PAS DIAGNOSTICA CRA 49C No. 76 – 224 BARRANQUILLA-COLOMBIA Tel: (57-5) 3018686 Fax: (57-5) 3580170

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SIGNIFICADO CLINICO: 1-3

La cuantificación de Ácido Úrico es comúnmente usada en el diagnóstico de gota. Niveles altos (hiperuricemia) se pueden presentar en leucemia, policitemia, arteriosclerosis, diabetes, hipotiroidismo y condiciones asociadas con una reducción en la función renal; Niveles bajos están presentes en pacientes con la enfermedad Wilson’s. MÉTODO: El Ácido Úrico ha sido históricamente determinado por métodos colorimétricos con variaciones de fosfotungstato 4,5 y reducción de hierro 6,7. Metodologías recientes usan las enzimas uricasa y peroxidasa, y un cromógeno para producir un producto final colorimétrico, demostrando mayor especificidad para la determinación de ácido úrico 8,9. El procedimiento de PAS DIAGNOSTICA usa uricasa, peroxidasa y el cromógeno TBHB para producir un producto final colorimétrico. El producto final colorimétrico producido en esta reacción puede ser medido a 520 nm y es proporcional a la concentración de ácido úrico en la muestra. PRINCIPIO: Uricasa Acido Urico + O2 + H2O Alantoína + CO2 + H2O2

Peroxidasa H2O2 + 4-AAP + TBHB Quinoneimina + H2O El ácido úrico es oxidado a alantoína por la acción de la uricasa con la producción de H2O2. El peroxido reacciona con la 4-aminoantipirina (4-AAP) y THBH en la presencia de peroxidasa para formar un colorante de quinoneimina. El producto resultante en la absorbancia a 520nm (500-550nm) es proporcional a la concentracion de acido urico en la muestra. CONTENIDO Y COMPOSICIÓN:

Reactivo: 4-Aminoantipirina 0.5 mM, TBHB 1.75mM, Uricasa >32 U/L, Peroxidasa (rábano) >1300U/L, Estabilizadores y aditivos no reactivos, pH (7.8 – 8.2). Estándar: Acido Úrico 5mg/dL. Evite ingerir el reactivo, la toxicidad no ha sido determinada. Contiene ácida de sodio (0.05%) como preservativo y puede reaccionar con la tubería de plomo o cobre. Enjuague las tuberías de drenaje con abundante agua. PREPARACIÓN DEL REACTIVO:

El monoreactivo y el estándar están listos para su uso. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO: Conservado de 2-8ºC el reactivo es estable hasta la fecha indicada en la etiqueta. DETERIORO DEL REACTIVO: No utilice este reactivo si: 1. El reactivo reconstituido tiene una absorbancia del blanco mayor de 0.5 a 500 nm. 2. El reactivo esta turbio. 3. El reactivo no cumple con los controles establecidos. RECOLECCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA: Suero libre de hemolisis, el ácido úrico en suero es estable por 3 días a 2-8°C y hasta 6 meses a -20ºC.2 INTERFERENCIA: Los siguientes resultados fueron obtenidos en estudios para determinar el nivel de interferencia de hemoglobina, bilirrubina, y lipemias. Hemoglobina: No interferencia (±10%) hasta 200 mg/L. Bilirrubina:

No interferencia (±10%) hasta 20.9 mg/dL. Lipemias: No interferencia (±10%) hasta 1020 mg/dL. Un número de drogas y substancias afectan la determinación de Acido Úrico. 10

EQUIPO ADICIONAL REQUERIDO: 1. Analizador de química clínica con longitud de onda de 500 nm y temperatura de 37ºC y

sus consumibles. 2. Material control (suministrados por PAS DIAGNOSTICA).

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO: Procedimiento para uso manual. 1) Atemperar el reactivo a temperatura ambiente. 2) Dispensar 1000 µL del reactivo en cada tubo (Estándar, Controles y muestra) e

incubar a 37ºC. 3) Agregar 20 µL de Estándar, muestra problema y/o suero control al tubo

correspondiente. Mezclar, e incubar a 37ºC durante 10 minutos 4) Ajustar a cero el espectrofotómetro con blanco de reactivo a 500 nm. 5) Leer la absorbancia exactamente a los 10 minutos después de la adición del

estándar, controles y muestras. Procedimiento automatizado: Para este procedimiento siga las instrucciones contenidas en el manual de operación del analizador y las aplicaciones de los reactivos PAS DIAGNOSTICA® para los analizadores más comunes.

PARÁMETROS:

Temperatura 37°C

Longitud de onda 500 nm

Tipo de Ensayo Punto final

Dirección Creciente

Relación: Muestra/Reactivo 1:50

Volumen de Muestra 0.003mL (3 L)

Volumen de Reactivo 0.150 (150 L)

Tiempo de incubación 5 minutos

CALCULOS: Abs: Absorbancia Absmuestra x Concentracion del estándar (mg/dL) = C Ácido úrico en mg/dL Absestándar Ejemplo de cálculos: Abs. Muestra = 0.071 Abs. Estándar = 0.302 Concentración del Estándar = 5.0 0.071 x 5.0 = 1.18 mg/dL ácido úrico 0.302 CALIBRACION: Esta prueba debe ser calibrada utilizando el Calibrador de Química de PAS DIAGNOSTICA (P/N: CAL1-5) o un estándar apropiado. CONTROL DE CALIDAD: La integridad de la reacción debe ser evaluada usando un control de dos niveles con valores conocidos como el PAS DIAGNOSTICA Control de Química (P/N: CON1-5 y CON2-5). LIMITACIONES: Valores superiores a 25 mg/dL debe ser diluida la muestra 1:1 con solución salina y evaluada nuevamente, multiplicando el resultado final por 2. VALORES DE REFERENCIA: 11

Niños: 2.0- 5.5 mg/dL Adulto Masculino: 3.5 – 7.2 mg/dL Adulto femenino: 2.6 – 6.0 mg/dL Se recomienda que cada laboratorio establezca su rango de normalidad7. DESEMPEÑO: Linealidad: Es linear de 0.2 a 25 mg/dL, cuando se evalúa de acuerdo a las recomendaciones del ensayo. Comparación del Método: Los siguientes resultados fueron obtenidos mediante estudios realizados entre éste procedimiento y uno similar:

Concepto Cromógeno

TBHB DCHBS

Número de pares de muestras 58 50

Rango de muestras 1.70 – 20.70 (mg/dL) 2.20 – 11.30 (mg/dL)

Coeficiente de Correlación 0.9792 0.9977

Pendiente 1.044 1.117

Intercepto 0.00 (mg/dL) -0.58 (mg/dL)

Precisión: Entre Corridas Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Promedio (mg/dL) 6.60 11.31 20.12 S.D. (mg/dL) 0.15 0.24 0.30 C.V. (%) 2.2 2.1 1.5 Entre Series: Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 S.D. (mg/dL) 0.27 0.47 0.51 C.V. (%) 4.1 4.1 2.5 Sensibilidad: Un factor de calibración aproximado a 58.66 fue obtenido, lo cual es equivalente a una sensibilidad de 0.01704 ∆ Abs por mg/dL. NOTAS:

Este ensayo requiere el uso de un Suero Estándar o Estándar apropiado.

Los volúmenes de muestra y reactivo pueden ser modificados proporcionalmente para adaptarlos a los requisitos de varios instrumentos.

Estudio realizado en Synchron CX.

REFERENCIAS: 1. Searcy RL: Diagnostic Biochemistry. McGraw-Hill, New York, NY, (1969). 2. Henry RJ, Common C, Winkelman JW (eds), Clinical Chemistry: Principles

and Techniques. Harper & Row, Hagerstown, MD, (1974). 3. Balls ME: Adv Clin Chem 18:213, (1976). 4. Folin, D., Dennis, W., J. Biol. Chem. 13:469 (1913). 5. Caraway, W.T., Clin. Chem. 4:239 (1963). 6. Morin, L.G., J. Clin. Path. 60:691 (1973). 7. Morin, L.G., Clin. Chem. 20:51 (1974). 8. Klackar, H.M., J. Biol. Chem. 167:429 (1947). 9. Praetorius, E., Pouldon, H., Scand. J. Clin. Invest 5:273 (1953). 10. Young, D.S., et al. Clin. Chem. 21:1D (1975). 11. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, WB Saunders Co., Philadelphia PA, 2

nd Ed (1994).

PI: URI2P.JS02 REV: 04/14/09

AACCIIDDOO UURRIICCOO Método Enzimático

Punto Final

Solo para uso diagnostico “In vitro”

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CLINICAL SIGNIFICANCE1-3 Uric Acid measurements are most commonly used in the diagnosis of gout. Increased levels (hyperuricaemia) may be observed in leukemia, polycythaemia, atherosclerosis, diabetes, hypothroidism, and conditions associated with decreased renal funtion. Decreased levels are present in patients with Wilson’s disease. METHODOLOGY Uric Acid has historically been determined by variations of colorimetric phosphotungstate 4, 5 and iron reduction 6, 7 methods. Recent methodologies use the enzymes uricase and hydrogen peroxidase, along with a chromogen to yield a colorimetric end product. These methods demonstrate better specificity for uric acid, 8, 9. The PAS procedure uses uricase, peroxidase and he chromogen TBHB to yield a colorimetric end product. The colorimetric end product produced in this reaction can be measured at 520nm and is proportional to the uric acid concentration in the sample. PRINCIPLE

Uricase Uric Acid + O2 + H2O Allantoin + CO2 + H2O2 Peroxidase H2O2 +4-Aminoantipyrine+TBHB Quinoneimine + H2O Uric Acid is oxidized by Uricase to allantoin and hydrogen peroxide. TBHB + 4-aminoantipyrine + hydrogen peroxide, in the presence of peroxidase, produce a quinoneimine dye that is measured at 520nm (500-550). The color intensity at 520nm is proportional to the concentration of Uric Acid in the sample. COMPOSITION AND CONTENT Reagent: 4-Aminoantipyrine 0.5 mM, TBHB 1.75 mM, Uricase (Bacillus Sp.) >32 U/L, Peroxidase (Horseradish) >1300 U/L, Non-reactive stabilizers and fillers, pH (7.8 – 8.2). Standard: Urid Acid 5mg/dL. Avoid eating the reagent, the toxicity has not been determined.Reagent contains Sodium Azide (0.05%) as preservative. In a dry state may react with copper or lead plumbing to form explosive metal azides. Upon disposal, flush with large amounts of water to prevent azide build up.

REAGENT PREPARATION

The monoreactivo and standard are ready for use. STABILITY AND STORAGE Conserved 2-8 º C, the reagent is stable until the date indicated on the label. REAGENT DETERIORATION Do not use the reagent if: 1. The reagent is turbid. 2. The reagent blank has an absorbance of 0.50 or greater at 500nm. 3. The working reagent does not meet stated performance parameters. SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE Haemolysis-free serum, the serum uric acid is stable for 3 days at 2-8 ° C and up to 6 months at -20 ° C.2

INTERFERENCE Studies to determine the level of interference for hemoglobin, bilirubin and lipemia were carried out, the following results were obtained:

Hemoglobin:No significant interference ( 10%) from hemoglobin up to 200 mg/dL.

Bilirubin:No significant interference ( 10%) from bilirubin up to 20.9 mg/dL.

Lipemia:No significant interference ( 10%) from lipemia up to 1020 mg/dL measured as

triglycerides.

A number of drugs and substances affect the determination of uric acid. 10

ADDITIONAL EQUIPMENT REQUIRED

1. Clinical chemistry analyzer with a wavelength of 500 nm and 37 º C and its consumables. 2. Control material (supplied by PAS DIAGNOSTICA).

ASSAY PROCEDURE

For this procedure follow the instructions in the manual operation of the analyzer and reagents applications of PAS DIAGNOSTICA ® Analyzer most common.

PARAMETERS

CALCULATIONS: Abs = Absorbance Abs (patient) x Concentration of standard = Uric Acid Abs (standard) (mg/dL) (mg/dL) Example: Abs patient = 0.071 Abs standard = 0.302 Concentration of standard = 5.0 mg/dL. 0.071 x 12.1 = 1.18 mg/dL Uric Acid 0.302 CALIBRATION A calibrator such as PAS DIAGNOSTICA Chemistry Calibrator (P/N: CAL1-5), or an appropriate aqueous standard should be used to calibrate this test.

QUALITY CONTROL The integrity of the reaction should be monitored by use of a two level control with known values such as PAS DIAGNOSTICA Chemistry Controls (P/N: CON1-5 and CON2-5). LIMITATIONS Values above 25 mg / dL should be diluted sample 1:1 with saline and tested again, multiplying the result by 2. EXPECTED VALUES 12 Child: 2.0 – 5.5 mg/dL Adult Male: 3.5 - 7.2 mg/dL Adult Female: 2.6 – 6.0 mg/dL It is recommended that each laboratory establish its range of normalidad7. PERFORMANCE Linearity: When run as recommended the assay is linear from 0.2 to 25.0 mg/dL. Method Comparison: Studies performed between this procedure and similar methodologies yielded the following results:

Concept Chromogen

TBHB DCHBS

Number of samples pairs 58 50

Range of samples 1.70 – 20.70 (mg/dL) 2.20 – 11.30 (mg/dL)

Correlation Coefficient 0.9792 0.9977

Slope 1.044 1.117

Intercept 0.00 (mg/dL) -0.58 (mg/dL)

Precision: Within Run Level 1 Level 2 Level 3 Mean (mg/dL) 6.60 11.31 20.12 S.D. (mg/dL) 0.15 0.24 0.30 C.V. (%) 2.2 2.1 1.5 Total Level 1 Level 2 Level 3 S.D. (mg/dL) 0.27 0.47 0.51 C.V. (%) 4.1 4.1 2.5 Sensitivity:

A calibration factor of approximately 58.66 was obtained, which is equivalent to a

sensitivity of 0.01704 Abs per mg/dL. NOTES • This test requires the use of a Standard or Standard Serum appropriate. • The volumes of sample and reagent can be modified proportionately to fit the requirements of different instruments. • Study conducted in Synchron CX. REFERENCES 1. Searcy RL: Diagnostic Biochemistry. McGraw-Hill, New York, NY, (1969). 2. Henry RJ, Common C, Winkelman JW (eds), Clinical Chemistry: Principles and Techniques. Harper & Row,

Hagerstown, MD, (1974). 3. Balls ME: Adv Clin Chem 18:213, (1976). 4. Folin, D., Dennis, W., J. Biol. Chem. 13:469 (1913). 5. Caraway, W.T., Clin. Chem. 4:239 (1963). 6. Morin, L.G., J. Clin. Path. 60:691 (1973). 7. Morin, L.G., Clin. Chem. 20:51 (1974). 8. Klackar, H.M., J. Biol. Chem. 167:429 (1947). 9. Praetorius, E., Pouldon, H., Scand. J. Clin. Invest 5:273 (1953). 10. Young, D.S., et al. Clin. Chem. 21:1D (1975). 11. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, WB Saunders Co., Philadelphia PA, 2

nd Ed (1994).

PI: URI2P.JS01 REV: 04/14/09

Temperature 37°C

Wavelength 500 nm

Assay type End point

Direction Increase

Sample / rgt ratio 1: 50

Sample vol 0.003mL. (3 L)

Reagent vol 0.150 mL (150 L)

Incubation time 5 min

UURRIICC AACCIIDD Enzymatic method

End Point

Only for in vitro diagnostic use