UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

Facultad de Ciencias Biológicas

Licenciatura en Biotecnología Genómica

Nombre de la Materia: “Ingeniería Genética”

Nombre del trabajo: “Práctica 1.Preparación y Análisis de DNA genómico a partir

de levaduras“

Mtra. Eddy Luz Cab Barrera

Nombre del Alumno: Alejandra Guardado Méndez

Marizza Lizeth Gándara García

Grupo: 453

Fecha de entrega: Monterrey, N.L. a 28 de agosto del 2015

Objetivo

Extraer y analizar DNA genómico a partir de Pichia pastoris mediante la técnica TSNT

Fundamento

La Técnica TSNT que se describirá a continuación es una de las más empleadas en biología molecular, debido a que se obtiene DNA genómico de muy alta calidad, que puede servir para posteriores análisis de la secuencia y en una gran variedad de aplicaciones. La técnica TSNT consta de cuatro pasos fundamentales que están presentes en la mayoría de los procesos de Extracción de DNA genómico; Lisis celular, extracción de contaminantes, precipitación y lavado del DNA y solubilización. En la lisis celular, se busca liberar el DNA del interior celular, se usa el buffer de lisis TSNT que contiene: detergentes como (SDS) sodio dodecilo sulfato y Triton X, que desestabilizan la membrana ya que interaccionan con los fosfolípidos y proteínas de ésta, formando micelas y eliminando estructuras secundarias y terciarias de las proteínas, pero sin alterar sus enlaces disulfuro. Una molécula quelante (EDTA), ácido etileno amino tetra acético, presente en el buffer, forma enlaces con los cationes presentes en la solución, que son cofactores de las nucleasas, de esta manera se protege al DNA especialmente de las DNAasas, ya que éstas se unen al EDTA, en vez de atarse al grupo fosfato entre los ácidos nucleicos y de esta forma se previene el quiebre de los mismos, estabilizando así el DNA y contribuyendo además a desestabilizar más la membrana al romper las moléculas hidrofóbicas presentes en las mismas. Las sales (como cloruro de sodio, NaCI) del buffer forman una capa iónica suave que recubre al DNA protegiéndolo y ayudándolo a evitar su degradación, el Tris-HCI ayuda a mantener el pH de la solución estable, con esto se evita que se degrade el DNA y el RNA en las células y la proteinasa K degrada proteínas y enzimas. El segundo paso es la extracción de contaminantes, en éste las proteínas desnaturalizadas son extraídas con Fenol y Sevag (cloroformo-alcohol isoamílico), ya que estos tienen función desnaturalizante en proteínas, lo que ayuda a la disociación de proteínas con ácidos nucleicos, remueve lípidos y el cloroformo permite una mejor separación de fases fenólica-acuosa al aplicarse fuerza centrífuga y el alcohol isoamílico disminuye las emulsiones. En el lavado y precipitación de DNA, se utiliza etanol absoluto para extraer el DNA del resto de los solutos; lo purifica y lo concentra. El alcohol al no ser soluble en agua, obliga al DNA (por su carga negativa a unirse entre ellos mismos con los grupos fosfatos y separándolos de los enlaces que pueda formar con el agua. La centrifugación permite separar los conglomerados de ADN suspendidos en el alcohol de los remanentes de las células. Una segunda precipitación con etanol pero ésta vez con acetato de amonio, permite neutralizar solución y eliminar las coprecipitaciones de dNTPs y la adición de ARNasa, para eliminar la contaminación por RNA. En la solubilización se re-suspende el DNA con él buffer TE 1x, ya que amortigua la solución con el DNA para que no se desnaturalice.

Material y Equipo

Equipo

Agitador vortex Congelador de -20°C Juego de micropipetas

(azules, amarillas y blancas) Hielera con hielo Centrífuga Transluminador Equipo para electroforesis

- Cámaras horizontales

- Fuente de poder- Accesorios

Materiales

Cepa de P. pastoris p Pic α-Glu, KM71

Medio de cultivo YPD (Extracto de levadura 1%, Peptona2%, Glucosa 2%)

TSNT (Tritón X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCI 100 mM, Tris-HCI 10 mM y EDTA 1mM pH=8)

Fenol SEVAG (cloroformo: alcohol

isoamílico, 24:1) TE 1x (Tris-HCI 10 mM pH= 8

y EDTA 1mM pH= 8) Etanol al 100% Etanol al 70% RNAasa Gradillas de plástico Guantes desechables Cajas de plástico para

guardar tubos con muestra Contenedores para desechos

químicos y otro para material biológico

Puntillas para micropipetas (azules y amarillas)

Tubos eppendorf de (1.5mL o 2 ml)

Procedimientos

Homogenización1. Añadir al paquete celular 200μL de la solución amortiguadora de lisis

TSNT, Mezclar por inversión. Nota: al mezclar por inversión no hacerlo bruscamente ya que podemos dañar el DNA

Extracción de contaminantes2. Añadir 500 μL de Fenol

Nota: Manejar con precaución el fenol, tomar del fondo, evitar tomar de la fase aceitosa o mezclarlas.

3. Añadir 100 μL de SEVAG y mezclar por inversión4. Añadir 200 Μl de TE 1x pH 8 y mezclar por inversión. 5. Centrifugar 10 min.6. Recuperar sobrenadante en un tubo Eppendor de 1.5 mL, con cuidado

de no tomar de la otra fase.

Precipitación y lavado del DNA

1. Añadir 1 ml de etanol al 100%. Mezclar lentamente por inversiónNota: Observar la precipitación del DNA hasta la formación de una hebra blanca

2. Llevar 10 min. a centrifugar y transferir la fase acuosa a un tubo Eppendorf nuevo de 1.5 mL

3. Lavar pastilla con etanol al 70% y decantar el sobrenadante teniendo encuenta que no se desprenda la pastilla. Nota: decantar del lado contrario a la pastilla.

4. Centrifugar 5 min. 5. Decantar sobrenadante6. Re-suspender en 50 μL de TE 1x pH = 8 y almacenar a 4°C para

posteriormente determinar concentración y calidad de la muestra de DNA

Preparación de Buffer SB 1X:

1. En un vaso de precipitado de 500 mL, añadir 25 mL de buffer SB al 20x, con ayuda de una probeta de 30 o 100mL

2. Añadir 475 mL de agua destilada al vaso de precipitado para disolver el buffer al 20x hasta 1x.

3. Agitar ligeramente el vaso de precipitado.

Preparación del Gel de agarosa:

4. Tarar báscula con un matraz Erlenmeyer de 500 mL sobre ésta.5. Pesar 0.8 gr. de agarosa con ayuda de una espátula 6. Retirar matraz Erlenmeyer

7. Limpiar y apagar báscula8. Medir un volumen de 100mL de buffer SB 1X con una probeta9. Añadir los 100mL de buffer SB 1x al matraz Erlen-meyer de 500mL10.Calentar el matraz con agarosa en un microondas hasta que se disuelva

bien, por 1 o 2 minutos evitando en lo posible la ebullición de la agarosa11.Retirar el matraz del horno de microondas con un guante de protección

térmica12.Vacíe el contenido del matraz bien homogenizado sobre el molde del gel,

con los adaptadores previamente ajustados en los extremos, para que no se salga la agarosa.

13.Colocar peine en el molde que contiene la agarosa14.Dejar solidificar la agarosa durante al menos 30 minutos15.Desarmar el molde (quitar los adaptadores de los extremos)16.Quitar peine con cuidado 17.Colocar el gel en la cámara de electroforesis18.Verter buffer 1x hasta cubrir el gel 19.Cargar marcador Lambda λ en el primer pocillo. 20.Cargar muestras en el pocillo correspondiente. (Revisar procedimiento)21.Conectar los electrodos a la fuente de poder, con la entrada de igual

color al del electrodo. Ajustar parámetros deseados. Variable ej. (80-100 volts/45 min.).

Cuantificación por espectrofotometríaDNA genómico198 μL buffer TE 1X + 2 μL de muestra DNA genómicoProcedimiento

1. Encender el equipo2. Seleccionar la operación lambda λ3. Leer a 260 nm4. Poner la muestra blanco para balancear o calibrar las

celdillas desechables5. Poner la muestra a leer en una celdilla desechable6. Retirar la muestra blanco 7. Poner la muestra con DNA genómico que se quiere leer8. Registrar resultados y retirar la muestra9. Repetir pasos a partir del 3 pero para leer a 280 nm

Para cargar muestrasDNA genómico 1 μL gel Red + 1 μL de Azul de bromofenol + 5 μL muestra DNA genómicoProcedimiento

1. En papel parafilm colocar con una micro-pipeta adecuada la cantidad especificada de gel Red

2. A lado del gel Red colocar con una micro-pipeta adecuada la cantidad especificada del buffer de corrida

3. Por último combinar la muestra de DNA a utilizar con el

buffer de corrida y el gel Red. Aumentar un poco el volumen de la micro-pipeta para homogenizar bien

4. Cargar muestra en el pocillo correspondiente del gel, con cuidado de no expulsar aire al introducir la puntilla en el pocillo

5. Presionar hasta el segundo tope, dentro del pocillo correspondiente, para expulsar la muestra

6. Dejar de presionar el tope de la micro-pipeta hasta haber retirado la puntilla del gel

Resultados:

Eq.

Mues-tra

μL de mues-tra

Volu-men final μL

Dilu-ción

Ab. 260 nm

Ab. 280 nm.

Rela-ción 260/280

Ab. A 260 nm x50

Multiplicar por el factor de dilución

Dividir/1000

Vol. de resuspensión

μg totales

1 Eq. 1 2 μL 200 μL 1:100 0.5730 0.5426 1.056 28.65 2865 2.865 50 μL 143.25 μg2 Eq. 2 2 μL 200 μL 1:100 0.1671 0.1271 1.315 8.355 835.5 0.836 50 μL 41.8 μg3 Eq. 3 2 μL 200 μL 1:100 1.2146 0.7013 1.732 60.730 6073 6.073 50 μL 303.65 μg4 Eq. 4 2 μL 200 μL 1:100 0.0072 0.0037 1.946 0.360 36 0.36 50 μL 1.8 μg5 Eq.5 2 μL 200 μL 1:100 0.2079 0.1901 1.094 10.365 1039.5 1039.

550 μL 52 μg

6 Eq.6 2 μL 200 μL 1:100 1.4874 0.8362 1.779 74.370 7437 7437 50 μL 371.85 μg

El ADN genómico puede obtenerse a partir de cualquier microorganismo, planta o animal en cualquier momento durante su desarrollo y nos provee de copias moleculares de genes de cada organismo.

DNAg

M 1 2 3 4 5 6

Marcador de Peso Molecular: Hyper Ladder l Kb(Promega)

Buffer SSB 1X

Tiempo de corrimiento 30 min.

100 volts

Teñido con Gel Red

Fig.1 DNA genómico de Escherichia coli teñido con Gel Red. Carril 1 corresponde al marcador Hyper Ladder (Promega). Carril 2(Equipo 1), Carril 3(Equipo 2), Carril 4 (Equipo 3), Carril 5 (Equipo 4), Carril 6 (Equipo 5), Carril 7 (Equipo 6).

El método de purificación para el aislamiento de ácidos nucleicos tiene que ser perfectamente compatible con el uso futuro que se piensa dar al ADN purificado.

Al analizar los carriles de la electroforesis obtenida durante la práctica se logra observar que el carril 3 no presenta alguna banda, normalmente esto pudiera haber ocurrido debido a que no se logró separar la muestra, para esto se debería aumentar el tiempo de electroforesis (puede requerir menor voltaje) y verificar que la concentración de agarosa en el gel es la adecuada para la resolución deseada (Herráez, 2014), sin embargo en el pocillo del carril 3 no se ve absolutamente nada, tal vez no se cargó ninguna muestra en él. Por el contrario se considera que el ADN extraído esta integro en los seis carriles, ya que si se observa una banda estrecha cercana al pozo en que se colocó la mezcla de ADN (Alejos, et. al, 2008).

El carril 1, 2, 4, 5 y 6 presentan dos bandas con una intensidad muy alta, una cercana al pocillo y otra un poco más tenue y cercana a la banda difusa de hasta abajo, en comparación con el marcador de selección, estas bandas corresponden a 12,007 y 10, 000 pb, sin embargo no es posible visualizar una buena separación de los fragmentos de ADN, ya que se encuentran muy juntas, esto pudo deberse a que la concentración de la agarosa para el marcador Hyper Ladder l Kb(Promega) utilizado, debe tener una concentración del 1% ó 2% (Fierro, 2005)

Al analizar la imagen, se puede observar la banda difusa al final de los carriles 1, 2, 4, 5 y 6, lo cual corresponde a RNA porque no se utilizaron enzimas como las ribonucleasas que lo degradaran (Clària, et. al , 2001 ).

Conclusiones y Recomendaciones:

En esta práctica se lograron los objetivos planteados, que son la extracción y el análisis de ADN genómico de la bacteria Escherichia coli mediante la técnica TSNT. La técnica permitió obtener gran concentración de DNA genómico y en el equipo 4 incluso se obtuvo DNA genómico de excelente calidad. Una recomendación sería que cuando se añada el alcohol frío, éste se deba hacerlo de forma cuidadosa y no inhalar los vapores ya que éste es dañino para la salud, además se prefiere etanol que isopropanol, ya que éste último alcanza a precipitar algunas proteínas junto con el DNA por lo que se obtiene un DNA de menor calidad. También se recomienda usar RNAasa durante la extracción para eliminar la contaminación por RNA y para tener una mejor resolución de los geles se recomienda un voltaje menor y aumentar el tiempo de electroforesis.

Bibliografía

Alejos, L. et, al. (2008). Extracción y purificación de ADN. Recuerado el día 27 de agosto de 2015 de http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf

Clària, J., et. al (2001). Herramientas básicas de análisis genético. Recuperado el día 16 de febrero de 2015 de http://www.jano.es/ficheros/sumarios/1/61/1400/53/1v61n1400a13019439pdf001.pdf.

Fierro, F. (2005). Electroforesis de ADN. Recuperado el día 29 de agosto de 2015 de http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.pdf

Herráez, A. (2014). Electroforesis. Recuperado el día 09 de marzo de 2015 de http://biomodel.uah.es/an/plasmido/inicio.htm