como la Poli-L-lisina.

La Poli-L-lisina se usó como recubrimiento de los cubre objetos que ya tenían un

tratamiento previo con alcohol etílico y ácido clorhídrico. Luego del tratamiento con Poli-L-

lisina el crecimiento celular permitió la formación de una monocapa más uniforme sobre los

cubre objetos (figura 21 c y d).

Para establecer la densidad de siembra para el subcultivo se tomó como base la densidad

en la que coinciden Schmierer y colaboradores (2002), así como Sirotkin y Grossmann (2008).

No obstante, debido a que estos investigadores emplearon las células para otros fines o sobre

86

otros materiales de crecimiento, se resolvió probar también con otras densidades de siembra

sobre cubreobjetos pre-tratados con poli-L-Lisina.

Con densidades de 5 x 104

células/cm2 se observaban espacios vacíos que no llegaron a

ser llenados por células en el transcurso del tiempo del cultivo. Por otra parte, con densidades de

2 x 105

células/cm2 se notaron zonas donde las células tendían a sobreponerse. Con una densidad

de siembre de 1 x 105

células/cm2, que es la densidad con la cual se trabajó, las células lograron

crecer y formar un monocapa homogénea.

El pasaje 1 de células de la granulosa de gallina, obtenido bajo las condiciones y manejo

mencionados en este trabajo, se caracterizó por mostrar células que si bien son del tipo

epitelioides, tienden a adoptar una forma estrellada (a la manera de fibroblastos) al adherirse a la

superficie de crecimiento luego de las 48 horas de cultivo.

Además, las células de subcultivo presentaron abundante vacuolización citoplasmática.

La vacuolización persistió durante todas las observaciones de seguimiento efectuadas con un

microscopio de contraste de fase y a los efectos de una mejor visualización se tomaron fotos

bajo microscopio de campo claro (figura 22).

Los subcultivos de granulosa de gallina teñidos con hematoxilina y eosina (H/E)

permitieron la observación más detallada de las características morfológicas de las células. En las

imágenes tomadas a partir de los preparados, se destaca que luego de 48 horas de cultivo las

células adoptan un aspecto fibroblástico con un núcleo ovalado central o levemente excéntrico

con cromatina laxa (figura 23 a).

Un porcentaje mayoritario de las CGG-P1 eran de tamaño similar, aunque también se

encontraron células de menor tamaño que formaban pequeños grupos celulares. Adicionalmente,

se observó en los subcultivos, células mono, bi y multinucleadas, así como también células en

diferentes estadios de mitosis o bien sufriendo procesos de necrosis (figura 23). Algunas células

mostraban citoplasmas pálidos, con una membrana citoplasmática irregular o discontinua (con

aparente daño de membrana), pero con núcleos intactos, características compatibles con las

etapas tempranas de necrosis (figura 23 b) (Zalacain et. al., 2005).

No se observaron imágenes de autofagia, en parte debido a que las vacuolas autofágicas

suelen ser pequeñas (Tsujimoto y Shimizu, 2005), pero sí se encontraron figuras compatibles con

87

la autofagia de pequeñas porciones de núcleo, nucleofagia (figura 23 c) (Mijaljica et. al. 2010).

También se vieron gran cantidad de células portadoras de micronúcleos (figura 23 h).

2.2 Curva de crecimiento de CGG-P1.

Las células que crecieron en placas de 12 pocillos, en presencia de 5% SFB a 38,5ºC,

aumentaron su población en función del tiempo entre las 24 y 96 horas de cultivo (gráfico 1). Se

notó tras dos repeticiones que la población celular alcanza su máximo crecimiento a las 96 horas.

La “zona de plateau” se alcanzó a las 72 horas de cultivo (3 días). Luego de cuatro días, se

presentó un período de 48 horas (96 a 144 horas) durante el cual el crecimiento celular se

estabilizó. Posteriormente se observó la caída paulatina de la población celular (gráfico 1).

La determinación de la curva de crecimiento permitió confirmar el momento de

semiconfluencia celular a las 72 horas de cultivo, a fin de evaluar la ocurrencia de apoptosis en

un período en el cual se elude la tendencia a la muerte celular que empieza a la semana de

cultivo (Schmierer et. al. 2003).

2.3 Presencia de lípidos intracelulares por tinción con Aceite Rojo O (ARO).

La aplicación de la técnica de tinción con Aceite Rojo O sobre las CGG-P1 mostró

abundantes vacuolas intracelulares teñidas de color rojo intenso, indicando la presencia de

lípidos (figura 24). Se observaron varias células con vacuolas de gran tamaño capaces en

ocasiones de ocultar la morfología del núcleo (figura 24 e). La mayoría de células poseían gran

cantidad de pequeñas vacuolas rojas perfectamente delimitadas, mientras que pocas células

estaban libres de vacuolas lipídicas (figura 24 c, d y f).

La presencia de la gran cantidad de vacuolas con lípidos en las células de granulosa es

una de sus características como células que realizan biosíntesis de esteroides (Welsch & Sobotta,

2009).

88

2.4 Caracterización de CGG-P1 por inmunohistoquímica para GnRH-R-I.

2.4.a Inmunohistoquímica sobre cortes de tejido ovárico.

En los cortes de hipófisis de gallina, usados como control positivo, se pudieron observar

agrupaciones celulares que tomaban una coloración marrón, y zonas donde las células eran

negativas frente al anticuerpo anti-GnRH-R-I (figura 25 b y d). Los cortes empleados que no

fueron expuestos al anticuerpo contra GnRH-R-I, resultaron enteramente negativos, validando la

detección efectiva del receptor de GnRH tipo I. (figura 25 a y c).

El análisis de 10 cortes de tejido ovárico provenientes de 10 gallinas diferentes, uno por

cada sacrificio realizado, mostró una marcación positiva para GnRH-R-I en las células de la

granulosa de todos los tipos foliculares encontrados. Sin embargo la intensidad y distribución de

la marca varió de manera inversa al grado de desarrollo folicular (figura 26).

En los folículos primordiales y primarios la marcación se presentó a nivel citoplasmático

en casi todas las células de la granulosa (figura 26 c, d, e y f). En los folículos prejerárquicos, en

cambio, se observó una marcación más intensa hacia la zona apical y que sólo se presentaba en

algunas células de la granulosa (figura 26 g y h).

Por otra parte, en los folículos preovulatorios se observó un patrón de marcación para el

receptor de GnRH tipo I bastante variable. En algunas regiones de un mismo folículo la marca

era intensa a nivel citoplasmático, pero se alternaban con zonas donde las células de la granulosa

poseían una marca leve a inexistente (figura 27).

Se observó marcación en las tecas de todos los tipos foliculares, ya sean primarios,

prejerárquicos o preovulatorios (figura 26 y 27). Sin embargo, la cantidad de células tecales

positivas así como la intensidad de marca no fue uniforme ni seguía un patrón específico

detectable en apariencia. Tampoco se pudo encontrar marcación para el receptor de GnRH tipo I

en el epitelio ovárico superficial de los preparados observados.

89

2.4.b Inmunocitoquímica sobre CGG-P1.

El receptor para GnRH tipo I fue evidenciado a nivel citoplasmático en las CGG-P1

(figura 28). En las células crecidas sin tratamiento con LA, se pudo observar la presencia de

células positivas y negativas para la expresión del receptor de GnRH tipo I.

Si bien la marca originada por el anticuerpo anti-GnRH-I no fue intensa en aquellas

células que la poseían, dicha marcación si fue distinguible comparada con el control negativo. En

el control negativo de la técnica se encontró que ninguna de las células presentó marcación para

el anticuerpo contra el receptor de GnRH tipo I (figura 28).

90

Figura 20. Fotografías de material de cultivo

(a) Aspecto macroscópico que presenta la membrana granulosa (junto con la membrana basal y la capa

perivitelina) obtenida a partir de un folículo pre-ovulatorio F1. (b) Imagen histológica de un corte teñido

con hematoxilina y eosina obtenido a partir de material para cultivo. x1000. (c) Tinción con Hematoxilina

de material para cultivo previo lavado de yema. Se señalan con flechas las estructuras encontradas y se

destaca (flecha roja) la presencia de células de la granulosa. x1000.

a

b c

91

Figura 21. CGG-P1, crecimiento sobre cubre objetos con y sin Poli-L-lisina a las 96 horas

de cultivo

(a) CGG-P1 en cubre objetos sin Poli-L-Lisina. Se destaca con un óvalo un conglomerado celular.

Microscopía de contraste de fase x1000. (b) CGG-P1 en cubre objetos sin Poli-L-Lisina, tinción con

Hematoxilina. Se señala con un óvalo un conglomerado celular. Microscopía de campo claro. x1000. (c)

CGG-P1 en cubre objetos con Poli-L-Lisina. Microscopía de contraste de fase. x1000. (d) CGG-P1 en

cubre objetos con Poli-L-Lisina, tinción con Hematoxilina. Microscopía de campo claro. x1000.

a b

c d

92

Figura 22. Fotografías representativas de CGG-P1

CGG-P1 a las 48 y 96 horas de cultivo, se observa el aspecto fibroblástico que adquieren las células, la

localización y forma nuclear, así como la vacuolización citoplasmática. Microscopía de campo claro.

x400

93

Figura 23. CGG-P1 con tinción H/E

(a) CGG-P1. Nótese la posición del núcleo y la vacuolización citoplasmática (x1000). (b) Célula

en necrosis temprana (destacada en un óvalo) (x1000). (c) Célula con nucleofagia (destacada con

circunferencia) (1000). (d) Célula en metafase (x1000). (e) Célula en anafase. (f) Célula en

telofase. (g) Células binucleadas. (h) Célula con micronúcleos (flechas negras). x1000.

94

Gráfico 1. Curva de crecimiento para CGG-P1

95

Figura 24. Fotografías de células de cuerpo lúteo bovino y CGG-P1 teñidas con Aceite

Rojo-O

(a) Células de cuerpo lúteo bovino teñidas con aceite rojo O (ARO), empleadas como control positivo de

técnica. x1000. (b) Células de cuerpo lúteo bovino teñidas con aceite rojo O (ARO) empleadas como

control positivo de técnica. x400. (c) y (d) CGG-P1 teñidas con aceite rojo O (ARO) x400. (e) y (f) CGG-

P1 teñidas con aceite rojo O (ARO). x1000.

96

Figura 25. Inmunohistoquímica para GnRH-R-I en hipófisis de gallina.

(a) y (c) Cortes de hipófisis de gallina como controles negativos de la técnica. x400 y x1000,

respectivamente. (b) y (d) Hipófisis de gallina con células positivas a GnRH-R-I. x400 y x1000,

respectivamente.

a b

c d

97

Figura 26. Inmunohistoquímica para GnRH-R-I en tejido ovárico de gallina.

(a) Folículos primarios en control negativo de la técnica. x400. (b) Células de la granulosa de un folículo

prejerárquico en control negativo de la técnica. x1000. (c y d) Folículos primordiales y primarios con

células de granulosa positivas a GnRH-R-I. x400. (e) Folículo primario con células de granulosa positivas

a GnRH-R-I. x400. (f) Células de la granulosa positivas a GnRH-R-I de un folículo primario. x1000. (g)

Folículo prejerárquico con células de granulosa positivas a GnRH-R-I. x400. (h) Células de la granulosa

positivas a GnRH-R-I de un folículo pre-jerárquico. x1000. Las flechas señalan marcación intensa en la

zona apical.

98

Figura 27. Inmunohistoquímica para anticuerpo anti-receptor de GnRH tipo I en folículos

pre-ovulatorios.

(a) Células de la granulosa, G, de un folículo previtelogénico con marca positiva a GnRH-R-I. x400 (b)

Zona del mismo folículo previtelogénico pero con marcación leve en granulosa, G, y evidente en tecas, T.

(c) Porción de folículo previtelogénico con células de granulosa marcadas, M, y no marcadas, NM, contra

GnRH-R-I. x1000.

a b

c

M

NM

G

T

G

99

Figura 28. Inmunocitoquímica para anticuerpo anti-receptor de GnRH tipo I en CGG-P1.

(a) CGG-P1 marcadas contra GnRH-R-I. Se puede observar la leve marcación del citoplasma de las

células. (b) CGG-P1 marcadas y no marcadas contra GnRH-R-I En los cuadros inferiores derechos se

presenta los controles negativos de la técnica (c-). x1000.

a

b

(c-)

(c-)

100

3. EVALUACIÓN DE APOPTOSIS

3.1 Análisis morfológico de la apoptosis por tinción con hematoxilina.

La tinción de las CGG-P1 con hematoxilina logró tanto en los cultivos controles (sin

tratamiento) como en los cultivos tratados (con LA 100 nM) realizar una evaluación simple, pero

precisa de la apoptosis. El análisis de la morfología celular permitió detectar la presencia de

cuerpos apoptóticos (CA) como elementos típicos reveladores de apoptosis tardía (figura 29). En

consecuencia, se tomó como factor de evaluación la contabilización de estas estructuras.

Para que los cuerpos apoptóticos fueran identificados como tales se consideró como

características básicas que estas estructuras estuvieran perfectamente delimitadas y tuvieran

hipercromasia (demostrando compactación cromatínica) o en caso de no contener restos

celulares fueran visualizados con una intensidad de coloración diferente a la del núcleo normal.

Gran parte de los cuerpos apoptóticos contabilizados se presentaron fagocitados por las

células vecinas. Las células granulosas que fagocitan CA presentaban una morfología

aparentemente normal manteniendo su forma estrellada (semejante a un fibroblasto) y

conservando un núcleo con cromatina laxa. Sin embargo, estas células se caracterizaron por

poseer vesículas fagocíticas a nivel citoplasmático y/o formar una identadura a nivel de la

membrana nuclear (figura 29 a, b y c).

Para poder realizar un conteo adecuado de CA, fue necesario también establecer

parámetros que permitieran distinguir estas estructuras de los micronúcleos (MN) y nucleofagia

(fenómenos que también fueron encontrados en los cultivos de CGG-P1) y de esta formar

establecer un índice de CA. Los micronúcleos, como su nombre lo indica, fueron distinguibles

dado su menor tamaño comparado con el núcleo, pero se caracterizaron por poseer una

cromatina laxa y en consecuencia presentar la misma intensidad de coloración que el núcleo. Por

su parte, fue posible distinguir claramente entre la nucleofagia y los CA debido a que la

intensidad de coloración de las “gemaciones” nucleares era igual a la del núcleo y siempre

estaban vinculadas o conectados al núcleo principal.

101

La inducción con LA 100 nM por un tiempo de 24 horas no mostró diferencia

significativa de activación de la apoptosis con relación a las células no tratadas (p = 0,9090). La

falta de diferencia entre el control y tratamiento se nota visualmente en el gráfico 2, el cual fue

elaborado en base al índice de cuerpos apoptóticos promedio para los grupos control (3,861%) y

para los tratados con LA 100nM por 24 horas (3,733%).

La proporción de CA encontrados para el tratamiento con LA 100nM por 48 horas de

inducción tampoco mostró una diferencia significativa con relación al control (p = 0,1268). Cabe

aclarar que, la proporción de cuerpos apoptóticos encontrada en los cultivos analizados a las 48

horas fue muy baja comparada con la cantidad de células contabilizadas (gráfico 3). Sin

embargo, el número de CA fue ligeramente mayor para el cultivo tratado con LA 100 nM por 48

horas que para el control. El índice de cuerpos apoptóticos promedio para los cultivos tratados

con LA 100 nM por 48 horas fue de 4,060% y para los controles de 3,805%. La relación

encontrada entre control y tratamiento para el tiempo de 48 horas se evidencia mejor en un

diagrama de cajas y bigotes (box and whisker) (gráfico 4).

3.2 Evaluación de Apoptosis tardía a través de TUNEL para CGG - P1.

En los controles negativos realizados para la técnica TUNEL no se observaron núcleos

marcados; mientras que en los controles positivos, por la acción de la DNAsa y los nucleótidos

conjugados, se encontró marcación en el 100% de los núcleos, independientemente de la

morfología celular (cuadro 1).

No se observaron células con núcleos positivos a TUNEL tanto en las células crecidas

con 5% SFB (controles) como en las células bajo la inducción con LA 100 nM por 48 horas

(tratamientos). Sin embargo, sí se hallaron cuerpos apoptóticos con presencia de marca positiva

para TUNEL tanto en los cultivos tratados como en los controles (cuadro 1).

Se concluye que la activación de apoptosis debida al tratamiento con LA 100 nM a las 48

horas de incubación no tuvo diferencia significativa con relación al control (p = 0,2215).

El gráfico de barras y bigotes elaborado para el índice de cuerpos apoptóticos muestra la

relación hallada entre el control y el tratamiento, ratificando que a pesar de existir un cantidad

102

algo mayor de CA en los cultivos tratados con LA no hay diferencia significativa comparada con

los controles (gráfico 5).

A los fines de comprobar que el sistema experimental es sensible a la inducción de

apoptosis se trataron a los cultivos durante 15 minutos con H2O2 5mM. Se pudo verificar que, la

proporción de CA aumentaba significativamente en comparación con los cultivos controles y los

tratados con LA 100 nM (p ˂ 0,0001) (gráfico 6), pero el índice de cuerpos apoptóticos siguió

siendo bajo comparado con la cantidad de células totales.

3.3 Evaluación de apoptosis mediante ICQ para Bax, Bcl-2 y Caspasa-3 clivada

3.3.a ICQ para la proteína BAX.

Debido a que comercialmente no se encuentra disponible el anticuerpo contra la proteína

Bax del Gallus gallus domesticus, se decidió emplear el anticuerpo anti-Bax humano basándose

en un trabajo de cultivos de granulosa de la gallina donde se utilizó un anticuerpo anti-Bax de

origen humano para evaluación de apoptosis (Sirotkin & Grossmann, 2006).

La positividad para Bax en las CGG-P1 se evaluó a través del porcentaje de área positiva

y la densidad óptica integrada (DOI) para cada imagen tomada a partir de tres repeticiones con

sus réplicas correspondientes.

El porcentaje de área positivo para Bax en los cultivos tratados con LA 100 nM por 48

horas no fue significativamente diferente del encontrado para el control (p = 0,4585). El análisis

hecho con las imágenes para DOI tampoco dio diferencias significativas, por lo que se concluye

que la inducción con LA 100 nM por 48 horas no difiere del control (p = 0,3019).

La falta de incremento de la expresión de Bax en los cultivos tratados con leuprolide se

muestra en los gráficos de barras y bigotes elaborados tanto para porcentaje de área como para

DOI (gráfico 7 y 8, respectivamente). Para una mejor interpretación, en el caso de la DOI se

utilizó en los gráficos la inversa de la DOI, con lo cual el aumento de la variable en el eje de las

ordenadas indica un aumento en la intensidad de la marca obtenida en las fotografías.

103

Durante este análisis de marcación para la proteína Bax se observaron células con

marcación citoplasmática, así como CA que presentaron marcación positiva para productos de

Bax, no marcándose la célula que los fagocitaba (figura 30).

3.3.b ICQ para la proteína Bcl-2.

Dado que, la información científica encontrada menciona que, anticuerpos elaborados

contra la Bcl-2 del humano se pueden utilizar para evaluar apoptosis en granulosa de gallina

(Sirotkin & Grossmann, 2006), se procedió a realizar un alineamiento de secuencias y

comparación entre la proteína de humano y la de Gallus gallus domesticus (en base a la

información contenida en el GenBank) (figura 31). El alineamiento realizado mostró que existe

una identidad de 74,25% entre las secuencias. Este porcentaje de identidad es suficiente para

considerar que la Bcl-2 del Gallus gallus domesticus es muy similar a la del humano (Eguchi et.

al., 1992). Por tanto, se pudo utilizar el anticuerpo policlonal (SC-783, Santa Cruz

Biotechnology) contra los aminoácidos 1 - 205 de la Bcl-2 humana para la evaluación de

apoptosis en las células de granulosa de gallina.

En los CGG-P1 la expresión de la proteína Bcl-2 se evaluó considerando el porcentaje de

área positiva marcada y la densidad óptica integrada (DOI) de cada una de las imágenes

adquiridas a partir de los cultivos celulares.

El porcentaje de área positivo para Bcl-2 promedio para los cultivos control fue de 2,85%

y para las CGG-P1 tratadas con LA 100 nM por 48 horas fue de 2,72%. Los porcentajes de área

encontrados muestran que no hay diferencia significativa para la marcación contra Bcl-2 entre

los tratamientos (p = 0,7688).

El análisis hecho de las imágenes para la DOI también demuestra que la expresión de

Bcl-2 en los cultivos tratados con LA 100 nM por 48 horas no es diferente de la encontrada en el

control (p = 0,9031).

La ausencia de diferencia para expresión de Bcl-2 evaluada a través de porcentajes de

área se muestra en el gráfico 9. En el caso de la DOI el gráfico de cajas y bigotes se realizó

104

aplicando la función inversa para los valores de la DOI, a los fines de facilitar la interpretación

gráfica, generando valores de orden positivo (gráfico 10).

3.3.c ICQ para Caspasa-3 activa.

La presencia de caspasa-3 activa en las CGG-P1 se evaluó empleando un anticuerpo

contra el sitio de escisión de caspasa 3 humana, luego de haber realizado un alineamiento y

comparación con la proteína del Gallus gallus domesticus, utilizando la base de datos del

GenBank. El alineamiento entre la caspasa 3 humana y la caspasa 3 de la gallina doméstica

muestra una identidad de 63.3% entre estas especies, pero en la región que reconoce el

anticuerpo empleado en la investigación, existe total identidad, excepto por sólo un aminoácido

(figura 32). En consecuencia, el anticuerpo contra el sitio de escisión de caspasa-3 humana

(aminoácidos167-175; código C8487, Sigma Aldrich) se pudo emplear con la certeza de que se

identificaría la proteína caspasa 3 activa en CGG-P1 como indicador del proceso de apoptosis.

Las células positivas para caspasa-3 activa mostraban citoplasmas color marrón,

destacándose además la marcación de cuerpos apoptóticos con el anticuerpo. Las células en

mitosis también fueron positivas para caspasa-3 activa (figura 33).

La evaluación de la cantidad de expresión de caspasa-3 al igual que para Bax y Bcl-2, se

efectuó a través de mediciones de porcentaje de área positiva y de la DOI en las imágenes

obtenidas a partir de CGG-P1.

No existió diferencia entre los cultivos tratados con LA 100 nM por 48h y los cultivos

control en lo que se refiere a la expresión de la proteína caspasa-3 activa. La ausencia de

diferencia entre los tratamientos se encontró tanto para el porcentaje de área (p = 0,6926) como

para la inversa de la DOI (p = 0,2548) (gráficos 11 y 12).

105

3.4 Evaluación apoptosis temprana con citometría de flujo para AV/IP:

La determinación de Anexina/IP por FACS permitió evaluar la exposición de las

fosfatidilserinas en la cara externa de la membrana plasmática como indicador de apoptosis

temprana.

Se evaluó la proporción de células que se encuentran en cuatro estadios diferentes:

células vivas, en apoptosis temprana, en apoptosis tardía y en necrosis (gráfico 14). La

distribución de las poblaciones celulares con “Dot Plots” muestra la poca cantidad de células

encontradas en apoptosis y necrosis, tanto para los cultivo control como para los tratados (gráfico

13).

No se observaron diferencias significativas para necrosis (N) (p = 0,3962; n = 9) y células

vivas (p = 0,503; n = 9), entre los cultivos incubados con 100 nM de LA por 48 horas y sólo con

5% de SFB (control experimental). Tampoco se encontraron diferencias significativas para la

apoptosis temprana (ATE) entre los tratamientos (p = 0,4166; n= 9) respecto de los controles

(gráfico 15)

Los porcentajes encontrados para la apoptosis tardía (ATA) no fueron diferentes entre los

tratamientos (p = 0,9183; n = 9) (gráfico 16), pero los valores fueron bajos (gráfico 14)

comparados con lo contabilizado por las técnicas de TUNEL y tinción con hematoxilina. Esto

podría deberse a que los CA fueron fagocitados por las células de granulosa vecinas evitando la

marcación celular para la apoptosis tardía.

Al no existir diferencias significativas para ATE y ATA, tampoco se encontró diferencia

en el análisis global tomado en consideración la apoptosis total (temprana más tardía).

106

Gráfico 2. Gráfico de barras para evaluación de apoptosis a través de morfología con

tinción de Hematoxilina (grupo control versus tratamiento con LA por 24 horas).

Células tratadas con LA 100 nM por 24 horas versus control de células crecidas sólo con 5% de SFB. No

hay aumento significativo en la proporción de cuerpos apoptóticos entre tratamientos. Las columnas

representan la media con su SEM.

107

Gráfico 3. Gráfico de barras para las proporciones de cuerpos apoptóticos (CA) y células

totales encontrados en cultivos con LA 100nM por 48 horas y cultivos control.

No se observaron diferencias significativas entre las proporciones de cuerpos apoptóticos entre los

tratamientos.

Gráfico 4. Diagrama de cajas y bigotes para evaluación morfológica de la apoptosis por

tinción con hematoxilina en CGG-P1 tratadas por 48 horas

Las barras y bigotes representan el índice de cuerpos apoptóticos promedio por repetición encontrados

para el grupo control versus el tratamiento con LA 100 nM por 48 horas. No se encontraron diferencias

significativas entre los tratamientos.

108

Figura 29. Fotos representativas de evaluación morfológica de apoptosis con Tinción

Hematoxilina-Eosina

(a), (b) y (c) CGG-P1 mostrando células con cuerpos apoptóticos fagocitados (flechas). (d), (e) y (f)

Cultivos de CGG-P1 con cuerpos apoptóticos libres (flechas). x1000.

109

Gráfico 5. Diagrama de cajas y bigotes para evaluación morfológica de la apoptosis

mediante TUNEL en CGG-P1 tratadas por 48 horas

Las barras y bigotes representan el índice de cuerpos apoptóticos promedio por repetición para las células

tratadas con LA 100 nM por 48 horas versus los controles de células crecidas sólo con 5% de SFB. No se

encontraron diferencias significativas entre los tratamientos.

Gráfico 6. Índice de Cuerpos Apoptóticos Positivos a TUNEL en CGG-P1

Las columnas representan la media con su SEM. p value fue de <0.0001.

110

ENSAYO TUNEL - Evaluación de apoptosis tardía

CONTROLES

DE TÉCNICA

Control

positivo

100X

400X

1000X

Control

negative

100X

400X

1000X

CGG-P1 Control

(5% SFB)

100X

400X

1000X

CGG-P1 Tratamiento

(LA 100nM)

Cuerpos apoptóticos

TUNEL (+)

Cuadro 1. Evaluación de apoptosis en CGG-P1 mediante técnica de TUNEL

111

Gráfico 7. Porcentaje de área marcado contra proteína Bax en CGG-P1 tratadas por 48

horas

Células tratadas con LA 100 nM por 48 horas versus control de células sólo con 5% de SFB. No

existieron diferencias significativas entre tratamientos.

Gráfico 8. Inversa de la densidad óptica integrada para proteína Bax en CGG-P1

tratadas por 48 horas.

Células tratadas con LA 100 nM por 48 horas versus control de células, no se observó diferencias

significativas entre estos tratamientos.

112

Figura 30. Fotos representativas de Inmunocitoquímica (técnica LSAB) para proteína Bax

(a) CGG-P1 marcadas con anticuerpo anti Bax. Obsérvese la marcación citoplasmática de las células

positivas versus las negativas. En ángulo inferior derecho se muestra el control negativo de la técnica

c (-). (b) y (c) CGG-P1 con CA fagocitados y marcados para anticuerpo anti-Bax (flechas negras).

Magnificación de las imágenes x1000.

b

(c-)

c

a

113

Humanos MAHAGRTGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWDAG-DVGAAPPGAAPAPGIFSSQPGHTPHP 59

Gallina MAHPGRRGYDNREIVLKYIHYKLSQRGYDWAAGEDRPPVPP--APAP---AAAPAAVAAA 55

***.** ********:************:* ** * ..** **** :: *. .. .

Humanos AASRDPVARTSPLQTPAAPGAAAGPALSPVPPVVHLTLRQAGDDFSRRYRRDFAEMSSQL 119

Gallina GAS--SHHRPEPPGSAAASEVPPAEGLRPAPPGVHLALRQAGDEFSRRYQRDFAQMSGQL 113

.** . *..* :.**. .... .* *.** ***:******:*****:****:**.**

Humanos HLTPFTARGRFATVVEELFRDGVNWGRIVAFFEFGGVMCVESVNREMSPLVDNIALWMTE 179

Gallina HLTPFTAHGRFVAVVEELFRDGVNWGRIVAFFEFGGVMCVESVNREMSPLVDNIATWMTE 173

*******:***.:****************************************** ****

Humanos YLNRHLHTWIQDNGGWDAFVELYGPSMRPLFDFSWLSLKTLLSLALVGACITLGAYLGHK 239

Gallina YLNRHLHNWIQDNGGWDAFVELYGNSMRPLFDFSWISLKTILSLVLVGACITLGAYLGHK 233

*******.**************** **********:****:***.***************

Figura 31. Alineamiento de secuencias aminoacídicas para Bcl-2 humana y Bcl-2 del Gallus

gallus domesticus

El anticuerpo usado en la investigación fue diseñado para reconocer los aminoácidos 1 a 205 de la Bcl-2

humana (GenBank #P10415.2), esta región está resaltada en color amarillo también en la Bcl-2 del Gallus

gallus domesticus (GenBank # Q00709.1).

Humanos -MENT-------ENSVDSKSIKNLEPKIIHGSESMDSGMSWDTGYKMDYPEMGLCIIINN 52

Gallina MMTDIKDGPRSGEDVSDARSFPGSKGMNLPASKSVDSGILPDDSYRMDYPEIGVCVIINN 60

* : *: *::*: . : : .*:*:***: * .*:*****:*:*:****

Humanos KNFHKSTGMTSRSGTDVDAANLRETFRNLKYEVRNKNDLTREEIVELMRDVSKEDHSKRS 112

Gallina KNFHRDTGLSSRSGTDADAASVREVFMKLGYKVKLNNDLSSRDIFKLLKNVSEEDHSKRS 120

****:.**::******.***.:**.* :* *:*: :***: .:*.:*:::**:*******

Humanos SFVCVLLSHGEEGIIFGTNGPVDLKKITNFFRGDRCRSLTGKPKLFIIQACRGTELDCGI 172

Gallina SFVCVLLSHGDEGLFYGTDGPLELKVLTSLFRGDKCRSLAGKPKLFFIQACRGTELDSGI 180

**********:**:::**:**::** :*.:****:****:******:**********.**

Humanos ETDSGVDDDMACHKIPVDADFLYAYSTAPGYYSWRNSKDGSWFIQSLCAMLKQYADKLEF 232

Gallina EADSGPDE-TVCQKIPVEADFLYAYSTAPGYYSWRNAAEGSWFIQSLCRMLKEHARKLEL 239

*:*** *: .*:****:******************: :********* ***::* ***:

Humanos MHILTRVNRKVATEFESFSFDATFHAKKQIPCIVSMLTKELYFYH 277

Gallina MQILTRVNRRVA-EYESCSTRQDFNAKKQIPCIVSMLTKEFYFPC 283

*:*******:** *:** * *:***************:**

Figura 32. Alineamiento de secuencias aminoacídicas para caspasa 3 de humanos y de la

gallina doméstica

El péptido sintético correspondiente al sitio de escisión (167 a 175aa) de caspasa 3 humana (GenBank

#CAC88866.1), que reconoce el anticuerpo empleado, se destaca en color amarillo y el único péptido de

esta región donde difieren en la secuencia de la gallina doméstica (GenBank #NP_990056.1) se presenta

en color rojo.

114

Gráfico 9. Porcentaje de área marcado para proteína Bcl-2 en CGG-P1

Células tratadas con LA 100 nM por 48 horas versus control de células crecidas sólo con 5% de SFB. No

hubo diferencias significativas entre tratamientos.

Gráfico 10. Inversa de la densidad óptica integrada en CGG-P1 para proteína Bcl-2.

Células tratadas con LA 100 nM por 48 horas versus control de células crecidas sólo con 5% de SFB. No

se observó diferencias significativas entre la inducción con LA 100 nM a las 48 horas versus el control.

115

Gráfico 11. Porcentaje de área marcado para Caspasa-3 activa en CGG-P1

Células tratadas con LA 100 nM por 48 horas versus control de células crecidas sólo con 5% de SFB. No

existieron diferencias significativas entre tratamientos.

Gráfico 12. Inversa de la densidad óptica integrada en CGG-P1 para Caspasa-3 activa.

Células tratadas con LA 100 nM por 48 horas versus control de células crecidas sólo con 5% de SFB. No

se observaron diferencias significativas entre los tratamientos.

116

Figura 33. Fotos representativas de Inmunocitoquímica (técnica LSAB) para caspasa-3

activa

(a) y (b) Célula en profase y CA marcados (flechas negras) contra anticuerpo anticaspasa 3. (c), (d) y (e)

CGG-P1donde se observan células con citoplasma marcado contra caspasa-3 activa. (f) Control negativo

de la técnica. x1000.

117

CONTROL TRATAMIENTO

Gráfico 13. Dot Plots representativos de CGG-P1 tratadas con LA 100nM y sin tratar

(marcados con AV/IP por FACS)

ATE, Apoptosis Temprana; ATA, Apoptosis Tardía; N, Necrosis; Células vivas encerradas en círculo

Verde.

Gráfico 14. Representación gráfica de las variaciones en los porcentajes de células

por los cuatro cuadrantes, de acuerdo a su marcación Anexina V/Ioduro de

Propidio.

118

Gráfico 15. Gráfico de barras y bigotes para evaluación de Apoptosis Temprana con FACS

(AV/IP)

Gráfico 16. Gráfico de barras y bigotes para evaluación de Apoptosis Tardía con FACS

(AV/IP)

119

DISCUSIÓN

1. SOBRE LA OBTENCIÓN, COMPORTAMIENTO Y MORFOLOGÍA DE LOS

CULTIVOS PRIMARIOS Y SUBCULTIVOS DE CGG.

La apoptosis es un mecanismo fisiológico dependiente de un programa genético, que es

esencial en el mantenimiento y en la regeneración tisular (Flores et. al., 2005; Mussche, 2004),

siendo la participación de la apoptosis determinante en ciertos procesos y tejidos.

En el caso del ovario, la apoptosis tiene un papel fundamental en la eliminación de los

folículos que no llegan a diferenciarse y ovular (atresia folicular) (Johnson & Woods, 2007;

Mussche, 2004; Tilly et. al., 1991). La identificación de clivaje internucleosomal del ADN

celular en folículos atrésicos de pollos, permitió concluir que la reabsorción fisiológica normal

de los folículos inicia en las células de la granulosa mediante procesos de apoptosis y luego

continúa hacia las membranas tecales y el ovocito (Tilly et. al., 1991).

En todos los vertebrados, incluyendo las aves, los procesos apoptóticos en la granulosa

son regulados por varios factores (Johnson, 2000b). En esta regulación participan hormonas

esteroideas sexuales, factores de crecimiento, diversas citocinas y gonadotrofinas (Asselin et. al.,

2000; Flores et. al., 2005). Además, se ha comprobado que la hormona GnRH también participa

del proceso apoptótico en los folículos ováricos de los mamíferos (Leung et. al., 2003). Existe

una variedad de trabajos que fueron dirigidos a la determinación de las acciones directas sobre el

ovario por parte de agonistas de GnRH (Carou, 2012; Clayton et. al., 1979; Germano, 2013;

Ramakrishnappa, 2004). Los agonistas de la GnRH tienen un efecto apoptótico sobre la

granulosa de folículos ováricos de humanos y ratas (In-Sun Hong, 2011; Kogo et. al., 1999;

Srivastava et. al., 1995). El agonista de GnRH, acetato de leuprolide, también tiene acción

apoptótica sobre células de línea de granulosa bovina (BGC-1) (Carou, 2012).

Queda suficientemente comprobado entonces que, al menos en mamíferos, la hormona

GnRH tiene acción apoptótica directa sobre las células de la granulosa (Bulfon & Bee de

Speroni, 2009; Carou, 2012; Kogo et. al. 1999). En las aves, en cambio, no hemos encontrado

estudios que relacionen a la hormona GnRH o sus agonistas, con la modulación del proceso

apoptótico en las células de la granulosa o en el ovocito.

120

Si bien existe información relacionada con los efectos de la GnRH en las gallinas, los

datos se limitan a las funciones centrales sobre la hipófisis y su relación con la liberación de

gonadotrofinas (Krishnan et al., 1993; Millar & King, 1983; Miyamoto et. al., 1984; Sharp et al.

1990).

La hormona GnRH, en los mamíferos, actúa de manera autocrina y/o paracrina a nivel

ovárico, regulando la esteroidogénesis ovárica y ejerciendo efecto tanto estimulatorio como

inhibitorio sobre la producción de hormonas esteroideas y sobre la apoptosis folicular

(Ramakrishnappa et. al., 2005; Srivastava et. al., 1995)

Asimismo, gracias a las propiedades funcionales que poseen los agonistas de GnRH, su

empleo está extendido tanto en medicina reproductiva humana como animal (Carou, 2012;

Germano, 2013; Rajamahndran et. al., 2001). Sin embargo, en las gallinas domésticas sólo se

han realizado trabajos donde agonistas de GnRH demuestran su capacidad para inducir la muda

forzada y los datos reportados sobre los posibles efectos locales sobre el aparato reproductor se

reducen a una mención de la disminución del peso del ovario y del oviducto (Attia et. al., 1993;

Burke & Attia, 1994; Dickerman & Bahr, 1989).

En función de la información descripta y de estudios hechos en el laboratorio sobre

modelos celulares en otras especies mamíferas, propusimos como objetivo principal evaluar el

efecto del acetato de leuprolide (LA) sobre la modulación de la apoptosis en células de la

granulosa de folículos preovulatorios de gallinas domésticas y obteniendo de forma indirecta

información acerca de los posibles efectos de la GnRH a nivel ovárico. Para alcanzar este

objetivo fue imprescindible contar con un modelo de células de granulosa de gallinas domésticas

en cultivos (modelo in vitro).

El método de separación de células de la granulosa a partir de folículos preovulatorios ha

sido empleado desde 1977 sin modificaciones importantes y ciertamente permite obtener células

de la granulosa para cultivos primarios sin contaminación de otros tipos celulares (Gilbert et. al.,

1977). A pesar que la técnica se describe en la literatura como relativamente sencilla de realizar,

no había experiencia documentada de que hubiera sido realizada en la Argentina. De acuerdo a

nuestra experiencia al respecto, existen ciertos detalles básicos que permitieron garantizar la

obtención de un material idóneo para trabajar. Los repetidos lavados con PBS de las células de la

granulosa luego de la separación de las tecas así como después de la disgregación enzimática

121

fueron importantes para eliminar residuos de yema. Igualmente, la concentración de la solución

de digestión enzimática al 0,25% por no más de 15 minutos fue determinante para obtener una

viabilidad del 95%.

Aunque el subcultivo (CGG pasaje 1) es un modelo que se obtuvo luego de congelar

cultivos primarios provenientes de folículos preovulatorios y resembrarlos, estas células

denominadas de “pasaje uno” se comportaron de manera semejante a lo descrito por Schmierer y

colaboradores (2003), quienes describen que las células de la granulosa en cultivos primarios

adquieren una morfología fibroblástica a las 48 horas de cultivo. Las células de pasaje 1 de

nuestro estudio, también pierden su fenotipo epitelioide a las 48 horas de cultivo y adquieren

forma fibroblástica.

Lin y colaboradores (2011) también reportaron que las células de las granulosa de

cultivos primarios empleados como control en sus experimentos y conseguidos a partir de

folículos prejerárquicos, toman una forma fibroblástica aplanada, en lugar de la apariencia

ovalada que se presentaba en los cultivos tratados con factor de crecimiento epitelial (EGF).

El equipo de Schimierer (2003) también reporta que los cultivos primarios de granulosa

de gallina crecidos exclusivamente con 5% de SFB mueren dentro de una semana, lo cual es

congruente con lo encontrado en nuestra investigación donde según la curva de crecimiento al

sexto día de cultivo (144 horas) comienza a disminuir la población celular promedio

contabilizada por día. Igualmente, Lovell y colaboradores (2002), mencionan trabajar con

cultivos de granulosa derivados de folículos preovulatorios por un máximo de cuatro días para

poder evaluar adecuadamente los efectos de la inhibina y la progesterona sobre dichos cultivos.

Una combinación de activina A y FSH ha sido sugerida para que el cultivo de granulosa

de gallina conserve la morfología epitelial de las células (Schimierer et. al., 2003). No obstante,

al menos en cultivos de granulosa provenientes de folículos prejerárquicos la FSH no sólo

estimula la proliferación celular sino que reduce el porcentaje de células apoptóticas y disminuye

la formación de oligonucleosomas (Johnson et. al., 1996; Lin et. al., 2011). En cultivos de

granulosa de folículos antrales de ratas también se ha evidenciado que el tratamiento con la

hormona FSH previene la apoptosis celular de manera dosis dependiente (Chun et. al., 1996).

Además, se sabe que las células de la granulosa de gallina cultivadas en medio libre de suero

experimentan apoptosis espontánea (Johnson et. al., 1996; Manchanda et. al., 2001). Por todo

122

esto, se decidió trabajar con subcultivos crecidos con medio de cultivo suplementado con 5% de

suero fetal bovino y sin adición de FSH, ni otros factores que pudieran modificar los resultados y

la posible generación de otras variables que incidieran en la tasa de apoptosis y que no fueran

debidos al tratamiento con el acetato de leuprolide.

Las células de granulosa de gallina de pasaje 1 que crecieron con medio de cultivo

DMEN + F12 suplementado con 5% de SFB, antibióticos, antimicóticos y glutamina, llegaron a

confluencia a las 96 horas de cultivo, y se caracterizaron por la presencia de vacuolas

citoplasmáticas con contenido lipídico. Welsch y Sobotta (2009) mencionan que la presencia de

vacuolas citoplasmáticas con lípidos libres, es una de las características de las células con

capacidad de biosíntesis de esteroides, tal y como los son las células de la granulosa de gallina

objeto de nuestro estudio.

En la evaluación morfológica de las CGG-P1 llama la atención la presencia de células

con micronúcleos y nucleofagia. Los micronúcleos se consideran figuras que reflejan

aberraciones cromosómicas o mitosis catastróficas y se originan por roturas en los cromosomas,

debido a errores durante la replicación y la posterior división celular del ADN (Zalacain et. al.,

2005). En nuestro modelo, la presencia de micronúcleos la consideramos como un indicador de

que las células estaban frente algún tipo de inestabilidad genética, pero que se equilibraba con el

fenómeno de nucleofagia, dado que este último mecanismo opera para que los núcleos dañados

sean reparados y las células puedan mantener la función normal y evitar la muerte celular por

apoptosis (Mijaljica et. al., 2010).

También se destacó en el estudio morfológico la presencia de células binucleadas y de

células fagocitando cuerpos apoptóticos (fagocitosis homóloga). Debido a la presencia de

cuerpos apoptóticos (CA) en el citoplasma de las CGG-P1, fue importante diferenciar éstas

estructuras de los micronúcleos (MN). Los MN son morfológicamente idénticos a los núcleos

pero son más pequeños (Fenech, 2000). Además, los MN tienen la misma intensidad de la

tinción que los núcleos principales (Fenech, 2000), mientras que los CA al poseer restos

nucleares son hipercromáticos.

El fenómeno de fagocitosis homóloga no ha sido descrito en las células de granulosa de

las gallinas domésticas, aunque se sabe que estas células son capaces de endocitar agentes

patógenos como Salmonella enteritidis (Thiagarajan et. al., 1996). En otras especies de

123

vertebrados, como el ratón y el cobayo, si se ha descrito, mediante estudios in situ, que las

células de la granulosa participan en la fagocitosis y eliminación de células vecinas que sufren

procesos de apoptosis dentro de los folículos atrésicos (Kasuya, 1997; Naka et. al., 2009). En

cambio, in vitro, solo en cultivos de células de la granulosa bovina, se ha propuesto que las

células de la granulosa actuarían como las encargadas de la limpieza de cuerpos apoptóticos en el

proceso inicial de atresia, previo a la aparición de células especializadas (Carou, 2012).

Las células granulosas de gallina que fagocitan CA se caracterizaron por mantener su

forma fibroblástica y su núcleo con cromatina laxa, pero poseían vesículas fagocíticas (con

cuerpos apoptóticos) distribuidas en el citoplasma o bien, formando una escotadura en la

membrana nuclear. Dada la observación de fagocitosis de cuerpos apoptóticos por parte de las

CGG-P1viables, y la ausencia de otros agentes que pudieran ser objeto del proceso fagocítico,

podemos suponer que en este sistema también operan fenómenos de fagocitosis homóloga.

2. SOBRE LA CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LAS CGG-P1. LA EXPRESIÓN

DEL RECEPTOR DE GnRH TIPO I.

En el Gallus gallus domesticus dos isoformas de GnRH (cGnRH-I y GnRH-II) han sido

aisladas y están presentes en el hipotálamo para estimular a nivel hipofisario la liberación de LH

y FSH (Hattori et al., 1986; Millar & King, 1983; Miyamoto et. al., 1984; Sharp et al. 1990). En

lo que se refiere a los receptores para GnRH, dos subtipos de receptores, GnRH-R-I y GnRH-R-

III, se han encontrado en los pollos (Dunn et. al., 1993; Joseph et. al., 2009).

La distribución y localización de los tipos de GnRH y sus receptores fuera del eje

hipotálamo hipófisis del Gallus gallus domesticus han sido poco estudiados, aunque en el gallo

se han identificado a la cGnRH I y al GnRH-R-I, en órganos como testículos, bazo, riñones y

corazón (Sun et. al., 2001a).

La presencia de GnRH y de sus receptores en el ovario de la gallina doméstica no ha sido

investigada. Dentro de la clase Aves, un solo trabajo reporta la localización por

inmuhistoquímica de la GnRH-I y el receptor de GnRH tipo I en las células de la granulosa y

teca de los folículos previtelogénicos y vitelógenicos del bengalí rojo (Amandava amandava)

(Padmasana et. al., 2007).

124

En este trabajo, se pudo demostrar por la inmunohistoquímica indirecta (IHQ) la

presencia del receptor de GnRH tipo I en las células de la granulosa, tanto en tejido ovárico

como en cultivos de células de pasaje 1 realizados a partir de folículos preovulatorios.

En concordancia con lo encontrado por Padmasana y colaboradores (2007) en el bengalí

rojo, la expresión del receptor de GnRH-R tipo I se detectó en la granulosa de todos los tipos

foliculares de la gallina doméstica. No obstante, haberse determinado en el bengalí rojo

inmunoreactividad semejante entre los folículos previtelogénicos y vitelogénicos; nuestros

resultados en la gallina doméstica indican que la marcación por IHQ del GnRH-R-I disminuye a

medida que los folículos se van diferenciando y van creciendo.

Como soporte de estos hallazgos podemos agregar que si la hormona GnRH es capaz de

inducir apoptosis en la granulosa de mamíferos, es lógico que también sea manifiesta la

expresión de los receptores para dicha hormona en esas células (Carou, 2012). Ahora bien, en las

gallinas domésticas se sabe que los folículos prejerárquicos son más susceptibles de sufrir

atresia, mientras que los folículos preovulatorios son más resistentes a este proceso (Decuypere

et. al., 1999; Gilbert et. al., 1983; Johnson, 2000a, b). Podemos suponer que de existir

vinculación de la GnRH con el proceso apoptótico de la granulosa, habrá menos expresión de

receptores para esta hormona en las células de folículos más resistentes.

En los subcultivos de células de granulosa hemos observado marcación para el receptor

de GnRH tipo I a nivel citoplasmático. El receptor para GnRH pertenece a los receptores

acoplados a proteína-G (GPCR), por tanto es un receptor de membrana. No obstante, su

presencia en el citoplasma se justifica, dado que el receptor también se internaliza hacia el

citoplasma previa su degradación endosomal (Edwards & Brody, 1995; Terán et. al., 2008),

hecho que definimos como translocación intracitoplásmica.

La inmunomarcación contra el GnRH-R-I en las CGG-P1 fue débil en la mayoría de las

células y ausente en otras. Este hecho correlacionó perfectamente, con un hallazgo particular en

los folículos preovulatorios que poseían un patrón de marcación zonal o irregular. Este patrón

irregular de marcación, no ha sido reportado en otros vertebrados como bovinos, reptiles y

anfibios (Carou, 2012; Padmasana et. al., 2007)

125

3. SOBRE LA MODULACIÓN DE LA APOPTOSIS POR EFECTO DE ANÁLOGOS

AGONISTAS DE GnRH.

En el trabajo realizado se evaluó el sistema GnRH/GnRH-R tipo I con el uso de un

análogo agonista de GnRH de mamíferos, modelo que se adopta en función de la información

científica que indica que la GnRH-I puede actuar fisiológicamente en las gallinas, pues estimula

significativamente la secreción de la hormona LH cuando se administra a gallinas de 22 semanas

de edad (Krishnan et. al., 1993). En aves, de 70 semanas de edad inyecciones con el agonista de

GnRH, acetato de Deslorelina, disminuyen la producción de huevos y las concentraciones de

LH y estradiol en plasma (Tilbrook et. al., 1992). Además, como ya se mencionó, se confirmó

previamente la presencia del receptor para GnRH tipo I en las células objeto de estudio tanto in

situ como en in vitro.

Los resultados de este trabajo, demuestran por diferentes metodologías que para el

modelo propuesto (CGG-P1), el acetato de leuprolide en la dosis ensayada (100 nM) no logró

modular la apoptosis en dichas células. Este resultado sugiere que en los folículos preovulatorios

de las gallinas, la hormona GnRH no regularía los procesos apoptóticos por acción directa sobre

el receptor de GnRH tipo I.

El análisis morfológico de apoptosis empleando la tinción de hematoxilina mostró que no

existían diferencias significativas entre los cultivos controles y los tratados con LA 100 nM por

24 y 48 horas. Además este estudio reveló índices muy bajos de cuerpos apoptóticos para las

CGG-P1 tanto a las 24 horas (3,733%) como a las 48 horas (4,060%) de inducción con el acetato

de leuprolide. Los niveles bajos de apoptosis detectados en estas células provenientes de

folículos preovulatorios, se correlacionan con lo encontrado por Johnson y colaboradores (1996),

quienes, luego de cultivar células de la granulosa aviar en un medio definido con suero por un

lapso comprendido entre 6 y 24 horas, determinaron que las células de la granulosa provenientes

de folículos preovulatorios eran más resistentes a la apoptosis que aquellas obtenidas a partir de

folículos prejerárquicos. Los investigadores llegaron entonces a la conclusión, mediante estos

cultivos primarios crecidos en condiciones basales, que la susceptibilidad a la apoptosis es

dependiente de la etapa de desarrollo del folículo.

126

Gilbert y colaboradores (1983) también destacan la mayor incidencia de atresia entre los

folículos prejerárquicos, mientras que los folículos jerárquicos normalmente no son susceptibles

a la atresia. A pesar, de que las células de la granulosa provenientes de folículos preovulatorios

son más resistentes a la apoptosis, la decisión de utilizar como modelo CGG proveniente de

folículos preovulatorios se basó en el hecho de tener mejores resultados en el aislamiento y

cultivo de las CCG, con una mayor eficiencia (> 90% de viabilidad). Mientras que las células

derivadas de los prejerárquicos ofrecen mayores dificultades metodológicas a la hora de su

aislamiento y cultivo, así como también una menor viabilidad (Johnson et. al., 1996). Además, es

importante considerar que la maquinaria de muerte celular está funcionalmente intacta en las

células de granulosa de folículos preovulatorios y por lo tanto pueden sufrir apoptosis frente a la

acción de un inductor adecuado (Johnson, 2000b).

Los experimentos preliminares en CGG-P1 permitieron confirmar que el agonista de

GnRH, el LA, en condiciones de una concentración de 100 nM y una inducción de 24 horas no

modula cambios en la apoptosis respecto de su control experimental. Además, en el modelo

bovino, estudiado en nuestro laboratorio (Cátedra de Histología y Embriología, Facultad de

Ciencias Veterinarias) el agonista LA induce apoptosis en una dosis de 100 nM y con un tiempo

de inducción de 48 horas (Carou, 2012). Los resultados que se mencionan soportaron la decisión

de adoptar como modelo, CGG-P1 inducidas con LA a una concentración de 100 nM durante 48

horas de incubación/inducción.

Un signo distintivo del proceso apoptótico es la fragmentación ordenada del ADN celular

(Casadelvalle, 2006). La aparición de fragmentos de 180 a 200 pares de bases o múltiplos de los

mismos (oligonucleosomas) se relaciona con las fases tardías de apoptosis. Estos fragmentos de

ADN pueden ser detectados a través de técnicas de fácil interpretación (Gómez & Zentella,

2000; Ramírez et. al., 1999). Se ha encontrado un aumento en la formación de oligonucleosomas

en cultivos de granulosa de folículos preovulatorios tratados con radiación UV o con el

quimioterapéutico daunorrubicina, lo cual demuestra que se puede inducir apoptosis en las

células que se consideran más resistentes a dicho proceso (Witty et. al., 1996). Por lo tanto, se

utilizó la técnica TUNEL para complementar la evaluación de apoptosis tardía realizada a través

de la tinción con hematoxilina en células inducidas con LA 100 nM por 48 horas.

127

La técnica de TUNEL permite detectar la degradación del ADN en células apoptóticas

individuales (Moreno et. al., 2000). La fragmentación del ADN se visualiza a nivel nuclear

gracias a la adición por parte de una transferasa terminal, de nucleótidos marcados a los

extremos 3´OH libres. En los experimentos realizados con células de la granulosa provenientes

de folículos preovulatorios, no se observaron células con núcleos positivos a TUNEL (ni en las

células de los grupos control ni tampoco en las células bajo la inducción con LA 100 nM por 48

horas). Sin embargo, se encontró CA positivos a TUNEL y dado que, éstos son estructuras

resultantes del proceso de apoptosis que sufren las células, pueden contener fragmentos

oligonucleosomales resultantes de la ruptura del ADN celular. En consecuencia, fue factible

considerar el conteo de CA positivos a la técnica TUNEL como indicativo de apoptosis tardía.

No se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de cuerpos apoptóticos

positivos a la técnica TUNEL entre los cultivos controles y los tratados con LA 100 nM por 48

horas. A los fines de comprobar la sensibilidad de las CGG a los inductores de apoptosis, se

ensayó un control positivo, exponiendo las células a peróxido de hidrógeno 5mM por 15

minutos. El resultado de este ensayo control fue una mayor proporción de cuerpos apoptóticos

(8,830%), confirmando que in vitro el modelo estudiado es sensible a la apoptosis bajo el efecto

de inductores fuertes como el peróxido de hidrógeno. Sin embargo, el análogo agonista de GnRH

estudiado (LA) en este modelo generó una respuesta de bajo nivel y no significativa respecto al

control, pudiendo ser explicado por la mayor resistencia de las CGG proveniente de folículos

preovulatorios, los que se describen como más resistentes a los mecanismos de atresia y por

consecuencia a inductores débiles y fisiológicos como los agonistas de GnRH.

En las CGG de los folículos que sufren atresia, los niveles de expresión de las proteínas y

los genes relacionados con la muerte celular, determinan la susceptibilidad o resistencia a

procesos apoptóticos (Johnson, 2000a; Mussche, 2004). En este trabajo se analizó la expresión

de las proteínas de la familia Bcl-2, ya que son consideradas entre las principales proteínas

reguladoras y al actuar en la fase efectora de la apoptosis, nos permite analizar una ventana de

tiempo anterior a la analizada por TUNEL, de manera tal de poder evaluar y/o descartar la

inducción que podría tener el LA en las CGG-P1 (Johnson, 2000b; Kuwana & Newmeyer, 2003;

Motyl, 1999).

128

El estudio de las proteínas Bax y Bcl-2 mediante la técnica de inmunocitoquímica

permite revelar la expresión o no de las mismas en las células bajo el efecto de un factor

inductor. Sin embargo, esta técnica tiene la desventaja de ser una herramienta de análisis e

interpretación subjetiva y cualitativa dado que las células pueden presentar diferentes patrones de

marcación, perdiendo valor cuantitativo susceptible de analizar estadísticamente (Riera, 1999).

Por ello, y con el fin de estandarizar estos factores de variación se hizo necesario aplicar, en

dicho análisis, una herramienta que detecte la marcación permita que la expresión de las marcas

se vuelva uniforme según criterios algorítmicos, tal como lo hace un programa de análisis digital

de imágenes. De esta manera, se eliminó esa cuota de subjetividad y se generó además valores

numéricos correspondientes a parámetros tales como porcentaje de área y densidad óptica

integrada (DOI). Parámetros que facilitaron una evaluación estadística más adecuada.

El análisis del porcentaje de área y la DOI para la proteína Bax no mostró diferencias

significativas entre los cultivos control y los tratados con LA 100 nM por 48 horas. La falta de

sobre expresión de la proteína Bax, nos muestra que no existe un efecto de inducción apoptótico

por parte del acetato de leuprolide sobre las CGG-P1. La inmunoreactividad para la proteína Bax

fue usada por otros investigadores sobre cultivos de granulosa de folículos preovulatorios para

verificar el efecto apoptótico producido por la hormona grelina o activadores sintéticos de la

misma. Estos autores encontraron una mayor proporción de células positivas a la proteína Bax en

los cultivos tratados con grelina versus los controles (Sirotki & Grossmann, 2008).

Del mismo modo, para la proteína Bcl-2 no se encontraron diferencias significativas en el

porcentaje de área y la DOI entre los tratamientos evaluados y el control. Se ha probado que el

porcentaje de células marcas contra Bcl-2 es menor en cultivos de granulosa de gallina donde se

induce apoptosis con la hormona grelina y que, en las células de la granulosa de ganso la

cantidad de proteína Bcl-2 se correlacionaba negativamente con la apoptosis de dichas células

(Sirotki & Grossmann, 2008; Wang et. al., 2012). En nuestro caso, la falta de diferencia que

existió entre los tratamientos estudiados, permite inferir que el LA en la concentración y tiempo

usados no tiene efecto apoptótico. Así como en estas condiciones de inducción de apoptosis con

un análogo agonista de GnRH, la Bcl-2 parece mantenerse estable, también se observa una

ausencia coherente de sobre expresión de la proteína Bax.

129

La ausencia de efecto apoptótico del LA 100 nM sobre las CGG-P1, podría explicarse

sobre la hipótesis de que todos los métodos de análisis de apoptosis mencionados hasta ahora

apuntan a una fase tardía en el proceso de muerte celular programada, pudiendo ser las 48 horas

post inducción insuficientes para detectar cambios morfológicos tardíos o degradación ordenada

del ADN en fragmentos uniformes. Hecho posible por ser los folículos preovulatorios resistentes

a la apoptosis o por resultar el LA ser un análogo agonista de GnRH con capacidad inductora

leve para el proceso de la apoptosis. De acuerdo con esto, a pesar de no existir diferencias

significativas entre los grupos experimentales, se hizo necesario verificar la ausencia del efecto

del acetato de leuprolide en otras ventanas del proceso apoptótico (apoptosis temprana).

Con la finalidad de corroborar y reforzar los resultados encontrados, se evaluó de forma

complementaria la expresión de Caspasa-3 activa o su forma clivada mediante

inmunocitoquímica, siendo esta una expresión bioquímica medianamente temprana del proceso

apoptótico. Las caspasas son proteasas requeridas para inducir la apoptosis y la caspasa-3 es la

responsable de la mayoría de los efectos apoptóticos (Díaz, 2010). En cultivos celulares de

granulosa provenientes de folículos prejerárquicos, la apoptosis espontánea se acompaña de un

aumento rápido de los niveles de caspasas activas-3 y 6 (Johnson & Bridgham, 2000).

Igualmente, la inducción farmacológica de la apoptosis con ácido okadaico en cultivos celulares

de granulosa obtenidos de folículos preovulatorios, produce la activación de las caspasas 3 y 6

entre las 8 a 16 horas después de iniciado el tratamiento con el inductor (Johnson & Bridgham,

2000). En nuestros experimentos, la inmunomarción contra caspasa-3 activa, mostró que no hubo

un efecto de inducción de apoptosis por parte del LA a una concentración 100 nM por 48 horas,

dado que no existieron diferencias tanto para porcentaje de área como para la DOI entre los

cultivos tratados y las células cultivadas tan sólo con 5% de suero fetal bovino. Es decir que los

niveles detectados responden a los de una apoptosis basal.

Para dar un mejor sustento a la evaluación de la apoptosis temprana y a los fines de

estudiar de forma dinámica el proceso de la apoptosis completo o en forma global y bajo las

condiciones experimentales de inducción planteadas en el diseño experimental, se realizó el

análisis por citometría de flujo de la expresión de la fostatidilserina en la membrana

citoplasmática de las CGG-P1. Con esta técnica y gracias a su elevada sensibilidad, se ratificó

que no hay efecto de LA 100 nM en las CGG-P1 a las 48 horas de inducción, pues no se

130

encontraron diferencias significativas con relación al control tanto para la apoptosis temprana,

para la apoptosis tardía y para la total. Los bajos porcentajes para apoptosis tardía en cultivos de

CGG-P1 evaluados por tinción con Anexina V y Ioduro de Propidio podrían explicarse debido a

un fenómeno descripto por nuestro laboratorio en otros modelos in vitro de células de mamífero,

correspondiente a lo que describimos como fagocitosis homóloga. Estas figuras de fagocitosis de

CA por células vecinas fueron encontradas de forma notoria y frecuente a nivel morfológico, y

confirmadas por TUNEL e ICQ para productos de Bax y Caspasa-3 activa en el presente modelo

de CGG-P1.

Aunque en esta tesis se muestra que el acetato de leuprolide en la concentración estudiada

y para los tiempos de inducción ejecutados no tiene efecto modulador sobre la apoptosis en

células de granulosa de pasaje 1 provenientes originalmente de folículos preovulatorios, la

especie objeto de estudio presenta ciertas particularidades que no descartan que la GnRH

participe en el proceso de apoptosis.

En primera instancia, se evaluó a la GnRH-I a través de su análogo agonista, el acetato de

leuprolide, teniendo en cuenta la afinidad que tiene el receptor tipo I del pollo por ella (Sun et.

al., 2001b). Sin embargo, las isoformas cGnRH-I y GnRH-II, propias de las aves, podrían estar

implicadas en la regulación de los procesos apoptóticos de las células de granulosa de gallina.

Por un lado, la inmunización activa contra cGnRH-I, pero no contra cGnRH-II, origina la

regresión total del sistema reproductivo de gallinas ponedoras, consecuentemente se cree que

sólo la cGnRH-I es capaz de regular la liberación de gonadotrofinas a nivel hipofisario (Sharp et.

al., 1990). Por consiguiente, no sería raro estimar que sea la cGnRH-I la que actúe a nivel

ovárico. Por otra parte, la otra isoforma de GnRH, la GnRH-II, es capaz de unirse con mayor

afinidad a los dos tipos de receptores que posee la gallina doméstica (Sun et. al., 2001b). No se

descarta, por lo tanto que la GnRH-II pueda estar implicada en el proceso de apoptosis en la

granulosa de los folículos de la gallina doméstica; más aun sabiendo que en los mamíferos, la

GnRH-II es la forma más abundante en los tejidos periféricos no hipofisarios (Flanagan et. al.,

1997; Ramakrishnappa et. al. 2005).

En segundo lugar, existe evidencia que sugiere que cGnRH-R-III es probablemente el

principal mediador de la función GnRH a nivel de la pituitaria (Joseph et. al., 2009) Este

postulado nos hace suponer que podría ocurrir de igual forma a nivel ovárico y en consecuencia,

131

es probable que el receptor tipo I de GnRH no participe en los procesos de apoptosis en la

granulosa de los folículos preovulatorios. Así también, cGnRH-R-I tiene alta afinidad de unión

con la GnRH de mamíferos, así como con sus agonistas (Sun et. al., 2001b). Por consiguiente, el

acetato de leuprolide podría haber mediado la modulación apoptótica a través de este receptor.

No obstante, debe recordarse que el incremento de la afinidad por los receptores de GnRH

evidenciada por la modificación realizada en el aminoácido 6 de los agonistas de GnRH-I, no se

produce en la gallina doméstica, pues la unión de dichos agonistas con los receptores de GnRH-I

no se ve mejorada en comparación con la GnRH-I nativa (Sun et. al., 2001b).

Finalmente, a pesar que el modelo planteado con GnRH-I, no induce apoptosis en las

células de granulosa de pasaje 1, se conoce que cGnRH-I y GnRH-II aumentan la producción de

fibronectina en cultivos de células de la granulosa de folículos preovulatorios y folículos

amarillos pequeños (Asem & Novero, 1993), evento relacionado con el inicio de la atresia

folicular. Además, está comprobado que, en cultivos de células de la granulosa de gallinas

domésticas provenientes de folículos maduros (F1 y F2), la preincubación con la hormona GnRH

de mamíferos incrementa significativamente la posterior producción de la progesterona en

respuesta a la inducción con LH (Hertelendy et. al., 1982). Igualmente, mGnRH atenúa de

manera consistente la esteroidogénesis estimulada por FSH en cultivos de células de granulosa

provenientes de folículos F4 y F5. (Hertelendy et al., 1982). En consecuencia, no puede

descartarse que la GnRH tenga algún efecto directo sobre la fisiología ovárica. Aunque en

nuestro modelo, hemos demostrado que la GnRH tipo I (representada por el análogo agonista, el

acetato de leuprolide) no posee efecto pro-apoptótico sobre folículos jerárquicos, el desafío

futuro será estudiar su influencia sobre los folículos prejerárquicos.

132

CONCLUSIONES

1. SOBRE EL CULTIVO Y LA CARACTERIZACIÓN DE LAS DE CGG-P1

a) El método empleado para la obtención de los cultivos primarios de células de granulosa

de gallina (CGG), si bien permite conseguir cultivos sin contaminación de otros tipos

celulares, es un proceso minucioso donde los lavados con PBS del material de cultivo, así

como la concentración de la solución de digestión enzimática son factores determinantes

que hubo que poner a punto a los fines de lograr el éxito de la técnica.

b) Las células de pasaje 1 de granulosa de gallina (CGG-P1) requieren para alcanzar una

monocapa, un tratamiento previo con Poli-L-Lisina aplicado sobre las superficies de

vidrio o del sustrato donde crecen. Es necesario que la superficie del sustrato esté

revestida con una carga negativa, como la que provee la poli-L-lisina, de manera que se

establezca una unión que permita la dispersión homogénea de las células y se evite su

levantamiento con los lavados.

c) Las CGG-P1 pueden crecer en el medio de cultivo DMEM + F12 suplementado con 5%

de SFB, en un ambiente de 38,5ºC con 5% de CO2, condiciones en las que, a pesar de

pasar de un fenotipo epitelioide a adquirir una apariencia fibroblástica, forman una curva

de crecimiento clásica con un crecimiento exponencial hasta confluencia (PPD -

population doubling time) a las 96 horas de cultivo, alcanzando la fase de “plateau” a las

72 horas y el inicio del decaimiento poblacional a partir de las 144 horas.

d) Las CGG-P1 presentaron aspecto vacuolar debido a la presencia lípidos libres (positivos a

la tinción con aceite Rojo O) dada su capacidad de biosíntesis de esteroides.

133

2. SOBRE EL RECEPTOR DE GnRH TIPO I

a) El receptor de GnRH tipo I se expresa en las células de la granulosa de los folículos

preovulatorios o jerárquicos tanto en tejido ovárico como en cultivo celular, aunque el

patrón de marcación visualizado mediante IHQ es zonal en ambos casos.

b) La expresión del receptor tipo I para GnRH también se detectó en los folículos primarios

y prejerárquicos, pero dicha expresión disminuye a medida que el folículo crece.

c) De acuerdo con lo expresado en el punto a, se supone que el análogo agonista utilizado en

el trabajo actuó sobre su receptor cuya presencia fue corroborada.

3. SOBRE LA MODULACIÓN DE LA APOPTOSIS POR PARTE DE UN ANÁLOGO

AGONISTA DE GnRH, EL ACETATO DE LEUPROLIDE (LA).

a) El análogo agonista de GnRH, acetato de leuprolide en la concentración 100 nM, en el

modelo estudiado y bajo las condiciones experimentales establecidas (48 horas de

inducción), no demostró modular de forma significativa el proceso de apoptosis en las

CGG-P1 provenientes de folículos pre-ovulatorios.

No se observaron diferencias significativas en las proporciones de cuerpos apoptóticos

(estudiado por tinción con hematoxilina y a través de la técnica TUNEL); ni variación en

la inmunomarcación para las proteínas Bax, Bcl-2 y caspasa-3 activa; así como tampoco

en la expresión de la fosfatidilserina (determinada por la marcación con AV/IP y

analizado por FACS).

b) Los niveles de apoptosis encontrados fueron bajos y es congruente con lo reportado en

otros estudios dado la condición de mayor resistencia a la apoptosis por parte de las

134

células provenientes de folículos preovulatorios. Particularmente los porcentajes de

apoptosis tardía hallados en el estudio FACS para marcación AV/IP podrían estar

relacionados con el fenómeno de fagocitosis homóloga ya descripto en nuestro

laboratorio.

c) Teniendo en cuenta que en este modelo experimental hubo un incremento en la

fragmentación oligonucleosomal de ADN (TUNEL) frente a la inducción con peróxido

de hidrógeno, se confirma que, aunque en niveles bajos, el sistema es sensible a la

inducción de apoptosis.

d) Considerando las particularidades del modelo en estudio no se descarta la modulación del

proceso de apoptosis por parte de otras isoformas de GnRH y/o por la unión a otro tipo de

receptor de GnRH, o bien sobre células de granulosa provenientes de otros tipos de

folículos tales como los folículos prejerárquicos, objeto de futuras investigaciones.

135

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