Desarrollo de un esquema de purificación para la hormona de ...

UNIVERSIDAD AUTONOMA BE NUEVO LEON FACULTAD DE MEDICINA

DESARROLLO DE UN ESQUEMA DE PURIFICACION PARA LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA

PRODUCIDA POR Pichsa pastoris

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN BIOLOGIA MOLECULAR E INGENIERIA GENETICA

PRESENTA:

L.Q.I. JUAN FRANCISCO VILLARREAL CHIÙ

Monterrey, N. II

à J

TM QH445

566 2006 c.l

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

FACULTAD DE MEDICINA

DESARROLLO DE UN ESQUEMA DE PURIFICACIÓN PARA LA

HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA PRODUCIDA POR

T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN BIOLOGÍA MOLECULAR E INGENIERÍA GENÉTICA

PRESENTA: L.Q.I. JUAN FRANCISCO VILLARREAL CHIÙ

Pichia pastoris

Monterrey, N. L Junio de 2006

DESARROLLO DE UN ESQUEMA DE PURIFICACIÓN PARA LA HORMONA DEL CRECIMIENTO BOVINA

PRODUCIDA POR PICHIA PASTORIS

Co-Director de Tesis

DR. DIONICIO A. GALARZA DELGADO Subdirector de Estudios de Postgrado

DRACO DÖRMENS NUNQUAM TTTILLANDUS

A MI FAMILIA:

DR. JUAN FCO. VILLARREAL ARREDONDO BIOL. MA. GUADALUPE CHIU DE VILLARREAL ANN1E CHANTALE VILLARREAL CHIU

Hay mil mentiras que pueden hacerme caer... Y un sólo un camino que lleve a la felicidad... Mis miedos a fracasar han muerto hace tiempo gracias a ustedes.

A AQUELLOS QUE DEPOSITARON SU CONFIANZA EN MI, EMPRENDIENDO JUNTOS EL DIFICIL CAMINO DE LA VIDA

Porque compartir los sueños con un amigo es empezar a convertirlos en realidad.

AGADRECIMIENTOS

TODO MI AGRADECIMIENTO

A mi director de tesis Dr. Gerardo Padilla Rivas por su calidez, sugerencias y confianza.

A los doctores Hugo Barrera Saldaña, Augusto Rojas Martínez, Rocío Ortiz López, Agnés Revolt de Mendoza, Juan Francisco Velásquez, Ana María Rivas y Herminia Martínez por su guía profesional y orientación para realizar este estudio.

A mis compañeros y amigos de los distintos departamentos de esta facultad con quienes compartí tantas aventuras.

Con profundo cariño y admiración al Dr. Karim Acuña Askar, por permitirme ser un profesional en el área de la investigación y ser una fuente de inspiración y confianza en todo momento.

Y en especial a la Dra. Clara Díaz y Mauricio Salinas por su amistad y ayuda incondicional a través de esta larga jornada.

TABLA DE CONTENIDO

Contenido Página:

Lista de Tablas i Lista de Cuadros ii Lista de Figuras iii Nomenclatura v

Resumen vi

CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO

1.1. Introducción 1 1.2. Antecedentes 2

1.2.1. Cromatografía de intercambio aniónico 4 1.2.2. Cromatografía de interacciones hidrofóbicas 6 1.2.3. Cromatografía de exclusión molecular 8 1.2.4. Cromatografía líquida de alta resolución 10

1.3. Justificación 11 1.4. Hipótesis 12

CAPÍTULO II. OBJETIVOS

2.1. General 13 2.2. Particulares 13

CAPÍTULO ra. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. Esquema general del trabajo 14 3.2. Material 16

3.2.1. Equipo 16 3.2.2. Material 17 3.2.3. Reactivos 19

3.3. Métodos 22 3.3.1. Purificación de la bGH 22 3.3.2. Cromatografia de intercambio aniónico 22 3.3.3. Cromatografía de interacciones hidrofóbicas 23 3.3.4. Cromatografía de exclusión molecular 24 3.3.5. Cromatografía liquida de alta resolución 24 3.3.6. Western blot 25

Contenido Página:

3.4. Análisis de proteínas 27 3.4.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida 27

3.4.1.1. Preparación de soluciones stock 27 3.4.1.2. Procedimiento 27

3.4.2. Cuantificación de proteínas totales 29

CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1. Implementación de metodologías 30 4.2. Esquema de purificación 34

CAPÍTULO V. CONCLUSIONES 42

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 43

APÉNDICES

Apéndice A. Datos obtenidos de la absorbancia de los estándares preparados para la curva de calibración empleada para la cuantificación de proteínas totales

Apéndice B. Curva de calibración para cuantificación de proteínas totales

Apéndice C. Promedio de las absorbancias obtenidas en las 6 réplicas del esquema de purificación.

Apéndice D. Promedio de los microgramos de las muestras analizadas en las 6 réplicas del esquema de purificación basados en la curva de calibración y las absorbancias obtenidas.

RESUMEN AUTOBIOGRÁFICO

LISTA DE CUADROS Cuadro: Página: 1. Técnicas de separación de proteínas 2

2. Ventajas de las técnicas principales para la separación de proteínas 3

3. Preparación de estándares para la curva de calibración del ensayo de Bradford. 30

4. Resultados del esquema de purificación 39

LISTA DE FIGURAS

Figura: Página: 1. Gel representativo del comportamiento de la bGH

estándar frente a la cromatografía de intercambio amónico 31

2. Gel representativo del comportamiento de la bGH comercial incubada con pPIC9 frente a la cromatografía de intercambio amónico 32

3. Gel representativo del comportamiento de la bGH comercial frente a la cromatografía de interacciones hidrofóbicas 33

4. Gel representativo del comportamiento de la bGH estándar frente a la cromatografía de exclusión molecular 33

5. Cromatograma representativo de la bGH comercial estándar frente a las condiciones establecidas por Mukhopadhyay et ai, 2002 para CLAR-FR 34

6. Cromatograma representativo de la reinyección del pico colectado a los 19 minutos de la separación de bGH comecial estándar frente a las condiciones establecidas por Mukhopadhyay et ai, 2002 para CLAR-FR 34

7. Gel representativo del comportamiento de la muestra dializada del medio de fermentación de Pichia pastoris que expresa bGHr frente a la cromatografía de intercambio amónico 36

8. Gel representativo de la cromatografía de interacciones hidrofóbicas de la muestra proveniente de la fracción 0M de intercambio amónico 37

9. Gel representativo del comportamiento de la bGH recombinante proveniente de la cromatografía de hidrofobicidad frente a la cromatografía de exclusión molecular 3 8

10. Cromatograma representativo de la bGHr purificada frente a la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa

11. Cromatograma representativo de la reinyección del pico colectado a los 19 minutos de la separación de la bGHr purificada frente a CLAR-FR

12. Gel de muestras procesadas en Western blot

13. Western blot de muestras representativas del proceso de purificación

NOMENCLATURA

DNA Ácido desoxirribonucleico nm Nanómetros GH Hormona del crecimiento bGH Hormona del crecimiento bovino bGHr Hormona del crecimiento bovino recombinante hGHr Hormona del crecimiento humano recombinante pl Punto isoeléctrico pH Potencial de hidrógeno CLAR-FR Cromatografía líquida de alta resolución en fase

reversa kDa Kilodaltones NaCl Cloruro de sodio (NH4)2S04 Sulfato de amonio mM Milimolar EGPA-SDS Electroforesis en geles de poliacrilamida con

dodecil sulfato de sodio mL Mililitros

|iL Microlitros

fjg Microgramos

\\m Micrómetros g Gramos SDS Dodecil sulfato de sodio BSA Albúmina sérica bovina rpm Revoluciones por minuto uA Unidades de absorbancia

RESUMEN L.Q.I. Juan Francisco Villarreal Chiù

Universidad Autónoma de Nuevo León. Facultad de Medicina Fecha de Graduación: Junio 2006 Área de Estudio: Biología Molecular

Candidato para el grado de Maestría en Ciencias con especialidad en Biología Molecular e Ingeniería Genética.

Numero de páginas: 52

Título del estudio. "Desarrollo de un esquema de purificación para la hormona del crecimiento bovina producida por Pichia pastoril. Introducción. La purificación de proteínas se realiza a través del empleo de técnicas cromatográficas que se basan en sus características intrínsecas. Entre las técnicas cromatográficas más empleadas se encuentran la de intercambio iónico, la de interacciones hidrofóbicas y la de exclusión molecular. Estas técnicas suelen ser combinadas para producir un esquema de purificación más eficiente al basarse en varías de las características de la proteina de interés.

Objetivo. Desarrollar un proceso de purificación para la bGH producida por Pichia pastoris.

Material y Métodos. La muestra inicial de trabajo fue el medio de cultivo sin biomasa de una fermentación inducida de la cepa de Pichia pastoris pPlC9-bGH, dializado contra buffer Tris-HCl 20 mM y EDTA 0J2mM. Como fase inicial de purificación se utilizó la cromatografía de intercambio amónico (CLA), empleando una resina tipo Q-Sepharose. La elución se realizó a través de un gradiente de 0, 0.4, 0.6,0.8 y 1 M de NaCl y se recuperaron fracciones de 10 mL. Como paso intermedio se utilizó la cromatografía de interacciones hidrofóbicas (CIH), donde se empleó una resina Pbenyl-Sepharose. La fracción con bGH obtenida en CIA se acondicionó con 1 M de sulfato de amonio (SA). La elución se realizó mediante un gradiente de 0.8,0.6,0.4,0.2 y 0 M de SA. Se colectaron fracciones de 10 mL. Como paso final se utilizó la cromatografía de exclusión molecular (GBM) con resina Sephaoyl S-100. La fracción con bGH obtenida de la CIH fue cargada en la columna empleando buffer Tris-HCL 20 mM para realizar la elución. En este caso se colectaron fracciones de 1 mL. La cantidad de proteínas en cada una de las fracciones fue determinada por el método de Bradford y su composiciÓD fue en ge les discontinuos de poliacrílamida al 4-15% en condiciones reductores.

Resultados. La muestra inicial contenía 912 ± 183 jig de proteína total, de los cuales el 15% representaron la bGHr. En la fase inicial mediante la CIA, la muestra se semi-purificó ai un 92% obteniéndose tm porcentaje de recuperación del 85.8% de bGHr en la fracción de elución 0 M de NaCl. En la fose intermedia de CIH se recuperó el 62.7% de la bGHr con una pureza del 98.5%. La bGHr se reciderò en la fracción OM de SA. En la CEM erano fose final se obtuvo un 97.4% de recuperación eoo u n pureza del 99.5%. El proceso presentó un 52.4% de recuperación total de la bGHr.

Conclusiones. La purificación con CIA-dH-CEM es eficiente al purificar en un 99.5% y recupmr el 52% de la bGHr producida por P. postáis. Además, el proceso presenta la ventaja de proporciona- distintos grados de pureza para satisfacer las necesidades del laboratorio.

Dr. Gerardo Padilla Rivas Dr. Hugo Barrera Saldaña Dr. Karim Acuña Askar Director de Tesis Co-director de Tesis Co-director de tesis

CAPÍTULO L MARCO TEÓRICO

1.1. INTRODUCCIÓN

La introducción de la tecnología del ADN recombinante ha permitido la

explotación industrial de proteínas con propiedades terapéuticas que permanecían

limitadas para su comercialización. Gracias a esto, las proteínas recombinantes juegan

un papel muy importante en la medicina moderna. Vacunas, anticuerpos, hormonas y

agentes anticancerígenos son sólo algunos ejemplos de la gran variedad de proteínas

recombinantes que se pueden obtener al emplear esta tecnología (B arrera-S aldaña,

1992).

A la par del uso de proteínas recombinantes, se ha favorecido el desarrollo de

mejores métodos para su producción y purificación. Diversos microorganismos han sido

desarrollados como las mejores opciones para expresar proteínas, destacando entre ellos

la levadura metilotrófica Pichia pastoris, la cual cuenta con mecanismos de expresión

condicionada de proteínas recombinantes y la capacidad para favorecer su secreción al

medio de cultivo (Barrera-Saldaríay cois., 2004).

La presente investigación se enfoca en la purificación de la hormona de

crecimiento bovina recombinante expresada por la levadura P. pastoris, empleando para

esto técnicas cromatográficas que se basan en las características intrínsecas de la

proteína de interés para lograr su acondicionamiento hacia el ambiente más adecuado

para su posterior utilización en análisis especializados de bioactividad.

1.2. ANTECEDENTES

La purificación de una protema es esencial para el estudio de sus propiedades e

investigar sus aplicaciones en la medicina. Para esto, existen técnicas de separación que

hacen uso de las propiedades fisicoquímicas propias de las moléculas, como las que se

describen en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Técnicas de separación de proteínas.

Técnicas Propiedad empleada Aplicación recomendada No cromatográficas Filtración por Membrana

Centrifugación

Cromatográficas Exclusión Molecular

Intercambio iónico

Hidrofobicidad

Fase reversa

Afinidad

Covalencia

Cromatoenfoque

Tamaño molecular

Densidad, tamaño molecular

Tamaño molecular

Carga

Hidrofobicidad

Hidrofobicidad

Unión a ligando

Grupos tiol

Carga, pl

Al inicio de un proceso de purificación, especialmente con grandes volúmenes de medio.

Fraccionamiento de componentes celulares

Paso final de esquema de purificación

Paso inicial de esquema de purificación

Después de una precipitación con sulfato de amonio Cuando la actividad biológica de la proteína no es relevante

Al inicio de un esquema de purificación

Separación de proteínas que contienen grupos tiol

Separación de isoformas.

Tomado de: Ahmed, 2005.

Las técnicas de separación pueden ser combinadas para producir un esquema de

purificación más eficiente al basarse en varias de las características de la proteína de

interés. El Cuadro 2 muestra las ventajas de las principales técnicas cromatográficas

empleadas en la purificación de proteínas y su conveniencia a través de las distintas

fases de un esquema de purificación (Skoog^ cois., 1995).

Cuadro 2. Ventajas de las técnicas principales para la separación de proteínas

Técnica Ventajas Fase Captara

Fase Intermedia

Fase Pulido

Condición inicial de la

maestra

Condición final de la muestra

Cromatografía de intercambio

iónico

Alta resolución

Alta capacidad

Alta velocidad

Muy conveniente

Muy conveniente

Poco conveniente

Baja fuerza iónica

Sin limite en volumen

Posible cambio pH

Alta filena iónica

Muestra concentrada

Buena resolución

Cromatografía Buena conveniente Muy Poco Alta fuerza iónica

Baja fuerza iónica

de interacciones capacidad

Alta velocidad

conveniente conveniente conveniente

Alta fuerza iónica

Baja fuerza iónica

hidrofóbicas capacidad

Alta velocidad

Sin limite en volumen

Muestra concentrada

Volumen de

Cromatografía Alta No Poco Muy

muestra limitado Posible cambio

de bu f fo de exclusión resolución conveniente conveniente conveniente Limite en

velocidad de flujo

Posible cambio de bu f fo

molecular Limite en velocidad de flujo

Muestra diluida

Cromatografía líquida de alta

resolución

Alta resolución

Poco convoiiente

Poco conveniente

Muy conveniente

Volumen de muestra Itmitnrin

Perdida de actividad biológica

Alta resolución Condiciones Condiciones

Alta específicas de específicas de

Cromatografía Alta Muy Muy conveniente ligación elución de Afinidad capacidad conveniente conveniente conveniente

Sin limite en Muestra Alta volumen concentrada

velocidad

Tomado de: Amersham Biosciences, 2001

1.2.1. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO AMÓNICO

La cromatografía de intercambio iónico empleada para la separación de

biomolécuias ñie introducida en 1960 y actualmente juega un papel muy importante en

la separación y purificación de proteínas recombinantes (Vydac, 2000).

Esta cromatografía basa su principio de separación en la relación que existe

entre la carga neta de las proteínas y el pH de la fase móvil, ya que esta relación es

única para cada proteína. La interacción entre las moléculas cargadas y la matriz es

controlada para favorecer la unión o elución de moléculas específicas y lograr así la

separación de la molécula de interés (Skoogy cois., 1995).

La cromatografía de intercambio amónico ha sido empleada como fase inicial en

distintos esquemas para purificar hormonas de crecimiento y otras proteínas de interés

médico e industrial. Olsony cois., (1981) fueron los primeros en reportar la purificación

de GH humana recombinante (hGHr) producida por Escherichia cotí. Para ello

emplearon la cromatografía de intercambio aniónico débil (DEAE-Sepharose) como

fase inicial en combinación de cinco pasos de separación, los cuales incluyen una lísis

celular, seguida de una precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía de

intercambio aniónico débil, una cromatografía de intercambio catiónico débil (CM-

Sepharose) y finalizando con una cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl S-

200), reportando con esto un 98% de pureza final sin anexar información de la

recuperación o pureza obtenidos por cada técnica individual. En 2003, Ouyang y cois.,

emplearon como único paso de purificación la cromatografía de intercambio amónico

fuerte (Q-Sepharose) para purificar GH porcina recombinante expresada por Pichia

pastoris previa precipitación con sulfato de amonio, recuperando cerca del 70% de la

GH recombinante con una pureza relativa del 95%.

Zhang y cois., (2004) purificaron inulinasa de Aspergillus níger expresada en P.

pastoris, la cual es una enzima degradadora de inulina con la cual se produce jarabe rico

en fructosa. Ellos reportaron el empleo de la cromatografía de intercambio aniónico

fuerte (HiTrapQ) como único paso cromatográfico obteniendo 11% de recuperación de

la proteína con un 95% de pureza. Además reportaron que las proteínas de P. pastoris

fueron eluídas a fuerzas iónicas mayores, destacando así el carácter aniónico de las

proteínas del sistema de expresión en condiciones de pH neutro, concluyendo que esta

característica puede ser empleada como estrategia principal para eliminar este tipo de

proteínas contaminantes en la cromatografía de intercambio iónico.

Lo anterior fue comprobado por Chen y cois., (2004), quienes produjeron y

purificaron fosfatasa alcalina de placenta humana en P. pastoris. Como purificación,

emplearon una columna empacada con una matriz de intercambio amónico débil

(DEAE-Sepharose), con la cual obtuvieron cerca del 100% de recuperación y una

pureza superior al 99%.

La cromatografía de intercambio an iónico en sus modalidades fuerte (resina

denominada Q) y débil (resina denominada DEAE) ha sido empleada para purificar

otras proteínas de interés llevando a porcentajes de pureza superiores al 95% cuando ha

sido empleada como fase inicial del proceso de purificación. Entre esas proteínas se

encuentran la ovalbumina de huevo (Ito y Matsudomi, 2005), la ovotransferrina

(Mizutani y cois., 2004), penicilina G acilasa de Providencia retígeri (Senerovic y cois.,

2005), pepsinogeno porcina (Yoshimasu y cois., 2002), galactosa-p-1,3-

glucorunosiltransferasa I (Lattard^ cois., 2005), enzima fibrinolítica PM246 (Hu>> cois.,

2005) y la tanasa de Aspergillus oryzae (Zhong y cois., 2004).

1.2.2. CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIONES HIDROFÓBICAS

Como fase intermedia de purificación, la cromatografía de interacciones

hidrofóbicas es una excelente herramienta para separar proteínas que presentan cierto

carácter hidrofóbico. Esta cromatografía está basada en el principio establecido por

Tiselius en 1948, donde menciona que las protemas y otras sustancias que son

precipitadas a altas concentraciones de sales neutras (proceso conocido como "Salting

Out") son adsorbidas fuertemente en adsorbentes, que en soluciones libres de sales no

muestran afinidad por las proteínas y que a altas concentraciones se convierten en

excelentes adsorbentes. (Skoogjycofc, 1995).

En 1986, Lefort y Ferrara obtuvieron a partir de Escherichia coli una hGHr

100% pura aplicando la cromatografía de interacciones hidrofóbicas (Phenyl-Sepharose)

como fase intermedia, en combinación con una cromatografía de intercambio aniónico

débil como fase inicial (DEAE-Sepharose) y una de exclusión molecular como fase de

pulido (Ultragel AcA44), reportando que el uso de la resina Phenyl-Sepharose llevó a

un 28% de recuperación del producto final, siendo este el paso más ineficiente del

proceso.

Este resultado fue comprobado por De Oliveiray cois. (1999) quienes reportaron

la reducción de contaminantes provenientes de E. coli en un 99%, recuperando un 43%

de hGHr planteando la utilización de una cromatografía de interacciones hidrofóbicas

(Phenyl-Sepharose) como fase final en el esquema de purificación desarrollado por

estos autores.

Hasta la fecha, la cromatografía de interacciones hidrofóbicas no ha sido

empleada para purificar GH recombinantes expresadas en Pichia pastoris. Sin embargo,

diversos autores han recurrido a esta cromatografía para purificar otras proteínas

expresadas bajo este sistema. Damasceno y cois., (2004) purificaron a través de esta

cromatografía un fragmento de anticuerpo humano, correspondiente al dominio variable

de la cadena sencilla, para su uso en el tratamiento contra el cáncer de colon

denominado A33scFv. Ellos emplearon la cromatografía de interacciones hidrofóbicas

(Phenyl-Sepharose) como fase intermedia de purificación, con la cual obtuvieron un

25% de recuperación y 90% de pureza.

Gadkari y cois., (2003) expresaron y purificaron las hormonas gonadotropina

coriónica y luteinizante humanas en Pichia pastoris para investigar su función en el

proceso de la reproducción humana. Los autores reportan el empleo de la cromatografía

de interacciones hidrofóbicas (Phenyl-Sepharose) como paso inicial seguido de una

cromatografía de intercambio catiónico fuerte (SP-Sepharose), obteniendo como

resultado una preparación enriquecida de ambas proteínas con una pureza superior al

95%.

Nuevas proteínas recombinantes han sido purificadas a través de la

cromatografía de interacciones hidrofóbicas, aumentando hasta en un 90% de pureza

cuando esta cromatografía ha sido empleada como fase inicial y/o intermedia del

proceso de purificación. Entre las proteínas purificadas se encuentran la aglutinina de

Galanthus nivalis (Baumgartner y cols2003), butolina (Weatherly y cois., 2002),

cinamoil esterasa de Aspergillus niger (Juge y cois., 2001), enzima activadora de

proteína C (Kunes>> cois., 2002), lipasa B de Candida antartica (Rotticci-Muldery cois.,

2001), bilimibina oxidasa de Afyrothecium verrucaria (Kataoka y cois., 2005) y la

equistatina (Outchkourovjy cois., 2002), entre otras.

1.2.3. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

La cromatografía de exclusión molecular ha demostrado ser una herramienta

eficaz para finalizar los esquemas de purificación (denominándose usualmente a esta

fase de finalización como fase de pulido), permitiendo el acondicionamiento de la

proteína de interés, bajo las condiciones más adecuadas para su uso final. Esta técnica

basa sus principios de separación, en la diferencia en tamaño que presentan las

macromoléculas y la migración diferencial que presentan a través de los poros de

distintos tamafios de la resina (Skoog y cois., 1995).

Autores antes mencionados (Olson y cois., 1981; Lefort y Ferrara, 1986; de

Oliveira y cois., 1999; Rotticci-Mulder y cois., 2001 y Kataoka y cois., 2005) han

empleado esta cromatografía como fase de pulido en sus esquemas de purificación,

consiguiendo con esto elevar sus porcentajes de purificación por arriba del 95%.

Por otra parte, Flodh y cois., (1986) reportaron que el uso de la cromatografía de

exclusión molecular (Sephaciyl S-200) logró aumentar la pureza de una preparación de

hGHr expresada en Escherichia coli, obteniéndola a un grado superior al 99%.

Barbier y cois., (2004) emplearon una resina de exclusión molecular tipo

Sepharose 4B (Amersham Biosciences) para purificar la enzima nitrato reductasa

eucariótica expresada en Pichia pastoris, como paso posterior a una cromatografía de

afinidad por metales inmovilizados. Este grupo de reportó una eficiencia de

recuperación del 98%, con una pureza superior al 98%. De manera similar, Fierens y

cois., (2004) usaron la cromatografía de exclusión molecular (Sephacryl S-100) como

paso final en su esquema de purificación para obtener la proteína inhibidora de xilanasa

I de Triticum aestmrn, la cual es utilizada en la preparación de cereales y sus derivados.

El empleo de esta cromatografía llevó a una pureza mayor al 95% con un rendimiento

de recuperación cercano al 50%.

Existen otros ejemplos donde la cromatografía de exclusión molecular como

fase de pulido, en el proceso de separación, ha logrado la purificación de proteínas

recombinantes producidas por Pichia pastoris, elevando la pureza de las proteínas

recombinantes hasta un 99%. Entre los esquemas de purificación que han reportado el

uso de esta cromatografía están los desarrollados por Damaso y cois., (2003) que

purificaron la xilanasa de Thermomyces lanuginosis; Sevo y cois., (2002) que lograron

aislar penicilina G amidasa de Providencia reitgeri; Rolland y cois., (2001) que

purificaron y caracterizaron un antágeno contra la proteína core del Hepatitis B;

Paramasivam y cois., (2002) que purificaron lactoferrina de caballo; Bishtj> cois., (2001)

que produjeron y aislaron una proteína de la envoltura del virus del dengue tipo 2; Liu>>

cois., (2001) que aislaron al interferón a-1 humano y Chantasingh y cois., (2005) que

prepararon y purificaron la xilanasa 10 de Aspegillus aerreus, entre otras.

1.2.4. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

La cromatografía líquida de alta resolución en su modalidad de fase reversa

(CLAR-FR) es una herramienta ampliamente utilizada para evaluar la pureza final del

producto purificado, con la cual se comparan los espectros y tiempos de retención del

producto purificado contra el tiempo de retención del compuesto estándar comercial.

Mukhopadhyay y cois., (2002) establecieron las condiciones de separación óptimas para

aislar y confirmar la identidad de diversas GHs recombinantes producidas por

Escherichia coli. Actualmente, la identidad de las proteínas recombinantes expresadas

en Pichia pastoris es evaluada mediante esta metodología, destacándose como

ejemplos de estas proteínas recombinantes la citosina bloqueadora de crecimiento de

Pseudaletia separata (Koganesawa y cois., 2002), pediocina PA-1 de Pediococcus

acidilactici (Beaulieu y cois., 2005), aleigen Ole 10 de polen de olivo (Barral y cois.,

2005), endotoxina neutralizante (Paus y cois., 2002), glicoproteína D de Herpes Simple

1 y 2 (Kooij y cois., 2002), Monoamina oxidasa A humana (Li y cois., 2002) y el

ligando Flt3 (Zhang>> cois., 2005), entre otras.

1.3. JUSTIFICACIÓN

El propósito de la producción en masa de proteínas recombinantes es el de

purificarlas para usarlas en el beneficio de la salud. Debido a que las hormonas de

crecimiento tienen un particular interés para la industria farmacéutica y pecuaria, es

necesario el desarrollo de un esquema de purificación que permita aislar estas proteínas.

Este trabajo surge de la necesidad de purificar la hormona de crecimiento bovina

recombinante producida en el Laboratorio de Biotecnología del Departamento de

Bioquímica por la levadura Pichiapastoris en un porcentaje superior al 95%.

1.4. HIPÓTESIS

La estrategia de purificación por Cromatografía de Intercambio Aniónico -

Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas - Cromatografía de Exclusión Molecular

es adecuada para establecer un porcentaje de pureza superior al 95% para la hormona de

crecimiento bovina producida por Pichia pastoris.

CAPÍTULO n. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Desarrollar un esquema de purificación para la hormona de crecimiento bovina

producida en Pichia pastoris.

2.2. OBJETIVOS PARTICULARES

1. Evaluar la eficiencia de purificación de la técnica de cromatografía de

intercambio amónico como fase inicial del proceso de purificación.

2. Evaluar la eficiencia de purificación de la técnica de cromatografía de

interacciones hidrofóbicas como fase intermedia del proceso de purificación.

3. Evaluar la eficiencia de purificación de la técnica de cromatografía de exclusión

molecular como fase final del proceso de purificación.

4. Evaluar la pureza final de la hormona de crecimiento bovino por cromatografía

líquida de alta resolución en fase reversa.

5. Comprobar la identidad de la hormona de crecimiento bovino obtenida del

esquema de purificación mediante Western Blot.

CAPÍTULO in. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. ESQUEMA GENERAL DEL TRABAJO

3.2. MATERIALES

3.2.1. EQUIPO

A continuación se presenta la lista del equipo que se empleó para la realización de este

trabajo:

• Bomba peristáltica Dynamax® RP-1.

(Rainin Instrument Co., Emeryville, CA, EUA)

• Cámara de electroforesis Mini-PROTEAN® 3.

(Bio-Rad Laboratorios, Inc., Hercules, CA, EUA)

• Centrífuga 5415C.

(Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania)

• Espectrofotómetro Biophotometer.


• Fuente de poder BRL modelo 500.

(Life Technologies Inc., Gaijhersburg, MD, EUA)

• Agitador mecánico Orbit modelo 3540.

(Barnstead International, Dubuque, 10, EUA)

• Incubadora de agitación oscilatoria R76.

(New Brunswick Scientific, Edison, NJ, EUA)

• Centrifugadora Beckman Allegra J2-M1.

(Beckman-Coulter, Inc., Fullert, CA, EUA)

• Campana de flujo laminar, Protector Laboratory Hood.

(Labconco Corp., Kansas City, MI, EUA)

• Cromatógrafo de líquidos de alta resolución: 600 Controller,

717 Autosampler, 996 Photodiode Array Detector.

(Waters Corp., Milford, MA, EUA)

• Termoagitador Cinarec 2 Thermolyne.

(Barnstead Internacional, Dubuque, IO, EUA)

3.2.2. MATERIAL

Dentro de los materiales utilizados, se encuentran:

• Columna Poly-Prep® de 9 cm.


• Columna Econo-Column® de 20 cm.


• Pipetas Research® modelos:

0.5-10JAL, 2-20^L, ÍO-IOO^L, 100-1000nL


• Tubos de polipropileno para centrifugar con capacidad de SO mL.

(Corning Incorporated, Acton, MA, EUA)

• Tubos de polipropileno para centrifugar con capacidad de 15 mL.


• Microtubos de polipropileno para centrifugar con capacidad de

0.6,1.5,2 mL.

(Cel Assosciates Inc., Pearland, TX, EUA)

• Pipetas serológicas de vidrio de 5 y 10 mL.


• Celdas de plástico para biofotómetro UVette® de 2 mL.


• Reservorios de vidrio Pyrex® de 1 L, 500 mL y 250 mL.


• Pizeta de plástico.


• Sistema de microfiltración de vidrio Fisherbrand®.

(Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA)

• Matraces Erlen-Meyer Pyrex® de 250, 500 y 1000 mL.


• Asa bacteriológica.

(Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EUA)

• Jeringas de plástico Piastipak de 3 y 10 mL.

(Becton Dickinson, Sparks, MD, EUA)

Acrodiscos de 022 y 0.45 \m.

(Waters Corp., Milford, MA, EUA)

Microfiltros Whatman de 0.22 y 0.45 pm.

(Waters Corp. Milford, MA, EUA)

Membrana de diálisis con corte de 12 kDa

(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, EUA)

Membrana de nitrocelulosa para Western blot


3.2.3. REACTIVOS

Lista de reactivos que se utilizaron para desarrollar la parte experimental:

Metanol absoluto grado ACS [67-s6-i]-

(Sigma Chemical Co„ St Louis, MO, EUA)

Ácido acético glacial grado ACS [64-19-7].


Ácido clorhídrico grado ACS |76i7-oi-o]-


Cloroformo grado ACS [67-66-3]'


Glicerol grado ACS [56-81-5]'

(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA)

Fosfato de potasio dibàsico anhidro grado ACS [7758-11-4].


Fosfato de potasio monobásico anhidro grado ACS [7778-77-oj.


Sulfato de amonio grado Biología Molecular [7783-20-2].


Fosfato de sodio dibàsico anhidro 99% [7558-79-41'


Fosfato de sodio monobásico anhidro 99% [7558-80-7]-

(Sigma Chemical Co., S t Louis, MO, EUA)

Carbonato de sodio grado ACS [497-19-8]-


Dicromato de potasio 99.5% [7778-50-91-


Nitrato de plata grado ACS [7761-88-8]-


N,N,N ',N '-Tetrdmeti leti lendiamina (TEMED) 99% [UO-IM].


Persulfato de amonio grado Biología Molecular [7727-54-0]'


CH3OH

CH3CH2COOH

HC1

CHCI3

C3H5(OH)3

K2HPO4

KH2P04

(NH4)2S04

Na2HP04

NaH2P04

Na2CC>3

K2Cr207

AgNOs

C6H16N2

(NH^SsOs

Azul de bromofenol grado Biología Molecular [<52625-28-9].


EDTA 994% sal disódica dihidratada [6381-92-6]-


Cloruro de sodio grado Biología Molecular [7047-14-5]•


Glicina 99% [56-4<wj.


Biotina (Vitamina H) 99% [SMS-SJ.


Dodecil sulfato de sodio (SDS).

(Pierce Chemical Co., Rockford, II, EUA)

Tris base ultrapura grado Biología Molecular [77-86-1]-

(US Biological, Swampscott, MA, EUA)

Coomasie Brilliant Blue R.


p-Mercaptoetanol grado Biología Molecular [60-24-2]-


Peróxido de Hidrógeno 30% [7722-84-u


Acrilamida/Bisacilamida 30%.


Albúmina bovina Fracción V 96% [9048-46-8]-


Extracto de levadura.


Bacto peptona.


Yeast Nitrogen Base.


Resina de intercambio aniónico Q-Sepharose fase flow.

(Amersham Biosciences, Suecia)

Resina de interacciones hidrofóbicas

Phenyl-Sepharose high performance.

C^HioBrtOsS

C10Hi4N2Na2O8

NaCl

C2H5NO2

Cl0Hi6N2O3S

C12H215O4S

C4H11NO3

C26H19N3O10S3

CzHgOS

H202

C3H5NO/C7H,0N2O2

(Amersham Biosciences, Sweden)

Resina de exclusión molecular Sephaciyl S-100 high resolution.

(Amersham Biosciences, Suecia)

Coomasie® Plus protein assay reagent

(Pierce Chemical Co., Rockfoid, II, EUA)

Diaminobencidina.

(Research Organics Inc., Cleveland, OH, EUA )

3.3. MÉTODOS

3.3.1. PURIFICACIÓN DE LA bGH

El esquema de purificación se desarrolló partiendo de una muestra de

fermentación a escala matraz de una cepa de Pichia pastoris productora de bGH

construida previamente en el laboratorio (Gallardo, 1999), la cual fue dializada en

membranas de celulosa de 12 kDa de corte (N° Catalogo D9402, Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO, EUA.) frente a buffer de trabajo, el cual contenía Tris-HCl 20 mM,

EDTA 0.2mM a pH 8. La alimentación de la columna con buffer y muestras se realizó a

través de una bomba peristáltica (Rainin, Modelo RP-1) a flujo continuo de 0.5 ml/min.

El esquema de purificación empleado se describe a continuación:

3.3.2. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO AMÓNICO

Se tomaron 912.8 ± 183 |¿g de proteína total como muestra inicial y se

inyectaron a una columna Poly-Prep® marca Bio-Rad® de 9 cm empacada con una

resina de intercambio aniónico fuerte (Q-Sepharose fast flow; Amersham Biosciences,

Suecia). Posteriormente, se realizó la elución de proteínas empleando distintas

soluciones que consistían en buffer de trabajo más diferentes concentraciones de cloruro

de sodio (0, 400, 600, 800 y 1000 mM NaCl). Se recolectaron 10 mL de cada

concentración de NaCl.

Para el análisis de la eficiencia del proceso se tomaron 500 pL de cada fracción

recolectada y las proteínas se precipitaron con metanol-cloroformo, añadiendo 600 (iL

de metanol y 450 pL de cloroformo a 500 pL de la muestra. Se agitó suavemente por un

minuto y la mezcla se centrifugó a 14,000 revoluciones por minuto (rpm) por 5 minutos,

en seguida se removió la fase superior cuidando de no perturbar la interfase, después se

añadieron 450 joL más de metanol y la mezcla se agitó y centrifugó nuevamente. Se

eliminó todo el líquido y la pastilla se secó en un equipo Savant de centrifugación al

vacío por 15 minutos; posteriormente, la pastilla seca se resuspendió en 16 ^L de buffer

de muestra y se calentó a 95°C por 5 minutos. La muestra se analizó por electroforesis

en geles de poliacrilamida en condiciones reductoras (EGPA-SDS; Ausubel y cois.,

1999). 100 pL de las muestras obtenidas de la cromatografía se emplearon para

cuantifícar proteínas totales por el método de Bradford (Bradford, 1976).

A través de la cromatografía de intercambio amónico se recolectaron 116.3 ± 16

jig de bGHr en la tracción 0 mM de NaCl y para acondicionar la muestra para la

siguiente cromatografía, a ésta se le adicionó una alta concentración (1000 mM) de

sulfato de amonio [(NHtJ&SO«].

3.3.3. CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIONES HIDROFÓBICAS

La fracción 0 mM de NaCl que contenía 116.3 ± 16 \i% de bGHr obtenida de la

cromatografía de intercambio amónico previamente acondicionada se inyectó a una

columna empacada con resina tipo Phenyl-Sepharose high performance (Amersham

Biosciences) de 1 mL de volumen de trabajo. Al terminar de pasar la muestra se inició

la elución de la misma con un gradiente decreciente de sulfato de amonio disuelto en

buñer de trabajo [1000, 800, 600, 400, 200 y 0 mM de (NHLO2SO4]. Se recolectaron 10

mL de cada concentración de (NHt)2S04 y las muestras se dializaron frente a Tris-HCl

20 mM por 24 horas, cambiando el buffer cada 6 horas. Al terminar la diálisis, se

tomaron 400 jiL de cada fracción y las proteínas se precipitaron con el método de

metanol-cloroformo y se analizaron por EGPA-SDS (Ausubel y cois., 1999). También

en este caso se tomaron 100 jiL más de cada fracción recolectada para cuantifícar

proteínas totales por el método de Bradford (Bradford, 1976).

3 3 . 4 . C R O M A T O G R A F Í A D E E X C L U S I Ó N M O L E C L A R

A partir de la cromatografía de interacciones hidrofóbicas se obtuvieron 64.8 ±

18 (ig de bGHr recolectados en la fracción 0 mM de (NRjfeSO^ de los cuales, por

limitaciones de la técnica fueron inyectados 14 ± 3 ng en una columna Econo-Column®

marca Bio-Rad® de 20 cm empacada con una resina de exclusión molecular (Sephacryl

S-100 high resolution de Amersham Biosciences). La muestra inyectada entró a la

resina por gravedad, después se adicionaron 200 \xL de buffer de trabajo con una pipeta

automática. Al tener un nivel adecuado de buffer por encima de la resina, se encendió la

bomba peristáltica para iniciar la elución de las proteínas. La recolección de fracciones

se realizó de manera manual, recolectando 1 mL por fracción, completando así 20 mL

de elución con el buffer de trabajo.

Nuevamente al terminar el proceso se tomaron 400 JIL de cada fracción y las

proteínas se precipitaron con el método de metanol-cloroformo y se analizaron por

EGPA-SDS (Ausubel y cois., 1999). Además se tomaron 100 JOL para cuantificar

proteínas totales por el método de Bradford (Bradford, 1976).

3.3.5. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

EN FASE REVERSA

La determinación de la pureza final del producto obtenido del esquema de

purificación se realizó a través de un análisis de Cromatografía Líquida de Alta

Resolución en Fase Reversa (CLAR-FR), en la cual se empleó un gradiente de

acetonitrilo-agua reportado previamente por Mukhopadhyay y cois. (2002) como se

describe a continuación:

Se estableció en el equipo un flujo de 1 mL/min y se dejó equilibrar durante 30

min. Las muestras a analizar se filtraron mediante un microfiltro de 0.22 jom de poro

(Acrodisc® GHP, N° Catalogo WAT200516, Waters Corp., Milford, MA, EUA) y se

colocaron en el automuestreador del cromatógrafo, el cual se programó para realizar

inyecciones de manera continua. La separación de la muestra se realizó empleando una

columna Cu como fase estacionaria y una frise móvil de acetonitrilo grado CLAR, y

agua con ácido trifluoro acético al 0.1%, los cuales se filtraron a través de una

membrana de 0.22 pm de poro.

El gradiente utilizado fue el siguiente:

Fase 1.- La separación inició con una mezcla 55:45% de acetonitrilo (ACN)ragua y se llevó hasta una relación 75:25% en un período de 5 minutos.

Fase 2.- La mezcla 75:25% de ACNiagua, se llevó a un 100% de ACN en un

período de 5 minutos.

Fase 3.- En un periodo de 20 minutos se llevo del 100 al 0% de ACN.

Fase 4.- Se restauró la mezcla inicial de 55:45% ACN:agua en un periodo de 5 minutos.

Lo anterior se realizó a temperatura ambiente y empleando una velocidad de

flujo de 1 mL/min. Los ensayos se realizaron por triplicado para cada muestra. Al

término de las inyecciones se extrajeron los cromatogramas para ser analizados en el

software Millennium® 32 (Waters).

3.3.6. WESTERN BLOT

(ENSAYO DE INMUNODETECCIÓN)

Se realizó una EGPA-SDS (Ausubel y cois., 1999) por duplicado de las muestras

a analizar. Al terminar, uno de los geles se reveló de la manera descrita en la sección

3.4.1.2., mientras que el segundo gel se sumergió en buffer de transferencia (3.03 g de

Tris-base, 14.4 g de glicina en 800 mL de agua destilada y 200 mL de metanol absoluto),

al igual que la membrana de nitrocelulosa, los papeles filtro y las esponjas a utilizar

durante 15 minutos. Posterior a esto, el cásete de transferencia se colocó en la mesa

teniendo cuidado de colocar el cátodo hacia arriba. Después se colocó una esponja de

fibra en el cásete, seguida de una hoja de papel filtro y la membrana de nitrocelulosa. El

gel equilibrado se colocó sobre la membrana teniendo mucho cuidado de identificar los

carriles en la membrana y de no dejar burbujas entre el gel y la membrana. En seguida

se terminó de armar el cásete al colocar el papel filtro y la esponja de fibra faltantes

sobre el gel. El cásete se cerró firmemente y se colocó en la cámara de transferencia y se

rellenó con buffer de transferencia. Se encendió la fuente a 250 A y se dejó correr

durante 3 horas. Al terminar la transferencia, el gel se sometió a una tinción con

Coomassie descrita en la sección 3.2.4.2., mientras que la membrana fue bloqueada con

solución bloqueadora (0.9 g de leche descremada en 30 mL de solución de lavado: 500

mL de solución PBS con 500 pL de Tween 20) durante dos horas a 37°C.

Posteriormente, la membrana se limpió con solución de lavado durante 10 minutos por

quintuplicado. Al término de los lavados, la membrana se incubó por 2 horas a

temperatura ambiente con una dilución 1:1000 del suero hiperinmune anti-bGH con

buffer diluyente (0.6 g de leche descremada en 60 mL de solución de lavado). Al

transcurrir este tiempo, la membrana se limpió con la solución de lavado durante 10

minutos en cinco ocasiones. Después, la membrana se incubó durante dos horas a

temperatura ambiente con una solución 1:10,000 del anticuerpo anti-conejo conjugado

con peroxidasa de rábano en buffer diluyente. Al término de la incubación, la membrana

se limpió 5 veces con solución de lavado durante 10 minutos cada uno. Para realizar el

revelado, se mezclaron 30 mL de solución PBS, 15 mg de 3'3' diamino bencidina sobre

la membrana y posteriormente se le añadieron 60 |¿L de peróxido de hidrógeno al 30%.

Para detener la reacción se empleó HC1 5N. La membrana revelada se guardó entre

papel de celofán para ser digitalizadas en un escáner.

3 . 4 . A N Á L I S I S D E P R O T E Í N A S

3.4.1. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN

CONDICIONES DESNATURALIZANTES (EGPA-SDS)

3.4.1.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES STOCK

A. Tris-HCl 1.5M, pH 8.8. Se disolvieron 54.45 g de Tris base en 150 mL de agua destilada, luego se ajustó el pH con HC1, una vez ajustado el pH, se aforó a 300 mL.

B. Tris-HCl 0.5M, pH 6.8. Se disolvieron 6 g de Tris base en 60 mL de agua destilada, luego se ajustó el pH con HC1, una vez ajustado el pH, se aforó a 100 mL.

C. SDS 10%. Se disolvieron 10 g de dodecil sulfato de sodio en 100 mL de agua destilada.

D. Persulfato de amonio 10%. 100 mg de persulfato de amonio se disolvieron en 1 mL de agua destilada.

E. Buffer de muestra 2X. Se mezclaron 1 mL de Tris-HCl 0.5M, 1.6 mL de glicerol, 1.6 mL de SDS 10%, 0.4 mL de 0-mercaptoetanol y 0.4 mL de azul de bromofenol al 0.5%, además de 1 mL de agua destilada.

F. Buffer de corrida 5X. Se disolvieron 15 g de Tris base, 72 g de glicina y 5 g de SDS en 1000 mL de agua destilada.

G. Solución de tinción. Se disolvieron 0.25 g de Coomasie blue R en 90 mL de agua destilada, 90 mL de metanol y 20 mL de acido acético glacial.

H. Solución de decoloración. Se diluyeron 20 mL de metanol y 20 mL destilada.

de acido acético glacial en 160 mL de agua

3.4.1.2. PROCEDIMIENTO

Los vidrios previamente lavados con SDS al 1% y etanol fueron montados

armando el sándwich en el preparador de geles. La preparación del gel separador (10

mL al 15%) se hizo mezclando 1.15 mL de agua destilada, 1.25 mL de Tris-HCl 1.5M,

2.5 mL de acrilamida al 30%, 50 ¿iL de SDS al 10%, 50 \\L de persulfato de amonio al

10% y 5 nL de TEMED, agitando la mezcla y colocándola rápidamente dentro del

sándwich. A continuación se colocó 1 mL de isopropanol sobre el gel para evitar el

contacto del gel con el aire y favorecer su polimerización. Al polimerizar, se preparó el

gel concentrador (5 mL al 4%) mezclando 1.48 mL de agua destilada, 0.63 mL de Tris-

HC1 0.5M, 0.33 mL de acrilamida al 30%, 25 pL de SDS al 10%, 25 pL de persulfato

de amonio al 10% y 2.5 |oL de TEMED. Al terminar de mezclarlos, se colocó la

solución en el sándwich hasta el tope para después colocar el peine y dejar

polimerizando la solución. Al terminar la polimerización se retiró el peine y se montó el

equipo Mini-protean® 3 (Bio-Rad Laboratorios, Inc., Hercules, CA, EUA.). Para

preparar el buffer de corrida se diluyeron 100 mL de la solución 5X en 400 mL de agua

destilada. La solución resultante se colocó en el equipo y a continuación se colocaron

las muestras de interés en los posillos. La muestra se corrió a un voltaje inicial de 100

volts (v) durante su migración por el gel de concentración y luego a 190 v cuando cruzó

al gel de separación. La fuente de poder se apagó justo después de que el colorante

saliera del gel. De esta manera se prosiguió a desarmar el equipo y teñir el gel con la

solución de tinción durante una hora. Al transcurrir este tiempo, se continuó con la

decoloración del gel utilizando la solución de decoloración por dos horas, renovando la

solución de decoloración cada media hora. Una vez desteñido el gel, éste se digitalizó

empleando un escáner (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA, EUA.) y se analizó

por densitometría empleando el software Gel-Pro Analyzer 3.2 (Media Cybernetics,

Inc., Silver Spring, MD, EUA.).

3.4.2. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES

(ENSAYO DE BRADFORD)

Para la cuantificación de proteínas totales por medio del ensayo de Bradford

(Bradford, 1976) se empleó un stock de Albúmina Sérica Bovina (BSA) a 200 jig/mL,

con la cual se desarrolló una curva de calibración según el Cuadro 3, midiendo la

absorbancia en un espectrofotómetro a 600 nanómetros (nm). La gráfica obtenida

responde a la ecuación tipo y = mLn(x) + b, donde:

y: Absorbancia de la muestra m: Pendiente de la gráfica x: Concentración de la muestra b: Intersección de la gráfica con el eje Y.

Cuadro 3. Preparación de estándares para la curva de calibración del ensayo de Bradford.

Stock BSA Agua Coomassie Conc. Final BSA G*L) (ML) (HL) (ltt>

0 100 100 0 0.5 99.5 100 0.1 3 97 100 0.6 15 85 100 3.0 30 70 100 6.0 45 55 100 9.0 60 40 100 12.0 75 25 100 15.0 90 10 100 18.0

Una vez establecida la curva de calibración, se prosiguió a cuantificar las

muestras obtenidas del proceso de purificación mezclando 100 pL de muestra con 100

jiL de reactivo de Coomassie e incubando por 5 minutos a temperatura ambiente. El

valor de la absorbancia obtenida se sustituye en la ecuación 3.1 para obtener el valor de

la concentración de la muestra.

x = e [(y - b)/m] (3.1)

rv. RESULTADOS Y DISCUSION

1. IMPLEMENTACIÓN DE LAS METODOLOGÍAS

La primera etapa consistió en determinar el comportamiento de la bGH

comercial frente a las condiciones propuestas.

La Figura 1 muestra un gel representativo del comportamiento del estándar

frente a la cromatografía de intercambio aniónico. En el carril 3 se aprecia que la

hormona comercial no es retenida por la resina, al ser eluida bajo condiciones de nula

concentración de NaCl (la cual es empleada para separar las proteínas unidas a la

matriz), indicando con esto que la bGH muestra poca afinidad hacia la resina, debido a

que no presenta una carga neta a pH 8, confirmando de esta manera su punto

isoeléctrico teórico de 7.86 (ProtParam, http://www.expasy.org/sprot/).

kDa

66 45 36

29 24

20

Figura 1. Gel representativo del comportamiento de la bGH estándar frente a la cromatografía de intercambio aniónico (n=3). 1, marcador de peso molecular; 2, bGH comercial antes de purificar; 3, elución con buffer de trabajo (BT); 4, elución con BT; 5, elución con 0.4 M NaCl; 6, elución con 0.6 M NaCl; 7, elución con 0.8 M NaCl; 8, elución con 1.0 M NaCl; 9, cairil vacío; 10, estándar comercial bGH.

Un vez confirmado el comportamiento de la bGH comercial bajo las condiciones

establecidas para este trabajo, se realizó una mezcla artificial de la bGH comercial y un

extracto de fermentación de Pichia pastoris que no produce bGHr. La mezcla artificial

se dejó incubando durante 24 horas tratando de simular las condiciones de fermentación.

Al término de la incubación se le realizó a la mezcla una cromatografía de intercambio

aniónico, dando como resultado el gel que se representa en la Figura 2. El carril 3

http://www.expasy.org/sprot/

describe el mismo patrón en el comportamiento del estándar comercial de la bGH, el

cual no es retenido por la resina fíente a las condiciones de pH y concentración de

buífer establecidas. Además se aprecia una co-elución de ciertas proteínas

contaminantes de Pichia pasíoris. Los carriles 5, 6, 7 y 8 muestran que las proteínas

contaminantes son eluídas de la resina cuando se añaden distintas concentraciones de

NaCl al buffer de trabajo, confirmando de esta manera que la cromatografía de

intercambio amónico como fase inicial de purificación resulta ser adecuada para

eliminar el mayor porcentaje de contaminantes de la levadura P. pastoris.

1 2 3 4 5 6 7 8 kDa

66 — > 45 — • 36 —>

29 — •

24 — •

Figura 2. Gel representativo del comportamiento de la bGH comercial incubada con pPIC9 frente a la cromatografía de intercambio amónico (n=3). I, marcador de peso molecular; 2, estándar comercial bGH; 3, mezcla artificial bGH comercial + pPIC9; 4, elución con BT; 5, elución con 0.4 M NaCl; 6, elución con 0.6 M NaCl; 7, elución con 0.8 M NaCl; 8, elución con 1 M NaCl.

La Figura 3 describe las fracciones de elución obtenidas de la bGH comercial

estándar cuando ésta es introducida a la cromatografía de interacciones hidrofóbicas. El

carril 12 muestra que la bGH estándar es eluida al final del proceso cromatográfíco bajo

condiciones que favorecen la elución de proteínas con bajo carácter hidrofílico.

Interesantemente, los carriles en los que fueron analizados muestras provenientes de las

cromatografías aparecieron bandas a una altura de 66 kDa correspondientes a falsos

positivos.

1 2 3 8 9 10 11

33

12

Figura 3. Gel representativo del comportamiento de la bGH comercial frente a la cromatografía de interacciones hidrofóbicas (n=3). 1, marcador de peso molecular; 2, estándar comercial bGH; 3, bGH comercial antes de purificar; 4, elución con BT; 5, elución con 1.0 M SA; 6, elución con 0.8 M SA; 7, elución con 0.6 M SA; 8, marcador de peso molecular; 9, estándar comercial bGH; 10, elución con 0.4 M SA; 11, elución con 0.2 M SA; 12, elución con 0 M SA.

Debido a que la cromatografía de interacciones hidrofóbicas es un paso

intermedio de purificación y el grado de contaminantes esperados es muy pequeño (De

Oliveria y cois1999), no se realizó la prueba de incubación de la bGH comercial con

el extracto de Pichia pastoris no productora de bGH., por lo que se prosiguió a realizar

el monitorco de la bGH comercial frente a la resina de exclusión molecular. En la

Figura 4, los carriles 6, 7 y 8 muestran que la bGH estándar presentó un rango en el

tiempo de retención que va de los 16 a los 20 minutos.

kDa 11 1? n 14 16 17 IR 19

Figura 4. Gel representativo del comportamiento de la bGH estándar frente a la cromatografía de exclusión molecular (n=3). 1, marcador de peso molecular; 2, estándar comercial bGH; 3, elución a tiempo 10 min; 4, elución a tiempo 12 min; 5, elución a tiempo 14 min; 6, elución a tiempo 16 min; 7, elución a tiempo 18 min; 8, elución a tiempo 20 min; 9, elución a tiempo 22 min; 10, elución a tiempo 24 min; 11, marcador de peso molecular; 12, estándar comercial bGH; 13, elución a tiempo 26 min; 14, elución a tiempo 28 min; 15, elución a tiempo 30 min; 16, elución a tiempo 32 min; 17, elución a tiempo 34 min; 18, carril vacío; 19, bGH comercial antes de purificar.

Además de los ensayos anteriores, la bGH estándar correspondiente al carril 2 de

la Figura 4, fue sometida a un análisis de CLAR-FR. La Figura 5 muestra un

cromatograma representativo del estándar frente a la CLAR-FR, en donde se puede

apreciar que el estándar presenta un tiempo de retención de 19.035 minutos a una

longitud de onda de 280 nm, además que los contaminantes presentes se encuentran en

cantidades traza. El cromatograma fue analizado en un rango de longitudes de onda que

abarcó de 200 a 400 nm, encontrando que el pico obtenido a los 19.035 minutos

correspondió a un solo compuesto por la inexistencia de traslape de picos

correspondientes a otros compuestos, confirmando de esta manera la identidad del pico

correspondiente a la bGH estándar. Extracto Figura 4

020

2 0. Ifr-

0.00-

I Q di

nnooooco r-Ofr "£T- CN lO co 1-OCO uO O") CO o- T>i <O

? IOK) lO •«BOO lO jk

5.0d ' ' ló.oo' ' ' 'is.od ' ' 20.00* ' * * 2S.QÓ ' 30.0CÍ ' 35.C)d Minutes

40.00

Figura 5. Cromatograma representativo del extracto de bGH comercial estándar frente a las condiciones establecidas por Mukhopadhyay y cois., 2002 para CLAR-

FR (n=3).

La fracción correspondiente al analito de 19.035 minutos se recolectó y se

reinyectó para corroborar su pureza, obteniendo como resultado un ligero

desplazamiento en el tiempo de retención del analito principal y la elución de

contaminantes traza al inicio de la cromatografía. Lo anterior se describe en la Figura 6.

Extracto Figura 5

0.20-

0.10-

0.00-

I s O

r»oOto coco o- *"~CN 4U-444- 4 -TJtttír - 4 -

Figura 6. Cromatograma representativo de la reinyección del analito colectado a los 19.035 minutos de la separación del extracto de bGH comercial estándar frente a las condiciones establecidas por Mukhopadhyay^ cois., 2002 para CLAR-FR (n=3).

2. ESQUEMA DE PURIFICACIÓN

La muestra inicial procedente de la diálisis del medio de fermentación de Pichia

pastoris que expresa bGHr presentó una concentración de 130.4 ± 26.1 mg/L de

proteínas totales, de los cuales 19.43 ± 2.7 mg/L correspondieron a bGHr, representando

así el 15% de la muestra total. Ouyang y cois. (2004) reportaron una producción de

2000 mg/L de proteínas totales para la producción de GH porcina bajo las mismas

condiciones de fermentación empleadas en este trabajo, añadiendo que la GHr porcina

correspondió al 45% (900 mg/L) de la muestra total. Por otra parte, Jo y cois. (1996),

reportaron la producción de 200 mg/L de GH porcina al emplear el sistema de expresión

de Saccharomyces cerevisiae. Lo anterior muestra que nuestro laboratorio aun tiene

como reto el mejorar sus métodos de producción para alcanzar mayores niveles de

proteína recombinante, ya que los niveles de producción actuales, son menores a los

alcanzados por sistemas de expresión eucarióticos de menor calidad.

La Figura 7 describe el comportamiento que presentó la muestra dializada (912.8

± 182 |ig de proteínas totales; 135.5 ± 19 ng de bGHr) frente a la cromatografía de

intercambio aniónico. El carril 5 muestra que la bGHr fue eluida en la fase inicial del

proceso, siendo similar al comportamiento de elución presentado por el estándar. Sin

embargo, se observó que la bGHr mostró un patrón electroforético distinto al estándar,

comportándose como una proteína cercana a los 25 kDa. Ciertas proteínas

contaminantes fueron co-eluídas junto a la bGHr, presentando pesos moleculares

aproximados de 18 y 27 kDa. Las demás proteínas de P. pastoris fueron eluídas de la

resina cuando se elevó la concentración de NaCl iniciando su elución a partir de 400

mM de NaCI, como puede observarse en los carriles 7, 8 y 9. Resultados análogos

fueron obtenidos por Ouyang y cois. (2004) quienes obtuvieron la GHr porcina en la

fracción inicial de elución, correspondiente a una concentración 0 M de NaCl, mientras

que las proteínas de P. pastoris eluyeron a concentraciones de NaCl superiores a 0.1 M.

Aunado a lo anterior, reportaron haber obtenido una GHr de peso molecular de 25 kDa,

similar al obtenido en este estudio. Sin embargo, a través de los análisis realizados de

espectrometría de masas, isoelectroenfoque y digestión con enzimas de desglicosilación,

no lograron explicar el motivo de la diferencia que presentó la GHr porcina en la

migración electroforética.

kDa

Figura 7. Gel representativo del comportamiento de la muestra diaiizada del medio de fermentación de P. pastoris que expresa bGHr frente a la cromatografía de intercambio amónico (n=12). 1, marcador de peso molecular; 2, estándar comercial de bGH; 3, carril vacío; 4, muestra diaiizada de fermentación de bGH; 5, elución con BT; 6, Elución con BT; 7, Elución con 0.4 M de NaCl; 8, Elución con 0.6 M de NaCl; 9, Elución con 0.8 M de NaCl; 10, Elución con 1.0 M de NaCl.

La técnica de cromatografía de intercambio aniónico presentó un 85.8% de recuperación al recobrar 116.3 ± 16 jxg de los 135.5 ± 19 fig de bGHr que fueron inyectados, registrando a su vez un porcentaje de pureza aproximado de la bGH del 91.6%. Ouyang y cois. (2004) reportaron un 71% de recuperación y un 95% de pureza de GH porcina empleando esta técnica. De igual manera, Becker y Hsiung citados por Ribelay cois. (2003) reportaron haber obtenido un porcentaje de pureza del 90% y un porcentaje de recuperación del 71% para la hGHr producida por Escherichia cotí, empleando condiciones similares. Por otra parte, existen diversos reportes del empleo de la cromatografía de intercambio aniónico para la purificación de proteínas recombinantes expresadas por Pichia pastoris, que muestran como resultado un alto porcentaje de pureza, entre los cuales se encuentran Zhang y cois. (2004), quienes purificaron inulinasa en un 95% obteniendo un porcentaje de recuperación del 11%; Mizutani y cois. (2004) obtuvieron un 98% de pureza para la ovotransferrina, reportando un 58% de recuperación; Senerovic y cois. (2005) reportaron la obtención de un 96% de recuperación para la proteína penicilina G acilasa, con un porcentaje de pureza superior al 98%, todos ellos empleando a la cromatografía de intercambio aniónico como único paso cromatográfico. Con lo anterior, se confirma la gran utilidad que tiene la cromatografía de intercambio aniónico (Q-Sepharose) para semi-purificar de manera lápida, sencilla y con altos porcentajes de recuperación a la bGHr.

En la cromatografía de interacciones hidrofóbicas se lograron recuperar 64.8 ± 18 de bGH de los 103.5 ± 15 ng derivados de la fracción 0 M acondicionada de la cromatografía de intercambio amónico, lo cual representó un 62.7% de recuperación, con una pureza relativa del 98.5%. Lo anterior se puede observar en la Figura 8, en la cual se muestra un gel representativo del comportamiento de la bGHr producida por Pichia pastoris, la cual fue previamente tratada a través de una cromatografía de intercambio aniónico. El carril 9 muestra que la elución de la bGHr se realizó bajo condiciones que favorecen la elución de proteínas de bajo carácter hidrofílico, similar al patrón obtenido por la bGH estándar mostrado anteriormente en la Figura 3.

1(03 1 2 3 4 5 6 7 8 9 66.*. 45 • >

1 * 2 4 - *

20-»-

14-*-

Figura 8. Gel representativo de la cromatografía de interacciones hidrofóbicas de la muestra proveniente de la fracción OM de intercambio aniónico (n=12). 1, marcador de peso molecular; 2, estándar comercial de bGH; 3, fracción OM proveniente de intercambio aniónico; 4, elución con 1.0 M (NH^SO^ 5, elución con 0.8 M (NH4)2S04; 6, elución con 0.6 M (NHO2SO4; 7, elución con 0.4 M (NHO2SO4; 8, elución con 0.2 M (NHO2SO4; 9, elución con 0 M (NH^SO».

Resultados similares a los obtenidos en el presente estudio han sido reportados por otros grupos de investigación. Lefort y Ferrara (1986) reportaron que el empleo de la resina Phenyl-Sepharose, llevó a un porcentaje de recuperación del 28% de la hGHr producida en células de riñon de mono, con un porcentaje de pureza del 100%, cuando se combinaba con las cromatografías de intercambio aniónico como fase intermedia y de exclusión molecular como fase final en el esquema de purificación. De igual manera, De Oiiveiraj cois. (1999) reportaron que el empleo de la resina Phenyl-Sepharose como fase final en el esquema de purificación para la hGHr producida por Escherichia coli consiguió un 43% de recuperación y un 99% de pureza. Por otra parte, Damasceno y cois. (2004) obtuvieron un 25% de recuperación junto con un 90% de pureza para los anticueipos A33scFv, empleando para la cromatografía de interacciones hidrofóbicas la

resina tipo Phenyl-Sepharose como fase intermedia de purificación. El alto grado de pureza alcanzado a través de esta cromatografía, junto con los reportes anteriormente mencionados, demuestran la utilidad que tiene la cromatografía de interacciones hidrofóbicas (Phenyl-Sepharose) para elevar en un alto nivel de pureza a la bGHr, presentando el inconveniente de obtener bajos porcentajes de recuperación.

Debido a las limitaciones en la capacidad de la columna empleada para la

cromatografía de exclusión molecular, solamente fueron inyectados 14.0 ± 3 jig de

bGHr, de los cuales 13.7 ±5 pg (97.4%) fueron recuperados al final de la cromatografía

con una pureza relativa de 99.5%. La Figura 9 presenta el comportamiento de la bGHr a

través de la cromatografía de exclusión molecular, confirmando a través de los carriles 6,

7 y 8, el rango en el tiempo de retención presentado por la bGH comercial estándar (16

a 20 minutos).

kOa

66 45 -

24 20 14

Figura 9. Gel representativo del comportamiento de la bGH recombinante proveniente de la cromatografía de hidrofobicidad frente a la cromatografía de exclusión molecular (n=12). 1, marcador de peso molecular; 2, estándar comercial de bGH; 3, fracción 0M proveniente de interacciones hidrofóbicas; 4, elución a 12 min; 5, elución a 14 min; 6, elución a 16 min; 7, elución a 18 min; 8, elución a 20 min; 9, elución a 22 min; 10, elución a 24 min.

Nuestros resultados son comparables a los obtenidos por Flodh y cois. (1986) quienes elevaron la pureza de la hGHr de un 85% a un 100%, a partir de una muestra semi-purificada a través de una resina de intercambio amónico débil (DEAE-Sepharose). Ellos reportaron para este paso cromatográfico un porcentaje de recuperación del 89%. De igual manera, el grupo de investigación de OIson y cois. (1981) reportaron que el empleo de la cromatografía de exclusión molecular llevó a un 98% de pureza de hGHr a una muestra procedente de una semi-purificación a través de una combinación de

cromatografías de intercambio aniónico e intercambio catiónico. Además de esto, otras

proteínas expresadas bajo el sistema de expresión de Pichia pastoris han sido

purificadas con la cromatografía de exclusión molecular como fase de pulido en el

proceso de purificación, ejemplo de esto son Fierens y cois. (2004), quienes purificaron

la proteína inhibidora de xilanasa I en un 95% con un rendimiento de recuperación

cercano al 50%. Liu y cois. (2001) purificaron en un 99% al interferón a-1 humano con

un porcentaje de recuperación superior al 80%.

El Cuadro 4 muestra la pureza relativa y el porcentaje de recuperación total

alcanzados al final del proceso de purificación.

Cuadro 4. Resultados del esquema de purificación.

Fase de purificación \ig de bGHr % Recuperación % Pureza

CIA Inyección 135.5 ± 19

85.8 91.6 CIA Recolección 116.3 ±16

85.8 91.6

CIH Inyección 103.5 ± 15

62.7 98.5 CIH Recolección 64.8 ±18

62.7 98.5

CEM Inyección 14.0 ± 3

97.4 99.5 CEM Recolección 13.7 ± 5

97.4 99.5

% Recuperación Total 52.4

La Figura 10 muestra el cromatograma del análisis de la bGHr obtenida al final

del proceso de purificación por CLAR-FR. La bGHr mostró un tiempo de retención

similar al obtenido por la bGH estándar (19.056 minutos contra 19.035 minutos

presentados por la bGH estándar), validando de esta manera la identidad de la proteína.

0.15-

0.10-

0.05-

0.00̂

o tf> O J E " r *

1 up o <71

Extracto Figura 9

l o d ' " '10.00' " " ' 15'od " ' 20.00' Minutas

25-OCÍ ' ' " 30.00Í

Figura 10. Cromatograma representativo de la bGHr obtenida al final del proceso de purificación frente a la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa

(n=3).

La fracción correspondiente al analito de 19-056 minutos se recolectó y se

inyectó nuevamente para corroborar su pureza, resultando con esto el cromatograma

presentado en la Figura 11, donde se aprecia una eliminación completa de las

contaminantes trazas. Extracto Figura 10

0 .06-

0.04-

0.02-

000̂

TI

é> /

S * /

H s ' V •W • t j— 5» I0IX3 isa) 23.CCÍ MnuH* 25

35.0d ¿od I—¡—I—1—!—I—5—r-15.00 10.00 20.00 Minutes

25 30 40.00

Figura 11. Cromatograma representativo de la reinyección del analito colectado a los 19.056 minutos de la separación de la bGHr obtenida al final del proceso de

purificación frente a CLAR-FR (n=3).

Otros grupos de investigación han empleado esta metodología para confirmar el

grado de pureza obtenido a través de sus procesos de purificación, entre los cuales se

encuentran Koganesawa y cois. (2002), quienes aislaron y purificaron la citosina

bloqueadora de crecimiento y Paus y cois. (2002) que expresaron y purificaron la

endotoxina neutralizante producida por Pichia pastoris. Mukhopadhyay y cois. (2002)

encontraron que CLAR-FR además de confirmar la pureza de distintas preparaciones de

GHs, fiie capaz de identificar el estado oxidativo que presentaron las GHs analizadas.

La identidad de la bGHr purificada fue confirmada mediante su

inmunodetección específica en membranas de Western blot Para ello se analizaron

muestras representativas del proceso cromatogràfico, tanto en geles de EGPA-SDS

como en membranas de nitrocelulosa. La Figura 12 muestra la tinción de Coomassie del

gel de EGPA-SDS de las muestras analizadas, donde el carril 3 presenta la composición

del producto de fermentación de la cepa de Pichia pastoris pPic9-bGH, en el cual se

aprecia una proteína de 22 kDa correspondiente a la bGH y más de 20 proteínas

contaminantes. El carril 4 muestra el producto de la elución 0M de NaCl obtenido de la

cromatografía de intercambio amónico, en el cual se destaca la presencia de la bGHr

con escasas proteínas contaminantes de alto peso molecular. En el carril 5 se observa la

banda de la bGHr obtenida de la fracción 0M de (NH^SQ* de la cromatografía de

interacciones bidrofóbicas. En el carril 6 se aprecia un aumento en la intensidad de

banda de la bGHr debido a la al efecto de concentración de la muestra por parte de la

cromatografía de exclusión molecular. El carril 8 presenta la composición del producto

de fermentación de la cepa de P. pastoris pPic9, empleado como control negativo para

el ensayo de Western Blot, en el cual se destaca la presencia de una banda a la altura de

22 kDa, similar a la presentada por la bGH, indicando con esto, que el vector de

expresión produce una proteína de peso similar a la bGH y que la banda de 22 kDa no

debe considerarse como 100% de bGHr en el carril 3.

kDa

66-** 45 t 36 29"* 24-* 20-*

14"*

Figura 12. Gel de muestras procesadas en Western Blot: 1, marcador de peso molecular; 2, estándar comercial de bGH; 3, Muestra de fermentación de bGH sin purificar; 4, fracción 0M de NaCl obtenida de la cromatografía de intercambio aniónico; 5, fracción 0M de (NHUfeSQ* obtenida de la cromatografía de interacciones hidrofóbicas; 6, elución a los 18 minutos obtenida de la cromatografía de exclusión molecular; 7, carril vacío; 8, fermentado de pPic9 como control negativo.

1 2 3 4 5 6 7 8

- H • « M

Man 1

La Figura 13 presenta la inmunodetección de la bGHr con anticuerpos policlonales anti-bGH, en el cual, el carril 2 muestra la reactividad de los anticuerpos frente a la bGH comercial. En el carril 3 se observa la presencia de la bGHr a la altura de 22 kDa, además de la presencia de posibles dímeros, trímeros y algunas bandas intermedias debido probablemente a la interacción de la bGHr con algunas proteínas de Pichia pastoris. El carril 4 muestra la presencia de la bGHr obtenida a partir de la elución con OM de NaCl de la cromatografía de intercambio amónico, demostrando la pureza y la integridad del producto obtenido. En el carril 5 se observa la presencia de la banda correspondiente al monómero de bGHr obtenida de la fracción OM de (NHifcSO« de la cromatografía de interacciones hidrofóbicas. El canil 6 confirma el aumento en la intensidad de banda correspondiente a la bGHr como parte del proceso de la cromatografía de exclusión molecular. El carril 8 fue empleado como control negativo, en el cual se demuestra que la proteína de peso similar a la bGHr propia del vector de expresión no presenta reactividad frente a los anticuerpos anti-bGH, con lo que se descarta la posibilidad de que en el vector de expresión se encuentre la inserción del cásete del gen de la bGH. Sin embargo, se muestra reacción frente a proteínas de alto peso molecular observadas también en la muestra de fermentación sin purificar (carril 3). Esto pudiera ser debido a reacciones inespecífícas del anticuerpo policlonal.

kDa ^ 2 3 4 5 6 7 8

66 . * 45^ 36

29 24-»» 20-*

14

Figura 13. Western Blot de muestras representativas del proceso de purificación: 1, marcador de peso molecular; 2, estándar comercial de bGH; 3, Muestra de fermentación de bGH sin purificar; 4, fracción OM de NaCl obtenida de la cromatografía de intercambio amónico; 5, fracción OM de (NH^SC^ obtenida de la cromatografía de interacciones hidrofóbicas; 6, elución a los 18 minutos obtenida de la cromatografía de exclusión molecular; 7, carril vacío; 8, fermentado de pPic9 como control negativo.

CAPÍTULO V. CONCLUSIONES

De los resultados encontrados en el presente trabajo se puede concluir lo

siguiente:

El esquema de purificación desarrollado confirmó ser muy efectivo al registrar

una pureza relativa del 99.5% para la bGHr producida por Pichia pastoris, presentando

una eficiencia de recuperación del 52%.

La cromatografía de intercambio aniónico resultó ser una técnica inicial

adecuada para semi-purificar de manera rápida y sencilla a la bGHr.

La cromatografía de interacciones hidrofóbicas fue la fase cromatográfica que

presentó menor rendimiento en recuperación.

La cromatografía de exclusión molecular confirmó ser una cromatografía eficaz

para pulir la proteína recombinante en el proceso de purificación.

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APÉNDICES

A. Datos obtenidos de la absorbancia de los estándares preparados para la curva de calibración empleada

para la cuantificación de proteínas totales.

Concentración final del estándar de BSA (jig)

Absorbancia (uA)

0.1 0.081 0.6 0.263 3.0 0.621 6.0 0.736 9.0 0.816 12.0 0.844 15.0 0.872 18.0 0.880

B. Curva de calibración para cuantificación de proteínas totales.

£1 análisis de la regresión logarítmica correspondiente a la absorbancia en

relación con los microgramos teóricos de albúmina sérica bovina en los estándares fue

obtenida a partir de los datos experimentales presentados en el Anexo A. Se empleó el

programa computacional Microsoft9 Office Excel 2003 para obtener la siguiente gráfica,

junto con su ecuación de regresión logarítmica y coeficiente de correlación:

microgramos de B S A

y = 0.1658Ln(x) +0.4245

r*= 0.9859

C. Promedio de las absorbancias obtenidas en las 6 réplicas del esquema de purificación.

L Maestra Inicial.

0.847 ±0.037

n. Cromatografía de intercambio amónico.

Elución 0M 0.448 ±0.023 Elución 0M 0.145 ± 0.051 Elución 0.4M 0.621 ± 0.048 Elución 0.6M 0.299 ± 0.069 Elución 0.8M 0.054 ± 0.010 Elución 1.0M 0.006 ± 0.006

m . Cromatografía de interacciones hidrofóbicas. Elución 1.0M 0.010 ± 0.010 Elución 0.8M 0.027 ± 0.026 Elución 0.6M 0.026 ± 0.028 Elución 0.4M 0.032 ± 0.027 Elución 0.2M 0.078 ± 0.036 Elución 0M 0.417 ±0.081

IV. Cromatografía de exclusión molecular. Elución 14 min 0.002 ± 0.004 Elución 16 min 0.067 ± 0.113 Elución 18 min 0.267 ± 0.112 Elución 20 min 0.307 ± 0.082 Elución 22 min 0.125 ± 0.106 Elución 24 min 0.028 ± 0.017 Elución 26 min 0.016 ± 0.009 Elución 28 min 0.008 ± 0.005 Elución 30 min 0.012 ± 0.017 Elución 32 min 0.006 ± 0.004 Elución 34 min 0.013 ± 0.011 Elución 36 min 0.006 ± 0.009

D. Promedio de los microgramos de las muestras analizadas en la 6 réplicas del esquema de purificación basados en la curva de

calibración y las absorbancias obtenidas.

L Muestra Inicial. 912.81 ±182.82

II. Cromatografía de intercambio aniónico. Elución OM 116.27 ± 16.22 Elución OM 19.28 ± 6.27 Elución 0.4M Elución 0.6M Elución 0.8M Elución 1.0M

338.36 ±87.67 50.19 ±18.45 10.73 ± 0.69 8.04 ± 0.31

m . Cromatografía de interacciones hidrofóbicas. Elución 1.0M Elución 0.8M Elución 0.6M Elución 0.4M Elución 0.2M Elución 0M

0.82 ± 0.05 0.92 ± 0.15 0.92 ± 0.16 0.95 ± 0.15 1.26 ± 0.30

64.84 ±17.89

IV. Cromatografía de exclusión molecular. Elución 14 min 0.00 ± 0.00 Elución 16 min 0.68 ± 1.33 Elución 18 min 3.93 ± 3.59 Elución 20 min 4.67 ± 2.86 Elución 22 min 1.21 ± 1.57 Elución 24 min 0.14 ± 0.08 Elución 26 min 0.07 ± 0.02 Elución 28 min 0.03 ± 0.01 Elución 30 min 0.05 ± 0.07 Elución 32 min 0.02 ± 0.00 Elución 34 min 0.06 ± 0.04 Elución 36 min 0.02 ± 0.03

Juan Francisco Villarreal Chiù, L.Q.I Plutarco E. Calles #345, Res. Periférico, Monterrey, México 66420

Teléfono: (0152) 8352-9447 • Fax: (0152) 8376-5753 E-mail: [email protected]

Educación Maestro en Ciencias, Biología Molecular e Ingeniería Genética, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Nuevo León (U.A.N.L.), Monterrey, México, 2006. Licenciatura, Licenciado en Química Industrial, Facultad de Ciencias Químicas, U.A.N.L., 2002.

Experiencia Profesional o Tesista Investigador, M.C., "Desarrollo de un esquema de purificación para la

hormona de crecimiento bovina producida por Pichia pastoril. Laboratorio de Biotecnología, Departamento de Bioquímica. Facultad de Medicina, UA.N.L. 2004-2006.

o Colaborador, "Determinación de la repetición CAG en el receptor de andrógenos en pacientes con cáncer de próstata". Laboratorio de Diagnóstico Molecular, Departamento de Bioquímica. Facultad de Medicina, UAN.L. 2004.

o Tesista Investigador, "Obtención de constantes cinéticas de biodegradación de BTEoX y EMTB por un consorcio mixto aclimatado a BTEX". Laboratorio de Biorremediación Ambiental. Facultad de Medicina, U.A.NX. 2003.

o Colaborador, "Producción, caracterización y determinación de enzimas lignolíticas". Laboratorio de Enzimología, Departamento de Bioquímica. Facultad de Ciencias Biológicas, U.A.N.L. 2001-2002.

o Analista Estadístico, "Programa Ganado Mejor 1999 de Alianza para el Campo en Nuevo León". SAGAR (Secretaria de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural) y FAO (Organización de las Naciones Unidas para la agricultura y la Alimentación). 1999.

o Analista Estadístico, "Programa Mejoramiento Genético 1998 de Alianza para el Campo en Nuevo León". SAGAR (Secretaria de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural) y FAO (Organización de las Naciones Unidas para la agricultura y la Alimentación). 1998.

o Analista Estadístico, "Programa Ganado Mejor 1998 de Alianza para el Campo en Nuevo León". SAGAR (Secretaria de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural) y FAO (Organización de las Naciones Unidas para la agricultura y la Alimentación). 1998.

mailto:[email protected]

Publicaciones Área de Biorremediación Ambiental

o Acuna-Askar, K., Gracia-Lozano, M.V, Villarreal-Chiu, J.F., Marmolejo, J.G., Garza-Gonzalez, M.T. y Chavez-Gomez, B.: "Effect of soil and a nonionic surfactant on BTEoX and MTBE biodégradation kinetics," Water Science and Technology. 2005: 52(8):107-115. IWA Publishing, Londres, Reino Unido. ISSN: 0273-1223.

o Acuna-Askar, K., Gracia-Lozano, M.V., Villarreal-Chiu, J.F., Garza-Gonzalez, M.T., Rodriguez-Sanchez, I.P., Barrera-Saldana, H.A y Chavez-Gomez, B. (2005). The effect of a nonionic surfactant on BTEOX and MTBE solubility in soil slurries. En: CONSOIL 2005, Site Characterisation and Risk Assessment O. Uhlmann, GJ. Annokkée and F. Arendt (Eds.). Forschungszentrum Karlsruhe GmbH, Publishers. Alemania, pp. 1268-1273. ISBN: 3-923704-50-X. Copyright 2005.

o Acuna-Askar, K., Villarreal-Chiu, J.F., Gracia-Lozano, M.V., Garza-Gonzalez, M.T., Chavez-Gomez, B., Rodriguez-Sanchez, I.P. y Barrera-Saldana, HA.: "BTEoX biodégradation kinetics with MTBE through bioaugmentation," Water Science and Technology. 2004: 50(5):75-92. IWA Publishing, Londres, Reino Unido. ISSN: 0273-1223.

Desarrollo Profesional Trabajos Expuestos en Congresos

o Villarreal-Chiu, J.F., Gracia-Lozano, M.V., Acuna-Askar, K., Garza-Gonzalez, M.T., Rodriguez-Sanchez, I.P. y Barrera-Saldana, HA.: "Bioremediation of BTEoX and MTBE in soil slurries by a biomass grown in a BTEX-fed batch-reactor," 105th General Meeting of American Society for Microbiology. Atlanta, E.U.A.. Jun. 5-9,2005.

o Acuna-Askar, K., Gracia-Lozano, M.V., Villarreal-Chiu, J.F., Garza-Gonzalez, M.T., Chavez-Gomez, B., Rodriguez-Sanchez, LP. y Barrera-Saldana, HA.: "The role of a nonionic surfactant on biodégradation efficiency kinetics models of BTEoX and MTBE," 4th World Wat» Congress and Exhibition. Marrakech, Marruecos. Sep. 19-24,2004.

o Vülarreal-Chiu, J.F., Gracia-Lozano, M.V., Garza-Gonzalez, M.T., Acuna-Askar, K., Rodriguez-Sanchez, LP. and Barrera-Saldana, HA.: "Aerobic bioremediation of BTEX with MTBE in soil samples," XXXVIII Congreso Mexicano de Química. Ixtapa, México. Sep. 21-25,2003.

o Villarreal-Chiu, J.F., Gracia-Lozano, M.V., Garza-Gonzalez, M.T., Acuna-Askar, K., Rodriguez-Sanchez, LP. y Barrera-Saldana, HA.: "Aerobic bioremediation of BTEX with MTBE in soil samples," 4° Congreso Regional Química Industrial. Mayo 27,2003. Monterrey, México.

Participación en Trabajos Presentados en Congresos o Acuna-Askar, K., Gracia-Lozano, M.V., Villarreal-Chin, J.F., Garza-Gonzalez,

M.T., Rodiguez-Sanchez, I.P., Barrera-Saldana, H.A. y Chavez-Gomez, B.:"The effect of a nonionic surfactant on BTEoX and MTBE solubility in soil slurries," 9th

International FZK/TNO Conference on Soil-Water Systems (ConSoil 2005). Bordeaux, Francia. Oct 3-7,2005.

o Acuna-Askar, K., Gracia-Lozano, M.V., VillarreaJ-Chio, J.F., Marmolejo, J.G., Garza-Gonzalez, M.T. y Chavez-Gomez, B. (2004). "Effect of soil and a nonionic surfactant on BTEoX and MTBE biodégradation kinetics". Proceedings of the 4th

International Water Association World Water Congress. Marrakech, Marruecos. Septiembre 19-24,2004. IWA Publishing, Londres, Reino Unido.

o Acuna-Askar, K., Gracia-Lozano, M.V., Villarreal-Chin, J.F., Garza-Gonzalez, M.T., Chavez-Gomez, B., Rodriguez-Sanchez, LP. y Barrera-Saldana, H.A. (2004). "The role of a nonionic surfactant on biodégradation efficiency kinetic models of BTE-oX and MTBE". Proceedings of the 4th International Water Association World Water Congress. Marrakech, Marruecos. Septiembre 19-24,2004. IWA Publishing, Londres, Reino Unido.

o Acuna-Askar, KL, Villarreal-Chin, J.F., Gracia-Lozano, M.V., Garza-Gonzalez, M.T., Chavez-Gomez, B., Rodriguez-Sanchez, I.P. y Barrera-Saldana, H.A.: "BTEoX biodégradation kinetics with MTBE trough bioaugmentation," 4th

Specialized International Water Association Conference on Assessment and Control of Hazardous Substances in Water (ECOHAZARD 2003). Aachen, Alemania. Sep. 14-17,2003.

Asistencia a Talleres y Congresos Relevantes o "Avances recientes en la biología molecular de Pichia pastoril, Instituto de

Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, U.A.N.L. Abril 4-5,2006.

o "Bioinformática estructural de las proteínas", Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, U.A.N.L. Dic. 12-15,2005.

o "Estabilidad estructural y espectroscopia de las proteínas", Instituto de Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, UA.N.L. Dic. 9-12,2005.

o "XVH Curso internacional: RNA de interferencia y PCR en tiempo real", Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, U.A.N.L. Nov. 8-13,2004.

o "2a1 Pan-American Symposium on Neurovirology and AIDS", Pan-American Society for Neurovirology y U.A.N.L. Facultad de Medicina. Mayo 5-7,2004.

o "Workshop on Scientific Writing: Proposal Application", National Institutos of Health, Harvard Medical School y U.A.N.L. Facultad de Medicina. Mayo 5,2004.

o "XXV Congreso Latinoamericano de Química", Federación Latinoamericana de Asociaciones Químicas y Sociedad Química de México. Cancún, México. Sep. 22-26,2002.

o "XXXVI Congreso Mexicano de Química", Sociedad Química de México. Ixtapa, México. Sep. 9-13,2001.

o "XXXIV Congreso Mexicano de Química", Sociedad Química de México. Monterrey, México. Oct 17-21,1999.

Seminarios Impartidos o Desarrollo de un esquema de purificación para la hormona de crecimiento bovina

producida por Pichia pastoris, XXIII Congreso Nacional de Investigación Bioquímica, Oct 29,2005.

o Obtención de constantes cinéticas de biodegradación de BTEoX y EMTB por un consorcio mixto aclimatado a BTEX, Escuela de Graduados, Facultad de Ciencias Químicas, U.A.N.L., Oct. 29,2004.

o Panel de Investigación, 5° Congreso Regional de Química Industrial, Mayo 13, 2004.

Experiencia Académica o Colaborador del taller, "Técnicas de Biorremed¡ación", Laboratorio de

Biorremediación Ambiental y Facultad de Agronomía, U.A.N.L., 2003 - 2004.

Premios Recibidos o Licenciatura, Premio a la mejor tesis de investigación en el área de Ciencias

Naturales, U.A.N.L., Monterrey, México, 2004.

o Premio Estatal de la Juventud en el área de Protección al Ambiente, otorgado por el Instituto Estatal de la Juventud y el gobernador del Estado de Nuevo León. Monterrey, México, 2004.

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