t

"EFECTO DE L A TEMPETARURA Y PH \

EN BACTERIAS LACTICAS

RESPONSABLES DE L A d

FERMENTACION MALOLACTICA

' 1

k

- La Fermentacih MalolActica tiene Oran e f e c t o e n los vinos

y en las caracteristicas orqanol&oticas de 105 mismos. dicho

efeFto es esencialmente la disminucirfin d e la acidez. Can este

f i n se r e a l i z 3 Xa fernentacih malolActica en un vino tinto

variedad Cabernet Sauvionon, marca L . A . Cetto. a

Las especies de b a c t e r i a s a c i d o - l k t i c a s r e s ~ o n s a b l e s de

la fermentacih. se c l a s i f i c a n en los pheros Lactobacil1.us.

Leuconostoc y Fedincoccus (16,25 1 . Leuconostog oenos.

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus hilparda, Pediococcus

pentosacens, 5on las especies encontradas con mks. frecuencia

en e l d e s a r r o l l o d e la fermentacicm. Para canfirmar s u e f e c t o

en e l vino, se realizaran d o s exoerimentos; en e l orimera s e

inoculb L.agtobaci1lus SDD. y en e l segundo, F e d i c ~ u e c u ~ , ?e. y-Stre.atorncr_rs 2 . p ~ - . /

Dentro d e los factores Que afectan la Fermentakidn ,/'

Malolkctica, se encuentran l a TemDeratura y e l pH. por l o q u e / 5e e l i g i d una temperatura de aprox. 20 C y pH d e 3 . 4 c9m_o,

constantes d e trabajo.

O

Durante e l transcurso d e los exoerimentos se llevaron a

cabo anAlisis fisicoqulmicos a f i n .de tener un control sobre

l a misma: evitando una d e s a c i d i f i c a c i h e x c e s i v a , as1 como

2

\

L)E JET I VOS

OBJETIVO GENERAL:

Verificar si un cultivo puro de Lsc&gbacillus. &%. Y

la mezcla de Streotococcus spp,. Y ~gd._iococcus SDD.~ pueden

desarrollar la desacidificacih del vino tinto, variedad

Cabernet Sauvignon-

OBJETIVOS ESFECIFIGOS:

- Investigar y seleccionar las tknicas a emplear en el

control de la Fermentacih Maloldctica.

- Efectuar an81isis fisicosuimicos al inicio de la

fermentacifm. y hacer las correcciones necesarias.

- Establecer las constantes d e trabajo, temDeratura y OH. aue

se utilizaran a lo largo de la ferrnentaciLmi-

- Inducir la fermentacih mediante la inoculacih de las

cepas licticas; Lactobacillus 5a.en el primer experimento,

y la mezcla de Streptococcus m. y pediococcus -.en el

segundo.

- Cuantificar el producto y sustrato durante la fermentacih.

- Realizar anAlisis en el vino tinto, una vez concluida FermentaciCn Malolktica.

- Elegir la cepa que mostrc5 una mayor eficiencia en

fermentaciún Malolktica, analizando la5 condiciones en

cuales se trabajo (temperatura y pH).

Para el segundo caso, cada uno de los frascos se inoculc5

p o r separado con dos cultivos, St.reptococcus s p p y

Pediococcus s_p_p,, en todos los casos se mantuvb la proporcih del 5% de intculo con resoecto al volumen

total, teniendo la orecaucirk de dedar un espacio de 1

cm. del vino a la taDa del frasco.

El cultivo de los micraorganismos debera estar en su

fase logaritmica de crecimiento. Por lo cual fue

necesario llevar a cabo frotis y tincih de G r a m del

cultivo antes de inocular, para verificar una

concentracih elevada de microorganismos,

Nota: La .preparaci& del in3culo se .describe

posteriormente.

3.- El vino inoculado se mantuvo a una temperatura de aprox .

. " - 2 0 ~ - C d - r a ~ t s tcrda la frrm=r:t;scih.--Gn el transcurso del

primer experimento se realizaron anA1isis por- 30 bias; cada 5 de &tos.

En el segundo experimento, las muestras 1 y 2 se tomaron

de un mismo frasco Y las restantes de uno

diferente, sufriendo una previa congelacirk de 24 a

72 hrs. analizhdolas cada 5 dias durante -35.

El volumen de muestrla alae se tom6 en cada caso fue de

15 ml. y los anglisis realizados son los siguientes:

a

Acidez Total (1,3,24).

Acido Lktico ( 4 ) .

Acidez VolBtil (3,27) . los resultados -de los dos experimentos.. se~_~mues_tran_.en~_-__~_ ..

las Tab, 1 y 2 y en las Fig. 1, 2, 3 -y 4. .

*El fin de la fermentacibnse determind cuando la acidez total se mantuvo constante y la acidez volitil fue mayor

a 0 . 7 g/l expresado en k i d 0 ac&tico.

- -

L

5

METODOLOGIA

1 . - Para el desarrollo de la Fermentacibr utilizh un vino tinto variedad Cabernet

L.A. Cetto, al cual se le realizaron

an91 isis:

MalolActica, se

Sauvionon, marca

los siguientes

Acidez total (1.3.24)

Acido lfictico (4 )

Acidez volAtil ( 3 , 2 7 )

Etanol (7 -10 )

Ciiucares reductores- directos ( 2 3 ) Sulfuroso libre (14)

Sctlfuroso total (14)

pH

. . "" _ . Los resuItados se mues;tran en la Tab. No. 2 y 3. Para la

fermentacib con Lactobacillus 5" (let-. Experimento)

se utilizaron 1800 ml. de vino tinto, contenidos en un

"

frasco de 2 l.. sin efectuar ninguna correccic5n-

Para el caso del vino a utilizar en la fermentaci&n con

Streptococcu~ s~g-. y Eediococcus seer. (20- Experimento) fue necesaria la correccirlrr de la acidez total mediante

la adicitn de Bcido mAlico (marca J.T. Baker, mezcla

rachica Acido mAlico D-L) hasta ajustar la acidez a 5.9

g/l como Ac. mAlico. La concentracibl de SO2 libre se

mantuvo constante en 20 ppm. Se colocaron 170,ml de vino en frascos de dilucicjn de aoroximadamente 180 ml,

4

.

4.- Los EtnAlisis r-kalizados a l i n i c i o y f i n a l d e la

fermentaciún fueran los mismos, tomando un volumen de

muestra de 120 ml. L o s resultados se muestran en l a

Tab. 2 y 3 -

t 5. - Considerando la concentracirh de 5UlfUr!J50 r e s i d u a l , e l

v ino se estabil izG aqregando metabisulfita de Dotasio

para l l e g a r a una c o n c e n t r a c i h d e 33 ppm. como

sulfur-oso Libre. El vino ya embotellado se de.ic5 en

reposo durante 1 mes.

6.- E l vino que 5e sometic5 a l a fermentaciGn Malol&tica,

inoculado con Streotococcus ssp_. y P_edioct>ccus s p p . f u e

analizado sensor-ialmente, haciendo una cmmoaracih

c u a l i t a t i v a con un vino de la misma variedad y marca,

s i n fermentar. . " . - . - . . -

. " " ~ . ..

METODOS

PREPARACION DE SOLUCIONES: r j ' .,

Hidrdxido 'de'sodio 0,1 N& (26) . Para 1 1 . de solucih,. se necesitan 4 9. de NaOH; debido a

las.impurezas que contiene, se pesan sobre un vidrio de

reloj, 5 g . del hidrhxido. Se disuelven en 200-300 ml. d e

agua destilada contenida en un vaso d e 500 ml. , se calienta Y

se agrega una solucich caliente, de 2-3 g. de cloruro de

bario en 25-30 ml, de agua, Se deja enfriar Y cuando

precipita el carbonato de bario, se filtra decantando. El filtrado, que contiene el hidrdxido libre de carbonato, se

diluye con agua hervida y fria, hasta lleqar a 1 1 , aprox.,

el-agua'debe ser hervida previamente pa& desalojar el qas

carbbico que tiene disuelto. La solucib se titula con HCl

0.1 N.

. q .

- - "" .

PROCEDIMIENTO:

En un matraz Erlenmeyer de 250 ml., colocar 20 ml. d e agua

destilada; af'íadir 1 0 m l . de muestra; agregar unas cuantas

g o t a s de azul de bromotimol como indicador y valorar con

disolucib de hidrdxido de sodio 0.1 N.

7

.

8

. ..

~ ~. ~

ACID0 LACTIC0 - "

- 'G

METODO COLORIMETRICD . .

" . . . .

PREPAREICION DE SO Sulfato d e cobre 20%.

'Disolver 20 9. de CuSO en 100 ml. de agua desionizada.

Sulfato d e cobre Dentahidratado 4%.

Disolver 4 g de CuSO en 100 m1 de agua desionizada.

Solucib- alcalina d e p-Hidroxifenil.

Disolver 0.59 de NaOH en 40 m1 de agua desionizada, . contenida

en un matraz, calentar la solucick a temperatura menor a 600

i c C y adicionar 1.5 g de p-Hidroxifenil, agitando hasta que se

1 B 4 2 ._.

'I SS.* ' .

,4 .n,%'r-,.

, 1 ;',>

1 . . . disuelva completamente. Llevarlo a un matraz de 100 m1 y

aforar con agua desionizada. . .

PROCEDIMIENTO: F ____ -. ~ .. - . .

Prepat-acih de la curva esthdard.

Para preparar la solucih de lactato con una concentracih de

100 pg/2ml, disolver 0 . 5 g. de lactato d e litio en 100 ml. de

agua desionizada, de esta solucih tomar 1 ml. y aforar a 100

ml. con agua desionizada. - EI partir de la solucibn anterior, hacer las siguientes

diluciones: 25, 50 y 75 ~49/2rnl.

Colocar 2 ml. de soluci'bn de lactato o muestra en tubos de

ensaye m& 1 ml. d e CuS04.5H O .al 20% y hacer un volumen de

1 0 ml. con 7 ml. de agua desionizada. EIdicionar 1 q. de

Ca(OH)2/pulverizado y agitar con vktex; dejar la soluciCn a

temperatura ambiente por 30 min., agitando ocasionalmente.

2

Despuk d e transcurrido este tiemp0,'agitar y centrifuqar a 3000 rpm.

1 " "

t 4

Tomar una allcuota de 1 ml.. de la parte media de la soluci& b

. . . I ,J.< :

. _, 1.

k , . ctato o muestra, y colocarla en tubos de ensaye, hacer

&to por duplicado. CIKadir t 0.05 m 1 de CuS04.5H20 al 4% y . 6 ,.. .

- m_l. de H SO' concentrado (reactivo analiticol-.. Someter los

bois a un bafFo de agua hirviendo por 5 min., escurrir y

riarlos con agua fría a temperatura inferior a 200 .C.

egar 0.1 ml. de p-Hidroxifenil (tener la precaucih de no

' ,'escurrir .. *i las paredes) y dispersar con el v e t e x . Colocar 10s

"" ~____ 2- 4. "" __ "" ". . ~ -~ . ~~~ .~ ~~ . ~. -

. I ) .",

'i .

.". .J. .~ - Y :'.,tubos I", . L en un baPk, de agua a 300 C/30 min, con aqitacich cada

1 5 min., posteriormente, transferirlos a un b a k de agua

hirviendo por 2 min.; enfriar en un baPb de aqua con hielo. Dejar reposar durante 1 0 min. y leer en esbectrofothetro-a

560 nm. con fototubo normal.

10

"4"".

.. ~ .. - ACIDEZ VOLATIL

<3,27)

I - . . "

" ." PREPARACION "" .DE-SOLUCI-ONES_=_ ~~ " ." " . . ~ ~ - - - - ~

Hidrdxido,_de sodio O. 01 N_. -. <

ucidn de NaOH 0.1 N, ya valorada tomar 1 0 ml. y

aforatya-1 1. con agua destilada. Valorarla con HCI 0.01 N.

Hidrdxido d e sodio. 0.001 N_. ~ ?&.

. , ?

' De la .solucidn anterior, tomar 100 ml. y aforar a 1 1, - con

agua destilada. . . -.

PROCEDIMIENTO:

Colocar 1 ml. de muestra en el microdestilador, recibir el

destilado en 10 ml. de agua destilada. Vaciar el destilado en

un matraz Erlenmeyer de 250 ml.; af'kdir 3 gotas de

fenoftaleína, como indicador y valorar con disolucibr de NaOH

0.001 N. c

i

~ - "" "" - -. . - - .

CALCULOS:

La acidez volAtil se expresa como &ido ac&tico:

Acido acbtico <g/l) = (VI (N) (0.06) (1000) / (v )

Donde: - V = Volumen d e NaOH gastado (m11

N = Normalidad de NaOH utilizada

v = Volumen de la muestra (ml).

1 1

OXIDACION CON-DfCROMATO . *i

( 7 , l

.. .. . .. " .. PREPARACION DE SOLUC-IONES:

Solucih- de dicromato.

Pesar 33-7 g . de K2Cr207 y d ver en 200 m l . de agua

destilada, transferirlos a un matraz aforado de 1000 ml. y

af"íadir1e 325 ml. de H2S04 al 98% (reactivo analítico), tener la precaucih de mantener en un baPSo de agua fria el matraz

durante la adicidn del *ido, aforar a 1000 m1 y colocarlo en

un frasco dmbar.

". -~______ ~ - " __ ~ "" . . .~ ~ ~~- ..

i.

. . , . .

PROCEDIMIENTO: . ._ . t - .. .: . .

Preparacih de la curva estAndard- .Se',preparan las soluciones patrbr a partir de alcohol etílico

absoluto, mediante la dilucibi con aqua destilada .paya

I _

obtener"Üria-mez-cId de "alcohol-agua al 10X. CS partir de esta

solucih hacer las siguientes diluciones: 0. 8 , 1.0, 1.2 y

l. 4% en volumen.

Colocar 1 ml, de muestra en el microdestilador, y recibir

aproximadamente 1 0 ml. del destilado en 25 ml. de dicromato -

e n un frasco Gerber, Someter los frasco a un baf'ii de agua a

60o.,C. por 5 min., e inmediatamente despuk enfriarlos en un

bafb de agua fria. Leer ..en espectrofotbmetro a 600 mm.

cALcuLos: Interpolar la absorbancia que se obtuvo con la muestra, a

partir de lá curva esthdard, para obtener la concentracih

de kta.

Nota: Este m&todo sufrid modificaciones con respecto a la

referencia citada, para adaptarlo a nuestras

necesidades.

. Í

12

/

MUCARES REDUCTORES' DIRECT& SS

' I '. i

D i l u i r 1. 8. de ,&ido 3,s d in i t ros .a l i c l l i co , . ., 1 9. de WaOH,

0-05 9 ,de -1 f i to .de sodio .~ 'anhidro yEAh+02 9. de fenol . CIforar

,a 100 aL, .c&,agua d&t i lada. . .

PRM=EDIMIENTO: . ., y- *. n - .. l a Surva esjithdard:

1 , 9- de , glucosa anhidra en 1000 m l . de agua

. " * I - .'' ' i I * . . S - .

- RJB,Qk . mg/l -Sol, e s t h d a r d <m11 Agua desti lada (ml.1

- 1 i., ~. O -I 0-0 . . 1.0 c

2 " 7 0 0. 8

3 40 0 -4 0. 6

4 6Q 0-6 0. 4

5 80 O. 8 0. 2

.. - o ~ 2 . ___" - - .. . ..

6 ~ - 1 , " ' L 100 1.0 0.0 - ~ 1

Colocar 1 ml, . de muestra en un tubo de .ensaye; adicionar 1

mE. de DNS. Agitar en v e t e x y calentar a ebul i ic i 'b l por 5

min,, procurando tapar.los tubos durante este paso. Dejar

enfr iar los tubos en un baPb de h ie lo y agregar 8 m l . de agua

dkstilada. Finalmente leer en espectrofotdmetro a 575 nm.

f . - ,

CALCULOS: - , . . . I . ~ . - . . - L - .. . , ^ ^ .

CI p a r t i r . d e , la absorbancia obfenida con l a muestra,

interpolar en l a curva esthdard, para obtener la

concentracih de k t a -

13

, I

J ~- ~- - . . .

SULFUROSO LIBRE -

. -

\':

METODO RIPPER

- . .. -. . . . - . I -

" .

- _ . . . . . . " - - . "_ - . "~ __ . ". ~~ "

PREPARACION DE SOLUCIONES: Solucida- e almidb- a l 2%. LI y &.r..' $:,&

Disolver 2 g. de a l m i d h soluble en 100 ml. de agua y '

calentar. Esta solucicln debe prepararse el mismo dla de la

deterininac i c*1 . Acido sulftlrico 1:3.

Para 100 m1 de solucih, mezclar 25 ml. de H SO concentrado

(reactivo-analltico) con 75 ml. de agua destilada, teniendo

la precaucih de mantener en un baRb de agua fría el matraz

durante la adicih del &ido. !

~~ "" . " - - ".

.,!-

-..2 4

Solucih- de Yodo 0.02 N. (26)-

Para 1 1. de solucih, se disuelven 8 g - de Yoduro de potasio

en 30 ml. de agua destilada, contenida en un matraz aforado

d e 1' l., en la soluci& d e Yoduro se ponen 2.6-2.7 g. de-Yodo

pesados sin exactitud en balanza qranataria y se deja i

.- - - .. " . __ "_ .

disolver en la solucih de Yoduro, agitando frecuentemente el

matraz. Cuando la disolucib del Yodo sea total, se diluye

con agua destilada, hasta el aforo. Despuk se procede a la titulacida con una solucih valorada de tiosulfato de sodio.

PROCEDIMIENTO:

Inmediatamente despuk de haber destapado la botella del

vino, tomar 25 ml. d e muestra y colocarlos en un matraz

Erlenmeyer de 250 ml., escurrihdolos por las paredes.

Adicionar 5 ml, de H2S04 1:3, agitando suavemente para

homogenizar la muestra; agregar 1 0 m1 de una solucih de Yodo

0.02 N hasta obtener una coloracib azul.

- 4

14

I

". " r

15

SULFUROSO TOTAL

Para?F 1. de solucidn 1 N se necesitan S6 9. de KOH; debido a

las impurezas que contiene se pesan sobre un vidrio de reloj,

60 g . del hidrbxido. Se disuelven' en 400-500 ml. de asua

destilada contenida en un vaso de S00 ml., se calienta y se

agrega una solucib, tambih caliente, de 2-3 g . de cloruro de -.

bario en 25-30 ml. de agua. Se deja enfriar y cuando

precipita el carbonato de bario, se filtra, decantando. El fiI%rado que contiene'el hidrdxido libre de carbonato se

-.dry? '5

I

PROCEDIMIENTO:

Colocar en un matraz de Yodo, 25 ml. de KOH 1 N y 25 ml. de

vino, vertihdolo por las paredes, tapar e l matraz, y dejar

reposar por 15 min. Adicionar 10 ml. de H SO 1:3 y 5 ml. de solucih de almidch al 2%. Titular con solucidn de Yodo 0.02

N.

2 4

CALCULOS:

Sulfuroso tata1 (mg/l) = (U) (N) (32) (1000) / (VI Donde: /

. V = Volumen de la solucih de Yodo consumido (ml). . N = Normalidad de la solucih de 'Yodo utilizada.

v = Volumen de la muestra (m11 .

16

L

.

TECN ICAS ?

PREPARACION DEL INOCULO

de los casos se llevc5 a cabo la siguiente metodología:

una asada de un cultivo puro de Lactobacillus sop-%

Posteriorme#Wte, se dejd incubar a temperatura amb-iente por un

lapso de 2 días; se realizaron frotis con tincih de Gram

para corroborar la presencia y abundancia de dicho

microorganismo. Una yez que se observd una alta poblacickl de

&te, se procedid a agregar 43 m l , - - d . e vino? se incub6 y se ". .

siguieron los pasos anteriores.

c

En el segundo experimento se'tomaron 23 ml. de vino que se

destin6 para inckulo y se mezcld con 23 m1 de medio

microindculo. Esta inezcla se dividid en partes equitativas en

dos tubos con rosca y se esterilizaron a 110- C./10 min., se

enfriaron' y se inoculd por medio de una asada; en un t u b o

Streptococcus m y en otro Pediococcus spp. a partir -de

cultivos puros. Se incubd a temperatura ambiente hasta tener

una alta concentracibn de &tos (utilizando la t&nica de

tincib de,,Grám). Fi.?$lmente se le adiciond a cada tubo 23

m1. d e vino. Se incitbaron a temperatura kmbiente hasta que en

Fa tincih se observc5 una abundancia d e microorganismos.

-

. L . . - . . ' . -

... . . > :. .I'. . r '

17 1 1 1 6 0 3

. . " .

. . .

4 .t. : 2" Cubrir el frotiscon cristal-violeta durante 1 min.

\ .

rc . ,. ..

3.- Enjuagar los portaobjetos con una corriente suave 1 -f de'"

-agua durante 5 seg. .~ . - . . ..

4.- Aplicar al frotis lug01 durante 1 min.

5.- Enjuagar como se indicc5 en el paso 3.

. .

6" Aplicar el reactivo de alcohol hasta que la tintura ya

no fluya del frotis.

.- - - - ~ __ -. - . 7.- Enjuagar inmediatamente como se hizo en el paso 3-

8.- Cubrir el fotis con safranina por 30 segs.

9.- Enjuagar coma se indice anteriormente y secar.

10.- Observar cada frotis utilizando el lente de inmarsibt en

aceite del microscopio. .

18

4

-u.

Tabla --No.l .-ANALISIS FISICOQUIMIFS EFECTUADOS, DURANTE LA

FEKMENTACION MALOLACTICA DEL VINO TINTO VARIEDAD CABEKNET

QNON INOCULADO CON L a c t o b a c i l l u s S-.

_.

"TIEMPO- CDIAS)

"- . . a

!3

10

15

20

25

35

" .

- 5-42?

5 .4?7 . -

5.4'77 .. .

S -427

AC I DO LACT I CO '"

2.146

- ""

2.334

"

l . 899 "--. "- "_I

2.416

L_

l . 9'78

2 . 8 5 3

"""

1.917 """

2.842 ""

.

ACIDEZ VOLATIL "

O . 509

O . 533

- O . 396

O . 392

O . 383

O . 582

O . 61'7 .. -

_""" O . 760

"

1" 'I

.

.. .~. . ~~ .". __ " """ .. ~ . . ~

? . "

Tabla No.2 ANALISIS FISICOQUIMICOS .-EFECTUADOS DURANTE LA

FERM ION MALOLACTICA DEL V. TINTO, VARIEDAD CABERNET,.SAUVIGNON, INOCULADO CON Streptococcus e. y Pediococcüs sa.

o. . *

-,& i

. I b

:.*.*.L%>' - 8 - .. \ . - - "

TIEMPO

(DIAS)

T . .

O

3 , .,""

11

14

17

20

23

26

29

32

ACIDEZ TOTAL

5.929 ~

5.829

5.527

5.628

5.628

S . 628

5,628

. AC I DO LACT IC0

2.694

. 3.025 -. %..A

2.563 .-.

2.126

2.344

2.006

2,187

1.866

1 965

2.055

20

.ACIDEZ VOLATIL

0. 359

O. 301

0 , 315

.O,310

O. 399 c

0. 420

O. 395

0.381

O. 577

1.149

O. 932

.

TABLA No. 3 ANALISIS FISICOQUIMICOS EFECTUADOS EN- EL VINO

,- . TINTO VARIEDAD CABERNET SAUVIGNON,.. AL INICIO Y

FIN DE LCI FERMENTACION MALOLACTICA POR

Lactobacillus S-. . . -

" e. -1* i.

. . "&b . &$g$Jz&&$$ '

" ~~. ." . "_.". ~. I .. " -.a : i . ~ . .

/

I__ - " -

-~ ~- "

ANALISIS FISICOPUIMICO

' ACIDEZ TOTAL <g/l) ~~~~ ~~ ~~ ~

~ ACID0 LACTIC0 (g/l)

. .. ." .- . - . " . ~ .,

ACIDEZ VOLATIL (g/l) . .. . - .

. .... . ETANOL < 9GL)

.. . . . , ~ "" .

" - ~~ . " ." . . AZUCARES RED. DIR. <g/l)

SULFUROSO LIBRE (ppm)

SULFUROSO TOTAL (ppm)

PH

"". . J -.

CONCENTRACION INICIAL

5.979

. 1.315

. _,

O. 509

13.700

O. 485

14'3 . 360

192.000

3.4

CONCENTRACION FINAL

5.628

2.842

O. 760

12.930

~.

O. 333

18.960

' - 50.680

3.4 - 3.5

21

TCIBLEI NO. 4 AN~LXSI-S-FISICOQUIMICOS- EFECTUADOS." EN EL VINO TINTO VCIRIEDfiD CAEERNET SAUVIGNON, AL%. INICIO Y

F DE LA FERMENTACION OLACpEI POR -9;. 1 ..

Streptococcus S-. y Pediococcus =Q. .

I

I SULFUROSO TOTAL (ppm)

I SULFUROSO LIBRE (ppm)

CONCENTRACION INICIAL

5.920

2.694 -1

o. 359

10. 989 $:e.

" ~ " O. 521 ~- .

_""

24.192

3.4

.,ir ' ... . CONCENTRACICW

FINAL

5,628

2.055

O. 932

9.934

0.740 r

53- 760

21.096

3.4 - 3.5

22

, t

i " I -\

. f-

- - .

-_ -

'L.

h

i

. .

. .

.

.

A r(

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. p 2.5 "" "" . . .

n w z O

3.

4- 4 20 Exwrimto

""

N fd u *'- :

I 20 - -.

... . . . I

". ,x '

.

correcciones: *: , .

1 c , .$ 5

c; # & ?I

"i . ;f.

~ ". .

La acidez total en los vinos, e s t a dada oor los Acidos .. .

orqbricos (Ac mAlico, c í t r i c o v t a r t b i c o ) d e la uva v los

*idos aue se oroducen duran'te la fermentacih vínica.

acetico. succínico v lactic-o- Dicha aciidez debe ser mavor a 6 .

6. 1 g/l (5 .5 o/l como & c m .I malico) (25)- Se. adicion6 &c. mglico hasta una concentracidn d e 5.9 011.

t:

La concentracidm i n i c i a l d e Ac. l k t i c o e n el vino CTab. No

& J . S Ü G c k 1.315 v-a? f inh~-"de-l~"FML-de-2,842, . 7 .

Durante l a FML hav un incremento e n l a a c i d e z v o l a t i l . debido

a los &idos qrasos volQti les presentes e n e l vino (ft5rmico.

acetico, butirico, . etc); a l a a e n e r a c i h de comouestos

aromAticos con c a r k t e r Acido, v a l a oroduccidm de

acetaldehido ( 9 , 1 1 , 1 5 Y 161, Dor l o aue es conveniente aue la

concentracidn sea baja o menor a 200 Dpm a l i n i c i o d e l a FML.

En l a Tab. No 3 , l a a c i d e z v o l A t i l d e l , vino corresoande a

0. 509 g / l I

Cuando la cpncentracidn d e alcohol es mavor a l 10 X , la 4 Caoacidad de las b a c t e r i o a s l k t i c a s o a r d d e s a r r o l l a r la FML

e n e l v i n o empieza a disminuir; teniendo s u mAxima tolerancia

1

.. . -

ducosa. xi losa, arabinosa, etc, ya que las bacterias . pueden

metabolizarlos y generar aran cantidad de &ido acdtico,

1Actico. acetolna, acetona, etc. o . una picadura - l k t i c a (251. E l v ino u t i l i zado ( ve r 'No. ' 3 ) tuvo badas

concentraciones de azucares reductore rectos (0.48 v 0.52

q/l) - , cantidades favorables Dara efec la FML sin esperar

alguna enfermedad en el. vino. .. .

"" . " . " ~- "" "" . . . " - "

.*' 4, - A::%.%, . t Q 9

Debido a l a accik, inhibidora aue posee e l SO2 sobre las

bacterias &ido-1;kticas;. l a c o n c e n t r a c i h ... I de SO to ta l debe

sermenor a SO ppm (12,181. esoecialmente a valores de OH

i n fe r io res . a 3.2 (61.. E l a n a l i s i s d e l v i n o d i o una

concentracih de 143 ppm de SO2 l ibre ; Dara reducir la

concentracidm se deS6 una c h a r d de a i r e en e l fermentador

(aprox. 1/3 del volumen to ta l d-eT"frascs), oara-faiErecer- f la

oxidacidn 'del SCI (S4+) a su l fa to <S 1. Sin embarao. tambi&fl

105 comouestos fendlicos son oxidados. modificando l a

coloracidra del vino.

Para l a ferrnentacich con l a mezcla de microoraanismos, e l

-".

2

..- -

6+ 2

vino oresent6 24.19 opm de SOz l i b r e , p o r l o que no fue

- necesario efectuar ninauna correccih.

E l pH es uno de los oar-bnetros que m& intervienen en e l

comportamiento de las bacte r ias l e t icas , i n f l uve

directamente en l a velocidad de consumo del su!strato y oor

consecuencia, afecta l a tasa de crecimiento de las bacterias,

modificando e l tiempo de la f e rmentac ih ( 3 0 ) . La- FML se

4

desarrolla fAcilmente a pH de 3 .4 Y con mavor d i f icu l tad a

pH's mA5 bajos (3 .1 - 3 . 3 ) , 50r l o que 5e e l i o i d e l v a l o r de

3.4 como constante de trabajo.

2

. (2,6,15,16,25), por tratarse de microoraan2smos

.~ ~

de que la temoeratura d e maduracih de los vinos es

20-C como promedio. siendo estas las razones' d e fe

20-c.

Se utili.zC, como inkula un cultivo'puro de LsctobaciIius S-.

i aislado d e una muestra de vino tinto Malbec de San Juan del

Rlo, Las caracterlsticas de dicho microoroanismo son: Baci'los

qram +, inmhiles, no esporulados: caracterlsticas que se

comprobaron oor tincih de Gram ( 5 ) .

Para estimular el crecimiento de Lactobacillus SPD., as1 como

la velocidad de la FML fue necesario llevar a cabo el

exoerimenb -en" ccndiricnss ar!aerobi.zs !?I " " . . -

Según los datos <Tab. No.1) hubo una disminucih de la acidez

total de 5.979 a 5.628 q/l, lo cual se mostrh notablemente

desouk de 30 días. como 5e observa en la Fio. No. l.

Paralelamente a la degradacidn del &c. mlrlico hubo un

incremento en la concentracidn de Ac. lktico de 2.146 a

2.842 g/l (Fig. No. 2), ref1ejAndos.e de esta forma la accih

de las bacterias lkticas, ya clue durante la FML. el &c. mAlico (dicarboxílico), es convertido a k. lktico

(monocarboxllico). Esta,conversi& trae como resultado una

desacidificacidn del vino (5,161.

La ficidez volitil sufrid un incremento de 0.25q/l, con

resoecto al valor inic%a-I de 0.509 q/l (Tab. No. 3 y 4) oor

la formacih de &c. ac&tico a partir de 'olucosa y fructosa

(9,15,16). AdemAs de que se presenta una disminucih de

azucares reductores directos de 0.152 o/I . (Tab. No. 3 ) al

I

3

fina'l de la fermentacich. , . .3 . Con resoecto al contenido de alcohol . % s e - obtuv6 - una

~ . ~. -. ~ ~~ ~~ ."." ~

.h.* . \ disminucih de 0.770 GL, con!siecuencia-";de-. una posible

I: ", .&.,, 361. ' esterificacih del etanol con los.acid G,vino 4 15).

De las causas que originan la disminuc SO libre (como

ocurrid en fa FML c m Lactobacillus m.) ' . se encuentran: La - . 1 . . . . 2

" . _" " .. """ ~ ". - "" __ . _____"_ " ~ c _ _ _ _ ~ - ~ ~ " __ "

\. . <+, - , &,:

f ormac i &-I de comouestos orqanosulfurosos , (An=. , ,.

"-? ",-;

etanalsulfbico. Ac. hidrosulfc2micos neutros derivados del

isobutiraldehido y diacetilo) (25) : la ,.>*.. daciLn a sulfatos

<que fue orovocada):. la reduccib a sulfuro por efecto del ::&e, I

medio reductor del vino al ser estabilizado y embotellado; la reaccib entre el i h bisulfito y las antocianinas

-"..

7"

disminuyendo como consecuencia el color del vino (16). .Pi;h.

A pesar de que el pH final dsel. vino ne'se midid, la enerqla

&ida (pH), disminuye con la FML 125), debido a 'Que el Ac.

LActico que sustituye al milico es alrededor de una tercera - )

parte menos disociado Que aquel; v a la oarcial

neutralizacih del Ac- tartiwico como resultado de la demolicih de los malatos.

. . "*, " T .*' X'

Y'

___ " ~ ~ ~ ~ .- .- . ~". . - " " ..

En el segundo experimento se utilizxd una mezcla de

microorganismos, Streptocaccug SQP. y Pedjococcus SOD.

Pediococcus SJP~., pertenece a la familia Streptococcaceae.

Son cocos que se presentan en pares o tetradas, no mdviles.

no es;porulan, g r a m +- homofermentativos v microaerdfilos ( 5 ) .

Streotococcus s _ Q ~ . , Dertenece a la misma familia. Son

bacterias gram +, se presentan como diplococos en cadenas no

esporuladas, inmCtvi les, anaerob ios facultativos, ! hornofermentativos, productores' de &z- lktico (3) . . . 1

Por ser Pediococcus spg. un microorganismo microaerdfilo, la 7

presencia de a i r e se restringid en todos los fermentadores,

dejando un espacio del vino a la taDa. Para conservar una

< 4 ,

4

.

chars de aire constante se utilizaron 10 fermentadores, bajo

. . la5 condiciones de trabajo especificadas anteriormente, tomando cada muestra de un fermentador diferente,:

En la Tab. No. 2, los datos nos indican-una disminucib-, en la

acide'z total de 0.292 q/1. - El comcrortamiento .irreQular de los

microorganismos se-abrecid-. tambi-&n en la Graf. No. 1. Desouk -

--de"ZS-di-= ?.=r 'dez"tata3"se mantuvo-constañte. - - . - "" ""

.Son varias la5 posibles causas Que Dueden explicar tal

decremento:

1.- La transformaciCn de Ac. mAlico a Ac. pirwico sin, lleaar

a &c. IActico como se muestra en una ruta oroouesta por

Lonvpd (19).

2.- La insolubilizacib de bitartrato de olot;asio como

consecuencia de la desaparicih de Ac. milico C25)-

3.- Puesto que el vino no se esterilizO las levaduras 1 presentes transformaron el Ac. milico a etanol Y CO (6,251.

~

2 .~ . * . ~ . . - ..__---- - . .. ' ""4

Durante la fermentacik, no hubo oroduccic5n de aC. lktico.

Dm- el contrario disminuyb de 2.694 a 2.055 ~ / l (Tab. No.2 v 1

Graf. No. 31, ya que posiblemente la ruta .bioqulmica I pirhico-liictica se desvid a la formaciCn de produc.tos

secundarios <aci?toína y diacetilo) por Streptococcus

w. (13,15,28), o bien a la formacidn de glicerol o al

consumo de k t e por otros microorganismos (11,151.

El aumento de acidez vol,Atil, la disminucih del etanol y el

SO libre tienen la misma exolicacib de los. fendmenos de

oxido-reduccih Que se presentaron en el exoerimento con

Lactobaci 11u5 ~ Q Q .

El- aumento en los azucares reductores directos (Tab. No. 41,

es debida a la hidrdlisis de las antocianinas que oripina un

azucar y una agluch, explicando el ligero aumento de los

azucares reductores (251. Este fenheno es un Droceso normal

1

2

/

5

.. I

. "

.. , . s.

la oxidacih de las antocianinas. princioalmente.

~~ ." -

AROMA Y BOUQUET: La sensacih de f rescu'ra se oerdi.6. así como . . - I

r varietal, desarrollhdose un bouauet fino. con

a fruto elaborado. : x " . :<

. ..

- . , " .. . ..

\

percibid un peauef'ío,aumento en el dulzor del vino

do posiblemente Dor la presencia del qlicerol.

.C. ,:%:

'.'CSCIDEZ TOTAL: E l vino se suavizc3 a l disminuir la acidez.

-. .

CUERPO: MAS redondo y espeso.'

. ' . SABOR: A ciruela pasa cocida, con un sabor metafico residual.

fiSTRINGENCIA:'Disminuy& con respecto al testigo. c

". " . ___- CALIDAD GENERAL: Físicamente, hubo una precioitacih de

compuestos fenblicos, principalmente quinonas.

.

7 111603

5

' i

CONCLUSIONES

- 1.- A l u t i 1 i z ; r r e l r u l t i v o our0 d e La_c.tobacillus-_._soD. Y l a

mezcla de Streptococcus 513p. y Pediococcus S-. hubo una

d e s a c i d i f i c a c i h e n . e l v i n o t i n t o variedad Cabernet

Sauvignon, marca L.A. Cetto-

?: 1 i I

- . . 2.- La i n o c u l a c i h d e Lactobacil lus s x . f u e conveniente para

l levar a cabo la . transformacih I de gC. mAlico hacia At=.

l k t i c o .

3.- La mezcla d e Streptococcus m. y Pediococcus m. no e5

recomendable para l a formaciCn de k. l k t i c o , pero s i

contribuyd mejorando e l sabor del vino, tornbdolo m& suave.

4.- E l sabor amargo que tuvo e l vino -al final d e l a

fermentacih originado por la transformaciCr\ de l a s

antocianinas a auinonas a causa d e l a presencia de oxiqeno,

8

:

se puede evitar teniendo un control m&s estricto de k t e en - - " ." . ~ .

los fermentadores.

'3.- Sensorialment rcibid la presencia de qliceral on ... _ . ~ el vino al final- rmentacih, por lo aue se aconse.ia

..# I , .<.

:' .h..% hacer una cuantificacidn de &te- a lo larqo- del Gxperimento.

6.- Por la est rmacibr que existe sobre el efecto de

Streptococcus 1 vino, se recomienda verificar su 4.:

comportamiento '" durante la fermentacib malolkctica. como 1 .., I 1. '2

cultivo puro. [ - .:: . $2'

I ::

En el presente

malolActica en

. . "

1

RESUMEN *

-

proyecto se llev6 a cabo una fermentacih

un vino tinto, variedad Cabernet Sauvionon.

marca L.A. Cetto, el cual se analizc5 previamente Dara conocer

las condiciones en que se encontraba dicho vino Y de esta .

manera estandarizarlo.

Se efectuaron dos experimentos, en el primero se utili26 un

cultivo puro de LactobaciLlu2 spo. y en el sepundo una mezcla

de dos cultivos, Streptococcus x. y rediococcus S=. En

ambos casos la temperatura de trabado ,fue de

aproximadamente 20-C y el pH inicial de 3.4..

Durante el transcurso de la fermentacih se practicaron

anAlisis fisicoqufmicos para determinar el fin de la misma.

Finalmente se hizo una evaluacib-1 sensorial cornoarhdolo con,

un vino de las mismas caracteristicas, Pero en el que no se

-

4

9

. ., . ..

realizh la fermentacih malolktica. " .~

.. . . . ~ . . "

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