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GENTICA
DIAGNSTICO MOLECULAR
QFB. Miguel Ruz de la Cruz
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PCR (polimerase chain reaction)
Reaccin en cadena de la polimerasa
Componentes del sistema
oligonucletidos (cebadores)
Tampn
Polimerasa termoestable
dNTP
DNA molde
Protocolo general
Aplicaciones
PCR inverso
PCR en tiempo real (PCR cuantitativo)
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PCR
amplificacin de la secuencia
comprendida entre los dos
cebadores
ciclos de amplificacin
desnaturalizacin
alineacin
polimerizacin
K. Mullis 1985
Premio Nobel 1993
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Componentes del sistema
1. Oligonucletidos
secuencia que flanquean el fragmento a amplificar
actan como cebadores
tamao de 20-24 nucletidos
diseo: 3-OH bien apareadoposibilidad de mutagnesis dirigida
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Componentes del sistema
2. Tampn
Tris pH 8,4, importancia de la concentracin de MgCl2. Afecta a:
incorporacin de dNTP, actividad polimerasa y Tm cebador-molde
A 0,5 mM
B 0,8 mM
C 1,5 mM
D 2 mM
E 2,5 mM
F 3 mM
Efecto de la
concentracin de MgCl2en la PCR
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Componentes del sistema
3. Polimerasas
Direccin de polimerizacin 5-3. Necesita 3-OH. Copian molde. Usan dNTP
Taq Thermus aquaticus 40 + - -
Vent Thermococcus litoralis 400 - + -
Pfu Pyrococcus furiosus 120 - + -
Tth Thermus thermophilus 20 + - +
DNA polimerasa a) b) c) d) e)
a) origen b) vida media (min) a 95C c) exo 5 d) exo 3 e) transcriptasa inversa
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Componentes del sistema
4. dNTPs
dATP, dGTP, dGTP, dTTP a 100-200mM
5. Molde
DNA cualquier secuencia
RNA usando polimerasas con actividad de trascriptasa inversa (RT-PCR)
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Procesamiento
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Protocolo general
Ciclo desnaturalizacin Alineacin polimerizacin
1 ciclo 5/94C 2/50C 3/72C2-34 ciclo 1/94C 2/50C 3/72C ltimo ciclo 1/94C 2/50C 10/72C
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Aplicaciones de la PCR
Diagnstico de enfermedades Establecimiento de la huella gentica Aislamiento de genes Secuenciacin Mutagnesis Amplificacin de RNA: RT-PCR (trascriptasa inversa) Amplificacin de secuencias adyacentes: PCR inversa PCR en tiempo real
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PCR
Resumen
Permite amplificar con gran rapidez segmentos relativamente cortos de
DNA por medio de tcnicas de calentamiento y enfriamiento.
La combinacin de los oligonucletidos descritos en el inciso de
hibridacin molecular y sondas gnicas para la identificacin rpida de
mutaciones puntuales.
La limitacin es que solo amplifica la porcin del gen en la que se sabe
que hay una mutacin concreta pero no informa nada sobre el resto del
gen.
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SOUTHERN (DNA)
Identificacin de un gen por:
1) El DNA se purifica y se trata con una o variasenzimas de restriccin.
2)Se fracciona DNA en mltiples segmentos unode los cuales contiene el gen, se somete a
electroforesis.
3)Se desnaturalizan estos segmentos separandolas cadenas dobles de DNAt
4)Se realiza la hibridacin
5)Se realiza deteccin.
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NORTHERN (RNA)
El procedimiento es idntico aSouthern, pero el cido nucleico
analizado es el RNA.
Se emplea principalmente para obtenerinformacin sobre tamao de Rnas y
sobre el mtodo de expresin de genes
especficos.
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Western blot
Su similitud mecanstica y tcnica es similar a las 2 anteriores.
Se utiliza para detectar protenas presentesen una muestra.
Son sometidas a electroforesis en gel de poliacrilamida ytransferidas a una membrana (Western blot).
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La deteccin de las bandas proteicasen la membrana o filtro se realiza a la
unin especfica de un anticuerpo
contra la protena o regin proteica que
se quiera estudiar.
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los seres humanos tenemos una variabilidad fenotpica
que podemos observar en muchos rasgos
causas
genticascausas
ambientales
variacin en la secuencia de nucletidos: mutacin/polimorfismo
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18:49:11Deteccin y medida del polimorfismo a nivel de DNA
Si una persona se diferencia de otra en 1/300, 10 millones de pb nos
diferenciamos unos de otros. Esta variabilidad no puede detectarse
a nivel de protenas, donde los polimorfismos que se conocen no explican
la variabilidad existente en la secuencia de DNA
Polimorfismo de longitud de los fragmentos de DNA (RFLP)
son variaciones en la secuencia de DNA de un par de bases que afectan
a la secuencia de reconocimiento de una enzima de restriccin.
Se detectan por Southern blot. Biallico.
Polimorfismo del nmero de repeticiones de secuencias en tandem (VNTR)
son variaciones en la secuencia de DNA que afectan al nmero de
repeticiones de una secuencia. Corresponden normalmente a los
minisatlites y microsatlites. Se detectan por PCR. Muy polimrfico.
Polimorfismo de un solo nucletido (SNP)
son variaciones en la secuencia de DNA de un par de bases.
Se detectan con biochips
(STR)