diagnostico_sepsis_neonatal_marcadores_moleculares.pdf
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Sepsis Panorama Mundial, en Mxico, en Yucatn
Fisiopatologa
Diagnstico de Sepsis Generalidades
Estndar de Oro
Pruebas convencionales
Diagnstico Molecular para Sepsis Qu es?
Aplicacin en Medicina
Ventajas y Desventajas
Proyecto de Investigacin Diagnstico Molecular en Sepsis Neonatal: Un Reto
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1-5/1,000*
6-9/1,000**
7.1-38/1,000**
6.5-23/1,000**
3.5-8.9/1,000***
Rodrguez, M.; Lpez, C.; Arredondo, J.; Gutirrez, P.; Snchez, F. Morbilidad y mortalidad por sepsis neonatal en un hospital de tercer nivel de atencin. Salud Pblica de Mxico 2003.** Vergnano, S.; Sharland, M.; Kazembe, P.; Mwansambo, C.; Heath, P. T. Neonatal sepsis: an International perspective. Archives of Disease in Childhood Fetal Neonatal. 2005.** Coronell, W.; Prez, C.; Guerrero, C.; Bustamante, H. Sepsis Neonatal. Revista de Enfermedades Infecciosas en Pediatra. 2009.
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Lawn, J.; Cousens, S.; Zupan, J. Neonatal Survival 1: 4 million neonatal deaths: When? Where? Why?. The Lancet. 2005, 365, 891-900.
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Mrida 4.3*
9.6%*
Mxico 4-15.4*
9%*
Sistema Nacional de vigilancia epidemiologica. Mortalidad Infantil. Perfil epidmeiologico de las defunciones por asfixia. 2006; 23 (45): 1-3
Leal YA. Risk Factors and Prognosis for Neonatal Sepsis in the Southeatern of Mexico: Analysis of a four years historic cohort follow-up. BMC
Pregnancy Childbirth.2012; 12 (1):48
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Inicia como una repuesta inflamatoria sistmica del hospedero frente a una infeccin localizada por bacterias u hongos; la cual, si no es controlada progresa a una infeccin sistmica con invasin, a tejidos del hospedero normalmente estriles con un resultado de cultivo positivo o negativo
Sepsis Confirmada con Cultivo positivo (Sangre, orina, LCR)
Sepsis Clnica con Cultivo negativo (con manifestaciones clnicas)
De acuerdo a temporalidad: Sepsis Temprana: Ocurre dentro de los 3 das de vida
Sepsis Tarda : Ocurre
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Bacteria/Hongo
TLRs
Respuesta Equilibrada Eliminacin de la bacteria.
Tejido recuperado
Respuesta no Equilibrada
Hiper-inflamacin Patologa mediado por
citoquinas Activacin de la coagulacin Activacin del complemento
Anergia Inhibicin de la sealizacin de
los TLRs. Apoptosis de clulas inmunes
Mortalidad temprana con disfuncin orgnica mltiple
Mortalidad tarda y/o desarrollo de infecciones secundarias
PAMPs
SIRS
Choque Sptico
FOM
Mejora Muerte
SEPSIS
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Hemocultivo: Estndar de Oro
Permite el aislamiento del microorganismo y el perfil antimicrobiano.
Sensibilidad y Especificidad del 80 al 90% en muestras de 3 mL. Sin embargo, se ha estimado una Sensibilidad del 20 al 30 % en muestras de 1mL.
Gram positivos Gram negativos
Staphylococcus aureus Klebsiella spp.
Staphylococcus coagulasa negativo Escherichia coli
Streptococcus pneumoniae Pseudomonas spp.
Streptococcus pyogenes Salmonella spp.
Incubar de 35 a 37 C. Registra produccin de CO2
Aumenta CO2 Hemocultivo Positivo
(verde a amarillo)
Se mantiene CO2 Hemocultivo Negativo
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Otras pruebas de Laboratorio
Reactantes de Fase Aguda:
PcR: Sen 40 90% y Esp 70 -80%
PCT: Sen y Esp 80 90%
VSG: Sen y Esp 80 90%
Relacin B/N: Sen y Esp 60 90%
Cuenta de Leucocitos: Sen 20-90% y Esp 30 al 95%
Cuenta de Plaquetas: Sen y Esp 10 90%
-
Desventajas pruebas de Laboratorio
En general tienen baja sensibilidad y especificidad
No cumplen con los requerimientos de un marcador ideal: rpido, econmico, fcil interpretacin de resultados, alta especificidad y sensibilidad, que permita correlacionar con la gravedad de la infeccin.
El diagnstico no se puede establecer con una sola de stas pruebas.
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Durante la ltima dcada, se ha reportado sobre la amplificacin de cidos nucleicos mediante PCR para la identificacin de bacterias,
La incorporacin de esta prueba molecular podra facilitar un diagnstico ms oportuno en los RN, ya que la sensibilidad de la prueba microbiolgica es muy baja en neonatas
La prueba molecular mediante PCR tienen una alta sensibilidad y especificidad en la deteccin de bacterias y por lo tanto en el diagnstico de sepsis.
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Tipos de Muestras
Mtodos de Extraccin de Acidos Nuclicos
Reaccin en Cadena de la Polimerasa
Revelado
Interpretacin
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Sangre total
Suero
Plasma
Lquido amnitico
Criterios de una muestra ideal en la PCR
1. Escoger la muestra clnica apropiada para el diagnstico
2. Volumen adecuado para ser procesado
3. Eficiencia en la extraccin de ADN y en la amplificacin por PCR
4. La secuencia a analizar debe ser estable durante la recoleccin de la muestra
5. Evitar las contaminaciones
6. Debe ser procesada inmediatamente
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Cualitativa
Mltiplex
Amplificacin simultnea de dos o
ms regiones de ADN en una sola reaccin
Anidado
Se realizan dos amplificacin de la misma regin
gentica
Cuantitativa
Tiempo Real
Es un anlisis cintico que registra los cambios
(fluorescencia) en cada ciclo de amplificacin.
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Las secuencias de cidos nuclicos que se utilizan para identificar bacterias se dividen en:
Secuencias de DNA que codifican para antgenos
Secuencias de DNA que codifican para toxinas
Secuencias de DNA plasmdico
Secuencias de rRNA
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Pueden utilizarse bajos volmenes de muestra
Alta sensibilidad y especificidad
Detecta bacterias viables y no viables
Reproducible
Es rpida de realizar
Diagnstico ms rpido
Costo elevado
No brinda el patrn de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos.
Riesgo de contaminacin
Inhibidores en las muestras
Algunos mtodos para eliminar contaminantes pueden afectar la muestra.
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Cules son los niveles sricos de los reactantes de fase aguda en el recin nacido con y sin sepsis?
Reactantes de Fase
aguda
Sin sepsis
N=63
Sepsis
N= 14 *p
PcR (mg/dL)** 0.32 0.44 1.90 4.58 0.18
Leucocitos (mm3) 14138 6262 14861 7618 0.41
Relacin
Banda/Neutrfilo 0.02 0.06 0.07 0.22 0.49
VSG (mm/h)*** 3.38 3.5 5.3 7.6 0.25
Plaquetas (mm3) 222453 65404 175076 68187 0.009
*Prueba de t Student
** Protena C reactiva
*** Velocidad de sedimentacin globular
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Cules son los niveles sricos de los reactantes de fase aguda en el recin nacido con y sin sepsis?
*Prueba de t Student
** Protena C reactiva
*** Velocidad de sedimentacin globular
Reactantes de Fase
aguda
Mejora
N= 67
Muerte o Secuela
N= 10 *p
PcR (mg/dL)** 1.0 2.3 1.1 1.4 0.42
Leucocitos (mm3) 16352 18573 15020 18652 0.41
Relacin
Banda/Neutrfilo 0.02 0.10 0.009 0.015 0.28
VSG (mm/h)*** 8.8 7.8 10.5 10.8 0.28
Plaquetas (mm3) 342823 459867 247900 85889 0.25
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Cul es el valor pronstico de las concentraciones sricas de IL6, IL8, IL10, IL-17 y TNF- durante la progresin del proceso sptico en neonatos?
Interleucinas
pg/ml
Sin sepsis
N=43
Sepsis
N=14
* p
IL6 49.97 70.85 120.76 166 0.04
IL8 52.96 71.52 34.01 20.84 0.49
IL10 11.00 20.53 34.01 20.84 0.35
IL17 19.60 28.15 20.10 24.13 0.22
TNF 18.55 28.18 15.24 14.35 0.027
*Prueba de t Student
-
Cul es el valor pronstico de las concentraciones sricas de IL6, IL8, IL10, IL-17 y TNF- durante la progresin del proceso sptico en neonatos?
Interleucinas
pg/ml
Mejora
N=67
Muerte o secuela
N=10 * p
IL6 88.06 550 21.31 18.67 0.35
IL8 74.44 177 41.12 29.22 0.27
IL10 10.34 14.92 6.78 3.76 0.05
IL17 17:26.36 37 5.58 6.37 0.001
TNF 29.86 13.99 13.99 18.47 0.02
*Prueba de t Student
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* ANOVA de una va. Intervalo de confianza 95%
Reactante de
fase aguda
Sin infeccin
n= 16
Con infeccin
n=64
*p
Prematurez
extrema
Pre-trmino Pre-trmino
tardo
Prematurez
extrema
Pretermino Pre-trmino
tardo
PcR (mg(dL) 0.55 0.32
0.78 0.52 5.44 4.52 0.61 0.34 0.87 0.56 6.72 4.04 0.003
VSG (mm/h) 5.12 2.36 5.41 3.88 11.38 7.04 5.02 2.72 6.30 3.84 13.69 5.53 0.009
Leucocitos 20856 7359 16209 4159 14738 1837 21257 8434 17307 3878 15193 1765 0.003
Rel B/N 0.12 0.17 0.03 0.05 0.03 0.04 0.151 0.186 0.045 0.057 3.01 5.989 0.485
Plaquetas
(mm3) 201233 39343 203627 38105 257890 82193 195291 42761 259845 80486 271230 88437 0.063
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Dentro de los reactantes de fase aguda el conteo de plaquetas puede ayudar al diagnstico de sepsis neonatal
En nuestros resultados preliminares documentamos un incremento de los niveles sricos de IL6 y una disminucin de TNF en neonatos con factores de riesgo para sepsis sugieren evolucin a gravedad del proceso sptico, en contra parte una disminucin de los niveles sricos de IL10, IL17 y TNF en sepsis grave sugieren un desenlace fatal o egreso hospitalario con secuelas
PcR, VSG y Leucocitos se observo una diferencia estadsticamente significativa entre los grupos de prematuro con y sin sepsis.
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15%
85%
Positivo Negativo
Hemocultivos Solicitados
entre 2005 al 2011:
4269 solicitudes
Gram + Gram- Otros
77.08%
15.71%
7.21%
En 75 (12%) pacientes se aisl ms de
un microorganismo
Bacterias
579 =92.8%
-
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0 72.4
18.3
2.7 5.0 1.7
-
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
CoNS CoPS Streptococcus Enterococcus Otros
-
26.5 23.5
15.3 15.3
10.2 9.2
0.00%
5.00%
10.00%
15.00%
20.00%
25.00%
30.00%
-
28
56.2%
50%
16
22.2 18.7
16.7
12.5
36
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
40.00%
50.00%
60.00%
2005 2006 2007
Klebsiella pneumoniae Pseudomonas ssp
Enterobacter ssp Escherichia coli
Serratia marcescens Otros
-
28.5
43.7
50.0
10 12.5
42.8
25
16.6
30
6.25
50
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
40.00%
50.00%
60.00%
2008 2009 2010 2011 Klebsiella pneumoniae Pseudomonas ssp
Enterobacter ssp Escherichia coli
Serratia marcescens Otros
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ANTIBITICO GRAM POSITIVOS
%
GRAM NEGATIVOS
%
Amikacina - 8.7 Ampicilina/Sulbactam 11.6 30.4 Ampicilina 91.1 47.8 Cefalotina 42.9 4.3 Cefepima - 30.4 Cefotaxima 42.9 47.8 Ceftazidima - 30.4 Ceftriaxona 11.6 47.8 Cefuroxima - 26.1 Clindamicina 52.7 - Eritromicina 71.4 - Gentamicina 62.5 21.7 Imipenem 64.3 4.3 Linezolid 0.9 0.0 Meropenem - 8.7 Oxacilina 75.9 - Penicilina 91.1 0.0 Piperacilina/Tazobactam 0.9
21.7 Vancomicina 1.8 -
-
ANTIBITICO GRAM POSITIVOS
%
GRAM NEGATIVOS
%
Amikacina - 82.6 Ampicilina/Sulbactam 7.1 21.7 Ampicilina 6.3 4.3 Cefalotina 0.9 - Cefepima - 65.2 Cefotaxima 0.9 39.1 Ceftazidima - 56.5 Ceftriaxona 7.1 43.5 Cefuroxima - 26.1 Clindamicina 30.4 - Eritromicina 21.4 - Gentamicina 24.1 69.6 Imipenem 7.1 73.9 Linezolid 44.6 Meropenem - 60.9 Oxacilina 14.3 - Penicilina 8.0 - Piperacilina/Tazobactam 5.4 52.2 Vancomicina 87.5 -
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Aunque el hemocultivo continua siendo el estndar de oro para el diagnstico para sepsis ste muestra un porcentaje bajo de aislamiento.
Los microorganismos ms frecuentemente aislados son las bacterias CoNS los cuales presentan mayor sensibilidad y resistencia.
Los antibiticos que presentan mayor sensibilidad son Vancomicina para Gram-positivo y Amikacina para Gram-negativo.
Los antibioticos con mayor resistencia son Penicilina y Oxacilina para Gram-positivos; para Gram-negativo Amipicilina, cefotaxima y ceftriaxiona.
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EL rRNA 16S BACTERIANO
La especificidad es dictada por el diseo de los dos oligonucletidos que hibridan
con las secuencias complementarias al ADN bacteriano.
Para la identificacin de las regiones conservadas se ha propuesto la utilizacin de
los oligonucletidos: RW01 y DG74, para amplificar un fragmento de 380 pb.
16S 23S 5S
1500 pb
2900 pb
100 pb
Nombre Secuencia del oligonucletido (5-3) Tamao
(pb)
RW01 AAC TGG AGG AAG GTG GGG AT 380pb
DG74 AGG AGG TGA TCC AAC CGC A
- Jordan, J. A.; Butchko, A. R.; Beth, M. Use of Pyrosequencing of 16S rRNA Fragments to Differentiate between Bacteria Responsible for Neonatal Sepsis. Journal of Molecular Diagnostics. 2005, -Jordan, J. A.; Durso, M. B. Real-Time Polymerase Chain Reaction for Detecting Bacterial DNA Directly from Blood of Neonates Being Evaluated for Sepsis. Journal of Molecular Diagnostics. 2005 -Persing, D. H.; Smith, T. F.; Tenover, F. C.; White, T. J. Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, 1a ed.; ASM Press: Washington, D. C., 1993 -Matar,G.; Khoudoud, V.; Fayad, M.; Mikati, M.; Abdelnoor, A. A two-step protocol for the identification of the etiology of bacterial meningitis in cerebrospinal fluid by PCR amplification of the 16s ribosomal RNA gene. Eastern Journal of Medicine. 1999
-
mpm (100 pb) 500 300 100
mpm (100 pb) 500 300 100
1 2 3 4
Amplificacin del gen ARNr 16S bacteriano. Carril 1. Marcador de
peso molecular (mpm) de 100pb, carril 2 control positivo, carril 3
muestra, carril 4 control negativo.
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La identificacin de la regin ARNr 16S mediante PCR ha demostrado ser una prueba molecular muy sensible y especfica en la deteccin de sta regin bacteriana. En un futuro se podra considerar a la PCR y al hemocultivo en conjunto para su uso como pruebas de laboratorio de rutina en el diagnstico de la sepsis neonatal bacteriana
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Dra. Martha Gmez
Jefe del Servicio de Neonatologa
UMAE-IMSS
Dra. Ana Lavadores May
Neonatologa-HGR IMSS
Dra. Nidia Diego Rodrguez
Neonatologa-UMAE-IMSS.
Personal Laboratorio Clnico del CMN Ignacio Garca Tllez Mrida. IMSS
Dra. Mara del Carmen Reyes S.
Neonatologa UMAE-IMSS
Dr. Abdi Oliva Garca
Mdico General-UAJ
Dra. Etna Paz Baeza.
Neonatologa-HGR-IMSS
PSS. Orlando Antonio Gernimo
PSS. Mara Palma Chim
Facultad de Qumica de la UADY