El quorum sensing regula la formacióde biofilm enVibrio scophthalmi

13 de juliol de 2012

Què és el quorum sensing?

RESPOSTA

- Producció d’antibiòtics- Alliberació de factors de virulència- Swarming- Formació d’endòspores- Formació de biofilm- Síntesi d’exopolisacàrids

Tipus d’autoinductors

Vibrio fischeri

Engebrecht J & Silverman M (1984) Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci U S A 81: 4154-4158.

Diversitat de circuits de QS…

Waters, C.M. and Bassler, B.L. 2005. Quorum Sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21:319-346.

V. harveyi, V. cholerae…

El cas de Vibrio scophthalmi…

* Cerdà-Cuéllar et al. 1997. Vibrio scophthalmi sp. nov., a new species from turbot (Scophthalmus maximus).

International Journal of Systematic Bacteriology 47(1); 58-61.

Especificitat alta amb el turbot tot i que no és l’espècie més abundant a l’aigua de mar on viuen aquests peixos*

La colonització de l’intestí del turbot per aquesta espècie podria estar regulada per mecanismes de quorum sensing?

HIPÒTESI DE TREBALL

Objectius

- Quins circuits de quorum sensing presenta?

- Quines funcions regulen?

Materials i mètodes

Detecció d’AHLs Detecció de l’AI-2

- Extracció d’AHLs

- Separació AHLs mitjançantcromatografia en capa fina idetecció amb el biosensord’AHLs A. tumefaciens NTL4

- Identificació mitjançant espectrometriade masses

- Detecció en el sobrenedantutilitzant la soca biosensora de l’AI-2 de V. harveyi BB886 (AI-1 +, AI-2 -).

- Detecció i seqüenciació de la sevasintasa, luxS, mitjançant PCR utilitzant encebadors degenerats.

Materials i mètodesDETECCIÓ DE GENS IMPLICATS EN LA TRANSDUCCIÓ DEL SENYAL

luxR V. harveyi-like, luxR V.fisheri-like, luxN

- Detecció gens mitjançantencebadors degenerats.

Con

trol

neg

atiu

V. s

coph

thal

mi

V. v

ulni

ficus

PhiX

174H

aeIII

luxR

- Seqüenciació complerta del gen mitjançant PCR inversa.

ER: enzim de restricció

Regió desconegudaSeqüència ADN coneguda

Encebador1 Encebador 2ERER

Digestió i lligació

Seq. coneguda

PCR

Seq. desconeguda

Materials i mètodes

SEQÜENCIACIÓ GENÒMICA DE V. scophthalmi (soques A089 i A102)Sequenciador 454 (Roche Diagnostics) i ensamblatge amb el programa Newbler

Identificació d’altres gens relacionats amb circuits de quorum sensing en vibris

Materials i mètodesIDENTIFICACIÓ DE FUNCIONS REGULADES PER QUORUM SENSING

Creació de mutants amb els gens luxS i luxR delecionats

Creació de recombinants productors de la lactonasa Aiia de Bacillus sp.

Materials i mètodes

IDENTIFICACIÓ DE FUNCIONS REGULADES PER QUORUM SENSING

- Cinètica de creixement

- Motilitat

- Formació de biofilm en microplaques de poliestirè

Resultats

Detecció d’autoinductors

- Detecció de 3 molècules activadores del biosensor A. tumefaciens NTL4

A089 A102

1

2

3

- Identificació de la molècula 3 com a una AHL amb una m/z de 300.2414 corresponent amb una N-(3-hidroxi-dodecanoil)-L-homoserin lactona

Resultats

- Detecció de l’autoinductor AI-2 en els sobrenedants de V. scophthalmi

- Detecció i seqüenciació del gen codificant per la seva sintasa (519 bp amplimer):

Similitud del 78% amb el gen luxS de V. vulnificus.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

hours

rela

tive

light

uni

ts

00,20,40,60,81

1,21,41,61,82

OD

600

nm

Resultats

Detecció de gens implicats en la transducció del senyal (PCR)

-Detecció i seqüenciació del gen luxR V. harveyi-like (615 bp):

Similitud del 75% amb el gen luxR de V. vulnificus.

-Els gens luxR V. fischeri-like i luxN no van ser detectats mitjançant l’amplificaciómitjançant PCR utilitzant encebadors degenerats.

Resultats

Detecció de gens implicats en la transducció del senyal (seqüenciació genòmica)

- En el cas de la soca A089 es van obtenir un total de 287 contigs que es van agrupar en 20 scaffolds representant un total de 4.5 Mb.

- En el cas de la soca A102 es van obtenir un total de 223 contigs que es van agrupar en 4 scaffolds representant un total de 4.45 Mb.

- En ambdues soques es van detectar homòlegs dels següents gens implicats en la transducció del senyal:

Resultats

Funcions regulades pels circuits QS en V. scophthalmi

Efecte de les AHLs en el creixementpACYC pACYC-aiiA

% motilitat 100 49,39SD 16,76

Efecte de les AHLs en la motilitat

Resultats

Funcions regulades pels circuits QS en V. scophthalmi

C- ∆luxR ∆luxSwt

Efecte de la deleció de luxR i luxS en la formació de biofilms

ResultatsEfecte de la deleció de luxR i luxS en les proteïnes de membrana externa

∆luxS

∆luxR

wt

Conclusions

- Vibrio scophthalmi presenta uns circuits de quorum sensing similarsals que presenta V. harveyi.

-V. scophthalmi produeix 3 molècules del tipus AHL una de les quals es vaidentificar com a N-(3-hidroxi)-L-homoserin lactona, tot i que es desconeixla seqüència de la seva sintasa.

- La disminució de la concentració d’aquestes AHLs mitjançant la lactonasa AiiAde Bacillus sp. provoca una disminució en la taxa de creixement.

- El regulador luxR regula positivament la formació de biofilm a elevadesdensitats cel·lulars.

- La deleció del gen luxS disminueix la formació de biofilm.

- V. scophthalmi té un gen codificant pel receptor de l’autoinductor CqsA, el gen cqsS, tot i que no s’ha identificat el gen codificant per aquest autoinductor.

AGRAÏMENTS: