INFORME # 3. DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR EL MÉTODO NUMERO MAS PROBABLE NPM

INFORME # 3. DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR EL MÉTODO NUMERO MAS PROBABLE NPM

RESULTADOS DE LA PRÁCTICA

IDENTIFICACIÓN DEL ALIMENTO

Nombre: Arepa casera.

Empaque: No aplica.

Nº lote: No aplica

Fecha de vencimiento: No aplica

INDICADOR MICROBIOLÓGICO O PATÓGENO EVALUADO

Coliformes Totales y Fecales. E coli

Rango microbiológico: No aplica para el NMP.

Limite de NMP inferior 3.5 y superior a 120.

REPORTE MICROBIOLÓGICO

Medios de cultivo y reactivos

Caldo Fluorcult – LMX (Peptona 10 g/l; Lactosa 10 g/l; Bilis de buey desecada 20 g/l; Verde brillante 0,0133 g/l; L-triptofano 1 g/l; 4-metilumbeliferil-b-D-glucurónido 0,1 g/l.)

Agua peptonada

Reactivo de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldehído 5%(p/v) en alcohol amílico o isoamílico con 2,5%(v/v) de HCl(c).

Temperatura de Incubación: 35°C

Tiempo de Incubación: 24 horas

COLIFORMES TOTALES

DILUCIÓN/TUBO 1 2 3 CODIGO

10-1 + + + 3

10-2 - - - 0

10-3 - - - 0

Los tubos positivos presentaron un color azul/verdoso y los tubos que dieron negativo conservaron el color del agar (transparente).

REPORTE

Según el código formado por la combinación de tubos positivos y negativos se busco en la tabla estadística del número más probable (NMP), obteniendo el siguiente resultado:

23 NMP / gr de arepa.

COLIFORMES FECALES

Los tubos positivos fueron expuestos a luz ultravioleta y se adicionaron 2 gotas del reactivo de Kovacs, el cual permite que en los tubos que dan positivo para E.coli se forma un aro de color rojizo en la parte superior.

DILUCIÓN/TUBO 1 2 3 CODIGO

10-1 + + + 3

10-2 - - - 0

10-3 - - - 0

E. COLI= La prueba es positivo (+)

REPORTE

Según el código formado por la combinación de tubos positivos y negativos se busco en la tabla estadística del número más probable (NMP), obteniendo el siguiente resultado

23 NMP / gr de arepa.

ANALISIS DE RESULTADOS

La arepa es un alimento el cual posee una serie de características especiales, por su proceso de elaboración. Primero que todo en el proceso de análisis de la muestra se tomó una porción de arepa y se homogenizó en una solución diluyente y se sembraron diluciones 10-1, 10-2 y 10-3, por triplicado respectivamente para evaluar el cambio de coloración a azul verdoso, el cual resultó positivo en 3 de las nueve muestras, ya que el alimento a analizar presenta características que lo hacen ajeno a esta clase de microorganismos. (Coliformes totales, fecales) y en la revisión que se le efectuó a los otros 6 tubos, todos conservaban una misma coloración, que indicada la ausencia de Microorganismos indicadores (CT y CF).

La presencia de E. COLI se pudo haber generado por las deficientes prácticas sanitarias del manipulador, teniendo presente que no usa implementos necesarios para la manipulación de un alimento; la mesa de trabajo puede ser de madera lo cual es un foco de contaminación y el sitio de trabajo es expuesto al ambiente donde frecuentemente pasan carros y personas.

Este alimento (arepa) no es apto para consumo, ya que evidencia la presencia de E. COLI, lo cual puede generar una enfermedad gastrointestinal a los consumidores.

La presencia de coliformes totales nos permite evaluar la calidad microbiológica del producto aunque no siempre indican una contaminación fecal.

Los recuentos de coliformes fecales evidenciaron la contaminación del producto ya sea por la materia prima utilizada o por fallas en el proceso de elaboración antes de la venta al consumidor.

CONCLUSIONES

Se hizo un buen manejo de la parte instrumental de laboratorio para que los resultados obtenidos fueran de una excelente margen de confianza, pero la muestra que utilizamos mostró una contaminación mínima por parte de los coliformes (T y F); y además el medio estaba completamente aséptico, facilitando mucho mas una buena elaboración de un plan de trabajo organizado, pues se mantuvieron todas las superficies con buena limpieza y desinfección y todos los utensilios utilizados en la practica de la misma forma.

Las arepas que se venden en la calle, poseen fuerte potencialidad para la transmisión de enfermedades gastrointestinales debido a que son alimentos extensamente manipulados.

Podemos aplicar los coliformes como indicadores en detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos, además, en la evaluación de la calidad microbiológica de un producto y la evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas en el equipo.

Las bacterias coliformes, comprenden la E. coli y Enterobacter aerogenes. Ambos organismos son bacilos cortos, gram negativos que fermentan la lactosa con producción gas. E. coli tiene su localización primaria en el tracto intestinal del hombre y de los animales, y de allí su nombre coli, que deriva del colon. E. coli se encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal de los animales, donde no suele causar enfermedad.

Los organismos coliformes son buenos indicadores de la calidad higiénica de los alimentos, se basa en la experiencia positiva adquirida en el agua. El hallazgo de gran número de organismos el los alimentos y en el agua indica la polución o contaminación fecal. Ya que las enfermedades transmitidas por el agua generalmente son de carácter intestinal la presencia de polución indica la posibilidad de que existan agentes etiológicos productores de estas enfermedades.

CUESTIONARIO

1. Describa los diferentes métodos para el recuente de CT y CF.

METODO DEL NMP

La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa.

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h.

La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.

METODO DE FILTRACIÓN A TRAVÉS DE UNA MEMBRANA (MF)

La muestra a analizar se pasa a través de un filtro de membrana estéril, que tiene las bacterias y luego el filtro se encuba en un medio de cultivo. Se deben tomar dos muestras de agua, las cuales deben ser tomadas en dos membranas y se incuban en agar Chapman TTC a 36 ºC y 44ºC, respectivamente. Después de 21 horas de incubación:- E. coli y Citrobacter spp presente colonias de color amarillo con el centro de color naranja.- Enterobacter spp forma colonias de color rojo y amarillo oscuro con el centro de color naranja. El medio es amarillo.

- Formulario de Klebsiella spp de color rojo o amarillo, pero sin centro. El medio es amarillo.

El agar lactosa TTC con Tergitol 7 es un medio selectivo y diferencial, se utiliza para el control presuntivo de E. coli y coliformes en las aguas para el consumo humano por la técnica de membrana de filtración.

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES POR CUENTA EN PLACA

El medio selectivo a emplear es agar-lactosa-bilis-rojo violeta (ABRV).

Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el ácido producido por la fermentación de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitación de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente están rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa.

Debe ponerse una sobre capa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, más adecuadas para los coliformes.

Para utilizar este método se debe considerar:

Si el alimento contiene mono o disacáridos en altas concentraciones, éstos pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias semejantes a las de coliformes.

El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes de 3 h. a partir de su preparación; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar en baño de agua a 45 °C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo.

Debe ponerse una sobre capa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, más adecuadas para los coliformes.

El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de incubación, especialmente la incubación prolongada, pueden ocasionar la formación de colonias rojas de cocos Gram positivos.

El rango estadístico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de sensibilidad del método) es de 15 a 150 UFC por placa.

El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.

2. Mencione mínimo 4 ejemplos en los que es reglamentario hacer el recuento de CT y CF.

Algunos de los alimentos reglamentarios para hacer el recuento de CT y CF en las pruebas microbiológicas son:

Plantas de agua Alimentos envasados para niños Agua potable Huevo pasteurizado Alimentos deshidratados para niños lactantes Mayonesa Mermelada

3. ¿Qué otras aplicaciones tiene el método de NMP?

ENUMERACION BACTERIANA: EL NÚMERO MÁS PROBABLE

EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística.

Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de plantas, (ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii) determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.

En este ejercicio, se utilizará una variante de esta metodología para estimar la densidad total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a utilizarse será la capacidad de microorganismos a formar colonias en medios sólidos de crecimiento.

4. Enumere y describa la composición de los medios de cultivo que se pueden utilizar para el recuento de CT y CF

SIMSulfato, indol y movilidad.Medio plano de color amarillo.Estado semisólido.pH 7.3 + 0.2

Es un medio que se usa para determinar la formación de sulfuro de hidrógeno, la producción de indol y la movilidad en el diagnóstico de Enterobacterias.

(g/litro)

Peptona de caseína 20 gPeptona de carne 6.1gSulfato de hierro y amonio 0.2gTiosulfato de sodio 0.2gAgar 3.5g

MIOMovilidad, indol, ortinina.Medio plano de color púrpura.Estado semisólido.pH 6.5 + 0.2

El Medio MIO es utilizado para la diferenciación de Enterobacterias en base a su movilidad, capacidad para descarboxilar la lisina y la producción de indol. Este medio también es conocido como Medio para Movilidad Indol y Ornitina.Edered y Clark así como Oberhofer y Hajkowsky desarrollaron el Medio MIO para poder observar las reacciones de movilidad, producción de indol y descarboxilación de la lisina simultáneamente. Estas reacciones son determinantes para la identificación de Enterobacterias. En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y nitrógeno. El extracto de levadura provee las vitaminas y cofactores requeridos para el desarrollo. La dextrosa proporciona la fuente de energía. El agar es adicionado para demostrar la movilidad. El púrpura de bromocresol actúa como indicador de cambios de pH facilitando la detección de la descarboxilación de la lisina.

(g/litro)

Extracto de levadura 3.0 gPeptona de gelatina 10.0 gPeptona de caseina 10.0 g

L-Ortinina 5.0 gDextrosa 1 gAgar 2 gPúrpura de bromocresol 0.02g

AGAR MCCONKEY

Medio diferencial para la detección, aislamiento y enumeración de bacterias coniformes y patógenas intestinales en aguas, productos lácteos y muestras biológicas. Su acción diferencial esta basada en que los microorganismos capaces de fermentar lactosa producen una caída de pH, junto con una absorción del colorante, apareciendo en la colonia el color rojo, las colonias de microorganismos que no fermentan la lactosa permanece incolora.

Pancreático digestivo de gelatina- 17gPancreático digestivo de caseína- 1.5gPeptona de tejido animal- 1.5gLactosa- 10gSales Biliares- 1.5gCloruro Sódico- 5gRojo Neutro- 0.03gCristal Violeta- 0.001gAgar- 13.5gpH 7.1+- 0.2 a 25 grados

AGAR LEVINE

Medio para el aislamiento y la diferenciación de los Escherichia coli y Enterobacterias, fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa y para la identificación rápida de los albicans.

(g/litro)

Peptona pancreática- 10gLactosa - 10gFosfato Dipotásico- 2gAgar- 15gEosina- 15gAzul de metileno- 0.065gpH 7.1+- 0.2 a 25 grados

EMB

Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

(g/litro)

Peptona 10gLactosa 5gSacarosa 5gFosfato dipotásico 2gAgar 13.5gEosina 0.4gAzul de metileno 0.065g

Para escherichia coli se observan colonias con brillo metálico y centro negro azulado

AGAR VERDE BRILLANTE.

Medio para crecimiento selectivo y numeración de gérmenes mediante determinación del titulo de E. Coli en agua, leche, alimento y otros materiales, la bilis inhibe notablemente el crecimiento de la flora contaminante incluso clostridios degradadores de lactosa con formación de gas, es un indicativo de la presencia de E. Coli.

En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el verde brillante actúa como agente selectivo.

(g/litro)

Pluripeptona 10gExtracto de levadura 3gCloruro de sodio 5gLactosa 10gSacarosa 10gRojo fenol 0.08Verde brillante 0.0125Agar 20gpH final: 6.9 ± 0.2

Escherichia coli ATCC 25922: las colonias se presentan Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento

AGAR ENDO O EMB VERDE BRILLANTE

COLONIAS CON BRILLO METALICO:Escherichia coliOtras coliformes

COLONIAS VERDES:Escherichia coliOtras coliformes

COLONIAS BLANCAS:SalmonellaShigellaProteusPseudomonas

COLONIAS ROJASSalmonellaShigellaProteusPseudomonas

AGAR CHROMOCULTAgar selectivo para la identificación simultanea de coliformes totales y E.coli.Gracias a la acción conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampón de fosfatos se garantiza un rápido crecimiento también de coliformes con daños subletales. El contenido de lauril sulfato inhibe ampliamente el crecimiento de bacterias grampositivas, sin tener influencia sobre el crecimiento de coliformes.

(g/litro)

Peptona 3gCloruro sódico 5gDihidrogenofosfato potásico 1.7gDihidrogenofosfato dipotásico 3gPiruvato sódico 1gTriptófanoAgar-agar 21gLauril sulfato sodico0.1Mezcla cromógenos 0.2g

CALDO BRILLACaldo-verde-brillante-bilis- lactosaPara el enriquecimiento y numeración de escherichia coli. La bilis y el verde brillante inhiben notablemente el crecimiento de la flora indeseable acompañante. la fermentación de lactosa con formación de gas, que es indicativo de la presencia de e. coli, se demuestra mediante campanas de DURHAM. Los restantes coliformes también crecen en este medio pero casi siempre sin formación de gas.

(g/litro)

Peptona 10gLactosa 10gBilis de buey desecada 20gVerde brillante 0.0133

CALDO LACTOSA

Medio de cultivo exento de sustancias inhibidoras para el ensayo previo orientado a bacterias coliformes especialmente E.coli. La utilización de lactosa se demuestra por la formación de gas, que se recoge en campanas de DURHAM.

(g/litro)Peptona de gelatina 5gExtracto de carne 3gLactosa 5g

CALDO LAURIL SULFATO

Medio recomendado para detección y recuento de coliformes en aguas, aguas residuales y alimentos. Medio rico en nutrientes, que permite un rápido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa, aún de los fermentadores lentos.

La Triptosa es la fuente de nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmóticoEs un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompañante. Por la fermentación de la lactosa, se produce ácido y gas, éste último se evidencia al utilizar las campanas Durham.

(g/litro)

Triptosa 20gLactosa 5gCloruro de sodio 5gLauril sulfato de sodio 0.1gFosfato dipotásico 2.75Fosfato monopotásico 2.75pH final: 6.8 ± 0.2Para recuento de coliformes totales, técnica del Número Mas Probable

5. Describa el procedimiento para la identificación de Escherichia coli a partir de los tubos múltiples usados en el recuento de CT y CF.

E. Coli y Coliformes

Principios. Las investigaciones ecológicas han puesto de manifiesto que E. Coli, procede del intestino de hombre y de los intestinos de los animales de sangre caliente, si bien puede sobrevivir y aun multiplicarse en determinados substratos. Del origen fecal de E. Coli, se concluye que si esta bacteria se encuentra en algún

alimento ello indica que han tenido lugar una contaminación de origen fecal y que, consiguientemente, existe el riesgo de que hayan llegado al alimento en cuestión microorganismos patógenos de procedencia enterica.

En los alimentos que han sido sometidos a un tratamiento de higienización eficaz, que asegura su inocuidad para el Consumidor, por lo general, la determinación de coliformes o gérmenes del grupo coliaerógenes: gérmenes que, incubados a 37° C, fermentan la lactosa con producción de gas en un medio, con verde brillante y 2 % de bilis. Ya hemos señalado antes que esta determinación no tiene necesariamente relación con una contaminación de origen fecal y consiguientemente, con la posible presencia en los alimentos de microorganismos patógenos de procedencia entérica, sino que es sólo una indicación de deficiencias o fallos en el tratamiento industrial de los alimentos.Se utiliza a veces también la denominación "coliformes fecales" refiriéndose a los microorganismos que crecen y producen gas a partir de la lactosa en un medio que contiene sales biliares u otros agentes selectivos, equivalentes y que se incuba a 44-45.5 °C.

Metodología.-E.coli.La determinación de este microorganismo en los alimentos no presenta problemas analíticos especiales. Cuando su número supera claramente la cifra de I/ml ó de I0/gr, en el Caso de un alimento sólido, puede ensayarse una técnica de recuento directo. Se ha demostrado sin lugar a dudas que la utilización del agar de MacConkey a 44  0,1°C, en anaerobiosis es el método de elección de las colonias obtenidas en este medio, una proporción adecuada, entre 3 y 10 por placa o bolsa, se someten a la prueba de Mackenzie-Taylor-Gilbert (MTG): formación de gas a partir de la lactosa en caldo verde brillante bilis lactosa Y producción de endol a partir de péptidos conteniendo triptófano, en ambos Casos a 44°C.Cuando el número de células de E. coli en los alimentos sea muy inferior al señalado más arriba, procede realizar las pruebas de presencia o ausencia o una determinación por el método del NMP. También en estos casos se cuenta con una técnica fiable. Primero se lleva a cabo el enriquecimiento en el clásico caldo lactosado bilis verde brillante y después agar de MacConkey que se incuba a 44°C.

Coliformes-Metodología.

Como ya hemos señalado repetidamente, el grupo coli-aerogenes no está definido de una manera precisa. Por lo tanto los resultados dependen en gran medida del método utilizado. La razón de la conveniencia de esta determinación, de sus partidarios, reside en una mayor facilidad de ejecución.Existen dos técnicas perfectamente estandarizadas tanto para el recuento directo de Ufc del grupo coli-aerogenes como para la prueba de presencia o ausencia (PA). Las primeras emplean un agar tipo bilis lactosa de MCConkey y sus modificaciones. La segunda hace uso de un caldo bilis verde brillante ó lauril

sulfato lactosa. La temperatura de incubación varia de 30 a 37 "C. Los niveles de identificación aplicados (presunción, confirmación Y terminación o pruebas finales).

BIBLIOGRAFIA

PELZAR, MICHAEL. Microbiología. Editorial Mc Graw – Hill. 2ª edición. Impreso en México, S.A.

COLLINS, C.H. Métodos Microbiológicos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza España. Impreso en España.

ALFARO, S. Carolina Y ROJAS, M. XIMENA. “validación de los métodos de filtración por membrana y sustratodefinido readycult, para la detección de coliformes totales y escherichia coli en aguas crudas, tratadas y potables en el acueducto de zipaquira”. pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Microbiologia Industrial. Bogota D,C. Bajado de: http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis271.pdf. 2006