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Crioprotectores
• Crioprotectores coligativos
previenen la deshidratación y
disminuyendo la cantidad de
agua absorbida por los cristales
de hielo.
• El DMSO es ligeramente tóxico.
• Atraviesa rápidamente las
membranas celulares
Dimetilsulfóxido (DMSO)
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Crioprotectores.
• Aumentan la supervivencia de las
células cuando se agregan a la solución
crioprotectora.
• Modifican la viscosidad y la
temperatura de la transición de la
solución crioprotectora.
• La fuente puede ser autóloga.
Proteínas
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Soluciones crioprotectoras
• Sustancia polimérica con cadenas de
diferentes pesos moleculares que no
penetra la célula de forma libre.
• Protege a la célula formando una capa
viscosa y hialina que retarda el
movimiento de agua.
Hidroxietilalmidón (HES)
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Almacenamiento• Congeladores mecánicos.
– -120°C a -86°C.
• Congelador de nitrógeno líquido.
– -196°C a -142°C.
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Velocidad de congelación
controlada.
• DMSO al 10 %.
• Concentración celular 50x106/ml.
• Velocidad inicial de -1°C/min.
• En -40°C incrementar a -10°C/min.
• En -80°C colocar en la fase gaseosa de
nitrógeno líquido hasta -146°C.
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Velocidad de congelación no
controlada
• DMSO al 5 % con HES al 6 %.
• Concentración celular menor a 300000 mm3.
• Colocar en bolsas de almacenamiento en un
congelador mecánico a -80°C.
• En los -80°C incrementar a 10-16°C/min la
velocidad hasta -146°C.
• Almacenar en la fase gaseosa de nitrógeno
líquido.
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Ventajas de la congelación no
controlada
• Menor costo.
• Menor tiempo técnico.
• El HES previene la lisis de granulocitos durante
el descongelamiento.
• Usando DMSO al 5% disminuyen las
reacciones tóxicas durante la infusión.
• Sencillo.
• Menos espacio en el congelador.
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Protocolo B = –1°C/min Protocolo D = –1.8°C/min
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Congelación
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Congelación
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Congelación
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Descongelación
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Descongelación
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Control de calidad de la
criopreservación.
• Conteo (citometría) (tasas de recuperación de células
mononucleares, CD34+, eritrocitos y PMN).
• Prueba de viabilidad por exclusión de tinción
(con azul de trípano o yoduro de propidio).
• Cultivo de CFU-GM.
Valoración in vitro.
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Citometría de Flujo
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Citometría de flujo (CF)
Es una técnica multiparamétrica que permite estudiar propiedades físicas y biológicas de las células vivas en una suspensión fluida.
El citómetro es un aparato capaz de medir varios parámetros celulares a partir de una suspensión celular por medio de la interacción de las células con un haz de luz láser guiadas mediante un flujo
contínuo.
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Parámetros celulares que pueden
estudiarse
Parámetros
estructurales
Parámetros
extracelulares
Parámetros
superficiales
Parámetros
citoplasmáticos
Parámetros
nucleares
Tamaño
Complejidad
citoplasmática
Proteinas de
superficie Proteinas secretadas
Interacción con
otras cél.
Contenido de
ADN
Proteinas
intracelulares
Actividad enzimática
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Esquema del citómetro
Fluídos
Sistema óptico
Sistema electrónico
Láser488nm
FL2 PE
SSC
FSC
FL3 PerCP, Cy5
FL1 FITC
Detectores
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Tipos de señales
���� Señales de dispersión
���� Señales de fluorescencia
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Tipos de señalesSeñales de dispersión
LASER
Detector de FSC
Detector de SSC
Detector de FSC
Detector de SSC
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Inmunomarcación
Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo
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Tipos de señalesSeñales de fluorescencia
Bioq. Andrea Novoa - Laboratorio de Citometría de Flujo - Servicio de Hematología
LASER
Detector de SSC
Detector de FL2
Detector de FL3
Detector de FL1
Detector de FSC
Detector de SSC
Detector de FSC
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Características de la CF
• Técnica sencilla y rápida
• Alta especificidad
• Multiparamétrica
���� FSC y SSC
���� FL1, FL2 y FL3 (un láser)
���� ó FL1, FL2, FL3 y FL4 (dos láseres)
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Fluorocromos
• FITC en FL1 (Isotiocianato de fluoresceina)
• PE en FL2 ( Ficoeritrina)
• PerCP en FL3 (piridin clorofil proteina)
• APC en FL4 (aloficocianina)
Son moléculas químicas que absorben luz a una
determinada longitud de onda y emiten a otra
diferente.
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Espectros de emisión
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Procesamiento de la muestra
Marcación de superficieCélulas en suspensión + Acs.
Monoclonales*
Lisis con Cloruro de amonio
Resuspender
Adquisición de la muestra
Incubar 20’ en oscuridad
Centrifugar 5’ a 1800rpm
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Distribución de las células de una muestra de sangre
normal
Complejidad citoplasmática
Tamaño celular
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Distribución de las células de una
muestra de médula ósea normal
10 10 10 10 100 1 2 3 4
10277.008
CD45 PERCPCY5,5 ->
CD45 PerCP
SSC
Granulocitos
Eosinófilos
Precursores CD34+Céls. Rojas nucleadas
Monocitos
Linfocitos
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Stem cell
GB
247.000mm3
CD 45 99.42 %
CD 34 1.05 %
GB
430.000mm3
CD 45 99.86 %
CD 34 0.02 %
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Stem cell
GB
170.000mm3
CD 45 97.42 %
CD 34 0.25 %
GB
220.000mm3
CD 45 98.43 %
CD 34 1.05 %
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• El recuento de células CD34+
es necesario para determinar
las dosis requeridas en los
transplantes de células
progenitoras
• La Citometría de Flujo provee
una metodología cuantitativa
rápida y reproducible para la
identificación y enumeración
de células CD34+
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Trypan Blue
• El método de exclusión Trypan Blue es
ampliamente utilizado en laboratorios para la
determinación de viabilidad; solamente
penetra en células cuyas membranas
plasmáticas estén dañadas. Las membranas
de células viables no se tiñen con el colorante
pues son impermeables al mismo, y las células
teñidas y las no teñidas se visualizan con un
microscopio.
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Trypan Blue
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CULTIVO CELULAR
-Método Funcional
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Recolección
+ IMDM
FICOLL
+ STEM
400 G 30`
GRD+Neutrof
STEM
IMDM
FICOLL
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STEM
+ IMDM
IMDM
X 2
Resuspensión
Recuento
1x 106
AGAR
Suero Bovino
Fetal
Células
Medio Cultivo
2 LAVADOS
STEM + Mononucleares
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Estufa 37º C Humidificada, CO2 al 5% durante 10 dias
Mezcla + FEC-G Mezcla sin FEC-GMezcla + FEC-G
Leer microscopio invertido
Microcolonias + 4 C / Colonias entre 40-50 C
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Efectos asociados a la infusión
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Efectos asociados a la infusión de
CPH.
• Los efectos colaterales de la infusión de CPH
se minimizan reduciendo el volumen total y
las células rojas infundidas.
• Los métodos al seleccionar mejor las celulas
disminuyen los efectos colaterales y mejoran
la velocidad de respuesta del injerto.
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ehheh….
¿Qué hay de nuevo, viejo?
Gracias