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DISEÑO Y DESARROLLO DE UN BIOSENSOR MICRO DISEÑO Y DESARROLLO DE UN BIOSENSOR MICRO DISEÑO Y DESARROLLO DE UN BIOSENSOR MICRO DISEÑO Y DESARROLLO DE UN BIOSENSOR MICRO

ELECTROMECÁNICO PARA DETERMINAR LA AUSENCIA O ELECTROMECÁNICO PARA DETERMINAR LA AUSENCIA O ELECTROMECÁNICO PARA DETERMINAR LA AUSENCIA O ELECTROMECÁNICO PARA DETERMINAR LA AUSENCIA O

PRESENCIA DE DIVERSOS TIPOS DE PESTICIDAS EN HORTALIZAS PRESENCIA DE DIVERSOS TIPOS DE PESTICIDAS EN HORTALIZAS PRESENCIA DE DIVERSOS TIPOS DE PESTICIDAS EN HORTALIZAS PRESENCIA DE DIVERSOS TIPOS DE PESTICIDAS EN HORTALIZAS

DEL ESTADO DE GUANAJUATODEL ESTADO DE GUANAJUATODEL ESTADO DE GUANAJUATODEL ESTADO DE GUANAJUATO

DISEÑO Y DESARROLLO DE UN BIOSENSOR MICRO DISEÑO Y DESARROLLO DE UN BIOSENSOR MICRO DISEÑO Y DESARROLLO DE UN BIOSENSOR MICRO DISEÑO Y DESARROLLO DE UN BIOSENSOR MICRO ELECTROMECÁNICO PARA DETERELECTROMECÁNICO PARA DETERELECTROMECÁNICO PARA DETERELECTROMECÁNICO PARA DETERMINAR LA AUSENCIA O MINAR LA AUSENCIA O MINAR LA AUSENCIA O MINAR LA AUSENCIA O

PRESENCIA DE DIVERSOS TIPOS DE PESTICIDAS EN HORTALIZAS PRESENCIA DE DIVERSOS TIPOS DE PESTICIDAS EN HORTALIZAS PRESENCIA DE DIVERSOS TIPOS DE PESTICIDAS EN HORTALIZAS PRESENCIA DE DIVERSOS TIPOS DE PESTICIDAS EN HORTALIZAS DEL ESTADO DE GUANAJUATODEL ESTADO DE GUANAJUATODEL ESTADO DE GUANAJUATODEL ESTADO DE GUANAJUATO

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PARTICIPANTES DEL PROYECTOPARTICIPANTES DEL PROYECTOPARTICIPANTES DEL PROYECTOPARTICIPANTES DEL PROYECTO Miguel Ángel Guzmán AltamiranoMiguel Ángel Guzmán AltamiranoMiguel Ángel Guzmán AltamiranoMiguel Ángel Guzmán Altamirano – prototipo y planos de fabricación Javier Gustavo Cabal VelardeJavier Gustavo Cabal VelardeJavier Gustavo Cabal VelardeJavier Gustavo Cabal Velarde – Datos de la simulación y el prototipo final, así como los planos de fabricación Nicolás Ortega MirandaNicolás Ortega MirandaNicolás Ortega MirandaNicolás Ortega Miranda – Datos de la caracterización, el diseño del biosensor. Akira Torreblanca PonceAkira Torreblanca PonceAkira Torreblanca PonceAkira Torreblanca Ponce – Información relevante sobre insecticidas y su caracterización, curva de calibración de los estándares, datos de la caracterización, reportes técnico, parcial y final. Isairis Guadalupe Ventura CabreraIsairis Guadalupe Ventura CabreraIsairis Guadalupe Ventura CabreraIsairis Guadalupe Ventura Cabrera – Tesista – (Titulada ) César Augusto Linares LópezCésar Augusto Linares LópezCésar Augusto Linares LópezCésar Augusto Linares López – Residencias Profesionales (terminado) María Carmen Vela SantoyoMaría Carmen Vela SantoyoMaría Carmen Vela SantoyoMaría Carmen Vela Santoyo – Tesista – Modalidad proyecto de Investigación (tesis terminada en proceso de titulación una vez terminada la residencia profesional) Ana Bertha Ana Bertha Ana Bertha Ana Bertha Flores DomínguezFlores DomínguezFlores DomínguezFlores Domínguez - Tesista – Modalidad proyecto de Investigación (tesis terminada en proceso de titulación una vez terminada la residencia profesional)

1

RESUMENRESUMENRESUMENRESUMEN

Consiste en diseñar un prototipo de biosensor portátil y de tamaño reducido a base

de micro electrodos utilizando la tecnología de sistemas micro electromecánicos

para determinar insecticidas, pesticidas y productos químicos utilizados para el

combate de plagas y enfermedades que pudiera presentar el cultivo de fresa, con el

fin de determinar de manera rápida e in situ la presencia o ausencia de dichos

compuestos lo que le permitirá tanto al productor como al empacador conocer el

estado de su producto en cuanto a inocuidad se refiere, y de esta manera

determinar si el producto cuenta con la calidad fitosanitaria necesaria y cumple con

las normas nacionales e internacionales; evitando con esto costos por procesamiento

y embarque de fruta contaminada con las consecuencias legales y económicas que

esto conllevaría.

2

ANTECEDENTESANTECEDENTESANTECEDENTESANTECEDENTES

Un pesticida es cualquier sustancia o mezcla de sustancias, natural o sintética,

formulada para controlar o repeler cualquier peste que compita con los humanos

por comida, destruya propiedades, y distribuya enfermedades. El termino peste

incluye insectos, mamíferos y microbios, entre otros.

La industria alimentaria es uno de los de los sectores que requiere de un control

de calidad más estricto, evaluando la composición y frescura de los alimentos, por

lo que se necesita una instrumentación capaz de realizar análisis en el menor

tiempo y a bajo coste.

La innovación y el desarrollo de la industria agroalimentaria recogen la necesidad

de desarrollar e implantar sistemas de control encaminados a aumentar la

seguridad y la calidad de los alimentos y a mejorar los sistemas de trazabilidad.

Esto es, el desarrollar e implementar métodos moleculares de análisis, detección y

diagnóstico que permitan el rastreo automatizado de agentes que amenacen la

inocuidad de de los alimentos. [González, et. al. 2005]

En los últimos años el desarrollo de biosensores ha tenido un gran avance no solo

en el área de la biomedicina sino también en el sector medioambiental y en el

agroalimentario. En la actualidad los biosensores son fuertes herramientas de

análisis con numerosas aplicaciones en la industria agroalimentaria (análisis de la

composición de los alimentos, detección de compuestos contaminantes,

pesticidas, alérgenos, antinutrientes, toxinas y microorganismos patógenos)

basándose en instrumentos de biotecnología.

Los biosensores MEMS al poder transformar propiedades fisicoquímicas en

señales eléctricas y a las características que poseen, los convierten en muy

buenas opciones para competir en el sector agroalimentario con otras tecnologías;

son específicos, altamente sensibles, alto desempeño, bajo consumo de energía,

3

a sus dimensiones, confiabilidad, analizan en corto tiempo, y a su facilidad de

automatización.

La fresa es uno de los frutos altamente apreciados en el mundo por su sabor y por

su riqueza en vitaminas y minerales; además es un producto que tiene una amplia

posibilidad de utilización industrial en la obtención de diferentes productos como

mermeladas, purés, concentrados, helados, etc. El cultivo de la fresa es muy

importante en el estado de Guanajuato, principalmente porque es un producto de

exportación. La fresa mexicana es una hortaliza que tiene más de cuatro décadas

abasteciendo al mercado norteamericano, cuyos consumidores la demandan cada

vez más como complemento de alimentos que se industrializan de manera fresca

y congelada en aquella nación.

Con el propósito de lograr una determinación rápida e in situ de pesticidas en

cultivos de fresa se pensó en el desarrollo del presente biosensor micro-electro-

mecánico que se pretende proteger por medio de la presente solicitud, se trata de

un dispositivo macro tipo peine macro del electrodo del biosensor, detectará bajo

la técnica espectroscopia de impedancias, la permitividad dieléctrica de fresas sin

residuos y la de fresas con residuos de los diferentes tipos de pesticidas. El

biosensor diseñado en el CIDEMYNT bajo la tecnología MEMS podrá determinar

in situ, la presencia o ausencia de diversos tipos de pesticidas utilizados para el

combate de plagas y enfermedades en los cultivos de fresa que son sembradas

bajo condiciones controladas.

Un biosensor se define como un dispositivo compacto de análisis que incorpora un

elemento de reconocimiento biológico (ácido nucleíco, enzima, anticuerpo,

receptor, tejido, célula) o biomimético (PIMs, aptámeros, PNAs) asociado a un

sistema de transducción que permite procesar la señal producida por la interacción

entre el elemento de reconocimiento y el analito. [González, 2005]

El primer biosensor fue un analizador de glucosa desarrollado por Clark y Lyons

en 1962 y comercializado a partir de 1975 por Yellow Springs Instrument

4

Company. Este biosensor se denominó “enzyme electrode” y consistía en una

enzima glucosa oxidasa acoplada a un electrodo para oxígeno. La enzima oxida la

glucosa y como consecuencia se produce un descenso proporcional de la

concentración de oxígeno en la muestra, que es detectado por el electrodo.

[González, 2005]

Guilbault y Montalvo (1969) detallaron el primer electrodo enzimático

potenciométrico basado en la inmovilización de la enzima ureasa sobre un

electrodo selectivo de amonio. [Castro, 2007]

En 1973, Guibault y Lubrano, desarrollaron un nuevo tipo de biosensor de primera

generación basado en la oxidación del agua oxigenada generada por la reacción

enzimática H2O2 O2 + 2H+ + 2e-. [Gonzalo, 2006]

En 1975, Guibault desarrolló el primer biosensor para la determinación de fosfatos,

basado en los enzimas Fosfatasa alcalina y Glucosa oxidasa. Debido a que la

detección de fosfatos precisa medidas inferiores a ppb, en los últimos años se han

desarrollado dispositivos capaces de alcanzar un menor límite de detección.

[Gonzalo, 2006]

Los organofosfatos y carbamatos son utilizados comúnmente en agricultura como

insecticidas, pese a su toxicidad. Bernabei et. al. Desarrollaron un biosensor para

la determinación de estos compuestos, basados en la inhibición de la

acetilcolinesterasa. [Gonzalo, 2006]

En el año1977 Karube desarrolló el primer sensor construido con un electrodo de

oxígeno y una membrana impregnada con la levadura T. cutaneum. [Ortega, 2006]

En 1991 se desarrollo un biosensor que determinaba los ácidos grasos libres

presentes en la mantequilla y responsables de causar malos olores en estos

productos. Este biosensor estaba acoplado con un sistema automático de análisis

5

por inyección de flujo que utilizaba un reactor de butirato kinasa inmovilizada. De

esta forma se conseguía la detección de los ácidos butíricos, propiónico, valérico

con una precisión de 300 ppm a un ritmo de 15 muestras/h.

En muchos cultivos se utilizan insecticidas, pesticidas y diversos productos

químicos en el control de enfermedades y plagas, la aplicación de estos esta

restringida o prohibida debido a los residuos que dejan en el producto y que son

dañinos a la salud humana. El cuidado de que los productos se encuentren libres

de pesticidas o insecticidas es responsabilidad de todos los eslabones de la

cadena de valor del producto, desde el productor hasta el minorista. En la cadena

de distribución de hortalizas hay diversos eslabones, en primer lugar el

comercializador en campo, esta persona compra el producto directamente a los

productores para su comercialización, es encargado de los gastos de la cosecha y

empaque, en segundo termino se encuentran los distribuidores mayoristas, y las

procesadoras, a partir de estos las frutas y verduras pueden ser distribuidas,

exportadas y comercializadas de varias formas. En la etapa anterior el

comercializador, la empacadora o congeladora debe tener certidumbre de que el

producto que esta comprando no esta contaminada o tiene residuos de productos

que pudieran arriesgar a la salud humana, actualmente se toman muestras en

dinámica del mercado, un producto contaminado o con residuos peligrosos podría

encontrarse en la mesa de los consumidores para la fecha en que se tienen los

resultados del laboratorio, por ello es de suma importancia un método de

detección rápida y confiable de la presencia de pesticidas o químicos prohibidos.

Cultivo de fresa

La fresa es uno de los frutos altamente apreciados en el mundo por su sabor y por

su riqueza en vitaminas y minerales; además es un producto que tiene una amplia

posibilidad de utilización industrial en la obtención de diferentes productos como

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mermeladas, purés, concentrados, helados, etc. El cultivo de la fresa es muy

importante en el estado de Guanajuato, principalmente porque es un producto de

exportación. La fresa mexicana es una hortaliza que tiene más de cuatro décadas

abasteciendo al mercado norteamericano, cuyos consumidores la demandan cada

vez más como complemento de alimentos que se industrializan de manera fresca

y congelada en aquella nación. Los estados de Guanajuato, Michoacán y Baja

California son los mayores productores nacionales y son también los principales

exportadores. [Ortega, 2006] Las plantas de fresa son atacadas por varias

enfermedades producidas por virus, hongos o bacterias, así como por plagas que

limitan su rendimiento y afectan la calidad del fruto. Situación que en ocasiones

tiende a agravarse debido a que en las zonas productoras no existe un programa

regular de asistencia técnica, lo que da origen al uso indiscriminado de pesticidas,

con la consecuente contaminación del ambiente y de los productos que se

destinan para el consumo fresco. [Guevara, et. al. 2004]

Plaguicidas

Los plaguicidas, también denominados pesticidas, son sustancias químicas

desinadas a prevenir, atrasar, repeler o combatir cualquier plaga.

La mayoría de los pesticidas están hechos para seleccionar ciertos organismos y

todos intervienen en el bloqueo de algunos procesos metabólicos, sin embargo es

difícil determinar el modo de acción y en algunos casos no se conoce, debido a

que ciertos insecticidas pueden presentar más de un modo de acción lo cual a su

vez dificulta su clasificación. El modo de acción se puede definir como la

respuesta bioquímica y fisiológica de los organismos que está asociada con la

acción de los pesticidas. Esta respuesta no necesariamente envuelve el principal

modo de acción, la reacción metabólica enzimática simple puede ser afectada a

dosis bajas como ninguna otra respuesta metabólica enzimática, en la primera

reacción efectuada a dosis bajas. [RESPYN, 2006]

7

Clasificación de Insecticidas

Los grupos de pesticidas más conocidos son: Organoclorados, Organofosforados,

Organonitrogenados, Carbamatos y Piretroides. A continuación se muestra una

tabla con la clasificación de los insecticidas de acuerdo al grupo que pertenecen:

ORGANOFOS

FORADOS

ORGANONITR

OGENADOS

PIRETROIDE

S

ORGANOCL

ORADOS

CARBAMATO

S

Armine Ametrina Deltametrina Aramite Aldicarb

Azinfos metílico Anilazina Fenotrina BHC Benlate

Demetón Atrazina Permetrina Bifentrina Carbaril

Clorpirifos Benomilo Resmetrina Captafol Carbofurano

Fentión Carbarilo Zeta -

Cipermetrina

Captan Dimetan

Fenamifos Carboxin Carbofurán Dimetilan

Disulfotón Esbiol Clofentizina Isolan

Malatión Leptofos Clordano Methiocarb

Diazinón Mefenoxam Clorodimefor

m

Metomil

DFP Mefosfolan Dicofol Pirimicarb

Diclorvós Metalaxil Dieldrín Propoxur

Difonato Metomilo DDT Pyramat

Dimetoato Metribuzin Endosulfan Pyrolan

Forato Prometrina Endrina Zectran

Maraoxón Propanil Heptacloro

Mevinfos Propazina L-

Cyhatotrina

Naled Terbutrina Metoxicloro

Paraoxón Tetrametrina Mirex

Paratión

metílico

Tetrasul

Temefós Toxafeno

8

TEPP Vinclozolin

Tionacin

Tabla 1. Clasificación de los diferentes insecticidas

- Organoclorados

Son sustancias apolares y lipofílicos que conllevan poca reactividad química. Este

grupo se caracteriza por presentar átomos de carbono, hidrógeno, cloro y en

ocasiones oxígeno en su molécula, a la vez contienen anillos cíclicos y

heterocíclicos de carbono. Los organoclorados se dividen en tres grupos desde el

punto de vista de mecanismos de resistencia: a) DDT y sus derivados, b) Grupo

del Benceno y c) Grupo de ciclodienos. [RESPYN, 2006]

Fig. 8 Ejemplos de pesticidas Organoclorados

9

Cyhalotrina

Nombre: Lambda cyhalothrin

Nombre químico: α – ciano – 3 – fenoxibencil 3 – (2 – cloro – 3, 3, 3 –trifluoroprop

– 1 – enil) – 2, 2 – dimetil ciclopropano carboxilato, a 1:1 de los isómeros (Z) – (1R

– 3R), s – ester y (z) – (1S – 3S), R – ester.

Fórmula: C23 H19 ClF3 NO3

Peso molecular: 449.85g/mol

Solubilidad: insoluble en agua

Es poco soluble en agua. Se

hidroliza rápidamente a pH 9 en

7 días. El tiempo de vida media

en el agua es de 20 días.

Organofosforados

Los plaguicidas organofosforados son ésteres del ácido fosfórico, con los OH

esterificados con diferentes radicales orgánicos. [13 Bioquímica ambiental]

Con enlace P-O fosfato

Con enlace P-S fosfotiolato

Con enlace P-C fosfonato,

Con enlace P-N fosforamido

10

Cuando en los ésteres de fostato, el O es sustituido por S tenemos los

compuestos fosfotiolato, cuando existe un enlace P-N son fosforamido y cuando

hay un enlace P-C tenemos fosfonatos. Todos ellos tienen actividad biológica

similar, son inhibidores de la acetilcolinesterasa. [13 Bioquímica ambiental]

Fig. 9 Ejemplos de pesticidas Organofosforados

La mayoría de los organofosforados actúan como insecticidas de contacto,

fumigantes y de acción estomacal, pero también se encuentran materiales

sistémicos, que cuando se aplican

al suelo y a las plantas son

absorbidos por hojas, tallos,

corteza y raíces, circulan en la

savia haciéndola tóxica para los

insectos que se alimentan al

succionarla. [RESPYN, 2006]

Diazinón

Nombre: diazinon

11

Nombre químico: 0,0 – dietil 0 – (- 2 –

isopropil – 4 – metil 6 –

pirimidinilfosforotioato)

Formula: C12 H21 N2 O3 PS

Peso molecular: 304.346g/mol

Malatión

Nombre: malathion

Nombre químico: 0,0 dimetil fosforoditioato de dietil mercaptosuccinato

Fórmula: C10 H19 O6PS2

Peso molecular: 330.358g/mol

El malatión es un insecticida organofosforado, de toxicidad baja en muchos

mamíferos, siendo por el contrario muy efectivo como insecticida para una gran

variedad de insectos y ácaros. Es muy utilizado en la agricultura especialmente

como plaguicidas de contacto (insecticida y acaricida), para combatir insectos

succionadores en cultivos comerciales, tales como frutales, floricultura, verduras,

plantas ornamentales y arbustos. Controla igualmente plagas caseras y parásitos

12

externos de los animales domésticos, tales como pulgas, garrapatas, y hormigas.

[Peñuela, ] En el cuerpo de los animales el malatión se degrada dentro de las 24

horas y es expulsado por vía urinaria (esto se demostró en ensayos con gallinas y

vacas, OMS, 1983). El tiempo medio para la descomposición química en el agua

(pH = 7,4 a 20°C) es de unos 11 días y depende del pH (hidrólisis lenta con pH<7

y más acelerada con pH>7).

Piretroides

El grupo de los piretroides ha recibido mucha atención debido a su baja toxicidad

para mamíferos, casi nula acumulación en el medio ambiente y gran utilidad como

alternativa en el combate de plagas agrícolas. Desafortunadamente, a pesar de

que sólo se han autorizado un número reducido de piretroides, ya se han

registrado casos de resistencia en campo y laboratorio. [RESPYN, 2006]

Este grupo de compuestos se ha sintetizado al usar como base la estructura

química de las piretrinas naturales, con las que comparten algunas características

toxicológicas. Las piretrinas y piretroides aumentan su actividad insecticida a bajas

temperaturas, esto significa que presentan un coeficiente negativo de temperatura,

junto al DDT. [RESPYN, 2006]

Fig 10. Ejemplo de pesticida piretroide

13

Deltametrina

Nombre: deltamethrin

Nombre químico: (S)-α-ciano-3-fenoxibencil (1R,3R)-3-(2,2-dibromovinil)-2,2-

dimetil ciclopropanocarboxilato

Fórmula: C22 H19 Br2 NO3

Peso molecular: 505.2g/mol

Solubilidad: insoluble en agua

En 1974 la Roussel Uclaf

produjo, en Francia, la

deltametrina, que actúa a bajas

concentraciones sobre los

insectos y es muy poco tóxico para los mamíferos. La deltametrina es un piretroide

insecticida que aniquila a los insectos por contacto directo o ingestión.

[Deogracias, ] La deltametrina inyectada al agua tiene una vida media de 5-60 días

y gran parte de su desaparición se debería al fenómeno de sedimentación.

Hidrólisis. La deltametrina es un compuesto sumamente resistente a la hidrólisis

en medio ácido. Pero en medios alcalinos, el fenómeno es un importante factor de

degradación.

Zeta - Cipermetrina

Nombre: cypermethrin

14

Nombre químico: α – ciano - (3 – fenoxifenil) metil (+) cis – trans 3 – (2,2 –

dicloroefenil) – 2 – 2 – dimetil ciclopropano carboxilato

Fórmula: C22 H19 Cl2 NO3

Peso molecular: 416.3g/mol

Solubilidad: insoluble en agua

La cipermetrina es altamente estable en la luz y a temperaturas inferiores a 220°C.

es mas resistente en medio ácido que en medio alcalino, con una estabilidad

óptima al pH 4. La cipermetrina tiene mayor actividad insecticida y es un poco más

tóxica a mamíferos.

15

Organonitrogenados

Fig 11. Ejemplo de pesticida Organonitrogenados

Metalaxil

Nombre: metalaxyl

Nombre químico:

Fórmula: C15 H21 NO4

Peso molecular: 279.332g/mol

Solubilidad: insoluble en agua

El Metalaxil es susceptible a la fotólisis en suelo. En el agua se solubiliza

fácilmente y no se espera que se adsorba a los sólidos suspendidos y sedimentos;

sin embargo, persiste por un tiempo relativamente largo (vida media mayor a 4

semanas). Su potencial de bioconcentración en organismos acuáticos es bajo.

Este plaguicida puede ser absorbido por las plantas a través de sus hojas y tallos.

16

Los insecticidas pueden ser detectados en alimentos y muestras ambientales por

una variedad de métodos de detección cromatográficos estándar, tal como HPLC,

GC-MS, o ensayos espectrofotométricos que están basados en la inhibición de

colinesterasa. Los sistemas cromatográficos son capaces de detectar estos

componentes en matrices complejas con alta sensibilidad. Los biosensores han

sido construidos con el propósito de detectar organofosfato y carbamato usando

colinesterasa como un elemento bioanalítico en combinación con transductores

potenciométricos, amperométricos o piezoeléctricos. [Bachmann, et. al. 2000]

17

JUSTIFICACIÓN

Las empresas del estado de Guanajuato exportaron en el 2006 más de 7,5 mil

millones de dólares. El sector agroalimentario por el valor de sus exportaciones

totales (377 millones de dólares) se encuentra en tercer lugar después del sector

automotriz (5,3 mil millones de dólares) y del sector de aparatos electrodomésticos

(552 millones de dólares); que junto con el sector textil y de confección (345

millones de dólares) representan el 83% de las exportaciones del estado. Las

exportaciones de productos del sector agroalimentario a los Estados Unidos, estos

datos sirven para dar una idea de la importancia del sector agroalimentario para la

economía de Guanajuato, de la participación del mercado estadounidense en las

exportaciones Guanajuatenses de alimentos y en particular de las exportaciones

de hortalizas y legumbres. La ley eleva el nivel de exigencia, para los

exportadores en general incluyendo a los mexicanos, esto implica mantener y

superar el nivel de posicionamiento y calidad de nuestros productos. Si un

importador, dueño o consignado no responde a un aviso de retención, o no

convence a la administración de drogas y alimentos (FDA) o al departamento de

Agricultura de los Estados Unidos (USDA), la FDA emitirá un aviso de rechazo o

bien aduanas rechazará el ingreso, bajo estas circunstancias, aduanas emitirá una

demanda de retorno (en el caso de un rechazo de la FDA) solicitando exportación

o destrucción.

18

HIPÓTESIS

El biosensor MEMS podrá ayudar a determinar la presencia o ausencia de

diferentes insecticidas organoclorados, organonitrogenados organofosforados y

piretrinas en las fresas que son exportadas, disminuyendo así el uso irracional de

este tipo de productos, incrementando la calidad del fruto, disminuyendo el tiempo

de análisis y además de evitar pérdidas económicas al productor.

19

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:

Diseñar un biosensor a base de micro electrodos utilizando la tecnología de

sistemas micro electromecánicos para determinar ausencia o presencia de

insecticidas, pesticidas y productos químicos utilizados para el combate de plagas

y enfermedades que presenta el cultivo de hortalizas (Fresa).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

- Diseñar y simular el biosensor mediante los software MEMS PRO y ANSYS

- Caracterizar el biosensor con los diferentes insecticidas, pesticidas y

fungicidas utilizados para el combate de plagas y enfermedades de las

hortalizas

- Integrar el sistema de adquisición de datos y acondicionamiento de señal.

METAS:

- Contar con una patente que permita a la institución contar con desarrollos

tecnológicos de aplicación industrial real.

- Contar con una publicación en un congreso para dar a conocer este

proyecto.

20

MATERIALES Y MÉTODOS

METODOLOGÍA

1. Búsqueda bibliográfica y estudio del estado del arte de los sistemas de

espectrometría por impedancias, con el cual se hará la determinación de la

ausencia o presencia de insecticidas.

2. Búsqueda bibliográfica y estudio del estado del arte sobre micro eléctrodos

MEMS que emplearan en el sistema de espectrometría por impedancias.

3. Determinación de los insecticidas mas comunes para el control de

enfermedades y plagas en el cultivo de fresas

4. En base al resultado del estudio anterior se realizará la selección del

sistema de espectroscopia de impedancias más adecuado a la aplicación;

así como la selección de la topología de la microestructura a emplear; todo

lo anterior se realizará mediante un análisis matemático y simulación por

computadora.

5. Definidos los sistemas y estructura a desarrollar, se realizaran los planos

del circuito impreso del sistema electrónico de medidor de impedancias.

6. En esta etapa se realizará la simulación mecánica-eléctrica de los

microelectrodos en programas como ANSYS y MEMS PRO

7. Depurada la estructura, se realizará una búsqueda técnica de los procesos

disponibles para su fabricación en tecnología MEMS, tomando en cuenta la

compatibilidad de los materiales empleados para esta aplicación.

8. Desarrollo de los planos de las microestructuras para su fabricación.

9. Fabricación de los prototipos de los microelectrodos y el circuito impreso.

10. Caracterización eléctrica de los microelectrodos.

11. Armado del prototipo del medidor de impedancias.

21

12. Integración del micro electrodo con el medidor de impedancias.

13. Caracterización de los insecticidas (puros) con el sensor de insecticidas.

14. Caracterización de los insecticidas en el fruto (fresa) con el sensor de

insecticidas.

15. Revisión y análisis de resultados.

16. Rediseño y ajustes del micro electrodo y el sistema de espectroscopia de

impedancias, de ser necesario.

17. Pruebas de caracterización finales.

18. Armado del prototipo final

19. Entrega de resultados y documentación del proyecto.

RESULTADOS

Selección de insecticidas

Una de las etapas previas para empezar la caracterización del sensor MEMS es la

selección de un número determinado de pesticidas a estudiar atendiendo a que

son los más utilizados en los cultivos de la región.

Los productos más utilizados actualmente para el control de las plagas y

enfermedades en los cultivos de hortalizas y fresa son los que se muestran en la

tabla 1. Los pesticidas que se encuentran en negritas son los que se han

seleccionado para realizar la caracterización del sensor MEMS.

Algunos de los pesticidas que se seleccionaron se encuentran prohibidos debido a

las daños que causan, se selecciona, el malatión ya que hay personas que a

pesar de que algunos pesticidas están restringidos los siguen manejando.

Se puede observar en la tabla 1 que los pesticidas más utilizados pertenecen a

diferentes campos de aplicación tales como insecticida (Zeta-cipermetrina,

Deltametrina, Cyhalotrina, Diazinon, Malatión), Acaricida (Zeta-cipermetrina,

22

Deltametrina, Diazinon, Malatión), Fungicida (Metalaxil) y además de encontrarse

en las diversas familias tales como: Organofosforados, organonitrogenados,

organoclorados y piretrinas.

De acuerdo a lo consultado en la bibliografía y considerando los insecticidas que

más comúnmente utilizan los productores de fresas (datos proporcionado por

Hidroponia Fresas A.C.) se enlista los insecticidas que serán caracterizados por

medio del sistema de espectrometría de impedancias, habiendo entre ellos

organofosforados, organonitrogenados, organoclorados y piretroides. Y los cuales

son los siguientes:

- Malatión

- Cyhalotrina

- Metalaxil

- Deltametrina

- Zeta- Cipermetrina

- Diazinón

- Vita

Otro de los puntos importantes a resaltar en esta lista es que debido a que

Hidroponia fresas nos proporcionaría los insecticidas utlizamos los enlistados ya

mencionados, por tal motivo no se hizo un análisis estadístico, para

seleccionarlos, además de que durante las platicas sostenidas con Hidroponia

fresas, es con estos insecticidas con los que ellos tienen mayor problema y los

cuales serían útiles de determinar mediante el uso de tecnologías MEMS.

Anteriormente se habían presentado avances sobre el diseño de un sistema de

control de bajo consumo de energía para el sensor de contaminación de

aisladores que actualmente se encuentra en etapa de caracterización y prueba; en

23

el presente reporte se muestra los avances relativos sobre otra aplicación la cual

requiere de bajo consumo de energía, que es un medidor de impedancias basado

en microcontroladores; que será utilizado como soporte de biosensores con

tecnología MEMS; el cual se describe a continuación.

El sistema cuenta con un microcontrolador (MCU1), el cual hará las funciones de

generador de señal para aplicar a la red eléctrica formada por el sensor (C4) y

una resistencia en serie (TMR1); así como también la función de medir la

magnitud y fase de la señal “leída” en el sensor.

Este bloque se puede representarse con el siguiente circuito equivalente,

mostrado en la figura 4.

Figura 4. Circuito equivalente de la red eléctrica del sistema de medidor de

impedancias.

Las señales tanto del generador (MCU), como la del sensor (C1) se aplican, en

primera instancia, a dos comparadores en la etapa del detector de fase (IC5);

que las convierte en señales cuadradas. Los comparadores tienen la

característica de saturar su salida ante la presencia de un diferencial de voltaje en

su entrada por pequeña que esta sea; puesto que las señales están desfasadas al

convertirlas en señales cuadradas, se magnifica el desfasamiento de las misma,

véase figura 4. Posteriormente se pasa esta señal a través de una compuerta Or

exclusiva (IC1), la salida nos dará un pulso cuyo ancho corresponderá al

desfasamiento ente la señal original y la señal del sensor se puede considerar que

la señal es modulada en ancho de pulso por el efecto de desfasamiento entre la

V1

R1

1kΩ

1

C1

2

3

MCU SENSOR

24

señal original y la señal del sensor.. Finalmente esta señal se pasa a través de un

etapa de conversión de frecuencia a voltaje formado por un filtro Sallen Key, cuyo

comportamiento esta dado por 1.

(1)

Donde R=R10=R11, C=C3=C2 y A corresponde a la ganancia del Amplificador

operacional.

La salida de esta etapa es un voltaje proporcional al ancho del pulso de la etapa

previa, indicando el desfasamiento que sufre la señal del sensor por su efecto

capacitivo. Esta señal que se obtiene del sensor se pasa través de un rectificador

de media onda y la convierte en un voltaje DC proporcional a la magnitud de la

señal presente en el sensor.

Las 2 señales obtenidas la etapas descritas anteriormente son leídas por el

microntrolador , el cual cuenta con una etapa de conversión analógica-digital para

su manipulación a través del procesamiento digital, estos serán comparados

con a una base datos que se obtendrá mediante la caracterización del sensor a

la presencia de organofosforados en la fresa.

Como este sistema será también utilizado por otras aplicaciones; como lo es la

detección de insecticidas en pimiento morrón, durante este periodo se logro

obtener la caracterización de la presencia de insecticidas en este fruto utilizando

un barrido de frecuencias de 10 Hz a 100Hz; este trabajo fue realizado en el

marco del 6º. Verano de investigación promovido por CONCYTEG, el cual fue

desarrollado por el Alumno Ricardo Rene Rosales del área de mecatrónica, así

13222

+−+

−=

RCAjCRA

V

V

i

o

)(ω

25

mismo los resultados se presentaron en el congreso del mismo evento. La

importancia de este trabajo radica en el hecho que a partir del estudio; se define

que; las señales eléctricas que debe generar el microcontrolador para obtener

una respuesta que nos permita definir la ausencia o presencia de distintos

compuesto debe de estar en el rango de 10 a 50 Hz.

26

Figura 12. Diagrama esquemático del sistema de medición de impedancias

27

Figura 13.Figura 13.Figura 13.Figura 13.---- Imagen del biosensor a nivel macroImagen del biosensor a nivel macroImagen del biosensor a nivel macroImagen del biosensor a nivel macro Los datos que se obtienen con el electrodo y que se registran mediante el NI ELVIS son correspondientes a la reactancia, resistencia y magnitud, (ver anexo I de las tablas con los valores obtenidos del control y de los extractos), dichos datos se someten a análisis estadístico para validarlos. De este análisis se notó que la reactancia es la única que se puede considerar para determinar la presencia o ausencia de los pesticidas debido a que los otros valores, de acuerdo a la espectroscopia de impedancia, son valores que se mantienen casi constantes. Para observar la tendencia general de los valores eléctricos registrados se hacen análisis estadísticos mediante el software Minitab 14, los parámetros de las variables se analizan con un nivel de significancia de P< 0.05, estos mediante un anova basada en la prueba de Tukey, el nivel de confianza que se emplea es de 95%. Se hacen comparaciones entre los controles, entre el control y los pesticidas, en estos últimos se emplean los datos de la concentración 1 y la concentración 5 y de las diluciones se manejan las concentraciones 1 y 9. Los datos que se obtienen son los siguientes:

28

En el caso de los controles, es decir, los extractos de fresa sin pesticida se obtiene que P de los controles es 0.103<0.05 lo que nos dice que no hay una variación significativa entre los valores de los controles.

Figura 14 Gráfica comparativa de las muestras control

En la gráfica de la figura 14, se puede observar que las curvas de los dos controles diferentes, son muy parecidas y los valores obtenidos son muy similares lo que indica que no hay mucha variación. Esto se confirma con los análisis estadísticos que se realizan en el minitab 14. En la gráfica de la figura 15, en la que se compara el control (fresa sin pesticida) contra la concentración 1 de los diversos pesticidas, se puede observar que la mayoría de los mismos se encuentran separados de los valores que forman la curva control.

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43

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64

71

78

85

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99

10

6

11

3

Rea

ctan

cia

Tiempo (s)

Comparación Controles

Control 1

Control 2

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-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-800

-600

-400

-200

0

1 5 9

13

17

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29

33

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57

61

65

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73

77

81

85

89

93

97

10

1

10

5

10

9

11

3

11

7

Rea

ctan

cia

Tiempo (s)

Control vs Pesticidas

Control

Deltametrina 1

Diazinon 1

Zeta-cipermetrina 1

Metalaxil 1

Malatión 1

L- cyhalotrina 1

Figura 15 Gráfica comparativa entre el control y los diversos pesticidas con concentración 1

Se puede apreciar que la mayoría de los pesticidas a concentración alta, sobre todo el metalaxil, se encuentran más alejados de los valores de la muestra control. También se puede ver que los datos de la lambda cyhalotrina son muy cercanos a los de la muestra control. En la gráfica de la figura 16 se comparan el control contra la concentración más baja de las soluciones concentradas de los pesticidas, en esta se puede observar que ninguno de los valores obtenidos por los pesticidas, coincide con los valores del control. En esta gráfica el comportamiento de la L- cyhalotrina es diferente que cuando se encuentra a mayor concentración, aquí se observa que a menor concentración se encuentra más alejada de los valores de la muestra control, que es lo contrario a lo que ocurre con los demás pesticidas, a menor concentración mas cercanos están a los datos de la muestra control.

30

-2000

-1800

-1600

-1400

-1200

-1000

-800

-600

-400

-200

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49

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65

69

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77

81

85

89

93

97

10

1

10

5

10

9

11

3

11

7

Rea

ctan

cia

Tiempo (s)

Control vs Pesticidas

Control

Deltametrina 5

Diazinon 5

Zeta-cipermetrina 5

Metalaxil 5

Malatión 5

L- cyhalotrina 5

Figura 16 Gráfica comparativa entre el control y los diversos pesticidas con concentración 5

Como se observa en la gráfica de la figura 17, control contra metalaxil, los datos entre ambos son diferentes, por lo que cuando se analizan en el minitab 14, se obtiene que P=0.00<0.05 lo que quiere decir que la variación entre estos si es significativo. Ahora comparando el control con los datos de metalaxil 5, se obtiene que P=0.032 por lo que es menor a 0.05 lo que hace que también con la menor concentración manejada sea significativos los valores. En el caso del malatión sucede lo mismo, cuando se compara el control contra el pesticida malatión, se obtiene que P=0.111 por lo tanto no es significativo. Cuando se comparan los datos del control contra los del malatión 5 se obtiene que son significativos ya que se obtiene que P= 0.001<0.05. Esto se puede observar en la gráfica de la figura 18. Al observar la grafica de la figura 19, del pesticida L- cyhalotrina, se puede observar que la concentración 1 es muy semejante a la del control, pero cuando se compara con la concentración 5 si hay diferencias, esto se comprueba con el siguiente análisis es entre el control y el pesticida L- cyhalotrina 1, el cual nos da que la P= 0.791 es mayor a 0.05, esto no es significativo. Cuando se analizan los datos obtenidos entre el control y L- cyhalotrina 5, el valor de P= 0.00<0.05, por lo tanto los datos son significativos.

31

-2000

-1800

-1600

-1400

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Rea

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cia

Tiempo (s)

Control vs Metalaxil

Control

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-1600

-1400

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1

10

6

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1

11

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Rea

ctan

cia

Tiempo (s)

Control vs Malatión

Control 1

Malatión 1

Malatión 5

Figura 17 Gráfica comparativa del control vs metalaxil

Figura 18 Gráfica comparativa del control vs malatión

Figura 19 Gráfica comparativa del control vs L- cyhalotrina Cuando se compara el control vs zeta-cipermetrina 1 se obtiene que P=0.005<0.05 lo que quiere decir que la variación entre estos si es significativo. Ahora comparando el control con los datos de zeta-cipermetrina 5, se obtiene que P=0.031 por lo que es menor a 0.05 lo que hace que también con la menor concentración manejada sea significativos los valores. Esto se puede observar en la grafica 20 donde se comparan el control con la zeta cipermetrina en sus dos concentraciones.

Figura 20 Gráfica comparativa del control vs zeta-cipermetrina

En el caso de la deltametrina, como se observa en la gráfica de la figura 21. Al hacer los análisis estadísticos del control vs deltametrina 1 se obtiene que P=0.029<0.05 lo cual indica que la variación entre estos es significativa. Al

-2000

-1800

-1600

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-1000

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-600

-400

-200

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1

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6

11

1

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Rea

ctan

cia

Tiempo (s)

Control vs Deltametrina

Control

analizar los datos del control vs deltametrina 5 se obtiene que P=0.485<0.05 lo que indica que estos no son significativas, esto se aprecia en la gráfica.

Figura 21 Gráfica comparativa entre el control y deltametrina

Cuando se compara el control vs diazinón 1 se obtiene que P=0.001<0.05 esto indica que la variación entre estos es significativa. Ahora comparando el control contra el diazinón 5, se obtiene que P=0.043 por lo que es menor a 0.05, lo cual indica que los valores son significativos. Esto se puede observar en la grafica de la figura 22.

Figura 22 Gráfica comparativa del control vs diazinón 1

34

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-700

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3

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9

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5

Rea

ctan

cia

Tiempo (s)

Control vs Deltametrina

Control

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-900

-800

-700

-600

-500

-400

-300

-200

-100

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61

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79

85

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10

3

10

9

11

5

Rea

ctan

cia

Tiempo (s)

Control vs Malatión

Control

Malatión 1

Malatión 9

Para las diluciones se obtienen otras gráficas y datos estadísticos diferentes a las anteriores, además de que las concentraciones que se emplean son mucho más bajas.

Figura 23 Gráfica comparativa entre el control y la deltametrina Al comparar y analizar los datos del control y deltametrina con concentración 1 se obtuvo que los valores no son significativos, al comparar el control con la concentración 9 se obtiene P=0.000<0.05 por lo que si son significativos. Como se aprecia en la gráfica de la figura23.

Figura 24 Gráfica comparativa entre el control y el malatión

Al analizar y comparar los datos del control vs malatión, se obtiene que P=0.000<0.05 los datos son significativos, a la otra concentración los valores no son significativos. Ver gráfica de la figura 24.

Figura 25 Gráfica comparativa entre el control y la zeta – cipermetrina Al analizar y comparar los datos del control vs zeta – cipermetrina, a sus dos diferentes concentraciones, se encontró que en ninguno de los casos se obtienen valores significativos. Esto se puede apreciar en la gráfica de la figura 25

Figura 26 Gráfica comparativa entre el control y L – cyhalotrina

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-1.4E+08

-1.2E+08

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1 8

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22

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64

71

78

85

92

99

10

6

11

3

Rea

ctan

cia

Tiempo (S)

Diazinón

Diazinón 1

Diazinón 9

Al realizar los análisis estadísticos en el minitab 14, como se observa en la gráfica de la figura 26, se obtiene que los datos son significativos P= 0.01<0.05 esto cuando se comparan los datos del control vs cyhalotrina 1, al comparar el control con la cyhalotrina 9, P= 0.004<0.05 lo que hace que también sea significativos. Al realizar la pruebas con las fresas infectadas con los pesticidas metalaxil y diazinón, se emplearon prototipos macro reutilizados, obteniéndose que los datos son incorrectos, ya que al comparar las graficas obtenidas con los datos de las fresas infectadas con las soluciones concentradas deberían de tener la misma tendencia (en el caso del metalaxil) y en el diazinón los valores son extremadamente altos lo que indica que están mal debido a que ni los pesticidas solos alcanzan esos valores.

Figura 271 Gráfica comparativa de metalaxil

Figura 28 Gráfica comparativa de metalaxil

37

Cromatografía de gases A las muestras que se envían al CESAVEG se les hacen pruebas para determinar la presencia de los diferentes grupos de pesticidas que se manejan en este proyecto, este análisis no solo se le hace del grupo de pesticida con el que se infecta sino que se le hacen pruebas para los cuatro grupos. Los grupos que maneja el CESAVEG son los organoclorados, los organofosforados, los piretroides y las triazinas, los límites de los residuos de pesticidas en los que se basan son establecidos por el COFEPRIS, (ver anexo IV de los informes de los resultados obtenidos). Los resultados de los análisis son los siguientes: En el caso de la muestra control, que es fresa sin infectar por pesticida, resulto contener pesticidas como de los grupos organoclorados (endosulfan), organofosforados (malatión) y piretroides (bifentrina), los cuales se encuentran dentro de los límites COFEPRIS. La muestra de malatión con concentración 1, presentó contener pesticidas del grupo de los organoclorados como el endosulfan, metamidofos que resultó ser un plaguicida no autorizado para cultivo de fresa, además de presentar dos compuestos no identificados. La concentración del malatión que se obtuvo fue de 2,55ppm (µg/g). La muestra de diazinón con concentración 1, contenía endosulfán y diazinón, de éste último tenía 0.519ppm (µg/g) el cuál sobrepasa los límites del COFEPRIS. Esta muestra contenía dos compuestos no identificados. La muestra de metalaxil con concentración 1, contenía endosulfán y metalaxil, de acuerdo al COFEPRIS, el metalaxil es un plaguicida autorizado solo para la aplicación en el suelo en los cultivos de fresa. Al igual que en las otras muestras se encontró que había un compuesto no identificado. La concentración que se encontró de metalaxil fue de 8,68 ppm (µg/g). La muestra de deltametrina con concentración 1, no se detecto por este método solo contenía al igual que las muestras ya mencionadas endosulfán. Se cree que esto se debe a que la deltametrina se degrada rápidamente dependiendo del medio en el que se encuentre (ácido o alcalino). Las muestras tanto de malatión, metalaxil, diazinón y deltametrina con concentración 9 de las soluciones diluidas, al ser analizadas, se encontró que contenían endosulfan pertenecientes al grupo de organoclorados, este se encuentra dentro de los límites COFEPRIS, además de que todas las muestras presentaron trazas de compuestos no identificados. Las concentraciones empleadas son muy bajas por lo cual no son detectadas. Ver el anexo XI de las tablas de las concentraciones empleadas en la infección de las fresas.

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Conclusiones Al hacer los análisis estadísticos de los datos obtenidos tanto de reactancia, resistencia y magnitud, es notorio que los dos últimos no son eficaces para que se pueda determinar la presencia o ausencia de los diversos pesticidas en los extractos de fresa, debido a que estos permanecen constantes y las variaciones son mínimas, por lo que se concluye entonces que los datos a considerar son los valores de la reactancia ya que en estos hay una mayor diferencia tanto en presencia como en ausencia de los pesticidas empleados. El análisis estadístico que se realiza mediante la anova nos permite validar los datos, y al ser significativos los valores nos indican que la concentración del pesticida influye a la hora de hacer la caracterización en el prototipo macro del electrodo, esto se ve reflejado en las variaciones que existen entre los datos y su comportamiento mediante las gráficas. Los datos obtenidos aprueban el desarrollo del modelo matemático el cual permitirá el desarrollo de simulaciones sin la necesidad de hacer las pruebas en el laboratorio. El prototipo macro del electrodo demuestra ser más efectivo en concentraciones que van desde 1x 10-3 a 1x 10-7g/ml, para los pesticidas organonitrogenados como el metalaxil, para los piretroides como la deltametrina y zeta- cipermetrina, para los organofosforados como el diazinón y malatión, para el caso de los organoclorados es más eficiente si se encuentra en concentraciones de 1 X10-3 a 1 X 10-17g/ml, aunque para esta última concentración se necesitaría hacer otro tipo de pruebas como una titulación para verificar que la concentración que se dice es real. La tecnología del prototipo macro de electrodo tipo peine, basada en níquel, demuestra que es eficaz para determinar la presencia o ausencia de los diversos pesticidas. Este tipo de material al emplearse varias veces, se desgasta lo que hace posible que el electrodo sea desechable. El prototipo macro del electrodo nos permite realizar análisis sin la necesidad de realizar tratamientos previos a la muestra, de manera rápida y segura, además de que el prototipo al ser pequeño permite que las pruebas se puedan realizar de manera in situ. La técnica que se emplea para realizar el análisis de espectroscopia infrarroja mediante el espectro Perkin Elmer, no es satisfactoria para determinar la presencia de los pesticidas en los extractos de fresa, debido a que los picos de los enlaces presentes en las moléculas de los pesticidas no son muy marcados e incluso algunos de ellos no aparecen. Esto se debe a que al extracto se le debe hacer una purificación previa para eliminar las sustancias que puedan interferir en el análisis, y una vez que la muestra es purificada ya se le puede hacer el análisis en el espectro infrarrojo. En el análisis de los extractos de fresa por cromatografía de gases se comprueba que si existe la presencia del pesticida.

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Perspectivas Las principales perspectivas para este proyecto serían continuar las caracterizaciones con el electrodo tipo peine del biosensor a nivel micro para determinar si los datos que se obtienen tienen los mismos parámetros que a nivel macro con los extractos de fresa y con los diversos pesticidas. Adaptar el biosensor para hacerlo tipo pluma y portátil, además de que las pruebas se realicen “in situ”, lo que permitiría hacer que la parte del micro electrodo sea desechable.

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43

ANEXOSANEXOSANEXOSANEXOS

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