AbstractoDiferentes tcnicas de biorremediacin (atenuacin natural, bioestimulacin y bioaumentacin) en suelos contaminados con dos concentraciones de lodos aceitosos (1,5% y 6,0%) en microcosmos abiertos y cerrados sistemas fueron evaluados durante 90 das. Los resultados mostraron que las tasas de biodegradacin ms altos fueron obtenido en suelos contaminados con 6% en el microcosmos cerrados. La adicin de consorcios microbianos y nutrientes en diferentes concentraciones mostraron una mayor tasa de biodegradacin de hidrocarburos totales de petrleo (TPH) que los del tratamiento de atenuacin natural. Los suelos tratados en microcosmos cerrados tasa mostr ms alta de eliminacin (84,1 0,9%) cuando se contamina en el 6% y el consorcio bacteriano y se aadieron nutrientes en cantidades bajas. En microcosmos abiertas, el suelo contaminado en un 6% el uso de bioestimulacin con las mayores cantidades de nutrientes (C: N: P de 100: 10: 1) present la mayor degradacin tasa (78,7 1,3%). Estos resultados demuestran que la aplicacin de consorcio microbiano y nutrientes biodegradacin favorecida de TPH presentes en lodos aceitosos, indicando sus aplicaciones potenciales para el tratamiento de los suelos impactados con este importante residuos peligrosos.

IntroduccinProcesamiento de petrleo genera cantidades considerables de un residuo nombrado lodo aceitoso. Uno de los problemas principales que enfrentan los re-refineras y las industrias petroqumicas se relaciona con la eliminacin segura de este residuo, ya que su destino y / o el tratamiento inapropiado Puede causar graves consecuencias para el medio ambiente y el riesgo potencial de la salud humana (Cameotra y Singh, 2008; Xu y Lu, 2010). Aceite lodos ha sido clasificado por los Estados Unidos del Medio Ambiente Agencia de Proteccin (US EPA) como un complejo orgnico peligrosos (Ubani et al., 2013). Por lo general, el lodo aceitoso contiene agua, arena, aceites, grasa, compuestos orgnicos, elementos qumicos, y metales. En medio de los compuestos orgnicos presentes, los ms comunes son los alquenos, alquenos cclicos, benceno, tolueno, etil- benceno, xilenos y policclicos hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) y fenoles (Kriipsalu et al., 2008). Los hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) consisten en un Seria preocupacin ambiental, ya que muchos de ellos son citotxicos, mutagnicos y potencialmente cancergenos (Ubani et al., 2013). Biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos, que explota la capacidad de los microorganismos para degradar y / o desintoxicar contaminantes orgnicos, se ha establecido como un eficiente, econmica, tratamiento verstil y seguro para el medio ambiente (Singh y Lin, 2008). En las plantas de procesamiento de petrleo, en el tratamiento de residuos, principalmente lodos aceitosos, el proceso landfarming es una frecuencia mtodo elegido, debido a su simplicidad operacional, bajo costo (cuando en comparacin con otras tcnicas), alto potencial de contaminante remocin y alta tasa de aplicacin residuo, variando de 83 a 252 m3 / ha / ao (Marn et al., 2005; Jacques et al., 2007). Sin embargo, el mtodo todava muestra varias limitaciones especialmente a lo que respecta a las grandes necesidades de reas de gestin y control apropiado, las desfavorables condiciones ambientales de los microbios el crecimiento y la ineficiencia en la reduccin de los contaminantes inorgnicos nivel (Khan et al., 2004). Eficiencia de los procesos de biorremediacin de reas contaminadas depende de varios factores; los ms importantes son la presencia de microorganismos con capacidad catablica apropiada en el sitio contaminado, favorable ambiental y nutricional condiciones para el crecimiento microbiano y el metabolismo, contaminante composicin y la concentracin y la biodisponibilidad de contaminantes a ataque microbiano. Se han propuesto dos tcnicas para aumentar la eficiencia de proceso de biorremediacin: bioestimulacin y / o bioaumentacin. La bioestimulacin proceso consiste en la introduccin de nutrientes, principalmente nitrgeno y fsforo bajo la forma de orgnico y / o fertilizantes inorgnicos, en el sistema contaminado para estimular la actual crecimiento de la poblacin microbiana y la actividad. La bioaumentacin proceso consiste en la introduccin de microorganismos, previamente caracterizado como potenciales degradadores para apuntar contaminante, en el ambiente contaminado con miras a un aumento en la poblacin microbiana y, como consecuencia, un aumento de la tasa de biodegradacin (Das y Chandran, 2011; Tyagi et al., 2011; Taccari et al., 2012). El objetivo del presente trabajo fue evaluar la biorremediacin potencial en suelos contaminados con diferentes lodos aceitosos concentraciones en abierto y microcosmos cerrado utilizando bioestimulacin y las tcnicas de bioaumentacin.

2. Material y mtodos2.1. MuestreoMuestras de suelo distrfica Red Argisoil (profundidad de 0e30 cm) fueron recogido al azar en 5 puntos en las clulas landfarming, que tienen recibida petroqumica lodos aceitosos durante tres dcadas. El muestreo se hizo al final del perodo de tratamiento y antes de aplicar lodos ms aceitosos. Las muestras fueron enviadas al laboratorio, homogeneizaron y los suelos tamizaron a 2 mm. Las muestras representativas de suelo y lodo aceitoso se presentaron a la caracterizacin qumica fsica (Mesa 1).2.2. Experimentos BiorremediacinPara la biorremediacin de suelos, dos niveles de contaminacin (1,5% y 6%) de lodos aceitosos fueron probados en microcosmos abiertos y cerrados. El suelo contaminacin fue ejecutado en el laboratorio en el experimento Empezar. Para cada combinacin diferente de nivel de contaminacin y condicin microcosmos, los siguientes tratamientos se llevaron a cabo en por triplicado:1) La atenuacin natural (NA): lodos aceitosos suelo 2) La bioestimulacin BS (NP): aceitosas nutrientes con lodos de suelos alta concentracin Aceitosas nutrientes lodos de suelo con:3) Bioaumentacin BA (NP) consorcio bacteriano alta concentracin 4) La bioestimulacin BS (NEP): aceitosas nutrientes con lodos de suelos baja concentracin Aceitosas nutrientes lodos de suelo con: 5) Bioaumentacin BA (NP) consorcio bacteriano baja concentracin

2.3. Consorcio bacterianoEn los experimentos bioaumentacin un consorcio bacteriano de 5 bacterias con potencial de biodegradacin de lodos aceitosos y produccin de biosurfactantes aislado directamente desde el lodo aceitoso (Stenotrophomonas acidaminiphila, Bacillus megaterium y Bacillus cibi) y el suelo (Pseudomonas aeruginosa y Bacillus cereus) era utilizado. Se identificaron las cepas basado en la secuenciacin parcial del gen 16S rRNA (Cerqueira et al., 2011). El inculo bacteriano fue preparado a travs de la transferencia con un hilo de platino del aislado (cultivo madre) a matraces que contiene el caldo nutritivo estril, que se mantuvieron en un orbital agitador a 100 rpm, 30 C durante 24 h. A partir de entonces las clulas se centrifug a 4 C, 9.000 rpm durante 15 min, se lav con estril solucin salina (0,85%) y los procesos se repiti 3 veces. Los las clulas se suspendieron en solucin salina estril (0,85%). El inculo de cada aislado fue estandarizada y el consorcio aade a los suelos de cada unidad experimental con el fin de inocular 108 clulas / g del suelo.2.4. Diseo experimentalLos experimentos se llevaron a cabo durante 90 das en 1.0 L microscoms (frascos de vidrio). En experimentos con microcosmos cerrado el matraces se mantuvieron bien cerrado y en experimentos de microcosmos abiertos los matraces se mantuvieron sin tapas. Los experimentos en microcosmos abiertos se realizaron para representar las condiciones de campo, donde la humedad el ajuste fue ms frecuente. La cantidad de suelo en cada matraz se calculado en base seca (200 g). Los suelos estaban contaminados con 1,5% y 6% w / w de petroqumica lodo aceitoso.En los experimentos de bioestimulacin y bioaumentacin, nitrgeno y el fsforo se aadieron utilizando soluciones de (NH4) 2SO4 y KH2PO4 respectivamente. El C: N: P se ajust a 100: 10: 1 y 100: 0,4: 0,2 para los experimentos que corresponden a alta y baja cantidades de nutrientes. Los experimentos de control se llevaron a cabo con suelo sin aplicar contaminantes y tratamientos.La humedad del suelo se ajusta peridicamente aadiendo estril agua destilada, despus de la ponderacin de los frascos, con el fin de mantener la capacidad de campo en el 70%. La capacidad de campo se determin de acuerdo Silva et al. (2007). Los suelos se giraron peridicamente para aumentar la velocidad de aireacin. Se mantuvieron los matraces cubierta y expuesto a las variaciones de temperatura para representar campo condiciones. La temperatura ambiente se control como una funcin de hora.2.5. Anlisis del sueloLos suelos fueron muestreados a 0 y 90 das para la cuantificacin del total hidrocarburos de petrleo (TPH) y despus de 7, 14, 30, 60 y 90 das para los anlisis microbiolgicos.2.5.1. Recuento de microorganismos que degradan hidrocarburos y totalesheterotrophicsEl recuento de microorganismos en los suelos se realiz en cada de las muestras por triplicado para cada tratamiento en el correspondiente muestreo momento por el mtodo del Nmero Ms Probable ( NMP) ( Braddock y Catterall , 1999). Inicialmente, se present la muestra de suelo a decimal de la dilucin con una solucin salina (0,85 %) en tubo de prueba y se homogeneizaron en un vrtice durante 30 s. Las diluciones de microtitulacin de 24 pocillos a continuacin, se hicieron placas.Para determinar el total de microorganismos hetertrofos 250 ml de medio de caldo de soja trptico (TSB) se dispens en 96-as placas de microtitulacin, se le aadi 10 ml de cada dilucin. Las placas se incubaron a 30 C durante 14 das y el microbiano crecimiento se determin por turbidimetra. Para la determinacin de degradantes hidrocarburos microorganismos mineral mnimo medio (MM1) se utiliz (composicin en g / L: KCl, 0,7; KH2PO4, 3,0; NH4NO3, 1,0; solucin de micronutrientes, 1 mL / L (MgSO4, 4,0; FeSO4, 0,2; MnCl2, 0,2; CaCl2, 0,2)) (Richard y Vogel, 1999) y una solucin de cloruro de 2.3.5-tripheniltetrazolium (TTC) como indicador (Bento et al, 2005; Cerqueira y Costa, 2009). Despus de la inoculacin de cada dilucin de las placas se inocularon con 1% de los lodos aceitosos. Las placas se incubaron a 30 C durante 14 das y el microbiano crecimiento se determin por el desarrollo de un color violeta (sealizacin reduccin del indicador a travs de la respiracin microbiana). Los luego poblacin microbiana estimativa se determin utilizando MPN tablas (APHA, 1995).2.5.2. La actividad respiratoriaLa actividad respiratoria microbiana en microcosmos cerrado que contiene lodos aceitosos suelo contaminado se evalu por el acumulativa liberacin de CO2 (Stotzky, 1965). Un sistema de captura de CO2 fue montado en cada microcosmos. El sistema de captacin consista en un vaso de plstico que contiene 20 ml de NaOH 0,5 mol / L suspendido en una marco de metal. Frascos sin suelo se utilizaron como blanco a fin de cuantificar el CO2. Los matraces se mantenindose bien cerrado y slo abri peridicamente para la determinacin de la respiracin basal. Actuar el anlisis, 1 ml de BaCl2 30 % y 3 gotas de fenolftalena al 1% se aadieron a la NaOH. La cantidad residual de NaOH se titul con HCl 0,5 mol / L. El gas carbnico producido se calcul la ecuacin:C-CO2 generated mg =Kg soil = (VB- VA)* MC/2 * MHCl - FC/mDnde: VB es el volumen en ml de HCl 0,5 mol / l utilizado para valorar el espacio en blanco la prueba; VA es el volumen en ml de HCl 0,5 mol / L utilizado para valorar la tratamiento; MC es la masa molar de carbono en g / mol; MHCl es la a concentracin en mol / L de la solucin de HCl estandarizado; FC es el factor de correccin para la molaridad (MHCl / MNaOH) y m es la masa en kg de suelo seco en el frasco.

2.5.3. Total de los anlisis de hidrocarburos derivados del petrleoEl Petrleo Hidrocarburos total se determinaron por la EPA 8015B mtodo / 3540. Las muestras de suelo se extrajeron con hexano y diclorometano en 1 : 1,5 proporcin y una alcuota del extracto ( 2 ml) se inyect en un cromatgrafo de gases ( Dani GC1000) con detector de ionizacin de llama (FID) y una columna capilar VF- 5MS ( 30 m 0,53 mm 1,5 mm). Se utiliz nitrgeno como gas portador y la concentracin de hidrocarburos se cuantific usando externa estandarizacin. El lmite de deteccin del mtodo era 0,05 mg / kg.

2.5.4. Anlisis estadstico Los resultados obtenidos se analizaron mediante la prueba de Tukey (comparacin entre los valores medios) a un nivel de confianza del 95 % utilizando el programa Statistica 7.1.3. Resultados y discusin3.1. Evaluacin El crecimiento microbianoLa poblacin de microorganismos hetertrofos totales (TH) y hidrocarburos degradar microorganismos ( HD ) se cuantificaron como en funcin del tiempo en los experimentos de biodegradacin de suelos contaminados con 1,5% y el 6% de los lodos aceitosos realizado en microcosmos abiertas (Fig. 1) y en el microcosmos cerrados (Fig. 2). La bioestimulacin (BS) y bioaumentacin (BA) experimentos en sistemas abiertos con la contaminacin de 1,5% y 6% mostr que se logr la mxima poblacin de microorganismos TH y HD en un mximo de 30 das despus de su procesamiento. La poblacin mxima de Se logr HT (10,3 0,0 log NMP / g) en 30 das en el experimento BS (NP) en suelos contaminados con un 6%. El mximo poblacin de HD (8,6 0,0 log NMP / g) se logr en los experimentos: BS (NP) y BA (NP) en suelos contaminados con 1,5% en 14 das y en el BA experimento (NP) en contaminado suelos con 6% tambin en 14 das.Los experimentos de bioestimulacin y bioaumentacin en cerrada microcosmos con una contaminacin de 1,5% mostraron que el se logr poblacin mxima de microorganismos TH y HD en un mximo de 30 das despus de su procesamiento. En los suelos contaminados en 6%, el Adems de los nutrientes en cantidades superiores mostr poblaciones mayores de TH en 60 y 90 das y de alta definicin en 30 y 90 das. En el Por otro lado, la aplicacin inferior de nutrientes mostr mximo de TH y HD en un mximo de 30 das. El BA experimento (NP) en el 6% contaminacin fue el que present la mayor poblacin de Microorganismos TH (10,54 0,0 log NMP / g) en 30 das de procesamiento. La poblacin mxima de microorganismos HD (9,38 0,0 log NMP / g) se logr en experimentos BS (NP) en suelos en la contaminacin 6% en 7 das de procesamiento. En todos los tratamientos aplicados a los microorganismos mostraron capacidad de la tolerancia y el crecimiento en lodo aceitoso. En hidrocarburos contaminados ambientes, la supervivencia de microorganismos despus de la inoculacin, el contenido y la diversidad de las comunidades microbianas autctonos y el agotamiento de los nutrientes son factores importantes que afectan a la tasa de biodegradacin de contaminantes. La adicin de nutrientes puede afectar tanto la velocidad y de la extensin de la biodegradacin de contaminantes orgnicos ya que alteran la dinmica de la comunidad de las poblaciones microbianas heterotrficas (DAS y Mukherjee, 2007; Machn-Ramrez et al., 2008).Otro factor importante que afecta el metabolismo microbiano es la temperatura. Condiciones de temperatura desfavorables pueden retrasar o inhibir el crecimiento y el metabolismo de la microbiota locales resultantes en la eficiencia reducida del proceso de biodegradacin y, por consiguiente la permanencia de este residuo por perodos ms largos. En esto trabajo, la temperatura ambiente se control como una funcin del tiempo y present una media de 27,5 C con un mnimo de 19,1 C entre 17 y 21 das y un mximo de 37,3 C entre 42 y 46 das (Fig. 3). Estos valores estn dentro del rango ideal considerado para la efectividad de Landfarming que es 10e45 C (EPA, 2004).3.2. La actividad microbiana RespiratorioLa actividad metablica de microorganismos se control por la medicin de la respiracin microbiana en los suelos contaminados en el 1,5% y 6% con lodo aceitoso se trat en microcosmos cerrados (Fig. 4). Todos los tratamientos aplicados en los suelos contaminados en el 1,5% mostraron mayor produccin de CECO2 en la primera transformacin de 30 das. Los altas tasas de mineralizacin diarias ocurrieron en los tratamientos BA (NP) (282,4 8,8 mg / kg) y BS (NP) (305,9 8,5 mg / kg) en 10 das. En los tratamientos con menor tasa de nutrientes, la ms alta la produccin se logr en el procesamiento de 3 das. Probablemente, en la inicial perodo de proceso, las fracciones ms lbiles presentes en el lodo aceitoso puede haber sido utilizado fcilmente como una fuente de carbono y energa para el microbiota, ya que las poblaciones microbianas y mximos HD altas tasas de mineralizacin se observaron en ese perodo. Tiene ha informado de que los compuestos orgnicos con bajo peso molecular y las estructuras moleculares ms simples se degradan preferentemente por muchos microorganismos, mientras que los que tienen estructuras ms complejas como hidrocarburos policclicos aromticos con ms de cinco benceno anillos presentan mayor resistencia al ataque microbiano (Lpez et al.,2008). Marn et al. (2005) demostraron que las emisiones de CO2 gradualmente disminuir mientras que las fracciones de hidrocarburos ms lbiles desaparecen, restante slo la fraccin ms recalcitrante. Se verific que despus de que el trigsimo da del acumulado Produccin C-CO2 haba empezado a estabilizarse para todos los tratamientos evaluados. Esto indica que la mineralizacin del lodo aceitoso ocurrido notablemente en un perodo de 30 das. Ms all de procesamiento de 70 das se observ una reduccin en la produccin de C-CO2 en todos probados tratamientos, indicando una posible inhibicin de la actividad catablica de los microorganismos locales. Bioestimulacin y bioaumentacin tratamientos en contaminados suelos en 1.5% presentaron valores de mineralizacin superior a la tratamiento atenuacin natural al final del perodo. Mayor producciones de acumulacin de C-CO2 despus del tratamiento 90 das ocurrido en el BA experimentos (NP) (3010,1 63,9 mg / kg) y BS (NP) (2.825,9 55,7 mg / kg), que difieren estadsticamente valores el tratamiento de la atenuacin natural (2014,5 36,7 mg / kg).El perodo de produccin de alta C-CO2 en experimentos con suelos contaminados en 6% lodo aceitoso fue mayor que la de suelos contaminados en el 1,5%, probablemente debido a la mayor cantidad de hidrocarburos para ser metabolizados y competencia microbiana en la metabolizacin de los hidrocarburos.La atenuacin natural, bioestimulacin y bioaumentacin tratamientos con menores cantidades de nutrientes mostraron alta produccin durante 90 das. La produccin mxima diaria C-CO2 ocurrido despus de un experimento BA 10 das (NP) (332,9 6,9 mg / kg) y en 7 das BS experimento (NP) (285,9 14,9 mg / kg). Los poblacin mxima de microorganismos HD (MPN 9,38 0,0 log / se logr g) en suelos contaminados en el 6% despus del procesamiento 7 das en el experimento BS (NP). La adicin de nutrientes en cantidad inferior favorecido la mineralizacin durante todo el proceso degradante mostrando una mayor produccin diaria en los pasos iniciales del proceso. Probablemente, el paso inicial de CECO2 liberacin est relacionada con la aliftico fraccin de hidrocarburos que corresponde a la fraccin ms lbil presentado en el lodo aceitoso donde la mineralizacin mximo se verific. En estos experimentos, es probable que la presente microbiota era capaz de degradar en mayor cantidad del hidrocarburo aromtico fraccin que se caracteriza por ser recalcitrante. Como seala Tahhan et al. (2011), a pesar de la degradacin alcano partiendo casi de inmediato a la incubacin del suelo del aromtico compuestos se degradan activamente en una etapa posterior en una escenario de la degradacin de hidrocarburos mixta, probablemente porque alcanos son fuentes de carbono preferenciales hasta que los microorganismos se capaces de utilizar ambos alcanos y compuestos aromticos. Adems, aromtico compuestos son ms fuertemente adsorbidos por el suelo que alcano, lo cual hace que su degradacin ms lenta. Debe tenerse en cuenta que junto con la sorcin, la baja solubilidad y por lo tanto la baja biodisponibilidad constituye un paso limitante en la biodegradacin de HAP (Tahhan et al., 2011).En tratamientos en los que se aadieron cantidades ms altas de nutrientes, una se observ una reduccin en la produccin de C-CO2 despus de 54 das cuando se compara a la atenuacin natural. Producciones diarias mximas para la BS tratamientos (NP) (271,2 36,7 mg / kg) e BA (NP) (266,5 14,0 mg / kg) se produjo en 38 y 33 das, respectivamente. Adems se observ que la atenuacin natural mostr mayor tasa de mineralizacin de que los tratamientos donde cantidades de nutrientes ms altos fueron agregados (p