DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.
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DETERMINACIONFLUORIMETRICAD
E QUININA EN TONICA
Pablo Fernández López
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¿QUE ES LA FLUORESCENCIA?
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FLUORESCENCIA:
Absorción molecular de un fotón
Emisión una luminiscencia a mayor
Salto de Stokes
Toma su nombre de la fluorita
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Extensión del sistema de electrones
Rigidez estructural
Impedimentos estéricos
Efecto de átomo pesado interno
Naturaleza de la transición
Formación de complejos organometálicos
Efectos de los sustituyentes
FACTORES ESTRUCTURALES
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Extensión del sistema de electrones Extensión del sistema de electrones
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Rigidez estructuralRigidez estructural
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Impedimentos estéricosImpedimentos estéricos
cis 1,2-difenileteno trans 1,2-difenileteno
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Efecto de átomo pesado internoEfecto de átomo pesado interno
F
Cl
Br
I
FLUORESCENCIARELATIVA
100%
7%
0.2%
<0.05%
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Absortividad molar alta
Velocidad de fluorescencia elevada
nAbsortividad molar baja
Velocidad de fluorescencia pequeña
Naturaleza de la transición fluorescenteNaturaleza de la transición fluorescente
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Formación de complejos organometálicosFormación de complejos organometálicos
Cambio en la naturaleza de la transición
n
-Análisis de metales
-Análisis de ligandos poco fluorescentes
Favorecer el cruzamiento entre sistemas
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Efectos de los sustityentesEfectos de los sustityentes
Los electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y -OR
aumentan la eficacia de la fluorescencia,desplazándola a mayores
Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y –NO2,reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transición n- *.
Los halógenos producen efecto de átomo pesado interno
Los grupos sulfónicos no modifican significativamente la fluorescencia
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FACTORES DEL MEDIO
Temperatura
Polaridad
Viscosidad
Atomo pesado externo
pH
Puentes de hidrógeno
Otros solutos: atenuación de la fluorescencia
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2 8 0 3 2 0 3 6 0L o n g itu d d e o n d a e x c itac ió n (n m )
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
Inte
nsid
ad d
e fl
uore
scen
cia
K
I s
Ia
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Fluorescencia de la orina
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Fluorescencia del suero sanguíneo
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Fluorescencia de la leche de vaca
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ANALISIS CUALITATIVO
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IDENTIFICACION EN EL ESPECTRO DE LAS DIFERENTES
BANDAS Y PICOS
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Fluorescencia de la quinina
excitación
emisión
Flu
ore
scen
cia
Longitud de onda (nm)
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Fluorescencia de la quinina
excitación
emisión
Flu
ore
scen
cia
Longitud de onda (nm)
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Fluorescencia de la quinina
excitación
emisión
Flu
ore
scen
cia
Longitud de onda (nm)
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Fluorescencia de la quinina
excitación
emisión
Flu
ore
scen
cia
Longitud de onda (nm)
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Fluorescencia de la quinina
excitación
emisión
Flu
ore
scen
cia
Longitud de onda (nm)
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Fluorescencia de la quinina
excitación
emisión
Flu
ore
scen
cia
Longitud de onda (nm)
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Fluorescencia de la quinina
excitaciónemisión
Flu
ore
scen
cia
Longitud de onda (nm)
Máximo de excitación Máximo de emisión
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Fluorescencia de la quinina
excitación emisión
Flu
ore
scen
cia
Longitud de onda (nm)
¿Esto que es?
¿Esto que es?
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200 250 300 350 400 450 500
LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D
ESPECTRO DE EXCITACION SIN SELECCIONAR em.La dispersión ocurre a todas las longitudes de onda.
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ESPECTRO DE EXCITACION A em = 450 nmResulta un pico de luz dispersa proveniente de la lámpara a ex = em = 450 nm.
200 250 300 350 400 450 500LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D
4 50 nm
Pico Rayleigh
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ESPECTROS ANTERIORES SUPERPUESTOS
200 250 300 350 400 450 500LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D
4 50 nm
![Page 52: DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.](https://reader036.fdocuments.mx/reader036/viewer/2022082404/54e455a14a795950188b5997/html5/thumbnails/52.jpg)
200 250 300 350 400 450 500LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D
4 50 nm
Pico Rayleigh
ESPECTRO DE EXCITACION A em = 450 nm.
RENDIJAS A 16 nm RENDIJAS A 2nm
ANCHURA DEL RAYLEIGH SEGUN RENDIJA
![Page 53: DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.](https://reader036.fdocuments.mx/reader036/viewer/2022082404/54e455a14a795950188b5997/html5/thumbnails/53.jpg)
200 250 300 350 400 450 500LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D
450 nm480 nm
300 350 400 450 500 550 600LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
ESPECTROS DE EXCITACION A DOS em
RENDIJAS A 16 nm RENDIJAS A 2nm
POSICION DEL RAYLEIGH RESPECTO AL ESPECTRO
![Page 54: DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.](https://reader036.fdocuments.mx/reader036/viewer/2022082404/54e455a14a795950188b5997/html5/thumbnails/54.jpg)
COMPARACION DE ESPECTROS
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375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
PA T RO N DE Q UI N I N A
![Page 56: DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.](https://reader036.fdocuments.mx/reader036/viewer/2022082404/54e455a14a795950188b5997/html5/thumbnails/56.jpg)
375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
DI S O LUCI O N DE T O N I CA
![Page 57: DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.](https://reader036.fdocuments.mx/reader036/viewer/2022082404/54e455a14a795950188b5997/html5/thumbnails/57.jpg)
375 400 425 450 475 500 525 550 575 600LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
DI S O LUCI O N DE T O N I CA
PA T RO N DE Q UI N I N A
NORMALIZACION DE ESPECTROS
![Page 58: DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.](https://reader036.fdocuments.mx/reader036/viewer/2022082404/54e455a14a795950188b5997/html5/thumbnails/58.jpg)
375 400 425 450 475 500 525 550 575 600LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
DI S O LUCI O N DE T O N I CA
PA T RO N DE Q UI N I N A
375 400 425 450 475 500 525 550 575 600LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
DI S O LUCI O N DE T O N I CAN O RM A LI Z A DO A LPA T RO N DE Q UI N I N A
PA T RO N DE Q UI N I N A
NORMALIZACION DE ESPECTROS
![Page 59: DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.](https://reader036.fdocuments.mx/reader036/viewer/2022082404/54e455a14a795950188b5997/html5/thumbnails/59.jpg)
ANALISIS CUANTITATIVO
![Page 60: DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.](https://reader036.fdocuments.mx/reader036/viewer/2022082404/54e455a14a795950188b5997/html5/thumbnails/60.jpg)
375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
100 ppb
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375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
100 ppb200 ppb
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375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
100 ppb200 ppb300 ppb
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375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
100 ppb200 ppb300 ppb400 ppb
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375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
100 ppb200 ppb300 ppb400 ppb500 ppb
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375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
100 ppb200 ppb300 ppb400 ppb500 ppbT O N I CA
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375 400 425 450 475 500 525 550 575 600
LO N GI T U D DE O N DA (nm)
0
1
2
3
4
5
6
7
INTE
NSI
DA
D (n
m)
100 ppb200 ppb300 ppb400 ppb500 ppbT O N I CA
ex = 350, em = 450 nm
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[Quinina] (ppb)
Fluorescencia
100 1.19
200 2.38
300 3.49
400 4.53
500 5.93
tónica 3.770 100 200 300 400 500 600
CO N CE N T RA CI O N (ppb)
0 . 0
0 . 5
1 . 0
1 . 5
2 . 0
2 . 5
3 . 0
3 . 5
4 . 0
4 . 5
5 . 0
5 . 5
6 . 0
6 . 5
7 . 0
FLU
ORE
SCEN
CIA
A j uste linear , y=b* x + aY = 0. 01163 * X + 0. 0150002Coefi ciente de la determinación r^2 = 0. 9977
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PROCEDIMIENTO 1.- Preparar disoluciones de 100, 200, 300, 400 y 500 ppb a partir de una disolución de sulfato de quinina de 2.5 ppm y enrasar a 25 ml con H2SO4 0.1 N.
2.- Registrar los espectros de excitación y emisión de una de las muestras y medir la intensidad de fluorescencia a 350 nm de excitación y 450 nm de emisión de todas ellas para construir la recta de calibrado. 3.- Pasar el contenido de un agua tónica a un vaso de precipitado y agitar vigorosamente a temperatura ambiente durante 10 minutos. 4.- Tomar 1.0 ml y añadir la cantidad necesaria de H2SO4 concentrado (36 N) para que en un volumen final de
250 ml sea 0.1 N. 5.- Registrar los espectros de excitación y emisión, comprobando que en estas condiciones la fluorescencia del agua tónica es debida únicamente a la quinina. 6.- Medir la fluorescencia a 350 nm de excitación y 450 nm de emisión calculando la concentración de quinina en el agua tónica a partir de la recta de calibrado.
MATERIALES PRODUCTOS
- Espectrofluorímetro- Matraces de 25 ml.- Pipetas graduadas.- Vaso precipitado.- Agitador magnético con núcleo.
- Agua tónica- H2SO4
- Bisulfato de quinina
PRÁCTICA Nº 1DETERMINACIÓN ESPECTROFLUORIMÉTRICA DE QUININA EN AGUA TÓNICA
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1. Componentes principales de un espectrofluorímetro. Función principal de cada uno de ellos.
2. En los espectros que se han dado en la práctica se muestra el espectro de excitación y de emisión de fluorescencia de quinina. Comentarlos brevemente, es decir:
a) Identificar cada uno de los espectrosb) Localización de los máximos. Número de bandas que
presenta cada espectroc) Señalar los máximos de intensidad. ¿Conviene realizar el
calibrado a dichos máximos? ¿Por qué?d) Encontramos alguna simetría entre ambos espectros. ¿Por
qué?e) En excitación encontramos más de una banda de
fluorescencia. Si se pretende evitar interferencia en la medida por parte de otras sustancias que puedan estar presentes en la muestra, ¿Qué banda se debería elegir para la determinación de quinina en tónica?
PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO
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PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO3. En espectrofotometría, los espectros son de excitación mientras que en espectrofluorimetría estos son de emisión y de excitación, es decir tridimensionales. Ventajas e inconvenientes (al menos 3)
4. ¿Coincide un espectro de excitación de fluorescencia con uno de absorbancia (espectrofotometría)? ¿Por qué? Explicarlo en términos de transiciones electrónicas.
5. ¿Cómo se relaciona la señal instrumental que se mide en fluorescencia y en espectrofotometría respecto a la intensidad de la radiación incidente? ¿Es ésta monocromática o policrómática? Explique la respuesta
6. Dibuja un posible espectro de excitación de fluorescencia de la clorofila sabiendo que absorbe en las regiones visibles del azul y del amarillo. Dibuja igualmente su espectro de emisión fluorescente.
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PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO
7. Una muestra problema ofrece un espectro de absorbancia en el que se observan tres máximos claramente definidos ¿Qué puede deducirse al respecto?
8. La muestra anterior ofrece un espectro de emisión de fluorescencia en el que se observan dos máximos claramente definidos. ¿Qué puede deducir en este caso? Dibujar este espectro y su correspondiente de excitación de fluorescencia (téngase presente tanto los valores de longitud de onda como de intensidad).
9. Proponga una estrategia para detectar el pico de luz dispersa (pico Rayleigh) en un espectro de emisión de fluorescencia.
10. Resultados obtenidos: recta de calibrado y concentración de quinina en la tónica.
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La quinina, C20H24N2O2 es un alcaloide natural, blanco y cristalino, con propiedades antipiréticas, antimalaria y analgésicas. Fue el principal compuesto empleado en el tratamiento de la malaria ya que resulta tóxico para el plasmodium, el parásito que infecta los glóbulos rojos. Actualemente, ha sido sustituida por otros medicamentos sintéticos más eficaces. Se puede utilizar todavía en el tratamiento de la malaria resistente, los calambres nocturnos en las piernas y en la artritis. Sin embargo, su usoa dosis terapéuticas puede provocar cinchonismo; en dosis altas o casos raros, puede ser incluso letal, debido a un edema pulmonar agudo y fulminante. El dosis muy elevadas puede provocar aborto o defectos de nacimiento (especialmente sordera) si es tomada por mujeres durante el embarazo. La quinina se extrajo por primera vez de la corteza de la quina, un árbol presente naturalmente en Sudamérica. Fue aislada y bautizada así, en 1820, por los investigadores franceses Pelletier y Caventou. La quinina se usa como potenciador del sabor en el agua tónica, confiriéndole su característico sabor amargo. Debido a los efectos secundarios de altas dosis de quinina, su concentración se ha limitado por la FDA estadounidense a un máximo de 83 ppm. Este valor es aproximadamente un cuarto del empleado terapéuticamente.
¿QUE ES LA QUININA?
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Quinina Número CAS [130-95-0]
Fórmula química C20H24N2O2
Peso molecular 324.42
Propiedades físicas
Punto de fusión 177°C (descompone ligeramente)
Punto de sublimación 180°C (en alto vacío)
Densidad 1.293 g/cm3
Solubilidad en agua
1 gramo/1900 mL, pH de la disolución saturada: 8,8, también soluble en etanol (1 g/0,8 mL), 4 g/l (éter anhidro), benceno (1 g/80 mL), cloroformo (1 g/1,2 mL), glicerol (50 g/L)
Fluorescencia Azul, se intensifica en ácido sulfúrico