Diseño de Primers
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Universidad Nacional Auto noma de Me xico Facultad de Estudios Superiores Cuautitla n
Asesoras:
M. en C. Maritere Domnguez Rojas
p.BQD Larisa Andrea Gonzlez Salcedo
Bioinformtica
Grupo: 2001
Flo
res
Rey
es J
osi
ff S
am
uel
20
14
Dis
e
o d
e P
rim
ers
, Mu
ltiP
lex
, O
lig
oa
na
lize
r y
Eje
rcic
ios.
-
Primer-BLAST
Seleccionando la secuencia de mRNA CDS completo del gen CTLA4 en la especie
H. sapiens.
Homo sapiens CTLA4 (CTLA4) mRNA, complete cds GenBank: AF414120.1
GenBank Graphics
>gi|15778585|gb|AF414120.1| Homo sapiens CTLA4 (CTLA4) mRNA, complete
cds
CTTCTGTGTGTGCACATGTGTAATACATATCTGGGATCAAAGCTATCTATATAAAGTCCTTGATTCTGTG
TGGGTTCAAACACATTTCAAAGCTTCAGGATCCTGAAAGGTTTTGCTCTACTTCCTGAAGACCTGAACAC
CGCTCCCATAAAGCCATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCTACCAGGA
CCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGCAATGCACGTGGCCCA
GCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAA
GCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCT
ACATGATGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCCAGTGGAAATCAAGT
GAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTGGAGCTCATGTAC
CCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGATCCAGAACCGTGCCCAG
ATTCTGACTTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCAGTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCAC
AGCTGTTTCTTTGAGCAAAATGCTAAAGAAAAGAAGCCCTCTTACAACAGGGGTCTATGTGAAAATGCCC
CCAACAGAGCCAGAATGTGAAAAGCAATTTCAGCCTTATTTTATTCCCATCAATTGAGAAACCATTATGA
AGAAGAGAGTCCATATTTCAATTTCCAAGAGCTGAGGCAATTCTAACTTTTTTGCTATCCAGCTATTTTT
ATTTGTTTGTGCATTTGGGGGGAATTCATCTCTCTTTAATATAAAGTTGGATGCGGAACCCAAATTACGT
GTACTACAATTTAAAGCAAAGGAGTAGAAAGACAGAGCTGGGATGTTTCTGTCACATCAGCTCCACTTTC
AGTGAAAGCATCACTTGGGATTAATATGGGGATGCAGCATTATGATGTGGGTCAAGGAATTAAGTTAGGG
AATGGCACAGCCCAAAGAAGGAAAAGGCAGGGAGCGAGGGAGAAGACTATATTGTACACACCTTATATTT
ACGTATGAGACGTTTATAGCCGAAATGATCTTTTCAAGTTAAATTTTATGCCTTTTATTTCTTAAACAAA
TGTATGATTACATCAAGGCTTCAAAAATACTCACATGGCTATGTTTTAGCCAGTGATGCTAAAGGTTGTA
TTGCATATATACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTTTAATTTGA
TAGTATTGTGCATAGAGCCACGTATGTTTTTGTGTATTTGTTAATGGTTTGAATATAAACACTATATGGC
AGTGTCTTTCCACCTTGGGTCCCAGGGAAGTTTTGTGGAGGAGCTCAGGACACTAATACACCAGGTAGAA
CACAAGGTCATTTGCTAACTAGCTTGGAAACTGGATGAGGTCATAGCAGTGCTTGATTGCGTGGAATTGT
GCTGAGTTGGTGTTGACATGTGCTTTGGGGCTTTTACACCAGTTCCTTTCAATGGTTTGCAAGGAAGCCA
CAGCTGGTGGTATCTGAGTTGACTTGACAGAACACTGTCTTGAAGACAATGGCTTACTCCAGGAGACCCA
CAGGTATGACCTTCTAGGAAGCTCCAGTTCGATGGGCCCAATTCTTACAAACATGTGGTTAATGCCATGG
ACAGAAGAAGGCAGCAGGTGGCAGAATGGGGTGCATGAAGGTTTCTGAAAATTAACACTGCTTGTGTTTT
TAACTCAATATTTTCCATGAAAATGCAACAACATGTATAATATTTTTAATTAAATAAAAATCTGTGGTGG
TCGTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
-
Se introdujo la secuencia en aparatado de Primer-BLAST donde se mostr
primeramente el rango de la secuencia nucleotdica.
Al dar clic en Search summary se muestran los parmetros con los que se especific
la bsqueda de cada cebador propuesto a continuacin. Como se pareca se
revisaron 310,279 blast para obtener los mejores cebadores de la secuencia.
Formato Graphics de los primeros 5 primers obtenidos, la secuencia en azul es la
regin que se reproducir del gen, al selecciona uno se desliza hacia su informacin
especfica que se mostrara a continuacin.
-
Primer par de primers propuestos, se aprecia su informacin en una tabla de fcil
lectura, estos datos se deben de analizar para determinar el de mejor eleccin.
Tabla de los 5 primeros Primers que proporciona Primer-BLAST, tambin se
muestran sus respectivas caractersticas, de rojo las secuencias que se deben de
evitar en los primers para evitar estructuras secundarias, y de verde las bases que
se deben de buscar para brindar estabilidad en este extremo.
Primers Secuencia 3-5 Cadena molde
Longitud
Start Stop
Tm CG%
Autocomplemntaridad Homodimeros
Autocomplemntaridad Heterodimeros
Longiotud del producto
Forward Reverse
TGAAGACCTGAACACCGCTC CGCACAGACTTCAGTCACCT
Plus Minus
20 20
126 413
145 394
59.97 59.97
55 55
2 6
1 1
228
Forward Reverse
AGGTGACTGAAGTCTGTGCG
GGCTGTGCCATTCCCTAACT Plus Minus
20 20
394 1132
413 1113
59.97 60.03
55 55
6 3
2 1
739
Forward Reverse
CTGAAGACCTGAACACCGCT ATCATGTAGGTTGCCGCACA
Plus Minus
20 20
125 427
144 408
59.97 60.04
55 50
2 5
2 3
303
Forward Reverse
AGTTAGGGAATGGCACAGCC
CTGCTGCCTTCTTCTGTCCA Plus Minus
20 20
1113 1837
1132 1818
60.03 59.96
55 55
3 3
3 2
725
Forward Reverse
TGTGCGGCAACCTACATGAT CATGAGCTCCACCTTGCAGA
Plus Minus
20 20
408 557
427 538
60.04 60.04
50 55
5 6
3 2
150
Para seleccionar el mejor Primer se deben de considerar aquel par que cumpla la
mayora o las mejores condiciones, los parmetros Start y Stop nos indican la
localizacin de los primers forward y reverse y es importante ver si entre estos se
encuentra la regin especifica del gen a amplificar; la direccin de la cadena molde
cuando es positiva nos indica que la secuencia va de 3 a 5 y negativo es de 5 a
3. Asi como la estabilidad de las cadenas en el extremo 5 y no en 3, recordando
que la estabilidad esta conferida por la cantidad de C y G debido a que requieren
una mayor energa para su separamiento. Este anlisis es sencillo a comparacin
del posterior con Oligo analyzer. Otros aspectos a considerar se resumen en la
siguiente tabla.
-
Longitud ideal de 20 a 25 nucletidos
Cualquiera de los primers mostrados en la tabla cumple con las condiciones de longitud.
Porcentaje de G/C entre 40% y 60%.
Todos entran dentro del rango oscilando en un contenido del 50%
La diferencia entre la temperatura a la que se abren las cadenas de DNA (55Tm75), de los primers forward y reverse no debe de ser mayor a 5C.
Todos presentan Tm muy similares donde su diferencia es de dcimas.
No se deben formar regiones 2 internas (Mientras menor sea la autocomplementaridad mayor probabilidad de formar estructuras secundarias) mientras que a mayor complementariedad en 3 indica la probabilidad del emparejamiento de los primers.
Las energas libres de Gibbs de Autocomplementaridad son mayores a 2 por lo que no se llevan a cabo reacciones espontaneas para la formacin de estructuras secundarias, al igual que la complementariedad en 3 son mayores que 1, y nos indica que no reaccionan los primers entre s.
Regin 5ms estable Todas presentan guanina y citosinas en el extremo 5, confirindole estabilidad, sin embargo los ms estables son los pares 1 y 4.
Evitar ms de 3 bases C o G seguidas en extremo 3
En los primeres 1 y 2 se presentan 3 bases seguidas de GC lo que no es conveniente, al igual que en el 5 que no estn l extremo pero es un tetrmero de Gy C.
Considerando el anterior anlisis podemos determinar que el mejor par de primers
es el par 4. El resumen de sus caractersticas se presenta en la tabla.
Ahora esta secuencia se analizara con oligo analyzer para poder determinar de
forma ms especifica la posible formacin de estructuras secundarias as como la
interaccin entre los primers.
-
Oligoanalizer nos muestra informacin
similar a Primer-BLAST indicndonos la
secuencia del primer a analizar, su
complementaria, la longitud de 20pb as
como el porcentaje de GC, peso molecular
y temperatura de fusin las cuales son
similares a lo reportado anteriormente, el
coeficiente de extincin molar es una
constante fsica derivada de la ley de
Lambert- Beer relacionada con la lectura
espectrofotomtrica de la secuencia a
260nm. Los datos de concentraciones
sirven como referencia de estndar donde
4.95nmoles de oligonucletido al
disolverse en 1ml de volumen resulta una
absorbancia de 260nm, sirvindonos como
referencia de pureza del oligonucletido, al
igual que los 30.65 los cuales fueron
derivados del coeficiente de extincin
molar.
Debajo encontramos una seccin sobre anotaciones sobre la temperatura de fusin
para que sea preciso como:
Se deben de usar oligos de 8 a 60 pb de longitud
Solucin buffer neutra (7Ph8)
Concentracin de Sodio (1.5mMNa+1.2M)
Concentracin de Magnesio (0.01mMMg++600mM)
Concentracin de Trifosfatos (dNTPs120% de la concentracin de catin divalente)
Al analizar la secuencia con la opcin Hairpin (Horquilla) nos muestra las posibles
estructuras de horquilla que se pueden formar del primer forward. Indicndonos que
son 3 diferentes a temperaturas de 45-61C.
-
Al analizarlo con self-dimer y Hetero-dimer podemos obtener informacin sobre
predicciones en la formacin de estructuras secundarias posibles u oligonucletidos
hibridados que pueden suceder a una temperatura determinada. Es importante
examinar que no se formen estructuras secundarias porque podran causar
problemas en experimentos de hibridacin como son la PCR produciendo errores
significativos. La estructura con menor energa libre es la que ms predomina en
solucin debido a que reacciona de manera ms espontanea.
El delta G se calcula tomando en cuenta la seccin de la secuencia con mayor
nmero de bases complementarias, representndose con una lnea que las une.
El valor que corresponde a la secuencia analizada presenta un delta G, pequeo
indicndonos la posibilidad de formar estructuras homodimericas, como lo muestra
a continuacin.
Sin embargo ninguna presenta estructuras
dimericas complejas, donde a lo mucho se
ven involucradas 3 bases, y no representan
mucho espontaneidad, debido a la energa
libre de Gibs tan baja.
A diferencia con Hetero-dimer se analiza la secuencia pero en comparacin con otra
secuencia de primer, eligiendo preferencialmente al reverse, para evaluar la
formacin de estructuras heterodimericas.
Pero este anlisis tambin se puede realizar entre otras secuencias de primers
ajenas al par, como en el diseo de una PCR multiplex y analizar la interaccin entre
cada cebado, aunque existen otras herramientas que proporcionan esta informacin
ms sencilla para mltiples cebadores.
-
Debajo nos muestra cada una de las interacciones entre los primers que pueden
suceder y el Delta G correspondiente as como el nmero de pares de bases
involucradas.
En el apartado Mismatch podemos alterar las bases de la secuencia del
oligonucletido y predecir la termodinmica de las molculas de DNA que contiene
el cambio comprado con el original para estimar la discriminacin y falta de
coincidencia en el diseo de sondas para detectar SNPs.
Primer Forward
Primer Reverse
-
Primer3
Para el anlisis de esta herramienta, emplearemos otro tipo de secuencia debido a
que sobre esta se tienen registrados los Polimorfismo de un solo nucletido SNPs.
Aportando la ventaja de seleccionar de forma ms rpida el cambio (regin roja).
Homo sapiens cytotoxic T-lymphocyte-associated protein
4 (CTLA4), RefSeqGene on chromosome 2
NCBI Reference Sequence: NG_011502.1
GenBank Graphics
>gi|224809308:5003-11175 Homo sapiens cytotoxic T-lymphocyte-associated
protein 4 (CTLA4), RefSeqGene on chromosome 2
CTTCTGTGTGTGCACATGTGTAATACATATCTGGGATCAAAGCTATCTATATAAAGTCCTTGATTCTGTG
TGGGTTCAAACACATTTCAAAGCTTCAGGATCCTGAAAGGTTTTGCTCTACTTCCTGAAGACCTGAACAC
CGCTCCCATAAAGCCATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCTACCAGGA
CCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGGTGAGTGAGACTTTTG
GAGCATGAAGATGGAGGAGGTGTTTCTCCTACCTGGGTTTCATTTGTTTCAGCAGTCAAAGGCAGTGATT
TATAGCAAAGCCAGAAGTTAAAGGTAAAACTCCAATCTGGCTTGGCTGGCTCTGTATTCCAGGGCCAGCA
GGGAGCAGTTGGGCGGCAGCAAATAAGGCAAAGAGATAGCTCAGAACAGAGCGCCAGGTATTTAGTAGGG
GCTTCATGAATGCATGTGAGTTGGTTTAGTAGAGAGACACAGGCAATTTCAGACCCTTCTATGAGACTGG
AAGTGATTTAAGAGGGAAAGGATAGCCATAGTCCTGAATACATTTGAGCTGGGTTTCAGGATGAGCTCAC
AAGTTCCTTTAAAAAAAATTGACTTAAGCAAATCCTGGGAAGAGTTTTTTTGCTATACAATTCAAGGTTT
TAAGGTCCTCGGATTCATATACTTTATAAATGAATTAGCCAGCTTGTTTAAAATGTAGGGAAATTGTGGG
AAGAATGCCTTCTTTACTTAATTCAAGGTTTTAAGGTTCTCTTAATCAATTCTACTAGCTAATTAGCCAA
TTATTTAAAAATAAAAGTTTGAAATTGCCAAAAAAAAAAGACAAGGAAAAGGAAAGAAAGAAAGCCACCA
GTCTGTTTGGCATACAATACTTAATTGTTGCCTGACCTACGTGTGGGTTTCAGATGCAGATCCTCAGTTT
TCAGCTCTTCAGAGACTGACACCAGGTTTGTTACACGGCTTAAAATGATGAGTATATCCATTGAATCTCA
ACCTTATCTCTCTCTAGACCTTCTTGGTTAAGAAACCATGTAGTTTGTATGAAGTAGGTACTCAAAAGAT
ATTTGATGATTTAATTTTTACTGGAGAAGAAATATTCATATATGTTTTCTTATTTTTACATGTTTTAAAT
ATGTAAAGATTAAATAAACACTCTTAGAAGTATTTAAATTTCCTAAAGTAAATTTATCTCAACCAGTAAC
AGGACCCTCCCAATACTGGAAAGTTGAGTGTGACCGCATTTAGTGGTGATGAGTGTGAGCTTGCTTGGGG
AGAGGGCAGGACATTTAGGATTTCTTAAGCTTAGAGTCAATACAATAAAGATTATTGAGTGCTCACTTGG
GTGGGCTATAATCACTGCTCACAGGAGTTCATGAACCACAAGTAAAAGAGTGAGGAGATATGATTAGCTC
ACAAATAACTTTAATACAGAGCAGAAAGTAATGAACTACTGCAATGGAGTTATCACAGTGCTAAGGATGC
TCAGAGGGCATCTCTGATAGGCAGAGGTGAGGGTTAGGGAAGGAAGCTGTAGTCTAGCTAGCTAGAGCTG
CTGGAATAGACATGACAATGGCTGCTGCCAAACTGTTTTCTCTTCTGAGGACAGATGTCCCGTGCAAGTG
GCTTGGTGGAAGGGACTAGTGTCTCTAATATAGGGTGATTTATAAGCAGGAAAGTGTGTCCTAGAAATTC
AGACCAGAGTGATAGATTGGAATTGGATCATGGGGGACTCATTGAATGTTATTTATTGTATTTGTTTTTG
CGATCAGTGTTAGTAAAGTGTCAAAGGGATTGAGCAGATGAGTGACATCATGCAACACAAGTTTTGAGTT
-
TCACTTGTCAGACTGACTGGAGAGGGGCCTGGTTAGTTACAGGAAGGTAATTTGGCATGCAGCCACTATT
TTTGAGTTGATGCAAGCCTCTCTGTATGGAGAGCTGGTCTCCTTTATCCTGTGGGAAAAGAGAACAAAGG
AGCATGGGAGTGTTCAAGGGAAGGAGAAATAAAGGGCAGAGAGGCAGCGGTGGTGTCAGGGGAAGCCCAC
AGGAGTTAACAGCAGGGTTGCCTCAACCTAGAGAGGAAGCGACCTGGTGCCCTCGGCTCTGTGGCTTCCT
TCATCTAACAACATCTTCCACTCTACAACAATGCCAGGGAAGGCGGAGGCTGGTACAGTGCATCAAGACA
CAGCTACTCCTGGGTGACAGAGGTTCAGGGCCAGCTCACTAAGTAGGCAGAAGTTTTTGACATATACTTT
GAGAGATAAAGCAAGATTCTGTACCTCAACCTTCAGAATTTCCCCTACCACTCATTATAGTTCCGGAGCT
ATATAGCTCCTATCATTCTATCATAACCTTAGAATACCAGAGAACATATCATCTCATCTAATTATCTCTT
ACTATATGTGAAAAAAATGAAGGACATGGGGGAAGTGTGACTTGCCCCAAATCACATATTTCATGGTAGA
GCCAGGTCTTCTGTTTGTCATATCAGTGTTCTTCCTGCCACAACCATCTTGAAGAATCTATTTCTCAGTA
AGAAAATATCTTTATGGAGAGTAGCTGGAAAACAGTTGAGAGATGGAGGGGAGGCTGGGGGTGTGGAGAG
GGGAAGGGGTAAGTGATAGATTCGTTGAAGGGGGGAGAAAAGGCCGTGGGGATGAAGCTAGAAGGCAGAA
GGGCTTGCCTGGGCTTGGCCATGAAGGAGCATGAGTTCACTGAGTTCCCTTTGGCTTTTCCATGCTAGCA
ATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGAGGCATCGCCAGCTTTGTGTGTGAGTATG
CATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTGACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGT
CTGTGCGGCAACCTACATGATGGGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCC
AGTGGAAATCAAGTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGG
TGGAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTAATTGGTGA
GCAAAGCCATTTCACTGAGTTGACACCTGTTGCATTGCAGTCTTCTATGCACAAAAACAGTTTTGTTCCT
TAATTTCAGGAGGTTTACTTTTAGGACTGTGGACATTCTCTTTAAGAGTTCTGTACCACATGGTAGCCTT
GCTTATTGTGGGTGGCAACCTTAATAGCATTCTGACTGTAAAATAAAATGATTTGGGGAAGTTGGGGCTC
TCGCTCTGGAGTGCTAACCATCATGACGTTTGATCTGTACTTTTGATATGATATGATGCTCCTGGGGAAG
TAGTCCCAAATAGCCAAACCTATTGGTGGGCTACCCATGCAATTTAGGGGTGGACCTCAAGGCCTGGAAG
CTCTAATGTCCTTTTTTCACCAATGTTGGGGAGTAGAGCCCTAGAGTTTAAAACTGTCTCAGGGAGGCTC
TGCTTTGTTTTCTGTTGCAGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGACTTCCTCCTCTGGATCCTTGCAGCA
GTTAGTTCGGGGTTGTTTTTTTATAGCTTTCTCCTCACAGCTGTTTCTTTGAGCAAAATGGTGAGTGTGG
TGCTGATGGTGCACCATGTCTGATGGGGATACCTTTAGTGGTATCAACTGGCCAAAAGATGATGTTGAGT
TTAGTGTTCTTGAGATGAGATGAGGCAATAAATGAAGAGGAAGGACAGTGGTAAAGAACGCACTAGAACC
GTAGGCATTGGCATTTGAGGTTTCAGAATGACTAATATTTTAGATGAATTTGTTTGACATTGAATGTTCA
TGTGCTTCTGAGCAGGGTTTCAATTTGAGTAACCGTTGCAATAACATGGGGCAGCTGTTTTGCTCTTTGT
CTTCATGACAACTGTACTTAAGCTAACAGCCCTGAAACATGAGATTAGGCTGGGCAGAATGCTGCTAGAG
AGGACCACTTGGATGGTCTTTATTCTCCTTCTCCATGTCCCTCTCCATCACCTGGAAGTCACCTCTGGGT
GCCACTCTGGTGCCTTCCTTGTCGAAGCTGTAGCTGCTCACATGACACCTATCCCTGTTATCCAGTTTGC
TTGACTGGGACGTTTTGCCTTCCCCTTCAGCCAGGAAGTGAAAGTCCCAGTTTTTATTTATCACAGGTGT
TGGTATTGGTGGTAGAAGAGGTAGAATTATGGAATCAGGCCTCCTGTCAGGATTTCTTTTTGACAGTCCC
TCTCAGACACCTCTGCCTAAGGCCAGCTTTGCCATTACAAACTCTCCCTTCTCCCTCTCTCCCTTCTTCT
CTTCCTCTTCCTTCTTCTCGCTCTTTCTCTCTCTCTCTTTCTCCCTCTCTGTCTCTTATACACATACACA
AAGATATACTCTATTCCAACATCCTCTACCCAACCTGACAGAGATGTCCTTTGCTGTAGGTTCAGCAGTG
GGGATGAGAAATACAGCTCTCAAACAGGATAACTAAAGCTTATTATCTTATCAAGCTTGTTCCCTTGCAG
ACAAGATTGATCAATTATCATAGGCTTTCTGGGTGTTCTTTCTGAAGCTTTCTCAAAGTCTCTTTCTCCT
ATCTTCCATTCAAGGCAAATGATTGCCATTTAACATCAAAATCACAGTTATTTATCTAAAATAAATTTTA
-
ATAGCTGAATCAAGAAAATCTCCTGAGGTTTATAATTCTGTATGCTGTGAACATTCATTTTTAACCAGCT
AGGGACCCAATATGTGTTGAGTTCTATTATGGTTAGAAGTGGCTTCCGTATTCCTCAGTAGTAATTACTG
TTTCTTTTTGTGTTTGACAGCTAAAGAAAAGAAGCCCTCTTACAACAGGGGTCTATGTGAAAATGCCCCC
AACAGAGCCAGAATGTGAAAAGCAATTTCAGCCTTATTTTATTCCCATCAATTGAGAAACCATTATGAAG
AAGAGAGTCCATATTTCAATTTCCAAGAGCTGAGGCAATTCTAACTTTTTTGCTATCCAGCTATTTTTAT
TTGTTTGTGCATTTGGGGGGAATTCATCTCTCTTTAATATAAAGTTGGATGCGGAACCCAAATTACGTGT
ACTACAATTTAAAGCAAAGGAGTAGAAAGACAGAGCTGGGATGTTTCTGTCACATCAGCTCCACTTTCAG
TGAAAGCATCACTTGGGATTAATATGGGGATGCAGCATTATGATGTGGGTCAAGGAATTAAGTTAGGGAA
TGGCACAGCCCAAAGAAGGAAAAGGCAGGGAGCGAGGGAGAAGACTATATTGTACACACCTTATATTTAC
GTATGAGACGTTTATAGCCGAAATGATCTTTTCAAGTTAAATTTTATGCCTTTTATTTCTTAAACAAATG
TATGATTACATCAAGGCTTCAAAAATACTCACATGGCTATGTTTTAGCCAGTGATGCTAAAGGTTGTATT
GCATATATACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTTTA
ATTTGATAGTATTGTGCATAGAGCCACGTATGTTTTTGTGTATTTGTTAATGGTTTGAATATAAACACTA
TATGGCAGTGTCTTTCCACCTTGGGTCCCAGGGAAGTTTTGTGGAGGAGCTCAGGACACTAATACACCAG
GTAGAACACAAGGTCATTTGCTAACTAGCTTGGAAACTGGATGAGGTCATAGCAGTGCTTGATTGCGTGG
AATTGTGCTGAGTTGGTGTTGACATGTGCTTTGGGGCTTTTACACCAGTTCCTTTCAATGGTTTGCAAGG
AAGCCACAGCTGGTGGTATCTGAGTTGACTTGACAGAACACTGTCTTGAAGACAATGGCTTACTCCAGGA
GACCCACAGGTATGACCTTCTAGGAAGCTCCAGTTCGATGGGCCCAATTCTTACAAACATGTGGTTAATG
CCATGGACAGAAGAAGGCAGCAGGTGGCAGAATGGGGTGCATGAAGGTTTCTGAAAATTAACACTGCTTG
TGTTTTTAACTCAATATTTTCCATGAAAATGCAACAACATGTATAATATTTTTAATTAAATAAAAATCTG
TGGTGGTCGTTTT
Para ejemplificar el uso de Primer 3, se emple la RefSeq del cromosoma 2, debido
a que bajo esta secuencia se encuentran reportadas los SNP de inters, aunque
bien se podra analizar en el CDS del mRNA del gen CTLA4, solo que se debera
de considerar la posicin, el SNP se encuentra en la posicin 204, y es una cambio
de una Adenina por una Guanina, el cual est asociado al padecimiento de diabetes
tipo1 (OMIM, 2013)
Una ventaja que presenta esta herramienta a diferencia de otras es que permite
usar smbolos dentro de la secuencia para seleccionar reas de inters, regiones
de exclusin, inicio obligado del cebador as como final.
Lo cual en opinin propia es ms fcil de colocar, distinguir e interpretar, es
importante remarcar que primer 3 y primer plus son muy parecidos en cuanto a su
interfaz.
-
Como podemos observar las condiciones que deben de cumplir los oligonucleotidos
son corretas ya que su longitud es de ambos de 20pb, asi como las temperaturas
de fusin son muy cercanas en ambos, el porcentaje de GC es adecuado, tampoco
hibrida consigo mismo ni con el otro primer as como tampoco forma estrcturas
secundarias segn el analisis proprocionado por Primer 3, el producto es de 246pb
donde se encuentra la region de interes que es la Adenina en la posicion 204.
Regin de inters
left primer >
right primer <
-
Posteriormente nos porporcionanan mas opciones de oligonucleotidos, para poder
elegir el mejor.
Analizaremos el primer par de oligonucleotidos para anaizarlos con Oligo analyzer
y asi determinar si nos se forman estrcuturas secundarias.
Left primer Rigth primer TTGGATTTCAGCGGCACAAG TGGAATACAGAGCCAGCCAA
Debido a la energia libre de Gibs reportada para cada estructura podemos decir que
no se forman estrcturas homodimericas ni heterodimericas.
-
Primer3Plus
Para ejemplificar su uso se trabaja con la misma secuecnia que la anterior (Refseq
CTLA4).
Donde se selecciona la misma secuecnia donde se encuentra el Polimorfismo de
un solo nucleotido que esta relacionado con la Diabetes Mellitus tipo1, siendo la
sustitucin de una Adenina por una Timina. Los cebadores propuestos por Primer
3Plus son los siguientes:
Longitud ideal de 20 a 25 nucletidos
Ambos miden 20 pares de bases.
Porcentaje de G/C entre 40% y 60%.
Ambos entran dentro del rango siendo de 50%
-
La diferencia entre la temperatura a la que se abren las cadenas de DNA (55Tm75), de los primers forward y reverse no debe de ser mayor a 5C.
Sus temperaturas se encuentran dentro del rango y su diferencia es de 0.8 grados Celsius.
No se deben formar regiones 2 internas (Mientras menor sea la autocomplemtaridad mayor probabilidad de formar estructuras secundarias) mientras que a mayor complementariedad en 3 indica la probabilidad del emparejamiento de los primers.
No se forman estructuras secundarias homodimericas de ninguno de los primers, tampoco interaccionan los cebadores entre s.
Debajo se observa dentro de la secuencia nucleotdica de azul el forward primer o
primer izquierdo y de verde el reverse primer o primer derecho, de verde se subraya
la secuencia de inters dentro de la cual se contiene la Adenina en la posicin 204.
Posteriormente tabein muestra mas opciones de pares de primers para seleccionar
el mejor, este analisis con Oligo analyzer ya no se hara puesto que es lo mismo que
con Primer-BLAST y Primer3.
-
Oligo Analyzer
La base de datos de IDT, permite aparte de hacer el uso de la herramienta de Oligo
analyzer asi como de sus otras calculadoras muy utiles en el labor tcnico de la
gentica, tambin permite proponer oligoncleotidos a partir de la secuencia
analizada, seleccionando PCR 2 primers.
Como resultados primero nos muestra de forma grafica las secciones de los primers
para observar las regiones que se reproduciran.
Debajo se muestran los conjuntos de primers que propone oligo analyzer, donde
apreciamos que ocilan entre los 20 pares de bases, siendo la Tm de todos de 62,
y el porcentaje de GC es en todos menor a 50, por lo que de primera instancia todos
son buenos candidatos, la diferencia aqu radica en la seccin del gen a reproducir,
ya que de forma similar a Primer-BLAST, nos porporciona regiones aletorias de
amplificacin.
Los conjuntos de primers se muestran sin la apreciacion de la secuencia de
oligonucleotido, pero si proporciona la longitud del producto a replicar.
-
Cambiando la seleccin de la secuecnia a replicar, se coloc que se desea que
entre la region del SNP relacionado con Diabetes mellitus (nucleotido en la posicin
204), por lo que las regiones en verde indican las secciones a reproducir.
Posterioremnete el analisis de cada uno de estos indica nuevamente que cualquiera
se puede elegir, ya que la Tm es adecuada, la longitud y el porcentaje de GC igual,
por lo que solo resta hacer el analisis con Oligo analyzer.
-
Tomando el conjunto de primers que presentan el producto de mayor tamao es
decir el conjunto 3, se analiza dando click en ver detalles de ensayo, donde se abre
una ventana que muestra las secuencias del primer sentido y del antisentido, asi
como sus caracteristicas que son buenas para ser primers.
Primer Forward
El primer forward si presenta reacciones de autocomplemnetaridad, a tempraturas
de fusion intermedias, sin embargo estas no son muy estables y no causan mayor
problema.
Primer Reverse
Presenta 4 posibles estrcturas pero que no se alcansan a formar debido a que no
se presentan espontaneamente.
En el analisis de Hetero dimeros mostr que no reaccionana los cebadores enttre si
no forman estrcturas secundarias.
-
MP primer
Se trato de disear una PCR multiplex para las variantes del gen CTLA4 que son 2,
sin embargo al introducir las secuencias a MPprimer, marcaba error. Se decidio
trabjar una PCR con distintos genes que predisponen la enfermedad celiaca, tema
con el cual se incio la investigacin del gen CTLA4.
Segn la base OMIM estos son los genes que predisponene la enfermedad Celiaca,
donde se trabajaron solamente con aquello que a nivel clnico se han vinculado con
la enfermedad y no solo in silico.
En esta imagen se muestran los numeros de identificacion de las secuecnias
empleadas, se introdujeron las secuecnias asi como algunas caracteristicas de
MPprimer.
A continuacion se muestra el resumen de los resultadosde los conjutnos de
cebadores propuestos por MPprimer, delante se aprecia un avlor de penalizacion el
cual es similar a un error producido por trabajar con estos primers, en la sigueinte
columna se aprecian la longitud de cada producto de amplificacin donde en general
oscilan entre los 397, 759, 482 y 581 pares de bases. El ltimo apartado son las
tempraturas de fusin de cada par de cebadores, es imporatante revisar que sean
similares entre todos y que encuentren dentro del rango optimo de Tm. Todos
cumplen con las caracteristicas sealadas.
-
Ahora seleccionando el primer conjunto de cebadores, ya que presenta la menor
penalizacin y las temperaturas de fusion son muy similares entre cada par de
primers con una desviacin estandar de 1.3C.
Se pueden descragar en 2 tipos de formatos el conjunto de primers pudiendo ser en formato
FASTA o en vista de Excel
>gi|52426772|ref|NM_002122.3|_0_397_fp
TGCTTCCAGACACCAAGGGCCA
>gi|52426772|ref|NM_002122.3|_0_397_rp
AGTCAGCCCTGGATGAAAGATGGA
>gi|15778585|gb|AF414120.1|_0_759_fp
TGAAGACCTGAACACCGCTCCCA
>gi|15778585|gb|AF414120.1|_0_759_rp
AGAATTGCCTCAGCTCTTGGAAATTGA
>gi|166788571|dbj|AB290184.1|_0_482_fp
TGGGAGGCATGCTGAAGCCA
>gi|166788571|dbj|AB290184.1|_0_482_rp
TCATCAAAGTCCGCCTGCTGCC
>gi|188194|gb|M32577.1|HUMMHDQBH_1_581_fp
TGCTACTTCACCAACGGGACGGA
>gi|188194|gb|M32577.1|HUMMHDQBH_1_581_rp
AGCACGAAGCCTCCAATGCCAC
Debajo de cada conjunto de primers esta la opcin de determinar el contenido de
GC y numero de sitios de union entre todos los cebadores, asi como su longitud,
con la herramienta submit to MFEprimer, donde tambien podemos cambiar las
condiciones termodinamicas y observar su comportamiento.
-
Tambien nos permite ver las reacciones entre los cebadores y las secuencias,
colocando en una tabla a cada cebador e indicando las interacciones.
Otro dato importante es que detecta 5 productos de replicacin, pero como uno se
repite, podemos asegurar que cada uno pertence a la expresion del gen de estudio.
A continuacin se presentan los sitios de union de cada primer a la secuencia
correspondiente.
-
La opcin Submit to PriDimerCheck perimte la evaluacion entre de los
heterodimeros con los diferetes cebadores.
-
Estas son todas las relaciones que se pueden producir entre los cebadores, la
mayoria no intervienen tantos enlaces, y s se llegan a formar debido a las energias
libres de Gibs indican que reaccin espontaneamente.
Por ltimo encontramos la opcin de submit to virtual electrophoresis que permite
seleccionar los pares de primers a evalar y observar un diagrma indicatio de lo que
sucederia si se correira la electroforesis, se puede modificar la concentracin del
gel de agarosa 0.5 a 2%
La imagen del electrofotograma es de mucha utilidad ya que nos permite observar
si se van a diferenciar los productos de la amplificacin asi como nos ayuda a
detemrinar el marcador de peso molclar adecuado, en este caso ese paramero no
se controla debido a que el programa lo asigna.
De acuerdo a los pesos de los replicados, podemos determinar que seria mejor un
marcador de peso molecular que valla de 100 en 100 debido a la carcania en el
peso.
-
Electroforesis virtual de 4 genes que predisponen a la enfermedad celiaca, en la
evaluacion de personas que presenten dicha enfermedad se tiene que presentar
teoricamnete la evidencia de las 4 bandas.
Peso molecular
Gen expresado
759 pb Homo sapiens CTLA4 (CTLA4) mRNA, complete cds
582 pb Human MHC HLA-DQ beta mRNA, complete cds
482 pb Homo sapiens mRNA for MYO9B variant protein, complete cds
397 pb Homo sapiens major histocompatibility complex, class II, DQ alpha 1 (HLA-DQA1), mRNA
-
Ejercicio de repaso
Los genes housekeeping empleados como estandares internos que eleg son: a la
albumina y la cycplophilin debido a que ambos se encuentran en la espcie H.
sapiens y se presentan secuecniados en forma de mRNA ambos.
Homo sapiens albumin (ALB), mRNA NCBI Reference Sequence: NM_000477.5
GenBank Graphics
>gi|215982788|ref|NM_000477.5| Homo sapiens albumin (ALB), mRNA
AGTATATTAGTGCTAATTTCCCTCCGTTTGTCCTAGCTTTTCTCTTCTGTCAACCCCACACGCCTTTGGC
ACAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTC
GTCGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTT
GGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAA
GTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCC
TTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGC
AAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTG
GTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACT
TATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAA
AGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTT
CGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAA
GAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTC
CAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGAT
GACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCT
GTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTT
GCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTC
TTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGAC
TTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAA
AGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTT
GAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGT
CAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGA
AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAG
AAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTT
CAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA
TATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACAC
AAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCT
GCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGC
CTTAGGCTTATAACATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGAT
CAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATT
TCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGT
-
ACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTG
TTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACT
CTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Para ambos se analizaron en Primer3Plus ya que se aprecio mayor claridad de lo
que se mostraba,
Se colocaron corchetes dentro de la secuecnia para la secuencia replicada fuera la
que pertence al CDS del gen, los cebadores se posicionaron adecuadamente.
El forward primer tiene un longitud adecuada de 19 pb, y su porcentaje de C y G es
un poco elevado pero entra dentro del rango, sin embrago se aprecia mayor
estabilidad en el extremo 3 que en el 5 sucediendo lo mismo con el reverse primer,
segn la fuente no presenta reaccion autocomplemetaria. El reverse primer
presenta una adecuada longitud de pares de bases y porcentaje de GC, la
temperatura de ambos esta dentro del rango y estan diferenciadas por 3 decimas
permitiendo que los dos se cebadores se unan al mismo tiempo al alcanzar la
temperatura de fusion optima.
EL primer forward puede presentar un acoplaminto de orquilla efecto de la
complemnetaridad de sus bases, esto es un proceso espontaneo y se produciria a
61.1C.
-
Tambien se pueden presentar reaccion de homodimerizacion de forma espontanea,
con enlaces fuertes en promedio 2 pares de bases.
En cuanto a la formacin de heterodimeros, hay dos que presentan un valor de delta
G muy bajo indicandonos que la reaccin es muy espontanea y que seguramente
se produciran estas estrcuturas secundarias que interfiran en el proceso, sin
embargo a comparacion de otras dos opciones mostradas por Primer3plus
presentan menor cantidad de estructuras secuendarias.
Para la realizacion del los primers para Cyclpphilin emple Primer3Plus, no
selecione ningun area en particular y me selecciono el mejor par de cebadores.
Homo sapiens cyclophilin mRNA, complete cds
GenBank: AF022115.1
GenBank Graphics
>gi|29028315|gb|AF022115.1| Homo sapiens cyclophilin mRNA, complete cds
CCACTGTCGCTTTTCGCCGCTTGCTGCAGCCATGGTCAACCCCACCGTGTTCTTCGACATCACGGCCGAT
GACGAGCCCTTGGGCCGCGTCTCCTTCGAGCTGTTTGCAGACAAAGTTCCAAAGACAGCAGAAAACTTTC
GAGCTCTGAGCACTGGAGAGAAAGGATTTGGCTATAAGGGTTCCTCCTTTCACAGAATTATTCCAGGATT
CATGTGCCAGGGTGGTGACTTTACACGCCATAATGGCACTGGCGGCAGGTCCATCTACGGAGAGAAATTT
GAGGATGAGAACTTCATCCTAAAGCATACAGGTCCTGGCATCTTGTCCATGGCAAATGCTGGACCAAACA
CAAACGGTTCCCAGTTTTTTATCTGCACTGCCAAGACTGAATGGCTGGATGGCAAGCATGTGGTCTTTGG
GAAGGTGAAAGAAGGCATGAACATTGTGGAAGCCATGGAGCGTTTTGGGTCCAGGAATGGCAAGACCAGC
AAGAAGATCACCATTTCCGACTGTGGACAGCTCTAATTTCTTTTGACTTGCGGGCATTTTACCCATCAAA
CCATTCCTTCTGTAGCTCAGGAGAGCGTCCCTACCCCATCCTGCTCGCAATGTCCTGTAATCTCTGCTCT
CACTGAAGTCTTTGGGTTCCATATTTTCCTCATTCCCCTTCAAGTCTAGCTGGATTGCAAAGTTAAGTTT
Homodimeros Heterodimeros
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ATGATTATGAATA
Donde la longitud de los primers son ideales, la temperatuura de fusion entra en el
rango, y su diferecnia es minima, el porcentaje de G y C es bueno, aunque indican
reaccion de autocomplementaridad. En el analisis con Oligo analyzer se
encontraron 4 posibles estrcturas que se producen espontaneamente pero no son
tan significativas.
Tambein inidca la formacion de homodimeros y heterodimeros, pero su delta G
indica que no son tan importantes, podiendo ser cebadores del gen.
Homodimeros
Heterodimeros