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Detección e identificación de hormonas peptídicas, proteínas y glicoproteínas de elevado interés

terapéutico

Detección e identificación de hormonas peptídicas, proteínas y glicoproteínas de elevado interés

terapéutico

J. BarbosaSevilla, 2004J. BarbosaSevilla, 2004

Estudio de las proteínas, de sus transformaciones y de sus funciones.

Se deben descodificar unos 30000 genesen un organismo vivo.

Deben estudiarse cientos de miles de proteínas, que pueden sufrir transformaciones y que se encuentran en los seres vivos a concentraciones diferentes.

Las PROTEÍNAS (cadenas de aminoácidos) juegan un papel básico en multitud de procesos biológicos.

ENZIMAS

NEUROTRANSMISORES

ANTICUERPOS

HORMONAS, etc.

Problema analítico de gran interésen numerosos campos científicos

Son fundamentales en un gran número de procesos metabólicos que tienen lugar en los seres vivos.

•Alteraciones protéicas Disfunciones metabólicas Su estudio permite el diagnóstico de enfermedades

•Una vez detectada,caracterizada y secuenciada, la administración de la proteína responsable puede solucionar la enfermedad.(Insulina-diabetes).

AUGE DE LAS BIOCIENCIAS

ENZIMA 1 ENZIMA 4ENZIMA 3

DEFICITARIAENZIMA 2

Conocer el metabolismo

Detectar y caracterizar enzima deficitaria

Sintetizarla

Administración

Diagnóstico de enfermedad

Solución A Solución B

Problema de gran interés pero también complejo

En una célula se cree que hay unas 10000 proteínas (se detectan aproximadamente 1000).

Actúan como enzimas, hormonas, etc. Están a concentraciones muy bajas.

Moléculas de PM elevado. Problemas de separación, detección, caracterización y secuenciación. (Fuente de ionización por MALDI o ES).

A diferencia de los genes están sujetas a modificaciones post-translacionales

GlicoproteínasGlicoproteínas

GLICOPROTEÍNASGLICOPROTEÍNAS

Una de las modificaciones post-translacionales más comunes de las proteínas es la glicosilación protéica

Consiste en la unión covalente al núcleo peptídico de cadenas decarbohidratos


Principales estructuras de las glicoproteínas

Bi- o Tetra-antenarias

Principales estructuras de las glicoproteínas

Bi- o Tetra-antenarias

S2

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

S2

A las diferentes especies que se generan se les llama

GLICOFORMASGLICOFORMAS


GLICOFORMASGLICOFORMAS

MICROHETEROGENEIDAD

Diferentes Glicoformas

El tipo, el número y la posición de las cadenas de azúcares varía

Una glicoproteína la componen una mezcla de glicoformas con igual núcleo peptídico pero diferentes cadenas de carbohidratos

Las glicoformasvarían lo que puede ser de gran interés analítico

Las glicoproteínas recombinantes difieren de las naturales (EPO, NESP)

El perfil glicoprotéico cambia con determinadas patologías (CDG, EET)

Las especies glicoprotéicas cambian con el proceso de obtención seguido. (Diferente estructura según laboratorio que las sintetice)

Isoformas: MetalotioneínasIsoformas: Metalotioneínas

ISOFORMASISOFORMASUna proteína no sólo puede presentar diferentes cadenas de azúcares, también puede cambiar su núcleo protéico y presentarpolimorfismo, es decir, cambios en la estructura primaria por variacion de los aminoácidos que la componen

Si son varios los aminoácidos que varían hablamos deisoformas. Si el número de aminoácidos que varia es mínimo hablamos de subisoformas.

Unas proteínas importantes que presentan polimorfismo son lasmetalotioneínas (MTs)

Entre sus funciones principales cabe destacar el control homeostático de metales esenciales ( Cu, Zn)

Isoformas: MetalotioneínasIsoformas: Metalotioneínas

MTs como medidores del impacto de la contaminación ambiental MTs como medidores del impacto de la contaminación ambiental

Importantes en estudios de contaminación

Importantes en estudios de especiación por su capacidad de formar complejos metal-proteína

Su estudio se puede abordar:

1. Mediante la caracterización directa de las distintas isoformas protéicas

2. A través del estudio de los metales enlazados a ellas

LC-MS

CE-MS

LC-ICP-MS

CE-ICP-MS

Detección de MTDetección de MT

Dentro de los estudios de proteínas con cambios en el núcleo protéico, realizamos el estudio de la :

SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE METALOTIONEÍNAS DE HÍGADO DE CONEJO POR CE-MS Y LC-MS

SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE METALOTIONEÍNAS DE HÍGADO DE CONEJO POR CE-MS Y LC-MS

Las metalotioneínas presentan dos isoformas MT1 y MT2 y seis subisoformas

MetAspPro AsnCysSer CysAla Thr

GlyAsnSer CysThrCysAla SerSerCysLysCysLysGluCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro AlaGlyCysThrLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla Ser AspLysCysSer CysCysAla

MetAspPro AsnCysSer CysAla AlaAlaGlyAspSer CysThrCysAlaAsnSer CysThrCysLysAlaCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro ProGlyCysAlaLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla Ser AspLysCysSer CysCysAla


GlyAspSer CysThrCysAlaSerSerCysLysCysLysGluCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro AlaGlyCysThrLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla Ser AspLysCysSer CysCysAla

MetAspPro AsnCysSer CysAla ThrAlaGlyAspSer CysThrCysAlaAsnSer CysThrCysLysAlaCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro ProGlyCysAlaLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla Ser AspLysCysSer CysCysAla


ArgAspSer CysAlaCysAla SerSerCysLysCysLysGluCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro AlaGlyCysThrLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla Ser AspLysCysSer CysCysAla


ArgAspSer CysAlaCysAla SerSerCysLysCysLysGluCysLysCysThrSer CysLysLysSer CysCysSer CysCysPro AlaGlyCysThrLysCysAla GlnGlyCysIleCysLysGlyAla LeuAspLysCysSer CysCysAla

MT-1a MT-2a MT-2b MT-2c MT-2d MT-2e

Secuencias primarias de MTsde hígado de conejo

Detección de MT por CE-UVDetección de MT por CE-UV

V= 10kVCapilar 57 cm x 75 µmInyección 10s, 5psi

Temp 25ºCλ 200 nmSeparaciones de MT-2Separaciones de MT-2

MT-2 FLUKA MT-2 SIGMA

10 20 30 40 50 60

t (min)

mAU

10 20 30 40 50 60

t (min)

mAU

Fórmico 100 mM,pH 2,2

Fosfato 100 mM / NH3pH=2,5

10 20 30 40 50 60

t (min)

mAU

10 20 30 40 50 60

t (min)

mAU

Fórmico 100 mM,pH 2,2

Fosfato 100 mM / NH3pH=2,5

INTERFASE CE-MS Y LC-MSINTERFASE CE-MS Y LC-MS

Técnica de ionización

ELECTROSPRAY

VENTAJAS: Ionización suave a presión atmosférica; transferencia directa de moléculas en fase líquida a iones gaseosos multiplemente cargados

INCONVENIENTES EN CE-MS:

No tener ningún vial que permita la continuidad eléctrica.

3 tipos de interfaseSheathlessLiquid-junctionSheath liquid

CE-MSCE-MS

1. Sheathless Recubrimiento conductor

CapilarAguja acero

Voltaje electrospray

Contacto eléctrico entre recubrimiento y

electrolito de separación

Son las interfses más utilizadas en CE-ESI-MS2. Sheath flow

Aguja acero

Voltaje electrospray

Gas nebulizador Contacto eléctrico entre

sheath liquid y electrolito de separación

Capilar

Sheath liquid

Se obtiene una resolución similar con ambas interfases. Interfase Sheathless

8.2 16.4 24.6 32.8 41.00

50

100

% In

tens

idad

Tiempo de migración (min)

Triptorelina + BuserelinaOxytocina + Met-encefalina

Bradicinina

Leu-encefalina

Eledoisina

Baja reproducibilidad

Poca durabilidad de las puntas

8.2 16.4 24.6 32.8 41.00

50

100

% In

tens

idad

8.2 16.4 24.6 32.8 41.0

Tiempo de migración (min)

0

50

100Triptorelina + Buserelina

Bradicinina Met-encefalina

Eledoisina

Leu-encefalina + Oxitocina

Interfase Sheath Flow

Interfase estable

Buena reproducibilidad

tm más cortos.

Detección de MT por CE-MSDetección de MT por CE-MS

OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES EXPERIMENTALESOPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES EXPERIMENTALES

TOFTOF--MS MARINERMS MARINER((Applied BiosystemsApplied Biosystems))

SpraySpray Tip PotentialTip Potential: : 2000 VNozzleNozzle PotentialPotential: : 100 VNozzleNozzle TemperatureTemperature: : 90ºCGas Gas Curtain FlowCurtain Flow: : 1 L/min

Sheath Liquid SplitSheath Liquid Split: : Flow rate 2ml/min

HPHP3D3D CAPILLARY CAPILLARY ELECTROPHORESISELECTROPHORESIS

((Agilent Agilent TechnologiesTechnologies))

CapillaryCapillary: : 100 cm x 75 µm I.D.

RunningRunning Buffer:Buffer:100 mM Acetic Acid :100 mM Formic Acid (pH 2.3)

InjectionInjection:: 50 mbar for 10s

LC LC PumpPumpSheath LiquidSheath Liquid: : 0.05 % Acetic Acid in 50% Isopropanol (v/v)


MT-IMT-I

600 800 1000 1200 1400 1600

0

20

40

60

80

100

120

140

160[M + 7H][M + 7H]7+7+

[M + 4H][M + 4H]4+4+

[M + 6H][M + 6H]6+6+

[M + 5H][M + 5H]5+5+

[M + 8H][M + 8H]8+8+

[M + 9H][M + 9H]9+9+

1041.26892.54

1249.26

1036.69

888.93

781.20

694.54

777.96

M=6215.76M=6215.76 ApoMTApoMT--2d2dM=6241.95M=6241.95 ApoMTApoMT--2e2e

m/z

Inte

nsity

(cps

)

Time (min)0 4 8 12 16 20

0

5000

10000

15000

20000

25000

ApoMTApoMT--1a1a

ApoMTApoMT--2d2dApoMTApoMT--2e2e

((ApoMTApoMT--1a non1a non))

((ApoMTApoMT--2d 2d nonnon))

ApoMTApoMT--2e2enonnon

CE-ESI-MS (TIC)CE-ESI-MS (TIC) TOF spectrumTOF spectrum


Espectros deconvolucionados a carga cero para todos los picos de MTs de hígado de conejoEspectros deconvolucionados a carga cero para todos los picos de MTs de hígado de conejo

6000 6100 6200 6300 64000

Mass

6215.28

6144.68

6241.74ApoApo--MT2eMT2e

ApoApo--MT2dMT2d

ApoApo--MT1aMT1a

6103.73

Nonacetylated Nonacetylated ApoApo--MT1aMT1a

6173.87

Nonacetylated Nonacetylated ApoApo--MT2dMT2d

6198.98

Nonacetylated Nonacetylated ApoApo--MT2eMT2e

6000 6100 6200 6300 6400

Mass

6125.82ApoApo--MT2aMT2a

6145.6ApoApo--MT2bMT2b

6154.44ApoApo--MT2cMT2c

6083.38

NonacetylatedNonacetylatedApoApo--MT2aMT2a

Detección de MT por LC-MSDetección de MT por LC-MS

LC-ESI-MSLC-ESI-MS

DeclusteringDeclustering PotentialPotential:: 80 VFocusing PotentialFocusing Potential:: 250 VEntrance PotentialEntrance Potential:: -7 VNebulizer Nebulizer Gas (NGas (N22):): 10CurtainCurtain Gas (NGas (N22):): 10IonIon Spray VoltageSpray Voltage:: 4000 VNebulizer TempNebulizer Temp:: 400 ºCAuxiliar Gas (NAuxiliar Gas (N22):): 8 L/h

MS: PEMS: PE--SCIEX API 3000 TripleSCIEX API 3000 Triple--QuadrupoleQuadrupole(TurboIonspray source)

LC: LC: AgilentAgilent 1100 Series1100 Series

Column: NUCLEOSIL 120 C18 / 5 mm / 20 x 0.21 cm

Mobile Phases:A: 0.05% TFA (v/v) in H2OB: 0.05% TFA (v/v) in MeCN

pH: 2.2 – 2.3Flow: 400 µL/min

Injection Volume: 5 ml

ColumnColumn:: NUCLEOSIL 120 C18 / 5 mm / 20 x 0.21 cm

Mobile PhasesMobile Phases::A: 0.05% TFA (v/v) in H2OB: 0.05% TFA (v/v) in MeCN

pH: pH: 2.2 – 2.3FlowFlow: : 400 µL/min

Injection VolumeInjection Volume: : 5 ml

Detección de MT por LC-MSDetección de MT por LC-MS

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

0.0E+0

1.0E+5

2.0E+5

3.0E+5

4.0E+5

5.0E+5

6.0E+5

[M + 3H][M + 3H]3+3+

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

0.0E+0

5.0E+4

1.0E+5

1.5E+5

2.0E+5

2.5E+5

3.0E+5

M=6214.9M=6214.9ApoMTApoMT--2d2d

1037.1

1555.0

1244.0

889.12073.3[M + 3H][M + 3H]3+3+

[M + 5H][M + 5H]5+5+

[M + 4H][M + 4H]4+4+

[M + 6H][M + 6H]6+6+

[M + 7H][M + 7H]7+7+

m/z

Inte

nsity

(cps

)[M + 5H][M + 5H]5+5+

[M + 4H][M + 4H]4+4+

[M + 6H][M + 6H]6+6+

[M + 7H][M + 7H]7+7+

M=6240.9M=6240.9ApoMTApoMT--2e2e

1041.7

1561.6

1249.6

892.82081.3

m/z

Inte

nsity

(cps

)

0 10 20 30 40 500.0E+0

5.0E+6

1.0E+7

1.5E+7

2.0E+7

2.5E+7

3.0E+7

Inte

nsity

(cps

)

Time (min)

ApoMTApoMT--1a1aApoMTApoMT--2d2d

ApoMTApoMT--2e2e

ApoMTApoMT--1a non1a non

ApoMTApoMT--2d non2d non

ApoMTApoMT--2e non2e non

ApoMTApoMT--2d nonac2d nonac

CdCd33CuCuMTMT--1a1aCdCd33CuCuMTMT--1a non1a non

CdCd33CuCuMTMT--2d2dCdCd33CuCuMTMT--2d2d nonnon

CdCd33CuCuMTMT--2e non2e nonCdCd44MTMT--2e2e nonnon

CuCu44MTMT--2e non2e nonCdCuCdCu33MTMT--1a1a nonnon

TIC

Q spectraMT-I

LC-ESI-MSLC-ESI-MS

Problemasa resolver

MÉTODOS DE DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE GLICOPROTEÍNAS EN MUESTRAS BIOLÓGICASMÉTODOS DE DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE GLICOPROTEÍNAS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

LC-MS, CE-MS (Tradicionalmente electroforesis seguida de masas off line )

Glicoformas. Diferente carga (ácido siálico), semejante masa CE-MS

Detección y caracterización rápida. Elevada selectividad, resolución y eficacia. Bajo consumo de muestra y reactivos

En la mayoría de ocasiones, sin embargo, tenemos que estudiar la parte protéica y también las cadenas azucaradas de las proteínas, ya que la mayoría son glicoproteínas.

CEAdsorción

proteínas paredcapilar

CE-MS•Interfase•Obtención de señal de glicoproteínas

Sensibilidad

Clean-up y preconcentración off-line muestra

LC, ALC, IALC

Preconcentración on-line con CE-MS

SPE-CE-MSIA-SPE-CE-MS Recubrimientos

• Dinámicos (Putrescina)

• Permanentes (PB, PB-DS)

Detección de TransferrinaDetección de Transferrina

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADESDIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES

GLICOFORMAS DE TRANSFERRINAGLICOFORMAS DE TRANSFERRINA

679 aminoácidos

Un 6% de su peso coresponde acarbohidratos

Proteína transportadora de Fe en suero y fluido cerebroespinal

Su anormal glicosilación se asocia con enfermedades como:

CDG (Congenital Disorder of Glycosilation)

Alcoholismo


GLICOFORMAS DE TRANSFERRINAGLICOFORMAS DE TRANSFERRINA

Protein surface

Protein surface

GlcNAc

Gal

SA

Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc

Gal

SA

Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn Asn Asn Asn

Asn

S6

S5

S4

S3

S2

S1

S0

Protein surfaceProtein surface

Protein surface

GlcNAc

Gal

SA

Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn


GlcNAc

Gal

SA

Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc

Gal

SA

Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn


GlcNAc

Gal

SA

Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn


GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA


GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc

Gal

SA

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

Protein surface

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn

GlcNAc GlcNAc

Gal

SA

Gal

SA

Man Man

Man

GlcNAc

GlcNAc

Asn Asn Asn Asn

Asn

S6

S5

S4

S3

S2

S1

S0


ELECTROFEROGRAMASELECTROFEROGRAMAS

12 14 16 18

0

5000

10000

15000

20000

12 14 16 18

0

2000

4000

6000

Healthyserum

CDG serum

S4

S0

S2

S0

S4

S2

Concentration of glycoformsobtained from the

electropherogram data

Healthy serum

CDG-I serum

Healthy serum

CDG-I serum

S0 - 13 - 2-29

S2 1 23 1-7 14-37

S4 61 25 46-73 18-57

Glycoform concentration (% of total Tf)

Reference values [4]

(% of total Tf)Glycoform

MÉTODO ACTUAL DE DIAGNOSIS DE CDG


MÉTODO ELECTROFORÉTICO COMPATIBLE CON DETECCIÓN POR MSMÉTODO ELECTROFORÉTICO COMPATIBLE CON DETECCIÓN POR MS

Malos resultados

Se realizaron pruebas utilizando recubrimientos conpolibrén (PB)

Sí se han obtenido buenos electroferogramas con recubrimiento de polibrén-dextrano (PB-DS)

Silanoles de la pared de sílice del capilar. Carga negativa.

o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o-o-+ + + + + + + + + + + + + + + +

- - - - - - - - - - - - - -

o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o-o-++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

-- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o-

+ + + + + + + + + + + + + + + +- - - - - - - - - - - - - -

o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o- o-

++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++-- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

Recubrimiento de polybren. Carga positiva. Recubrimiento de

dextrano (sulfato). Carga negativa.

EOF de ánodo a cátodo (NO inversión de flujo)

Polibrén

Dextran


ELECTROFEROGRAMAS DE TRANSFERRINAELECTROFEROGRAMAS DE TRANSFERRINA

Condiciones compatibles con CE-ESI-MS

min35 36 37 38 39 40

mAU

10

20

30

40

50

60

S4

S2

S5 S6

S3

Tf standardTf standard

S4

S2

12 14 16 18

0

10

20

mAU

Método con putrescinaMétodo con putrescina Método con PB-DSMétodo con PB-DS

25 mM tetraborato

100mM DABIncompatible con CE-ESI-MS

Transferrin standard

23 24 25 26 27 28

T26.5

T26.9 T27.3

Retention Time (Min)

4.1E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

CE-ESI-MS electropherogram obtained with a PB-DS method


LC-ES-MS. Deconvoluted dataLC-ES-MS. Deconvoluted data

72000 76000 80000 84000Molecular Mass

0

50000

100000

150000

200000

72000 76000 80000 84000Molecular Mass

0

20000

40000

60000

S4, 79555.6 Da S2, 77352.0 Da

S4, 79550.0 Da

S0, 75144.6 DaHealthy serum

CDG serum

Detección de EPO por CE-UVDetección de EPO por CE-UV

ERITROPOYETINA HUMANA (EPO)ERITROPOYETINA HUMANA (EPO)

Asn 24

Asn 38

Asn 83

Ser 126

Asn 24

Asn 38

Asn 83

Ser 126

Asn 24

Asn 38

Asn 83

Ser 126

Asn 24

Asn 38

Asn 83

Ser 126

Posiciones N-glicosiladas

Puentes disulfuroPosición O-glicosilada

165 aminoácidos30 kDa (38 % carbohidratos) 4 puntos de glicosilaciónSe sintetiza en riñones

Estimula la producción de eritrocitosaumentando la capacidad portadora de O2Tratamiento de: anemias, SIDA, artritisreumatoide, nacimiento prematuroProhibida por el COI desde 1989Es la proteína que genera más dinero.

Aplicaciones

NESPAnálogo hiperglicosilado. 37.1 KDa (51% carbohidratos)Mayor vida media en sangre

rHuEPO and NESP

40.00

0.00

4.00

8.00

12.00

16.00

80.00

1

3

45

6

7

2

12

3

4

5

7

89

20.00 40.00

0.00

5.00

10.00

15.00

20.006

Abs

orba

nce

at21

4 nm

Abs

orba

nce

at21

4 nm

a) rHuEPOpH 5.5

b) NESPpH 4.5

Time (minutes) Time (minutes)

CE separation of rHuEPO and NESP glycoforms using a separation buffer containing putrescine and urea (Sample: 1000 ppm NESP filtered; Injection: 15 s, 33.5 mbar; Voltage: 15.4 kV; T : 35 ºC; λ: 214 nm; Bare-fused silica capillary: 68.5 cm x 50 µm; Separation Buffer: 0.01 M tricine, 0.01 M NaCl, 0.01 M NaAc, 7 M urea, 2.5 mMputrescine, pH value adjusted with 2 M HAc to a) rHuEPO pH 5.5 b) NESP pH 4.5.

Separación de EPO y NESP por CESeparación de EPO y NESP por CE

SEPARACIÓN GLICOFORMAS POR CE CON RECUBRIMIENTO PERMANENTE POLIBREN (Amina Cuaternaria)

4’

min12 12.5 13

mAU

-2

0

2

4

1’

2’

3’

5’

min12

mAU

-5

0 EPO BetaEPO Beta

EPO BRPEPO BRP

12 12.5

mAU

-2.5

0

2.5EPO AlfaEPO Alfa

1’

2’

3’4’

5’

1’

2’

3’4’

5’

6’

12.5

-5

min

Recubre la pared del capilar de una elevada carga positiva, produciendo una inversión del flujo electroosmótico

Muy Buena Repetibilidad y Reproducibilidad.

Compatible con la detección en línea por MS debido a lavolatilidad del electrolito deseparación.

Electrolito de separación: 400mM HAc/NH4Ac pH 4.75;LT:57cm; V:10kV; T:25ºC;

λ:214nm

Detección de EPO por CE-MSDetección de EPO por CE-MS

CE-ES-MSCE-ES-MS

0 2.4 4.8 7.2 9.6 12.0

Retention Time (Min)

0

3.7E+4

0

50

100

% In

tens

ity

400 540 680 820 960 1100Mass (m/z)

0

51.8

0

10

20

30

40

% In

tens

ity

703.4

707.3606.4

584.4 704.3293650.5562.4

738.6 805.1 870.7498.7

915.3

981.3825.7483.7 958.7

1047.9469.0

Se pierde la resolución

Espectro muy complicado

No se puede deconvolucionar

Detección de EPO por MALDI-TOFDetección de EPO por MALDI-TOF

INFLUENCIA DE LA INTENSIDAD DEL LASER Al obtener los espectros de masas se pueden perder azúcares con lo que se debe controlar la energía suministrada

27000

28000

29000

30000

31000

32000

33000

34000

60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80

% In t e n s i t a t Làs e r

BSA

EPO BRP

EPO Beta

EPO Alfa

No influenciada por el láser

BSA no glicoproteína

rHuEPOse fragmenta

perdiendo ácidossiálicos y gruposglucosamina

Al aumentar laintensidaddel láser

Láser de N2Láser de N2

Masas Moleculares Medias a 65%

Intensidad del láserEPO BRP: 29451 Da

Detección de EPO por MSDetección de EPO por MS

rHuEPO por MALDI-TOFPermite determinar masas moleculares de proteínas.

(65% de intensidad del láser)

Técnica que no puede acoplarse en línea con la CE.

9999 23000 36000 49000 62000 750000102030405060708090

100

9999 23000 36000 49000 62000 750000102030405060708090

100

9999 23000 36000 49000 62000 750000102030405060708090

100

29384.5[M+H]+

X 2

EPO alfaEPO alfa

28854.9[M+H]+

29477.5[M+H]+

X 2

EPO BRP EPO BRP

EPO beta EPO beta

% In

tens

itat

Da/z

58810.6[2M+H]+

14775.8[M+2H]+2

58332.2[2M+H]+

14431.2[M+2H]+2

58259.4[2M+H]+

14606.7[M+2H]+2

65% intensidad del láser

Detección de EPO por CE-MSDetección de EPO por CE-MS

Aumento de la sensibilidad por CE-ES-MSAumento de la sensibilidad por CE-ES-MSClean-up y preconcentración “off-line” de la muestra (célula, sangre,orina, líquido encefaloraquídeo, lágrimas, etc)

Preconcentración “on-line” con CE-MSPreconcentrador de afinidad (C18)

Preconcentrador con anticuerpos de inmunoafinidad

Para trabajar con metodologia de inmunoafinidad necesitamos disponer de anticuerpos que en general interesa que sean lo más específicos posible.

Anticuerpos comerciales (caros y poco específicos)

Inoculación a conejos de peptidos conjugados.

(L)

Región HipervariableSitio de unión del antígeno

Cadena ligera (L) Carbohidratos

Cadena pesada

rHuEPO / IA-SPE-CErHuEPO / IA-SPE-CE

PROTOCOLO DE UNIÓN DEL ANTICUERPO AL SOPORTE SÓLIDOPROTOCOLO DE UNIÓN DEL ANTICUERPO AL SOPORTE SÓLIDO

NaAnticuerpo (Ab-NH2)

GLUTARALDEHÍDOLos grupos aldehído son reactivos

con aminas primarias y secundarias.

O O

H H

E tO

E tOO

O Si O

O

Na Si CH2 N CH CH2 CH

O

( )3

O

O Si O

O

Na Si CH2 N CH CH2( )3

CH N Ab

O

O Si O

O

Na Si CH2 N CH CH2Na

3

O

O Si O

O

Na Si CH2 N CH CH2Na( )3 ( )3

E tO

E tO

2. Activación

3. Inmovilización

+Grupo SILANOL de

la superficie del soporte

3

3-APTSReactivo que introduce un

grupo alquilamino en la superficie

E tO

Si CH2 NH 2

E tO

E tO ( )

Superficie aminoderivatizada o silanizada

1. SilanizaciónONa CH2 N 2

E tO

O

Si O

O

Si H

E tO

( )3

O

O Si OH

O

Na

PreconcentraciónPreconcentración

METODOLOGÍA SPE-CE:INTERACCIÓN reversible de los ANALITOS con una FASE

ESTACIONARIA, inmovilizada sobre un soporte sólido.

PRECONCENTRADOR: contiene la fase estacionaria retenida entre dos fritados.

Capilar de separación

VentanaUV

Outlet Inlet Faseestacionaria

Fritado

Soporte sólido

rHuEPO / IA-SPE-CErHuEPO / IA-SPE-CE

11.0 12.0 13.0

-532.0

-530.0

-528.0

-526.0

-524.0

0.0 40.0 80.0

40.0

44.0

48.0

52.0

56.0

60.0

1

2

34

5

rHuEPO 500 ppm rHuEPO 50 ppm rHuEPO 10 ppmmin min min

mAU mAU mAU

11.0 12.0 13.0

-532.0

-530.0

-528.0

-526.0

-524.0-524

-532

-524

-53211 13 11 13 0 80

56

40

CE-UV IA-SPE-CE

• Capilar de sílice fundida (57cm × 50µm)• Recubrimiento de polibrén• 400 mM HAc (pH=4,75)• 10 kV, 25 ºC, 214 nm

CE:• Muestra: 35 mbar, 5sSPE-CE:• Muestra: 930 mbar, 15 min• Eluyente: 100 mM H3PO4 (pH=1,5)

Desarrollando procesos de:

- Clean-up y preconcentración de la muestra por ALC e IALC.

- Preconcentradores de afinidad e inmunoafinidad en linea con CE-MS (IACE- MS).

Establecer procedimientos analíticos para la detección y caracterización de proteínas y glicoproteínas por LC-MS y CE-MS.

Anicuerpo policlonal

José Barbosa Torralbo

Victoria Sanz Nebot

Fernando Benavente Moreno

Pilar González Sánchez

Balbina Andón Fernández

Elvira Balaguer Ardanuy

Elena Hernández López

Estela Giménez López

José Barbosa Torralbo

Victoria Sanz Nebot

Fernando Benavente Moreno

Pilar González Sánchez

Balbina Andón Fernández

Elvira Balaguer Ardanuy

Elena Hernández López

Estela Giménez López

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