Desarrollo de una base de datos para la identificación de bacilos gram negativos pigmentados anaerobios por MALDI-TOF MS.

Fox B, Berger M.A, Striebeck P, Maldonado I, Fernández Canigia L. Laboratorio de Microbiología, Laboratorio Central, Hospital Alemán.

Introducción: Los bacilos gram-negativos pigmentados anaerobios (BGNPA) pertenecen principalmente a dos géneros, Prevotella y Porphyromonas. Forman parte de la

microbiota de las mucosas y se asocian a infecciones odontógenas, de piel y partes blandas, abdominales y genitales. La identificación por pruebas fenotípicas es dificultosa

ya que se han descripto nuevas especies que las comparten, dificultando su diferenciación.

Objetivo: Desarrollar una base de datos de espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz con detección de masas por tiempo de

vuelo (MALDI-TOF) para la identificación (ID) de BGNPA.

Materiales y métodos: Se incluyeron 28 aislamientos clínicos para extender la base de datos, identificados a nivel fenotípico basados en la producción de pigmento marrón-negro, patrón de sensibilidad empleando discos de antibióticos y la producción de lipasa e indol: Prevotella intermedia (Pi)/nigrescens (Pn) n:7, Prevotella spp. n:2, Porphyromonas spp. n:19.

B12

Aislamiento 48 hs de

incubación

ID fenotípica

Secuenciación

Espectrometría de masa

Análisis proteico: Se realizó la extracción proteica en tubo a partir de cultivos de 48 horas de incubación, en agar Brucella a 37° en condiciones de anaerobiosis. Se analizaron con un equipo Microflex LT y el software Flex Control (versión 3.1 Bruker Daltonics). Los espectros se enfrentaron con la base de datos del fabricante (MBT-BDAL5627 2014). Se consideró como ID confiable a nivel de especie un score ≥1.7 y una diferencia >10% entre el score del primer taxón de la lista y el siguiente. Scores entre 1.5 y 1.69 se consideraron como ID confiable a nivel de género y ≤1.5 se consideraron ID no confiable. Para construir la base se crearon los espectros principales, MSP (del inglés, main spectra profile), según instrucciones del fabricante (Revisión EE, 2/2014).

Análisis molecular: La identificación se realizó mediante la amplificación y secuenciación del gen ARNr 16S (ARNr16SSec). Las secuencias se analizaron con la herramienta BLAST V2.0 del NCBI. Se consideró una divergencia >0,8% para identificar a nivel de especie (CLSI MM18-A). Para diferenciar Porphyromonas asaccharolytica (Pa) de Porphyromonas uenonis (Pu) se secuenció el gen hsp60 (hsp60sec) de 13 aislamientos según Sakamoto et al, 2010.

B12 Resultados & Discusión: Se analizaron los espectros de los 28 aislamientos secuenciados con la base de datos disponible (Tabla 1).

La comparación de la intensidad y la posición de la relación masa carga mostró diferencias entre las distintas especies estudiadas (Fig. 1).

Tabla 1: Aislamientos incluidos en la base de datos y análisis de los mismos con la base de datos MBT-BDAL5627 2014.

A nivel molecular se pudieron diferenciar los aislamientos de Pi, Pn y Pg. ARNr16SSec no alcanzó una divergencia >0,8% entre especies para distinguir Pa de Pu y P. melaninogenica de P. histicola ni P. jejuni. hsp60sec pudo separar Pa de Pu en solo 1 de 13 aislamientos. Para la comparación de los espectros de P. asaccharolytica-uenonis, Pa y Pu, se utilizó el índice de correlación compuesto, que mostró un comportamiento heterogéneo entre las especies Pau, y separó a Pu del resto de las especies (Fig. 2).

BASE DE DATOS HA Género y especie

n

Calidad espectro

BASE DE DATOS BRUKER ID especie ID género no ID

MSP (n) score >1.7

score 1.50 - 1.69

Score <1.5

Prevotella intermedia 3 1 3

Prevotella nigrescens 4 2 4

Prevotella melaninogenica/histicola/jejuni 2 4 1 1

Porphyromonas asaccharolytica/uenonis 12 1 12

Porphyromonas asaccharolytica 4 1 4

Porphyromonas uenonis 1 0 1

Porphyromonas gingivalis (Pg) 2 2 2

TOTAL 28 11 9 1 18

Conclusiones: Nuestra base de datos aportó 28 MSP para la identificación de BGNPA, para previa de 11 MSP de los géneros y especies estudiados. Además, se incorporó una especie no incluida anteriormente (Pu). Expandir la base de datos con aislamientos locales, nos permitirá obtener un mejor desempeño en la identificación por espectrometría de masas, tanto para fines diagnósticos como epidemiológicos.

P490 0:A5 MS

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

AP62 0:H4 MS

0.0

0.5

1.0

1.54x10

Inte

ns. [a

.u.]

507-Pm 0:A4 MS

0

1

2

3

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

5288DM3230 0:D9 MS

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

7199-95 0:A1 MS

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

5178DM3157 0:C4 MS

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

Porphyromonas gingivalis HA6049-3091 0:D12 MS

0

1

2

3

4

5

4x10

Inte

ns. [a

.u.]

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000m/z

Figura 1: Espectros principales de las diferentes especies

Figura 2: Matriz de correlación para las especies de Porphyromonas asaccharolytica/uenonis, P. asaccharolytica y P. uenonis

Figura 3: Dendograma de los espectros de BGNPA

ingresados a la base de datos de MALDI-TOF MS