Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de ...
Transcript of Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de ...
Desarrollo de un complejo de inclusión
molecular de fármacos a partir de
almidón nativo
Alexander Puentes Parra
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Área Curricular de Farmacia
Bogotá D.C., Colombia
Agosto de 2020
Desarrollo de un complejo de inclusión
molecular de fármacos a partir de
almidón nativo
Alexander Puentes Parra
Químico
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magíster en Ciencias Farmacéuticas
Directora
Claudia Elizabeth Mora Huertas
Química Farmacéutica., MBA, Ph.D.
Departamento de Farmacia
Universidad Nacional de Colombia
Línea de Investigación:
Farmacotecnia
Grupo de Investigación en Diseño y Calidad de Productos Farmacéuticos, GIDECA
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Área Curricular de Farmacia
Bogotá D.C., Colombia
Agosto de 2020
A mis padres; Maria Oliva Parra, Eduardo Puentes y hermanos que han sido durante toda
mi vida un apoyo fundamental en todos los aspectos, familia, amigos, mi tía Martha y
Cristóbal. Un sinergismo que forjó este logro.
Yo había saltado desde el borde y entonces, en
el último instante, algo me cogió en el aire. Ese
algo es lo que defino como amor. Es la única
cosa que puede detener la caída de un hombre,
la única cosa lo bastante poderosa como para
invalidar las leyes de la gravedad.
Paul Benjamin Auster. “El palacio de la luna”
Agradecimientos
Es axiomático el conjunto de gratitudes que tengo que procurar a todas aquellas personas
que hicieron de este viaje en el tren de la existencia algo imperecedero y apacible, espero
tan solo no ser fugaz. He aludido textualmente la vida como una analogía, el tren, ese
pasmoso tren que transita sin rumbo fijo, cambiando de trayectoria y conviniendo sus vías
de acuerdo a su meta, en dicha trayectoria se suben personas que nos acompañan por un
breve trayecto, otras por un extenso recorrido, en esa dinámica algunas personas tienen
que descender, olvidando adrede su equipaje, otras bajan y se aseguran de no dejar a las
espaldas absolutamente nada, a tal punto de pasar inadvertidas, como si en absoluto se
hubiesen subido, y están aquellas que nos acompañan hasta el concluyente caminar. Esos
equipajes los llamo recuerdos y momentos inolvidables que han quedado guardados en el
tren de mi vida, dichosamente el tren se ha saturado de equipajes y personas en el trayecto
de esta meta.
Quiero agradecer a la Universidad Nacional de Colombia por acogerme en sus brazos, por
convertirse en un pilar fundamental en mi desarrollo profesional y personal.
Al Departamento de Farmacia junto con su personal administrativo y de laboratorios. Al
grupo de investigación GIDECA por permitirme hacer parte de él, a sus integrantes que se
convirtieron en amigos y en un apoyo fundamental con sus sugerencias y observaciones. A
la profesora Claudia Elizabeth Mora Huertas por depositar su confianza en mí, por su
apoyo y colaboración incondicional, por sus correcciones, aportes y exigencias, que sin
ellas los resultados no hubiesen sido lo que son. Al profesor Jorge Ariel Martínez por su
colaboración.
A mis amigos y vecinas de laboratorio, a Don Jorg por su espíritu colaborativo.
Resumen y abstract IX
Resumen
El almidón es un polímero biodegradable y biocompatible cuyas investigaciones durante los
últimos años lo proyectan como un material de partida prometedor para el desarrollo de
sistemas de entrega de moléculas en el campo farmacéutico. En este contexto, en la presente
investigación se extrae y caracteriza el almidón de una fuente poco convencional como el
bambú y se evalúa su posible uso como hospedador en la formación de complejos de
inclusión molecular con el ibuprofeno, de igual manera se empleó almidón de maíz con fines
comparativos.
El almidón de bambú está constituido de gránulos con formas irregulares y un tamaño medio
de 15 µm ± 1.0 µm, con un contenido de amilosa de 18.3% ± 1.2%, exhibe un patrón
cristalográfico correspondiente al polimorfo A con una alta temperatura de gelatinización
(79.1 °C) y una baja entalpía (ΔH = 8.8 J g-1). Por su parte, el almidón de maíz presenta el
mismo patrón cristalográfico del polimorfo A y en contraste con el almidón de bambú, tiene
un menor contenido de amilosa (16.30% ± 2.24%), una menor temperatura de gelatinización
(71.10 °C) y una mayor entalpía (ΔH = 22.35 J g-1).
Para la formación de los complejos molécula activa - almidón se emplearon tres métodos:
acidificación de una solución alcalina, calentamiento - sellado y calentamiento - sellado por
rotaevaporación, siendo este último una propuesta de esta tesis. Las cantidades de agua y los
tiempos de reacción utilizados en cada procedimiento influencian el rendimiento de los
complejos obtenidos; los que se encuentran entre 16.3% y 89.6% para el almidón de bambú
y entre 30.3% y 74.5% para el almidón de maíz. Igualmente, la eficiencia de complejación
es influenciada por dichas variables alcanzando valores de hasta 10.30% ± 0.02% cuando se
trabaja almidón de bambú y de hasta el 22.35% ± 0.04% en el caso de almidón de maíz. Las
estructuras semicristalinas de los complejos obtenidos evidencian algunas diferencias
X Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
importantes, principalmente en sus comportamientos térmico y de liberación del activo. Los
complejos parecen mantener una estructura más compacta en condiciones gástricas
simuladas pH 1.2 con porcentajes de liberación bajos obtenidos por un transporte de difusión
predominantemente Fickiana. Por otro lado, en condiciones simuladas del intestino (pH 6.8
y 7.2) en presencia de amilasa pancreática, se observó una liberación de aproximadamente
el 90% al cabo de 6 h con una cinética de liberación principalmente de primer orden,
probablemente como consecuencia de la escisión de los enlaces α(1-4) en cualquier punto
de las cadenas poliméricas.
Estos resultados sugieren que los almidones investigados podrían ser empleados como
sistemas transportadores de moléculas activas cuya liberación sea requerida a nivel
intestinal, lo cual abre posibilidades de generación de valor agregado a fuentes nativas de
almidón, especialmente para el diseño de nuevos sistemas de entrega de fármacos.
Palabras clave: Almidón, bambú, complejos de inclusión molecular, ibuprofeno, liberación
de activos, encapsulación molecular.
Resumen y abstract XI
Abstract
Starch is a biodegradable and biocompatible polymer whose recent research projects it as a
promising starting material for the development of drug delivery systems in the
pharmaceutical field. In this context, the present investigation extracts and characterizes the
starch from an unconventional source such as bamboo and evaluates its possible use as a
host in the formation of molecular inclusion complexes with ibuprofen, in the same way
corn starch was used for comparative purposes.
Bamboo starch consists of granules with irregular shapes, an average size of 15 µm ± 1.0
µm, an amylose content of 18.3% ± 1.2%, and a crystallographic pattern corresponding to
polymorph A exhibiting a high gelatinization temperature (79.1 ° C) and a low enthalpy (ΔH
= 8.8 J g-1). On its part, corn starch presents the same crystallographic pattern of polymorph
A but in contrast to bamboo starch, characterizes by a lower amylose content (16.30% ±
2.24 %), a lower gelatinization temperature (71.10 ° C) and a higher enthalpy (ΔH = 22.35
J g-1).
Three methods were used to form the drug - starch complexes: acidification of an alkaline
solution, heating - sealing and heating - sealing by rotavaporation, the latter being proposed
in this thesis. The amounts of water and the reaction times used in each procedure influence
the yield of the complexes obtained which varies between 16.3% and 89.6% for bamboo
starch and 30.3% and 74.5%, for the corn starch. Likewise, the complexing efficiency is
influenced by these variables reaching values of up to 10.30% ± 0.02% when bamboo starch
was used and of up to 22.35% ± 0.04% for corn starch. The semicrystalline structures of the
obtained complexes show some important differences, mainly in their thermal and drug
release behaviors. Probably, the complexes maintain a more compact structure under
simulated gastric conditions pH 1.2 with low release percentages delivered predominantly
by Fickian diffusion transport. On the other hand, under simulated conditions of the intestine
(pH 6.8 and 7.2) in the presence of pancreatic amylase, a drug release of approximately 90%
was observed after 6 h mainly following a first order release kinetics, probably because of
the excision of the α (1-4) bonds at any point in the polymer chains.
XII Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
These results suggest that the investigated starches could be used as carriers for active
molecules whose release is intended at the intestinal level which offers attractive
possibilities for generating added value to native starch source, particularly to design of new
drug delivery systems.
Key words: Starch, bamboo, molecular inclusion complexes, ibuprofen, active release,
molecular encapsulation.
Contenido XIII
Contenido
Resumen .............................................................................................................................. IX
Lista de figuras ................................................................................................................... XV
Lista de tablas .................................................................................................................. XIX
Lista de símbolos y abreviaturas .................................................................................... XXIII
Introducción .......................................................................................................................... 1
1 Marco teórico ................................................................................................................. 5
1.1 Amilosa .................................................................................................................. 6
1.2 Amilopectina .......................................................................................................... 8
1.3 Estructura interna del gránulo de almidón ........................................................... 10
1.4 Complejos de inclusión basados en almidón........................................................ 14
2 Objetivos ...................................................................................................................... 23
2.1 Objetivo general ................................................................................................... 23
2.2 Objetivos específicos............................................................................................ 23
3 Extracción y caracterización del almidón de bambú ................................................... 25
3.1 Métodos y materiales ........................................................................................... 26
3.1.1 Extracción del almidón ................................................................................. 26
3.1.2 Caracterización del almidón de bambú ......................................................... 27
3.2 Resultados y discusión ......................................................................................... 35
4 Preparación y caracterización de complejos de inclusión molecular a base de almidón
nativo................................................................................................................................... 46
4.1 Métodos y materiales ........................................................................................... 47
4.1.1 Preparación de los complejos de inclusión molecular .................................. 47
4.1.1.1 Método de acidificación de una solución alcalina .................................... 48
4.1.1.2 Método de calentamiento - sellado............................................................ 50
4.1.1.3 Método de calentamiento - sellado por rotaevaporación .......................... 50
4.1.1.4 Preparación de los controles y las mezclas físicas .................................... 51
4.1.2 Caracterización de los complejos de inclusión molecular ............................ 52
4.1.2.1 Determinación de la cantidad de ibuprofeno complejado ......................... 52
4.1.2.2 Microscopía electrónica de barrido (SEM) ............................................... 53
4.1.2.3 Calorimetría diferencial de barrido de alta presión (HP-DSC) ................. 53
4.1.2.4 Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) ................ 53
XIV Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
4.1.2.5 Difracción de rayos X (XRD) ................................................................... 54
4.1.2.6 Evaluación del comportamiento de liberación .......................................... 54
4.1.2.7 Modelos cinéticos de liberación ................................................................ 55
4.2 Resultados y discusión ......................................................................................... 56
4.2.1 Rendimiento, porcentaje de activo complejado y eficiencia de
complejación…. ........................................................................................................... 60
4.2.2 Caracterización de los complejos por SEM, DSC, FTIR, XRD ................... 65
4.2.3 Liberación del activo..................................................................................... 79
5 Conclusiones y recomendaciones ................................................................................ 89
5.1 Conclusiones ........................................................................................................ 89
5.2 Recomendaciones ................................................................................................. 90
A. Anexo: Determinación del contenido de amilosa aparente ......................................... 93
B. Anexo: Observaciones de impurezas por microscopía óptica y SEM ......................... 95
C. Anexo: Distribución del tamaño de partícula .............................................................. 97
D. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC ......................................... 99
D.1 Condiciones cromatográficas de partida .............................................................. 99
D.2 Preparación de las muestras ................................................................................. 99
D.3 Validación de la metodología analítica .............................................................. 100
D.4 Resultados y discusión ....................................................................................... 103
E. Anexo: Datos de liberación en condiciones simuladas del tracto gastrointestinal ... 113
6 Bibliografía ................................................................................................................ 117
Contenido XV
Lista de figuras
Figura 1-1. Representación estructural de la amilosa. ......................................................... 6
Figura 1-2. Representación estructural de la amilopectina. ................................................. 9
Figura 1-3. Clasificación de las cadenas de amilopectina. Los círculos representan las
unidades de glucosa, las líneas horizontales representan los enlaces α(1→4) y las líneas
curvas los enlaces α(1→6), el círculo con una línea cruzada representa el grupo terminal
reductor. Todas las cadenas A son cadenas externas, por otro lado las cadenas B consisten
de un segmento externo y un segmento interno, este último es definido como las unidades
entre los puntos de ramificación sin tener en cuenta toda la longitud de la cadena y que es
representado en la figura mediante los círculos con un punto en su interior (Adaptado de
Pérez y Bertoft, 2010). ........................................................................................................ 10
Figura 1-4. Modelos estructurales propuestos para representar la organización de la
amilopectina dentro de los gránulos de almidón. Los gránulos de almidón consisten en
anillos de crecimiento con una alternancia entre laminillas cristalinas (C) y amorfas (A) que
son observadas en mayor detalle en la parte inferior de la imagen. Los detalles de las dobles
hélices (cilindros) y bloques de construcción (círculos grises) se representan en la figura
central, los círculos en blanco y negro representan las unidades de glucosa. Los segmentos
interbloques (S-IB) y los segmentos interclúster (S-IC) se encuentran en ambos modelos, la
unidad principal en el modelo de clúster es el clúster y en el modelo de columna vertebral
de bloques de construcción es el bloque de construcción el cual es mucho más pequeño y
estrechamente ramificado. Una diferencia importante entre los modelos es que en el modelo
de clúster las cadenas de amilopectina penetran las laminillas mientras que en el modelo de
columna vertebral de bloques de construcción no sucede (adaptado de Vamadevan y Bertoft,
2015). .................................................................................................................................. 11
Figura 1-5. Representación esquemática de la estructura interna de los gránulos de almidón
desde los anillos de crecimiento: (A) imagen TEM sección fina de un gránulo de almidón;
(B) alternancia de los anillos de crecimiento amorfos y semicristalinos; (C) modelado de la
estructura de la amilopectina. Las líneas en puntos describen las laminillas amorfas y
cristalinas (repetición de 9-10 nm) que corresponden a los puntos de ramificación; (D)
detalle de un clúster que muestra la formación de doble hélices de las cadenas ramificadas
cortas de la amilopectina (adaptado de Buléon et al., 2007). ............................................. 12
XVI Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Figura 1-6. Modelos moleculares de hélices, proyecciones de las celdas unitarias y el patrón
cristalográfico correspondiente a: (A) polimorfo A; (B) polimorfo B y (C) polimorfo Vh -
amilosa (adaptado de Buléon et al., 1998 y Kong et al., 2014c). ....................................... 13
Figura 3-1. Pasos para el pretratamiento del material vegetal de bambú previo a la
extracción del almidón. ....................................................................................................... 27
Figura 3-2. Pasos para la extracción de almidón a partir de tallos de bambú. ................... 28
Figura 3-3. Procedimiento para la preparación de las muestras para la curva de calibración
y posterior determinación del contenido de amilosa........................................................... 32
Figura 3-4. Registro de presencia de Rhipidocladum cf. Harmonicum (Parodi) Mcclure en
América (adaptado de GBIF Backbone Taxonomy, 2019). ............................................... 36
Figura 3-5. Micrografías SEM del parénquima celular en fibras de bambú. ..................... 37
Figura 3-6. Micrografías de los gránulos del almidón de bambú, observado en: Microscopio
electrónico de barrido (A y B); microscopio óptico sin luz polarizada con una magnificación
de 100x (C); microscopio óptico de luz polarizada con una magnificación de 100x (D). . 39
Figura 3-7. Distribución en densidad de volumen del tamaño de partícula del almidón de
bambú (A); distribución del tamaño de partícula del almidón de bambú en términos de área
superficial (B). .................................................................................................................... 41
Figura 3-8. Termograma obtenido para el almidón de bambú mediante HP-DSC (A);
espectro infrarrojo obtenido para el almidón de bambú (B). .............................................. 43
Figura 3-9. Patrón de difracción de rayos X del almidón de bambú. ................................ 44
Figura 3-10. Poder de hinchamiento del almidón de bambú (A); porcentaje de sólidos
solubles (%SS) e insolubles (%SI) lixiviados en el almidón de bambú (B). ...................... 45
Figura 4-1. Representación de la estructura química de la mezcla racémica del ibuprofeno
(ácido 2-(4-isobutilfenil) propiónico). ................................................................................ 46
Figura 4-2. Obtención de los complejos de inclusión molecular por el método de
acidificación de una solución alcalina. ............................................................................... 49
Figura 4-3. Obtención de los complejos de inclusión molecular por el método de
calentamiento - sellado. ...................................................................................................... 50
Figura 4-4. Obtención de los complejos de inclusión molecular por el método de
calentamiento - sellado por rotaevaporación. ..................................................................... 51
Figura 4-5. Determinación del comportamiento de liberación de los complejos. ............. 55
Figura 4-6. Mecanismo de reacción propuesto para la formación de complejos de inclusión
molecular mediante el método de acidificación de una solución alcalina. Dispersión de
almidón en solución básica (A); inicio de la lixiviación de los componentes estructurales del
almidón como consecuencia de la ionización de los grupos hidroxilo y el aumento de la
temperatura (B); componentes estructurales en solución posterior a la ruptura del gránulo de
almidón (C); enfriamiento y protonación de los grupos hidroxilo de las cadenas poliméricas
que van adoptando una conformación helicoidal con el huésped incluido en la cavidad de la
misma (D). .......................................................................................................................... 58
Contenido XVII
Figura 4-7. Mecanismo de reacción propuesto para la formación de complejos de inclusión
molecular mediante el método de calentamiento - sellado. Dispersión de almidón en agua
destilada (A); inicio de la lixiviación de los componentes estructurales del almidón como
consecuencia del aumento de la temperatura (B); componentes estructurales en solución
posterior a la ruptura del gránulo de almidón (C); enfriamiento de la solución y
conformación helicoidal de las cadenas poliméricas con el huésped incluido en la cavidad
interna de la misma (D)....................................................................................................... 59
Figura 4-8. Mecanismo de reacción propuesto para la formación de complejos de inclusión
molecular mediante el método de calentamiento - sellado. Dispersión de almidón en agua
destilada (A); inicio de la lixiviación de los componentes estructurales del almidón como
consecuencia del aumento de la temperatura (B); componentes estructurales en solución
posterior a la ruptura del gránulo de almidón (C); evaporación del solvente gradualmente,
acompañado de la conformación helicoidal de las cadenas poliméricas con el huésped
incluido en la cavidad interna de las mismas (D y E). ........................................................ 60
Figura 4-9. Micrografías SEM correspondientes a los complejos de inclusión molecular.
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación
de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento
- sellado por rotaevaporación (RE). .................................................................................... 66
Figura 4-10. Termogramas correspondientes a los complejos de inclusión molecular, los
controles y las mezclas físicas de dichos materiales. Almidón de bambú (AB); almidón de
maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA);
método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación
(RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF). ............................................... 70
Figura 4-11. Espectros FTIR correspondientes a los complejos de inclusión molecular, los
controles y las mezclas físicas de dichos controles. Almidón de bambú (AB); almidón de
maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA);
método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación
(RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF). ............................................... 73
Figura 4-12. Difractogramas de rayos X correspondientes a los complejos de inclusión
molecular, los controles y las mezclas físicas. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz
(AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método
calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE);
control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF). ......................................................... 75
Figura 4-13. Perfiles de liberación de ibuprofeno a partir de los diferentes complejos
investigados en condiciones gástricas simuladas pH 1.2. Almidón de bambú (AB); almidón
de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA);
método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación
(RE). .................................................................................................................................... 80
Figura 4-14. Perfiles de liberación de ibuprofeno a partir de los diferentes complejos
investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8. Almidón de bambú (AB);
XVIII Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina
(ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por
rotaevaporación (RE). ......................................................................................................... 82
Figura 4-15. Perfiles de liberación de ibuprofeno a partir de los diferentes complejos
investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en presencia de pancreatina.
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación
de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento
- sellado por rotaevaporación (RE). .................................................................................... 85
Figura 4-16. Perfiles de liberación de ibuprofeno a partir de los diferentes complejos
investigados en condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en presencia de pancreatina.
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación
de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento
- sellado por rotaevaporación (RE). .................................................................................... 87
Figura A-1. Espectros de absorción obtenidos en la determinación de la cantidad de yodo
necesaria para la cuantificación de amilosa. ....................................................................... 93
Figura A-2. Curva de calibración para la determinación del contenido aparente de amilosa.
............................................................................................................................................. 94
Figura A-3. Espectros de absorción correspondientes a la curva de calibración en la
determinación del contenido aparente de amilosa. ............................................................. 94
Figura B-1. Micrografía SEM de los sólidos insolubles presentes en el almidón (A);
micrografía óptica del almidón con una magnificación de 100x (B). ................................. 95
Figura C-1. Comportamiento de los datos y los ajustes en la determinación del tamaño de
partícula............................................................................................................................... 97
Figura D-1. Espectro de absorción del ibuprofeno obtenido mediante HPLC. ............... 100
Figura D-2. Cromatograma correspondiente al estándar de ibuprofeno (5 µg/mL) obtenido
mediante HPLC. ................................................................................................................ 103
Figura D-3. Cromatogramas obtenidos para la evaluación de la selectividad mediante
HPLC: matriz de almidón de bambú enriquecido con ibuprofeno 5 µg/mL (A); matriz de
almidón de bambú (B); matriz de almidón de maíz (C); fase móvil (D). ......................... 105
Figura D-4. Determinación de la pureza del pico correspondiente al ibuprofeno, datos
procesados con el software Agilent ChemStation con un límite de umbral de 990. ........ 105
Figura D-5. Curva de calibración del sistema obtenida mediante HPLC, datos ajustados a
un modelo de regresión lineal simple. .............................................................................. 106
Contenido XIX
Lista de tablas
Tabla 1-1. Enzimas y sustratos empleados para la síntesis in vitro de la amilosa (Ohdan
et al., 2006). .......................................................................................................................... 8
Tabla 1-2. Agentes complejantes y sus diferentes hospedadores empleados en el estudio de
los complejos de inclusión molecular. ................................................................................ 16
Tabla 1-3. Clasificación de las estructuras cristalinas de los complejos de inclusión
molecular con sus respectivas dimensiones de las celdas unitarias y la localización de la
molécula huésped (adaptado de Putseys et al., 2010). ........................................................ 18
Tabla 3-1. Proporciones de amilosa - amilopectina empleadas en la curva de calibración
requerida para la determinación del contenido de amilosa en almidón. ............................. 30
Tabla 3-2. Condiciones de medida utilizadas para la determinación de la distribución del
tamaño de partícula del almidón de bambú mediante difracción láser. .............................. 33
Tabla 3-3. Propiedades térmicas del almidón de bambú. .................................................. 42
Tabla 3-4. Cristalinidad relativa estimada para el almidón de bambú. .............................. 44
Tabla 4-1. Características fisicoquímicas obtenidas para el almidón de maíz. .................. 47
Tabla 4-2. Condiciones de reacción empleadas para la preparación de complejos de
inclusión molecular basados en almidón. ........................................................................... 48
Tabla 4-3. Modelos matemáticos de liberación empleados para lograr una aproximación al
mecanismo de liberación del activo a partir de los complejos............................................ 55
Tabla 4-4. Porcentajes de rendimiento, porcentaje de ibuprofeno complejado y eficiencia
de complejación determinados para los diferentes complejos. ........................................... 62
Tabla 4-5. Temperaturas y entalpías de disociación de los complejos de inclusión, de los
controles y de las mezclas físicas de dichos controles. ....................................................... 71
Tabla 4-6. Indexación del d-espaciado observado en los respectivos complejos con
ibuprofeno en las celdas unitarias reportadas en la literatura. ............................................ 77
Tabla 4-7. Ajuste a los diferentes modelos cinéticos de los perfiles de liberación de los
diferentes complejos investigados en condiciones gástricas simuladas pH 1.2. ................. 81
Tabla 4-8. Ajuste a los diferentes modelos cinéticos de los perfiles de liberación de los
diferentes complejos investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8. ........... 83
Tabla 4-9. Ajuste a los diferentes modelos cinéticos de los perfiles de liberación de los
diferentes complejos investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en
presencia de pancreatina. .................................................................................................... 86
XX Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Tabla 4-10. Ajuste a los diferentes modelos cinéticos de los perfiles de liberación de los
diferentes complejos investigados en condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en
presencia de pancreatina. .................................................................................................... 87
Tabla C-1. Residuales de la curva de datos, ajuste e índices de refracción y absorción
utilizados en la determinación del tamaño de partícula. ..................................................... 97
Tabla D-1. Niveles de concentración seleccionados para evaluar la linealidad del sistema
en la validación de la metodología analítica mediante HPLC. ......................................... 101
Tabla D-2. Datos de idoneidad del sistema obtenidos mediante HPLC. ......................... 104
Tabla D-3. Datos primarios para la evaluación de la linealidad del sistema en la validación
de la metodología analítica mediante HPLC. ................................................................... 107
Tabla D-4. Prueba t de Student para el intercepto y la pendiente empleada para la evaluación
de la linealidad del sistema en la validación de la metodología analítica mediante HPLC.
........................................................................................................................................... 108
Tabla D-5. ANOVA para la evaluación del modelo de regresión lineal empleado en la
validación de la metodología analítica mediante HPLC. .................................................. 108
Tabla D-6. Datos primarios para la evaluación de la repetibilidad de la metodología analítica
mediante HPLC. ................................................................................................................ 109
Tabla D-7. Evaluación de la repetibilidad y prueba de hipótesis estadística C de Cochran
empleados en la validación de la metodología analítica mediante HPLC. ....................... 109
Tabla D-8. Datos primarios para la evaluación de la precisión intermedia de la metodología
analítica mediante HPLC. ................................................................................................. 110
Tabla D-9. ANOVA para la evaluación de la precisión intermedia de la metodología
analítica mediante HPLC. ................................................................................................. 110
Tabla D-10. Evaluación de la exactitud y prueba t de Student realizadas en la validación de
la metodología analítica mediante HPLC. ........................................................................ 111
Tabla D-11. Límite de detección y límite de cuantificación obtenidos con datos de la curva
de calibración correspondiente a la metodología analítica mediante HPLC. ................... 111
Tabla E-1. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones gástricas
simuladas pH 1.2. .............................................................................................................. 113
Tabla E-2. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones simuladas del
intestino pH 6.8. ................................................................................................................ 113
Tabla E-3. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones simuladas del
intestino pH 6.8 en presencia de pancreatina. ................................................................... 114
Tabla E-4. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones simuladas del
intestino pH 7.2 en presencia de pancreatina. ................................................................... 114
Tabla E-5. Factor de similitud (f2) correspondiente a los perfiles de liberación obtenidos
para los complejos de inclusión molecular en condiciones gástricas simuladas pH 1.2. . 115
Tabla E-6. Factor de similitud (f2) correspondiente a los perfiles de liberación obtenidos
para los complejos de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 6.8.
........................................................................................................................................... 115
Contenido XXI
Tabla E-7. Factor de similitud (f2) correspondiente a los perfiles de liberación obtenidos
para los complejos de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en
presencia de pancreatina. .................................................................................................. 116
Tabla E-8. Factor de similitud (f2) correspondiente a los perfiles de liberación obtenidos
para los complejos de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en
presencia de pancreatina. .................................................................................................. 116
Contenido XXIII
Lista de símbolos y abreviaturas
Símbolos con letras latinas Símbolo Término
ΔH Entalpía de gelatinización
k0 Constante de velocidad de liberación de orden cero
k1 Constante de velocidad de liberación de primer orden
kH Constante de velocidad de liberación de Higuchi
kkC Constante de velocidad de liberación de Korsmeyer - Peppas
nKP Exponente n del modelo matemático de Korsmeyer - Peppas
Abreviaturas Abreviatura Término
AFM Microscopía de fuerza atómica (Atomic Force Microscopy)
AOAC
International
Asociación de Colaboración Analítica Oficial Internacional
(Association of Official Analytical Collaboration (AOAC)
International)
ASA Acidificación de una solución alcalina (Alkaline Solution
Acidification)
ATR Reflectancia total atenuada (Attenuated Total Reflectance)
BSE Electrones retrodispersados (Back-Scattered Electrons)
CS Calentamiento - sellado
DP Grado de polimerización (Degree of Polymerization)
XXIV Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
DSC Calorimetría diferencial de barrido (Differential Scanning
Calorimetry)
FTIR Espectrometría infrarroja por transformada de Fourier (Fourier-
Transform Infrared Spectroscopy)
FMI Perspectivas del mercado futuro (Future Market Insights)
GP Glucógeno fosforilasa (Glycogen Phosphorylase)
G-1-P Glucosa 1-fosfato (Glucose 1-Phosphate)
HP-DSC Calorimetría diferencial de barrido de alta presión (High Pressure
Differential Scanning Calorimetry)
IBU Ibuprofeno
NMR Resonancia magnética nuclear (Nuclear Magnetic Resonance)
RE Rotaevaporación
SANS Dispersión de neutrones de ángulo pequeño (Small-Angle Neutron
Scattering)
SAXS Dispersión de rayos X de ángulo pequeño (Small-Angle X-Ray
Scattering)
SE Electrones secundarios (Secondary Electrons)
SEM Microscopía electrónica de barrido (Scanning Electron Microscopy)
S-IB Segmentos interbloques
S-IC Segmentos interclúster
TEM Microscopía electrónica de transmisión (Transmission Electron
Microscopy)
WAXS Dispersión de rayos X de ángulo amplio (Wide-Angle X-Ray
Scattering)
XRD Difracción de rayos X (X - Ray Diffraction)
Introducción
El almidón es uno de los carbohidratos naturales más abundantes en las plantas en donde es
biosintetizado en forma de gránulos semicristalinos, almacenado como fuente de energía en
diferentes órganos incluidos los frutos, semillas, hojas, tubérculos, raíces, y es transformado
en hidratos de carbono simples durante periodos de actividad fotosintética reducida. El
contenido de almidón, así como el tamaño, la forma geométrica, la composición y la
estructura de los polímeros constituyentes de los gránulos, varían dependiendo de las
condiciones ambientales del cultivo, la edad de la planta y la fuente botánica (Lawton, 2015).
Los almidones comercialmente disponibles son aislados principalmente de cereales como el
maíz y el trigo, y de tubérculos como la papa y la yuca, siendo el maíz la fuente más
importante con una producción mundial del 83% (Lawton, 2015). Dentro de las aplicaciones
del almidón como excipiente en la industria farmacéutica se destacan su uso como
desintegrante, aglutinante, absorbente, viscosante, diluente y deslizante, entre otras (Qi y
Tester, 2019). En el campo cosmético es frecuentemente utilizado como diluente en polvos
faciales, absorbente en talcos y estabilizante en emulsiones.
Las diferentes propiedades del almidón debidas especialmente a la fuente botánica motivan
la exploración de nuevas fuentes de este carbohidrato que permitan obtener características
funcionales únicas. Debido a su biodegradabilidad, biocompatibilidad y disponibilidad, el
almidón se ha convertido en un material de partida para desarrollar excipientes con nuevas
funcionalidades, como es el caso de los almidones modificados que han sido empleados en
la preparación de emulsiones de Pickering (Albert et al., 2019)
Igualmente, los almidones han sido investigados como transportadores de moléculas activas
con el propósito de aportar alternativas de solución a los retos de disminuir los efectos
secundarios de algunas moléculas activas, protegerlas frente a condiciones ambientales
2 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
adversas, entregarlas en el sitio de acción y de forma controlada, así como satisfacer la
exigencia de emplear como excipientes materiales biodegradables y biocompatibles. Con
este propósito se han desarrollado técnicas de encapsulación empleando almidones tales
como el secado por aspersión (Ocampo-Salinas et al., 2020; Rocha et al., 2012), la extrusión
(Hassanzadeh et al., 2017; Xie et al., 2020), el recubrimiento por lecho fluidizado (Li et al.,
2019), y la coacervación (Fiedler et al., 2020; Zaki Rizkalla et al., 2013), entre otros
(Saifullah et al., 2019). Dentro de estas últimas, la encapsulación por inclusión resulta de
interés para la presente investigación. Esta técnica permite la asociación supramolecular de
un ligando o huésped en un hospedador que contiene una cavidad interna donde se aloja
finalmente el huésped estabilizado por puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals o
bien, por el efecto hidrofóbico impulsado por la entropía (Gouin, 2004).
Se ha demostrado que el almidón puede formar complejos de inclusión helicoidales con
moléculas orgánicas como alcoholes y ácidos grasos (Le Bail et al., 2005; Obiro et al., 2012;
Takeo et al., 1973; Wulff et al., 2005), así como con moléculas inorgánicas (Tomasik y
Schilling, 1998). La adición de ligandos complejantes induce la formación de hélices
simples denominadas V-amilosa, especialmente en las cadenas lineales de amilosa y en las
cadenas que hacen parte de la estructura ramificada de la amilopectina (Conde-Petit et al.,
2006). Estas hélices presentan una cavidad hidrófoba y una superficie hidrofílica, que
permiten la complejación de compuestos bioactivos lipofílicos en su interior. Estos
complejos de inclusión presentan propiedades interesantes con aplicaciones potenciales en
la industria farmacéutica y de alimentos. Por ejemplo, los complejos formados con amilosa
y lípidos modulan las propiedades reológicas y de resistencia a la hidrólisis ácida, así como
a la degradación enzimática, siendo empleados principalmente en la industria de alimentos
para disminuir el envejecimiento del pan. Adicionalmente, debido a la similitud de las
estructuras tipo V-amilosa con las ciclodextrinas, el uso de estos complejos puede brindar
protección a las moléculas activas frente a diferentes condiciones ambientales del tracto
gastrointestinal disminuyendo los efectos secundarios y permitiendo la entrega del activo en
el intestino.
La estructura V-amilosa se puede obtener en diferentes formas macromoleculares tales como
fibras, monocristales lamelares y esferulitas que dependen principalmente de las
Introducción 3
condiciones de cristalización. El estudio de los alomorfos se ha llevado a cabo
principalmente mediante difracción de rayos X (XRD), donde se han propuesto modelos
moleculares de hélices-zurdas simples (Buléon et al., 1990; Helbert y Chanzy, 1994; Putseys
et al., 2010; Rappenecker y Zugenmaier, 1981; Yamashita et al., 1973). Sin embargo, varios
detalles de dichas estructuras, como la influencia de la molécula huésped en la conformación
helicoidal, la disposición del empaquetamiento cristalino, la forma como se ubica la
molécula huésped dentro o entre las hélices, el mecanismo por medio del cual se da la
complejación y los parámetros de cristalización que afectan la estructura final, entre otros,
permanecen sin ser resueltos.
La mayoría de investigaciones en este tema se han centrado en la complejación de amilosa
con ácidos grasos de interés para la industria alimentaria (Conde-Petit et al., 2006;
Cozzolino y Degner, 2016; Cui y Oates, 1999; Crowe et al., 2000; Kim et al., 2017; Putseys
et al., 2010; Wang et al., 2019), pero muy poco se ha abordado en el campo farmacéutico
como una alternativa de sistema de entrega de fármacos (Yang et al., 2013; Zhang et al.,
2016; Carbinatto et al., 2016; Zhang et al., 2011; Cohen et al., 2008, 2011; Marinopoulou
et al., 2019). Como un aporte en este sentido, la presente tesis investiga la formación de
complejos de inclusión entre almidón y una molécula modelo (ibuprofeno) y con el
propósito de generar valor agregado a los recursos naturales disponibles en Colombia, se
empleó como hospedador un almidón nativo extraído del bambú. Así, la primera parte de
este trabajo se centra en la obtención de dicho almidón y la caracterización de sus
propiedades estructurales y fisicoquímicas de interés en su función como agente
complejante. Posteriormente, en la segunda parte se investigó la preparación de los
complejos de inclusión empleando el almidón nativo de bambú e ibuprofeno. Como
referencia, también fueron preparados complejos entre el activo y el almidón de maíz. Este
es un primer paso dentro del grupo de investigación en Desarrollo y Calidad de Productos
Farmacéuticos y Cosméticos -GIDECA- hacia el empleo del almidón como material de
partida para el diseño de medicamentos en los que además, se aprovechen fuentes no
convencionales de este excipiente.
1 Marco teórico
El almidón es un carbohidrato no estructural, insoluble en agua, compuesto por dos
homopolímeros con unidades de D-glucosa conocidos como amilosa y amilopectina, los que
representan alrededor del 98% de su peso en base seca y cuya relación varía según la fuente
botánica (Tester et al., 2004). En las plantas, el almidón existe como gránulos
semicristalinos insolubles biosintetizados mediante un proceso complejo llevado a cabo en
varios tejidos de órganos tales como hojas, raíces, brotes, frutas, granos y tallos (Bertoft,
2017; Preiss, 2018). Las diferencias entre las proporciones de amilosa y amilopectina y la
forma en la que se organizan al interior de los gránulos varía dentro y entre las diferentes
especies, repercutiendo en su forma, tamaño y propiedades como absorción de agua,
hinchamiento, gelificación y susceptibilidad a la degradación enzimática, entre otras (Wang
y Copeland, 2013). Esta variabilidad se origina principalmente en los procesos biosintéticos
dado que se involucran genes que están sujetos a controles de desarrollo e influencias
ambientales (Wang y Copeland, 2013). Igualmente el método de aislamiento del almidón y
las técnicas analíticas empleadas para su caracterización pueden explicar algunas diferencias
entre ellos (Vamadevan y Bertoft, 2015).
La mayoría de los almidones nativos se caracterizan por un contenido de amilosa que varía
entre el 20% y el 30%, aunque pueden existir variantes naturales fuera de este rango (Chung
y Liu, 2009; Wang y Copeland, 2013). Por otra parte, los gránulos de almidón pueden
contener pequeñas cantidades de proteínas ubicadas a nivel superficial, así como minerales
y lípidos (Vamadevan y Bertoft, 2015). Estos últimos representan la fracción asociada más
importante en los gránulos de almidón; así, en algunos almidones de cereales como el de
trigo se encuentran porcentajes entre 0.8% y 1.2% y para almidón de maíz, entre 0.6% y
0.8% (Buléon et al., 1998). Algunos gránulos de almidón contienen poros en la superficie y
canales internos que varían en términos de su ubicación, dimensión y extensión y que
6 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
podrían estar conectados entre sí y con la cavidad interna del gránulo como ocurre en los
almidones de maíz y sorgo (Jane, 2009; Qi y Tester, 2019); dichos poros han sido empleados
para la incorporación de moléculas activas tales como clorhidrato de tiamina, riboflavina,
ácido gálico, caquetina, leucina, isoleucina, metionina, lisina, ibuprofeno, benzocaína,
sulfapiridina, curcumina y ácido ascórbico (Han et al., 2015; Janaswamy, 2014; WeiRong
y HuiYuan, 2002; Zhu, 2017b) dentro de los gránulos de almidón en su forma nativa,
planteándose como una alternativa a los sistemas transportadores convencionales. De igual
manera, es posible inducir la formación de los poros cuando éstos están ausentes en los
almidones nativos mediante hidrólisis ácida o por métodos enzimáticos, favoreciendo la
carga de la molécula de interés (Qi y Tester, 2019).
1.1 Amilosa
La amilosa es una molécula lineal con un rango de peso molecular de aproximadamente 105
g mol-1 y 106 g mol-1 y un grado de polimerización (DP) entre 1000 y 10000 unidades de
glucosa (Copeland et al., 2009; Gidley et al., 2010). Como se muestra en la Figura 1-1,
dichas unidades de glucosa están unidas principalmente por enlaces α(1→4) de D-
glucopiranosa. No obstante, se encuentran puntos de ramificación con enlaces α(1→6) que
varían según el origen botánico (Gunning et al., 2003; Takeda et al., 1987).
Figura 1-1. Representación estructural de la amilosa.
La localización de la amilosa dentro de los gránulos de almidón aún no se conoce muy bien.
En este sentido, se han propuesto varias hipótesis que indican que algunas cadenas de
amilosa participan en interacciones con la amilopectina; por otro lado, que la amilosa podría
estar en mayor proporción en la periferia que en el núcleo amorfo de los gránulos. Sin
embargo, una hipótesis contradictoria indica que la amilosa forma la mayor parte del núcleo
O
H
H
OH
OHOH
H
H
H
CH2OH
O
O
H
H
OH
OH
H
H
H
CH2OH
O
O
H
H
OH
OH
H
H
H
CH2OH
O
O
H
H
OH
OH
H
H
H
CH2OH
OH
n
1
23
4
5
6
1
23
4
5
6
Marco teórico 7
amorfo de los gránulos y una pequeña cantidad de sus cadenas se intercalan entre los grupos
de amilopectina orientados hacia la superficie de dichos gránulos actuando como columnas
de refuerzo (Blazek y Gilbert, 2011; Wang y Copeland, 2013).
La amilosa obtenida de los gránulos de almidón es heterogénea en cuanto a su tamaño
molecular, no es completamente lineal y puede estar contaminada por moléculas de
amilopectina. A diferencia de ésta, la amilosa obtenida mediante síntesis presenta ciertas
ventajas que incluyen el lograr cadenas de peso molecular más homogéneo y completamente
lineales, lo que es de gran importancia en la complejación con moléculas huésped.
La amilosa puede ser sintetizada enzimáticamente tratando de imitar la capacidad de la
naturaleza en dicho proceso (Wulff et al., 2005). Algunas de las enzimas y sustratos
empleados con este propósito se presentan en la Tabla 1-1, dentro de ellas, las más utilizadas
son la isoamilasa y la glucógeno fosforilasa. La isoamilasa cataliza la escisión de los enlaces
α(1→6) presentes en las cadenas de amilosa y amilopectina siendo una alternativa para la
obtención de cadenas lineales de amilosa principalmente a partir de la amilopectina. Sin
embargo, a pesar de que es un método económico, no permite obtener cadenas con el DP
deseado. Además, el tamaño promedio de las cadenas depende de las características
estructurales de la amilopectina (Doblado-Maldonado et al., 2017; Ohdan et al., 2006). Por
su parte, la síntesis empleando la enzima glucógeno fosforilasa (GP) y su sustrato glucosa
1-fosfato (G-1-P) permite tener control sobre el tamaño molecular de la amilosa con altos
rendimientos (> 60%); sin embargo, es una metodología poco económica (Ohdan et al.,
2006; Yanase et al., 2005).
Existen diferentes métodos para el fraccionamiento de la amilosa a partir de los gránulos de
almidón, los que se pueden dividir en cuatro grupos según su principio de separación
(Hanashiro, 2015): (I) lixiviación y separación acuosa de amilosa después de someter los
gránulos de almidón a un proceso de gelatinización (Banks et al., 1959; Doblado-Maldonado
et al., 2017; Meyer et al., 1940; Greenwood y Thomson, 1962; Hizukuri, 1991; Schoch,
1945), (II) precipitación de un complejo insoluble de amilosa con agentes complejantes
(Banks y Greenwood, 1967; Bourne et al., 1948; Kuge y Takeo, 1968; Klucinec y
Thompson, 1998; Schoch, 1942, 1945), (III) cromatografía de permeación en gel (Karve et
8 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
al, 1981; Kobayashi et al., 1985; Kennedy et al., 1992; Klucinec y Thompson, 1998;
Yamada y Taki, 1976) y (IV) separación de la amilosa soluble después de la precipitación
de un complejo insoluble de la amilopectina con concanavalina A o lectina (Matheson y
Welsh, 1988; Matheson, 1996; Yun y Matheson, 1990). Cada método presenta sus ventajas
y desventajas en términos de rendimiento y pureza.
Tabla 1-1. Enzimas y sustratos empleados para la síntesis in vitro de la amilosa (Ohdan et al., 2006).
Enzima Sustrato
Almidón (glucógeno) sintasa ADP-glucosa (UDP-glucosa)
Isoamilasa Almidón
Ciclodextrina glicosil transferasa (CGTasa) Ciclodextrina
D-enzima Maltrodextrina
Amilosucrasa Sacarosa
Glucógeno fosforilasa (GP) Glucosa 1-fosfato (G-1-P)
Sacarosa fosforilasa + glucógeno fosforilasa Sacarosa
Celobiosa fosforilasa + glucógeno fosforilasa Celobiosa
1.2 Amilopectina
La amilopectina (Figura 1-2) comprende aproximadamente el 70% del peso del gránulo de
almidón; no obstante, a diferencia de la amilosa, es una molécula altamente ramificada con
enlaces glucosídicos α(1→4) presentando aproximadamente de 4% a 5% de puntos de
ramificación con enlaces α(1→6) (Preiss, 2018; Vamadevan y Bertoft, 2015). La
amilopectina tiene un rango de peso molecular entre 107 g mol-1 y 109 g mol-1 (Gidley et al.,
2010) y un grado de polimerización (DP) que oscila entre 5.6 x 105 y 5.6 x 107 con un
número promedio de cadenas por molécula entre 180 y 1800 (Tang et al., 2006). Al igual
que en el caso de la amilosa, estas características de la amilopectina difieren con la fuente
botánica.
La organización de la molécula de amilopectina se describe en términos de las cadenas A,
B y C, donde las cadenas A son cadenas externas que están unidas a cadenas internas (B) a
través de enlaces α(1→6). Por otra parte, las cadenas B llevan otras cadenas A y B como
Marco teórico 9
ramificación a través de enlaces α(1→6). Cada macromolécula posee una única cadena C
de la que se desprenden otras cadenas (A y B) como ramificación y que está caracterizada
por la presencia de un grupo terminal reductor (Figura 1-3). Hanashiro et al. (1996) indican
que las cadenas de amilopectina pueden ser agrupadas según sus unidades de glucosa en
cadenas A: cadenas cortas con un DP entre 6 - 12; cadenas B1: cadenas cortas con un DP
entre 13 - 24; cadenas B2: cadenas cortas con un DP entre 25 - 36; y cadenas B3: cadenas
largas con un DP > 37 (Bertoft, 2004). Aunque la relación de cadenas A y B, así como su
longitud, varían según el origen botánico, de forma general la amilopectina tiene un número
mayor de cadenas A que de cadenas B, con proporciones que varían de 1.0:0 a 1.5:1 (Buléon
et al., 1998; Bertoft, 2004; Vamadevan y Bertoft, 2015).
Figura 1-2. Representación estructural de la amilopectina.
A partir de los resultados de la determinación de las longitudes de las cadenas de
amilopectina se han propuesto varios modelos respecto a la organización de la amilopectina
dentro del gránulo de almidón, de los cuales, el modelo de grupo (clúster) y el modelo de
columna vertebral de bloques de construcción (building block backbone) (Bertoft, 2015) son
los más aceptados (Figura 1-4). El primero propone que las cadenas cortas de amilopectina
se organizan en grupos paralelos, interconectados por cadenas largas y caracterizados por
presentar segmentos internos con una longitud menor a 9 unidades de glucosa. Por su parte,
el modelo de columna vertebral de bloques de construcción sugiere que los grupos se forman
a
1
23
4
5
6
1
23
4
5
6
c
1
23
4
5
6
1
23
4
5
6
b
1
23
4
5
6
CH2OH
OH
O
H
H
OH
OH
H
H
H
CH2OH
O
O
H
H
OH
OH
H
H
H
CH2OH
O
O
H
H
OH
OH
H
H
H
CH2OH
O
H
H
OH
OHOH
H
H
H
CH2OH
O
O
H
H
OH
OH
H
H
H
CH2
O
O
H
H
OH
OH
H
H
H
CH2OH
O
O
H
H
OH
OH
H
H
H
CH2OH
O
H
H
OH
OHOH
H
H
H
O
O
H
H
OH
OH
H
H
H
CH2OH
OH
10 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
a partir de unidades estructurales más pequeñas llamadas “bloques de construcción”,
ubicadas perpendicularmente a un esqueleto formado por las cadenas largas de amilopectina
con un segmento interno de 1 a 3 unidades de glucosa (Vamadevan y Bertoft, 2015; Wang
y Copeland, 2013). Sin embargo, la determinación de las longitudes de las cadenas de
amilopectina no indican la organización estructural de dichas cadenas, por lo que hasta el
momento no existe evidencia científica que permita distinguir entre los dos modelos. Por
ello el modelo que se considera aplicable en un determinado momento depende de su
capacidad para explicar las diferentes propiedades funcionales del almidón (Vamadevan y
Bertoft, 2015).
Figura 1-3. Clasificación de las cadenas de amilopectina. Los círculos representan las unidades de glucosa,
las líneas horizontales representan los enlaces α(1→4) y las líneas curvas los enlaces α(1→6), el círculo con
una línea cruzada representa el grupo terminal reductor. Todas las cadenas A son cadenas externas, por otro
lado las cadenas B consisten de un segmento externo y un segmento interno, este último es definido como las
unidades entre los puntos de ramificación sin tener en cuenta toda la longitud de la cadena y que es representado
en la figura mediante los círculos con un punto en su interior (Adaptado de Pérez y Bertoft, 2010).
1.3 Estructura interna del gránulo de almidón
Los gránulos de almidón son resistentes a la degradación por parte de la mayoría de enzimas
amilolíticas, lo que limita su estudio empleando métodos por degradación enzimática. Por
tal motivo, la mayoría de información se ha obtenido mediante métodos de caracterización
física como XRD, microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía electrónica de
transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM) (Copeland et al., 2009) y
química como la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR) (Manners, 1989).
La arquitectura interna de los gránulos de almidón nativo es compleja y depende
principalmente del origen botánico.
Marco teórico 11
Figura 1-4. Modelos estructurales propuestos para representar la organización de la amilopectina dentro de
los gránulos de almidón. Los gránulos de almidón consisten en anillos de crecimiento con una alternancia entre
laminillas cristalinas (C) y amorfas (A) que son observadas en mayor detalle en la parte inferior de la imagen.
Los detalles de las dobles hélices (cilindros) y bloques de construcción (círculos grises) se representan en la
figura central, los círculos en blanco y negro representan las unidades de glucosa. Los segmentos interbloques
(S-IB) y los segmentos interclúster (S-IC) se encuentran en ambos modelos, la unidad principal en el modelo
de clúster es el clúster y en el modelo de columna vertebral de bloques de construcción es el bloque de
construcción, el cual es mucho más pequeño y estrechamente ramificado. Una diferencia importante entre los
modelos es que en el modelo de clúster las cadenas de amilopectina penetran las laminillas mientras que en el
modelo de columna vertebral de bloques de construcción no sucede (adaptado de Vamadevan y Bertoft, 2015).
En términos generales se considera que la amilopectina se caracteriza por formar anillos de
crecimiento (Baker et al., 2001; Ridout et al., 2003, 2006; Zhu, 2017a) con un núcleo amorfo
que corresponde a capas concéntricas semicristalinas de 120 nm a 400 nm de espesor,
separadas por regiones amorfas que involucran la presencia de amilosa (Figura 1-5A). Las
capas cristalinas consisten en una alternancia regular entre laminillas amorfas y cristalinas
(Figura 1-5B) con una distancia de repetición de 9 nm a 10 nm (Buléon et al., 2007; Wang
y Copeland, 2013), y debido a sus propiedades birrefringentes pueden ser observadas por
12 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
microscopía de luz polarizada mostrando una cruz de malta (Gallant et al., 1997). La
disposición de las cadenas externas ramificadas y no ramificadas de la amilopectina
contribuyen a la cristalinidad de los gránulos mediante la formación de dobles hélices
organizadas en grupos cristalinos (Wang y Copeland, 2013).
A) B) C) D)
Figura 1-5. Representación esquemática de la estructura interna de los gránulos de almidón desde los anillos
de crecimiento: (A) imagen TEM sección fina de un gránulo de almidón; (B) alternancia de los anillos de
crecimiento amorfos y semicristalinos; (C) modelado de la estructura de la amilopectina. Las líneas en puntos
describen las laminillas amorfas y cristalinas (repetición de 9-10 nm) que corresponden a los puntos de
ramificación; (D) detalle de un clúster que muestra la formación de doble hélices de las cadenas ramificadas
cortas de la amilopectina (adaptado de Buléon et al., 2007).
La estructura helicoidal de los componentes del almidón fue propuesta en 1937 y seis años
después (1943) surge la primera evidencia cristalográfica para dichas estructuras (Hancock
y Tarbet, 2000). Los modelos más recientes se basan en hélices bicatenarias paralelas,
diestras o zurdas, y empaques antiparalelos o paralelos en la celda unitaria. Energéticamente
es más favorable la hélice de mano izquierda en comparación con la de mano derecha
(Imberty et al., 1991). De otro lado, a partir de análisis por XRD se ha identificado que los
gránulos de almidón exhiben polimorfos que dependen de la disposición de las dobles
hélices dentro de los grupos cristalinos (clústers). El polimorfo A, el cual está más
densamente empaquetado, es característico de los cereales y el polimorfo B, menos denso o
con una estructura más abierta, predomina en los almidones de tubérculos, de raíces y de
almidones con alto contenido de amilosa (Wang y Copeland, 2013). Por otra parte, el
polimorfo C predomina en las leguminosas y algunas raíces y frutas. De igual manera se ha
identificado la estructura cristalina Vh - amilosa, característica de los complejos con ácidos
grasos y monoglicéridos formados tras el proceso de gelatinización del almidón. Si bien
estos complejos están presentes en los almidones nativos, rara vez son detectados. Solo se
Marco teórico 13
dispone de evidencia mediante NMR en estado sólido, de complejos amorfos de amilosa -
lípidos presentes en almidones nativos de maíz, arroz y avena (Morrison et al., 1993).
Las diferencias entre los polimorfos A y B surgen del contenido de agua y la manera en que
éstos se empaquetan en los respectivos cristales (Figura 1-6). De acuerdo con el modelo de
dobles hélices, en el polimorfo A, que se caracteriza por una altura de paso (distancia entre
dos giros sucesivos de la hélice) de 2.08 nm a 2.38 nm, las cadenas se empaquetan con el
grupo espacial B2 en una celda unitaria monoclínica (a = 2.124 nm, b = 1.172 nm, c = 1.069)
con ocho moléculas de agua por celda unitaria (Figura 1-6A) y en el polimorfo B, las hélices
dobles se empaquetan con el grupo espacial P61 en una celda unitaria hexagonal (a = b =
1.85 nm, c =1.04 nm) con treinta y seis moléculas de agua por celda unitaria (Figura 1-6B)
(Buléon et al., 1998; Pérez et al., 2009).
Figura 1-6. Modelos moleculares de hélices, proyecciones de las celdas unitarias y el patrón cristalográfico
correspondiente a: (A) polimorfo A; (B) polimorfo B y (C) polimorfo Vh - amilosa (adaptado de Buléon et al.,
1998 y Kong et al., 2014c).
14 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
1.4 Complejos de inclusión basados en almidón
Un complejo de inclusión se define como un arreglo molecular en el que un componente
hospedador o anfitrión forma una cavidad que contiene espacios en forma de túneles en los
que se ubican entidades moleculares de una especie química conocida como huésped. El
complejo se caracteriza porque no existe ningún enlace covalente entre el hospedador y el
huésped y la interacción se debe principalmente a fuerzas de van der Waals y puentes de
hidrógeno. Si los espacios en la estructura del hospedador están enrejados, la especie
huésped está atrapada como en una jaula; en estos casos el complejo resultante se denomina
clatrato o compuesto enjaulado (McNaught y Wilkinson, 2009).
Dentro de las ventajas que ofrece la tecnología de complejación molecular en el ámbito
farmacéutico se incluyen:
• Incremento de la solubilidad: La complejación produce un aumento de la solubilidad
acuosa de fármacos lipofílicos dado que el complejo resultante tiene una cavidad interior
donde se ubica la mayor parte de la funcionalidad hidrófoba de la molécula, mientras
que los grupos hidrófilos se orientan en la superficie externa permaneciendo expuestos
al entorno; como resultado se obtiene un complejo hospedador - fármaco soluble en agua
(Lee y Lee, 1995; Moriwaki et al., 2008; Hu et al., 2012; Auda, 2014; Sharma y Baldi,
2016; Loh et al., 2016; Pacheco et al., 2018).
• Mejora de la absorción: Cuando la baja biodisponibilidad de una molécula se debe a su
baja solubilidad, los complejos aumentan su velocidad de disolución y en consecuencia,
su absorción. Se ha reportado que el aumento de la solubilidad también mejora la
absorción percutánea o rectal de un fármaco (Choudhury y Nelson, 1992; Auda, 2014;
Nair et al., 2014; Sharma y Baldi, 2016; Jacob y Nair, 2018; Lima et al., 2019a, 2019b).
• Aumento de la estabilidad: La complejación permite la protección de un activo frente a
diferentes ambientes fisiológicos e impide su degradación al ser expuesto al oxígeno, el
agua, la radiación y el calor (Hu et al., 2012; Sharma y Baldi, 2016; Yildiz et al., 2018a,
2018b; Rajbanshi et al., 2020).
Marco teórico 15
• Reducción de la irritación: Algunas moléculas activas pueden generar irritación en el
estómago, la piel y los ojos; por lo tanto, su administración como complejos de inclusión
molecular permite disminuir estos efectos debido a que se reduce la concentración local
del fármaco libre por debajo del umbral de irritación (Sharma y Baldi, 2016; Zhao et al.,
2016; Muankaew y Loftsson, 2018).
• Prevención de incompatibilidades: Las moléculas activas a menudo son incompatibles
entre sí o con los excipientes en una formulación. Así, la complejación de moléculas
estabiliza las formulaciones separando físicamente los componentes para evitar posibles
incompatibilidades físicas o químicas (Sharma y Baldi, 2016).
• Enmascaramiento de olores y sabores: Los olores desagradables o sabores amargos de
las moléculas activas o excipientes dentro de una formulación se pueden enmascarar por
complejación debido a que se ocultan las moléculas o los grupos funcionales causantes
de dichos sabores u olores frente a los receptores sensoriales; el resultado es un complejo
con el activo que tiene poco o ningún sabor u olor siendo más aceptable para el usuario
(Marques, 2010; Sharma y Baldi, 2016).
• Favorece la manipulación de materiales: Sustancias como aceites, que se caracterizan
por ser líquidos a temperatura ambiente, pueden generar problemas cuando se pretende
su uso en formas de dosificación sólidas estables. En este sentido, a través de la
complejación, tales sustancias se convierten en polvos que pueden incorporarse en este
tipo de productos (Sharma y Baldi, 2016).
La amilosa tiende a formar complejos de inclusión helicoidales con una variedad de agentes
complejantes tales como lípidos y ligandos pequeños como alcoholes y compuestos de
sabor, que pueden inducir la formación de hélices simples (Tabla 1-2) caracterizadas por un
patrón de XRD tipo Vh (Putseys et al., 2010; Lourdin et al., 2015).
Dependiendo del tamaño de la molécula huésped, la amilosa puede adoptar una estructura
helicoidal con seis, siete u ocho unidades de glucosa por turno, donde la estructura con seis
unidades de glucosa ha sido ampliamente investigada empleando ácidos grasos y alcoholes
lineales. Un modelo ampliamente aceptado indica que la parte alifática de dichas moléculas
16 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
se ubican en el interior de la hélice mientras que el grupo polar se ubica fuera de ella (Pérez
y Bertoft, 2010; Obiro et al., 2012; Cheng et al., 2018).
Tabla 1-2. Moléculas huésped y sus diferentes hospedadores empleados en el estudio de los complejos de
inclusión molecular.
Molécula huésped Hospedador Referencia Hexanal Amilosa de maíz, amilosa de arroz,
amilosa de papa, almidón de papa, almidón de maíz
Jouquand et al. (2006), Ma et al. (2019), Wulff et
al. (2005)
(E)-2-Decenal, (E)-2-nonenal, octenol Amilosa de maíz Wulff et al. (2005)
Decanal Amilosa de maíz, almidón de papa, amilosa de papa
Le Bail et al. (2005), Nuessli et al. (1995), (1997), Wulff et al. (2005)
Guaiacol, fentona Amilomaiz Wulff et al. (2005)
(E)-2-Octenal, (E,E)-2,4-decadienal, (Z)-
4-decenal, (E)-4-decenal
Amilosa de papa Wulff et al. (2005)
Mentona Amilosa de papa, amilosa sin
especificación
Conde-Petit et al. (2006), Le Bail et al. (2005)
Timol, mentol, alcanfor, geraniol,
carvona, δ-heptalactona, δ-nonalactona, δ-
decalactona, δ-dodecalactona, γ-
decalactona, γ-dodecalactona
Amilosa sin especificación Conde-Petit et al. (2006)
α-Naftol Amilosa de papa, amilosa sin
especificación
Conde-Petit et al. (2006), Le Bail et al. (2005)
Linalol, 2-hexanona Amilomaiz Wulff et al. (2005)
Butanol Amilosa de papa Helbert y Chanzy (1994), Le Bail et al. (2005)
Ácido caprílico Amilosa de papa Godet et al. (1995)
Ácido láurico Amilosa de papa, almidón de maíz, amilomaiz
Fanta et al. (1999), Godet et al. (1995), Meng et al. (2014)
Ácido palmítico Amilosa de papa, almidón de maíz,
amilomaiz, amilosa de guisante, Hylon® VII
Bhosale y Ziegler (2010), Fanta et al. (1999), Godet
et al. (1995), Kong y Ziegler (2014a), Marinopoulou et al. (2016a), (2016b), (2016c), Meng et al. (2014a),
(2014b), Raphaelides et al. (2015)
Pentanol Amilosa de papa Helbert y Chanzy (1994)
Ácido decanoico Amilosa de papa, amilosa de guisante, Hylon® VII
Biais et al. (2006), Marinopoulou et al. (2016a), (2016b), (2016c)
Ácido hexanoico Amilosa de papa Biais et al. (2006)
Ibuprofeno Amilosa de papa, amilosa sintética Yang et al. (2013), Zhang et al. (2016)
Praziquantel, nimesulida Hylon® VII Carbinatto et al. (2016)
Ácido mirístico Almidon de maíz, amilomaiz, amilosa de guisante, Hylon® VII
Fanta et al. (1999), Marinopoulou et al. (2016a),
(2016b), (2016c), Meng et al. (2014b), Raphaelides
et al. (2015) Acido esteárico
Almidón de maíz, amilomaiz, amilosa de guisante, Hylon® VII
Fanta et al. (1999), Marinopoulou et al. (2016a), (2016b), (2016c), Meng et al. (2014b)
Ácido oleico Almidón de maíz, amilosa de
guisante, Hylon® VII
Marinopoulou et al. (2016a), (2016b), (2016c),
Meng et al. (2014)
Ácido linoleico Almidón de maíz, amilosa de
guisante, Hylon® VII
Marinopoulou et al. (2016a), (2016b), Meng et al.
(2014b), Seo et al. (2016)
Monoestearato de glicerina Almidón de semillas de loto Chen et al. (2017)
Palmitato de ascorbilo Amilosa de papa, Hylon® VII Ma et al. (2011), Kong y Ziegler (2014a), (2014b)
Palmitato de retinilo, ésteres de fitosterol Hylon® VII Ma et al. (2011)
Ácido salicílico Amilomaiz, amilosa sintética Oguchi et al. (1998), Wang et al. (2017)
Quercetina Almidón de maíz Zhang et al. (2011)
Ácido ferúlico Almidón de yuca Hung et al. (2013)
Genisteína Amilosa de papa, Hylon® VII Cohen et al. (2008), (2011)
2-Naftol Amilosa sintética Uchino et al. (2001)
Indometacina Amilosa de guisante, almidón de guisante
Marinopoulou et al. (2019)
Marco teórico 17
La cavidad interna de la hélice está revestida con grupos metileno y enlaces glucosídicos
dando como resultado una cavidad hidrófoba, mientras que los grupos hidroxilo se ubican
en el exterior de la hélice generando una superficie externa hidrofílica (Immel y
Lichtenthaler, 2000; Obiro et al., 2012). Debido a las fuerzas de van der Waals y a los
puentes de hidrógeno, se generan enlaces intramoleculares e intermoleculares entre los
residuos de glucosa a lo largo de las hélices, el agua y el ligando, permitiendo cierta
estabilidad a la hélice simple (Putseys et al., 2010; Obiro et al., 2012). Por lo tanto, la
cavidad interna puede contener moléculas de agua que están unidas entre sí, pero no a la
amilosa, y se localizan principalmente en los espacios interhelicoidales donde forman una
red mediante puentes de hidrógeno en un modo bidentado glucosil-O···H-O-H···O-glucosil,
generando cierto grado de estabilidad a la estructura helicoidal (Obiro et al., 2012). Los
complejos entre la amilosa y lípidos tales como ácidos grasos, lisofosfolípidos y
monoacilglicéridos, pueden modificar significativamente las propiedades y funcionalidades
de los almidones. Por ejemplo, se logra reducir la solubilidad del almidón en agua, alterar
sus propiedades reológicas, disminuir su capacidad de hinchamiento, incrementar su
temperatura de gelatinización, debilitar la estructura del gel, retardar la retrogradación y
aumentar su resistencia a la degradación enzimática (Copeland et al., 2009).
Los complejos V-amilosa se pueden clasificar en dos grupos dependiendo de sus
propiedades térmicas y cristalinas. Los complejos tipo I, que se generan debido a una rápida
nucleación en el proceso de cristalización, se caracterizan por presentar una transición
endotérmica cercana a 100 °C y un patrón de XRD amorfo (Tufvesson et al., 2003). Por otra
parte, los complejos tipo II, que pueden ser divididos en IIa y IIb, requieren el empleo de
una mayor temperatura en su formación y se caracterizan por presentar transiciones
endotérmicas alrededor de 115 °C y 125 °C y un patrón de XRD de tres picos característicos
de una estructura más ordenada en comparación con la del tipo I (Obiro et al., 2012; Wang
y Copeland, 2013; Doblado-Maldonado et al., 2017).
De otro lado, cuando los complejos de amilosa se analizan mediante difracción de rayos X
de ángulo amplio (WAXS) es posible lograr diferencias en su estructura cristalina que han
servido de base para proponer una clasificación según el tamaño de la hélice y la ubicación
más probable de la molécula huésped (Tabla 1-3). Es importante tener en cuenta que, aunque
18 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
algunas de estas propuestas están sustentadas en aproximaciones cristalográficas obtenidas
mediante estudios computacionales, otras solo corresponden a hipótesis (Lourdin et al.,
2015).
Tabla 1-3. Clasificación de las estructuras cristalinas de los complejos de inclusión molecular con sus
respectivas dimensiones de las celdas unitarias y la localización de la molécula huésped (adaptado de Putseys
et al., 2010).
Estructura Localización del
ligando
Dimensiones de la celda unitaria
a (nm) b (nm) c (nm)
Vh V6I Cavidad helicoidal 1.36 - 1.37 2.37 - 2.58 0.78 - 0.81
Va Cavidad helicoidal 1.30 - 1.32 2.25 - 2.70 0.79
Vbutanol V6II Cavidad helicoidal y
espacio intersticial 2.74 2.65 0.80
Visopropanol V6III Cavidad helicoidal y
espacio intersticial 2.82 2.93 0.80
V7 Cavidad helicoidal y
espacio intersticial 3a 2.83a 0.78a
a(Yamashita et al., 1973). Debido a que no existe un consenso respecto a la nomenclatura
empleada para hacer referencia a las diferentes estructuras cristalinas se presentan los dos
tipos usados comúnmente en la literatura.
Cuando el tamaño de la hélice corresponde al de seis unidades de glucosa por turno se tienen
las estructuras tipo V61 o Vh, donde el ligando está incluido dentro de la cavidad helicoidal
que presenta un diámetro de aproximadamente entre 13.0 Å y 13.7 Å y una cavidad interna
entre 5.0 Å y 5.4 Å. Bajo condiciones de secado de la estructura Vh se genera una estructura
anhidra denominada Va, la que presenta unas dimensiones de celda más pequeñas con un
diámetro externo entre 13.0 Å y 13.3 Å, las moléculas que inducen este tipo de estructuras
son los ácidos grasos y los alcoholes lineales. La estructura V6II también denominada como
Vbutanol, hospeda el ligando no solo dentro de las hélices sino también en los espacios
intersticiales generando un aumento en las dimensiones de las celdas unitarias. Por otra
parte, en la estructura V6III o Visopropanol el ligando también está ubicado dentro de las hélices
y en los espacios intersticiales; sin embargo, se diferencia de la estructura V6II en que el
espacio intersticial es mayor y por ende, las dimensiones de su celda unitaria. No obstante,
Marco teórico 19
en presencia de ligandos voluminosos las cadenas poliméricas adoptan una conformación
helicoidal con siete u ocho unidades de glucosa por turno. En efecto, moléculas como
mentona y fentona inducen la formación de estructuras V7 y el naftol estructuras V8 (Conde-
Petit et al., 2006; Putseys et al., 2010; Obiro et al., 2012).
La formación de los complejos V-amilosa se ve afectada por el tipo de almidón, el DP de
sus componentes estructurales (amilosa y amilopectina), el tipo de ligando, la relación
almidón o amilosa - ligando, la temperatura de complejación, el tiempo de complejación y
el pH del medio, entre otras (Putseys et al., 2010; Obiro et al., 2012; Seo et al., 2016).
Recientemente, se ha demostrado que la cooperatividad positiva es una característica
importante de los complejos de inclusión donde un primer ligando influencia el aumento de
la afinidad de unión de un segundo ligando. Al respecto, Carbinatto et al. (2016)
evidenciaron la cooperatividad positiva de un ácido graso (ácido palmítico) en la formación
de complejos de inclusión molecular con dos moléculas farmacológicamente activas
(praziquantel y nimesulida) y almidón de maíz con alto contenido de amilosa (Hylon® VII).
Asimismo, el empleo de modificaciones químicas tales como la degradación enzimática del
almidón de partida puede ser una alternativa importante para lograr mayor afinidad entre el
huésped y el hospedador. En este sentido Arijaje y Wang (2016) demostraron que después
de someter los almidones de maíz y de papa a una degradación enzimática empleando
isoamilasa y un tratamiento adicional con β-amilasa para disminuir el peso molecular de las
cadenas de amilosa y amilopectina, se incrementa la capacidad de complejación de los
almidones debido a que se generan cadenas de amilosa y amilopectina con longitudes más
favorables para la formación de complejos de inclusión molecular. Igualmente, Reddy et al.
(2018) reportan resultados similares empleando pululanasa como enzima desramificadora.
Teniendo en cuenta que los complejos a base de almidón son insolubles en agua, Conde-
Petit et al. (2006) reportaron que la hidroxipropilación de la amilosa y la amilopectina en un
bajo grado favorece su incorporación en sistemas acuosos, lo que puede resultar de interés
en su aplicación como portadores de moléculas activas.
Para la preparación de los complejos de inclusión molecular basados en almidón han sido
reportados diferentes métodos, que de acuerdo con Putseys et al. (2010) pueden clasificarse
20 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
en tres grupos: (I) formación a partir de almidón y un ligando, (II) a partir de amilosa y un
ligando y (III) síntesis de la amilosa en presencia de un ligando. La formación de los
complejos con los métodos II y III genera estructuras más puras y monodispersas.
Desde otro punto de vista, Obiro et al. (2012) proponen una clasificación considerando el
procedimiento empleado en la obtención de los complejos. Así, también se reconocen tres
categorías: (I) métodos clásicos, (II) métodos enzimáticos y (III) métodos termomecánicos.
Los métodos clásicos se basan en la mezcla de una dispersión de almidón y el ligando en
condiciones de calentamiento. Para tal fin, el almidón es previamente disuelto a una
temperatura entre 40 °C y 130 °C garantizando su completa disolución en solventes tales
como el agua, también denominado método de calentamiento - sellado (Oguchi et al., 1998;
Heinemann et al., 2001; Uchino et al., 2001; Wulff et al., 2005; Biais et al., 2006; Bhosale
y Ziegler, 2010; Hung et al., 2013; Kong y Ziegler, 2014b; Carbinatto et al., 2016; Seo et
al., 2016; Wang et al., 2017; Feng et al., 2018; Kumar y Loos, 2019), en una solución de
hidróxido de potasio (KOH), denominado método de acidificación de una solución alcalina
(Lalush et al., 2005; Cohen et al., 2008, 2011; Yang et al., 2013; Marinopoulou et al., 2016a,
2016b, 2017c, 2019; Zhang et al., 2016) o en dimetilsulfóxido (DMSO) (Godet et al., 1995;
Lalush et al., 2005; Lay Ma et al., 2011b; Kong y Ziegler, 2014b). Luego, el ligando es
adicionado y la dispersión es sometida a calentamiento empleando temperaturas elevadas
(entre 70 °C y 170 °C) para facilitar la formación del complejo. Dependiendo del medio
empleado se realiza un ajuste de pH hasta aproximadamente 4.5 y en todos los casos se lleva
a cabo un proceso de enfriamiento para permitir la cristalización (Panyoo y Emmambux,
2017).
Respecto a los métodos enzimáticos, éstos se pueden clasificar en dos grupos: métodos
completamente enzimáticos que involucran la síntesis de las cadenas poliméricas de amilosa
a partir de unidades de glucosa (Kaneko y Kadokawa, 2005; Yang et al., 2013) y métodos
parcialmente enzimáticos en los que se emplean las cadenas poliméricas como punto de
partida para, mediante un proceso de degradación enzimática, generar cadenas poliméricas
con el DP de interés (Wongprayoon et al., 2018).
Marco teórico 21
Finalmente, los métodos termomecánicos requieren el empleo simultáneo de procesos de
calentamiento y fuerzas de cizallamiento para la formación de complejos V-amilosa, dentro
de los que se incluyen la cocción a chorro de vapor (Fanta et al., 1999; Kenar et al., 2016),
la homogeneización (Meng et al., 2014a, 2014b; Chen et al., 2017), la extrusión
(Raphaelides et al., 2015) y recientemente, la formación de complejos de inclusión
molecular mediante electrohilado (Kong y Ziegler, 2014b).
2 Objetivos
2.1 Objetivo general
Contribuir al diseño de un nuevo sistema de administración de fármacos mediante el
desarrollo de un complejo de inclusión helicoidal con al menos una molécula
farmacológicamente activa y utilizando almidón nativo como material de partida.
2.2 Objetivos específicos
• Obtener almidón a partir de bambú (Rhipidociadum Harmonicum (Parodi) McClure)
como fuente alternativa disponible en Colombia y caracterizar algunas propiedades
fisicoquímicas de interés para el desarrollo de un complejo de inclusión molecular.
• Formar y caracterizar fisicoquímicamente un complejo de inclusión helicoidal a partir
del almidón obtenido en cumplimiento del objetivo anterior y al menos una molécula
farmacológicamente activa.
3 Extracción y caracterización del almidón de
bambú
De acuerdo con Future Market Insights (FMI), el mercado global para el bambú estaba
valorado en 3.600 millones de dólares a finales del 2017 (Chen et al., 2020). Esto se debe a
que el bambú se ha utilizado principalmente como material de construcción desde la
antigüedad (Hong et al., 2020) y como sustituto de la madera debido a que es un material
económico, ecológico y sostenible. Por otro lado, los culmos de bambú se comercializan
como productos alimenticios en forma de brotes de bambú enlatados o envasados al vacío
para ser utilizados en diferentes preparaciones alimenticias, dado su carácter dulce y su
contenido de vitaminas A, B6, C y E, de fitoesteroles y de 17 aminoácidos de los cuales
ocho son esenciales para el cuerpo humano (Felisberto et al., 2017). Asimismo, el elevado
contenido de fibra del bambú lo convierte en una fuente para la extracción de fibra dietética
que es comercializada en productos como Jelucel®BF, Nutriloid®, Bamboo Fiber® y
CreaFibe® (Felisberto et al., 2018).
Desde el punto de vista agrícola, el bambú es un cultivo que no requiere pesticidas y no tiene
antecedentes de propagación de plagas como los cultivos de soja, maíz, trigo o caña de
azúcar. Adicionalmente, es un cultivo económicamente viable debido a que sus culmos son
perennes y asexuales, por lo que no requiere un proceso de recultivo (Felisberto et al.,
2017b), con un crecimiento de aproximadamente 36 m en 6 meses (Luo et al., 2019).
Como se ha mencionado, el presente proyecto busca generar valor agregado al bambú a
través de la investigación de su posible aplicación como excipiente farmacéutico para el
diseño de sistemas de liberación de activos. En este orden de ideas, inicialmente se realizó
su extracción y posteriormente se avanzó en su caracterización, considerando
principalmente la aplicación prevista.
26 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
3.1 Métodos y materiales
Como material de partida para el desarrollo de la presente investigación se utilizaron
almidón nativo obtenido de una fuente poco convencional como el bambú y almidón nativo
de maíz gentilmente donado por Ingredion Colombia S.A. Para el caso del almidón de
bambú, el material vegetal de partida fue colectado en el Departamento de Boyacá
(Municipio de Garagoa, Vereda Caldera Abajo, Finca La Casita. Alt. 1685 m.s.n.m.) para
su posterior identificación taxonómica en el Herbario Nacional de Colombia ubicado en la
Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, con número de colecta 610329. Con el
propósito de identificar los gránulos de almidón dentro de la estructura del bambú, algunas
muestras del material fueron observadas por microscopía electrónica de barrido (FEI Quanta
200, operado al vacío a una presión de 5.3 x 10-5
Pa y una energía de aceleración del haz de
electrones de 30 kV).
3.1.1 Extracción del almidón
Inicialmente, se realizó un pretratamiento al material vegetal (Figura 3-1) que consistió en
la eliminación manual de las hojas y la corteza de los tallos. Posteriormente, los tallos fueron
cortados con una sierra industrial hasta obtener ortoedros con un tamaño aproximado de
3*1*1 cm y se procedió a la disminución del tamaño de partícula utilizando un molino
(Erweka KU1).
Para la extracción del almidón (Figura 3-2), 200 mL de una solución de cloruro de sodio al
1%, a una temperatura de 4 °C, y 100 g del material vegetal se licuaron durante 60 s
(licuadora industrial Vitamix 62825) para favorecer la desintegración del parénquima
cortical de los tallos y permitir la liberación de los gránulos (Cailliau et al., 2007). La
suspensión obtenida fue filtrada utilizando tela garza y el material retenido se sometió al
mismo procedimiento de licuado las veces necesarias hasta no detectar almidón en el
filtrado, lo que se verificó mediante una prueba cualitativa utilizando una solución de yodo
- yoduro de potasio (2.5 x 10-3 M I2 / 6.5 x 10-3 M KI).
Métodos y materiales 27
Figura 3-1. Pasos para el pretratamiento del material vegetal de bambú previo a la extracción del almidón.
Los filtrados obtenidos fueron colectados en botellas de vidrio a una temperatura de 4 °C y
se permitió la sedimentación del almidón por gravedad durante 18 h. Con el objetivo de
evitar algún proceso biológico de fermentación originado por la actividad microbiana, se
utilizó como preservante azida de sodio (NaN3, Sigma-Aldrich) a una concentración de 20
ppm. Pasadas las 18 h se realizaron tres lavados del material sedimentado descartando el
sobrenadante y resuspendiendo dicho sedimento en agua destilada. Finalmente, el almidón
obtenido se filtró al vacío (Bomba de vacío R-400), se lavó tres veces con etanol al 96%
(Merck Millipore) y por último con acetona (Merck Millipore), se secó a una temperatura
de 45 °C (Jouan IG 150) durante 12 h hasta peso constante (Ohaus® PA214). La torta de
material sólido se trituró con la ayuda de un mortero y se almacenó en recipientes de vidrio
sellados herméticamente para su posterior caracterización y utilización.
3.1.2 Caracterización del almidón de bambú
Una vez obtenido el almidón de bambú, se evaluó su morfología e integridad física mediante
microscopías óptica, de luz polarizada y electrónica de barrido, con el fin de determinar que
28 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
el proceso de extracción no había afectado la estructura macro de los gránulos de almidón
debido a los diferentes esfuerzos cortantes a los cuales fue sometido.
Figura 3-2. Pasos para la extracción de almidón a partir de tallos de bambú.
El contenido de humedad, cenizas, fibra cruda y lípidos de las muestras de almidón se
determinaron usando los métodos AOAC (2003) 925.10, 923.03, 962.09, 945.16,
respectivamente, con algunas modificaciones. Todos los análisis se realizaron por triplicado.
Igualmente, se determinó el contenido de amilosa por espectrofotometría UV, se caracterizó
el almidón por DSC, FTIR, XRD y se investigó su comportamiento de hinchamiento.
• Contenido de humedad
El porcentaje de humedad se determinó mediante un método termogravimétrico utilizando
un analizador de humedad halógeno (Radwag® PMX 50). El contenido de humedad se
calculó comparando el peso inicial de la muestra respecto al peso final (Ecuación 3-1).
% Humedad = Peso inicial (g) - Peso final (g)
Peso inicial (g) * 100 (3-1)
Métodos y materiales 29
• Cenizas
Las cenizas hacen referencia al remanente inorgánico como resultado de una ignición u
oxidación completa de la materia orgánica. La determinación se realizó teniendo en cuenta
la pérdida de masa (Ohaus® PA214) después de la incineración de las muestras (2 g)
depositadas en crisoles de porcelana y posteriormente introducidas en una mufla a una
temperatura de 600 °C durante 3 h. El porcentaje de cenizas se calculó usando la Ecuación
3-2.
% Cenizas = Peso residuo (g)
Peso inicial muestra (g) * 100 (3-2)
• Contenido de lípidos
Se determinó el porcentaje de lípidos en las muestras de almidón mediante una extracción
con solventes orgánicos utilizando un equipo Soxhlet. Para tal fin, se depositaron 30 g de
muestra en un dedal de extracción y se sometieron a reflujo durante 8 h utilizando 200 ml
de una mezcla de acetato de etilo (Merck Millipore) - metanol (Merck Millipore) (1:1).
Posteriormente se evaporaron los solventes con la ayuda de un rotaevaporador (Heidolph
Hei-VAP, temperatura de 60 °C, presión de 200 mbar, velocidad de rotación de 80 rpm). El
material remanente en el balón se extrajo con acetona (Merck Millipore) para ser sometido
a un secado en una estufa (Jouan IG 150) durante 12 h a 45 °C hasta peso constante (Ohaus®
PA214). La proporción de lípidos se calculó a partir de la Ecuación 3-3.
% Lípidos = Peso residuo (g)
Peso inicial muestra (g) * 100 (3-3)
• Contenido de fibra cruda
Para la determinación de la fibra cruda, 3 g de almidón se sometieron a digestión con una
solución de KOH 0.1 N (300 mL) a una temperatura de 90 °C (IKA® C-Mag HS 7) durante
30 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
4 h con agitación continua (250 rpm). Posteriormente, la solución se filtró al vacío (bomba
de vacío R-400) en caliente, el residuo se lavó dos veces con agua destilada y se secó en una
estufa (Jouan IG 150) durante 24 h a una temperatura de 45 °C hasta peso constante (Ohaus®
PA214). El porcentaje de fibra o sólidos insolubles se calculó mediante la Ecuación 3-4.
% Fibra cruda = Peso residuo seco (g)
Peso inicial muestra (g) * 100 (3-4)
• Contenido de amilosa
El contenido de amilosa se determinó espectrofotométricamente siguiendo el procedimiento
descrito por McGrance et al. (1998), con ligeras modificaciones. Inicialmente, se preparó
una curva de calibración con seis niveles de relación amilosa - amilopectina en diferentes
proporciones (Tabla 3-1) utilizando estándares de amilosa de papa (A0512 Sigma-Aldrich)
y amilopectina de papa (10118 Fluka Biochemika) previamente secados en una estufa
(Jouan IG 150) durante 12 h a 45 °C, hasta peso constante (Ohaus® PA214).
Tabla 3-1. Proporciones de amilosa - amilopectina empleadas en la curva de calibración requerida para la
determinación del contenido de amilosa en almidón.
Nivel 1 2 3 4 5 6
% Amilosa 0 10 25 50 75 100
% Amilopectina 100 90 75 50 25 0
Así, 20 mg de muestra de la mezcla amilosa - amilopectina correspondiente se dispersaron
en 6 mL de DMSO (Merck Millipore) usando viales de vidrio sellados herméticamente.
Dicha mezcla fue sometida a calentamiento durante 1 h a una temperatura de 90 °C (IKA®
C-Mag HS 7) en un baño de agua con agitación continua (250 rpm). Posteriormente, las
muestras se enfriaron a temperatura ambiente y la solución obtenida se llevó a un volumen
total de 10 mL en un balón aforado utilizando agua destilada. Se tomaron 500 µL de dicha
dilución y se llevaron a un volumen total de 25 mL en un balón aforado utilizando agua
destilada. Para determinar la cantidad de solución de yodo - yoduro de potasio (2.5 x 10-3 M
I2 / 6.5 x 10-3 M KI) necesaria para el análisis, es decir aquella cantidad en la que la
Métodos y materiales 31
absorbancia de la muestra no se ve afectada dado que se garantiza la complejación completa
del yodo con la amilosa, se eligió el nivel 6 de la curva de calibración donde se tiene el 100%
de amilosa. Así, 1.4 mL de la solución de amilosa se depositaron en tubos Eppendorf con
capacidad de 1.5 mL. A cada uno de ellos se les adicionó un volumen específico de la
solución de yodo - yoduro de potasio (40, 60, 80 y 100 µL), se agitó en vortex (LB PRO
MX-S) durante 1 min y se dejaron en reposo durante 15 min para su posterior análisis. Los
espectros de absorbancia se tomaron en un rango de 250 nm a 950 nm en un
espectrofotómetro UV-Vis (Shimadzu UV-1800) utilizando celdas de cuarzo con una
longitud de 1 cm, una velocidad de escaneo media y un intervalo de muestreo de 0.5 nm.
Como blanco se empleó agua destilada.
De acuerdo con los espectros obtenidos (Anexo A) se concluyó que la cantidad necesaria de
yodo para la determinación de amilosa en el almidón era de 100 µL y que la longitud de
onda más adecuada correspondía a 620 nm.
Para la determinación del contenido de amilosa de las muestras de almidón se siguió
exactamente el mismo procedimiento descrito previamente en la elaboración de la curva de
calibración y resumido gráficamente en la Figura 3-3. Se realizaron tres réplicas para cada
medición
• Morfología del almidón
Microscopía óptica: Se utilizó un microscopio óptico (Olympus® BX51-P) en modo normal
y de luz polarizada. Las muestras se dispersaron en agua destilada y se sometieron a
ultrasonido (baño Elma S15H) durante 1 min a una frecuencia de 37 kHz para favorecer su
dispersión. Posteriormente se tomó una gota de dicha dispersión con ayuda de una pipeta
Pasteur, se depositó en un portaobjetos y se cubrió con una laminilla cubreobjetos para
realizar la observación al microscopio.
Microscopía electrónica de barrido: Las micrografías electrónicas de barrido de los
almidones fueron tomadas con un microscopio electrónico de barrido (FEI Quanta 200),
equipado con un filamento de tungsteno convencional como fuente de electrones, detectores
de electrones secundarios (SE), electrones retrodispersados (BSE) y de rayos X de
32 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
dispersión de energía, además de una cámara interna. Las muestras de almidón fueron
recubiertas con oro al 99.9% de pureza, utilizando un revestidor de pulverización catódica
con bomba rotativa (Q150R ES), durante 30 s a una corriente de pulverización de 60 mA.
El microscopio se operó utilizando vacío a una presión de 5.3 x 10-5
Pa y una energía de
aceleración del haz de electrones de 30 kV.
Figura 3-3. Procedimiento para la preparación de las muestras para la curva de calibración y posterior
determinación del contenido de amilosa.
• Tamaño y distribución de partícula
Se determinó la distribución del tamaño de partícula del almidón de bambú utilizando la
técnica de difracción láser (Mastersizer 3000, Malvern). Debido a la dificultad del almidón
de bambú para ser dispersado, presentando una fuerte tendencia a formar agregados, se
utilizó ultrasonido durante la medición después de verificar la integridad de los gránulos
mediante microscopía óptica. Para todas las mediciones se utilizaron 20 mg de almidón
generando una obscuración entre 5% y 6%. En la Tabla 3-2 se especifican las condiciones
de medida empleadas.
• Calorimetría diferencial de barrido de alta presión (HP-DSC)
Métodos y materiales 33
La temperatura de transición vítrea y la entalpía de dicha transición en los almidones se
determinó en un calorímetro de alta presión (HP DSC 1 Mettler Toledo®), previamente
calibrado con estándares de indio y paladio. Se utilizaron crisoles estándar de aluminio con
capacidad de 40 µL, se pesó 1 mg de muestra en los crisoles y se adicionaron 5 µL de agua
destilada, posteriormente los crisoles fueron sellados herméticamente y se les realizó una
pequeña perforación en la tapa. El equipo se operó bajo una atmósfera de nitrógeno a una
presión de 1 MPa, con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min en un rango de
temperatura de 25 °C a 130 °C, como referencia se utilizó un crisol vacío. El tratamiento de
los datos se realizó utilizando el software STARe, las gráficas y el tratamiento para la línea
base se realizaron con el software OriginPro® 9.
Tabla 3-2. Condiciones de medida utilizadas para la determinación de la distribución del tamaño de partícula
del almidón de bambú mediante difracción láser.
Material Almidón bambú (20 mg)
Índice de refracción 1.52
Índice de absorción 0.18
Densidad 1 (g/cm3)
Tipo de partículas No esférico
Dispersante Agua (500 mL) Índice de refracción 1.33
Medida
Duración de la medida del fondo 60 s
Duración de la medida de la muestra 60 s
Evaluación de la estabilidad del fondo 180 s
Velocidad de agitación 2100 rpm
Ultrasonido Pre medida 1200 s al 100%
Desgasificación después de ultrasonido Si
Alineación después de ultrasonido Si
Número de medidas 5
Modelo de análisis Uso general
Modelo de dispersión Mie
• Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)
Los espectros vibracionales de las muestras se tomaron en un espectrofotómetro (IR-
Affinity-1S SHIMADZU) equipado con accesorio ATR. Las medidas se llevaron a cabo en
34 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
un rango de 3500 cm-1 a 400 cm-1 con una resolución de 4 cm-1, las gráficas y el tratamiento
para la línea base se realizaron con el software OriginPro® 9.
• Difracción de rayos X (XRD)
Los patrones cristalográficos de los almidones se determinaron en un difractómetro de rayos
X PANalytical modelo X´PERT PRO MPD, configuración óptica de Bragg – Brentano,
equipado con un detector de estado sólido de alta velocidad (PIXcel) y un tubo generador
de rayos X con ánodo de cobre. Las condiciones de medida fueron: longitud de onda: 1.54
Å, filtro de níquel, voltaje: 45 kV y corriente: 40 mA, región de escaneo con ángulo dos
theta (2θ) de 7° a 100°, tamaño de paso: 0.0263°, tiempo de paso: 100 s. El porcentaje de
cristalinidad relativa se determinó mediante la relación de la proporción de las áreas
cristalinas y el área total correspondiente a las áreas cristalinas más la contribución de las
áreas amorfas, siguiendo el procedimiento descrito por Lopez-Rubio et al. (2008). El
tratamiento de los datos y el ajuste de la curva se realizó utilizando el software HighScore
plus (versión 3.0c) con una función gaussiana.
• Poder de hinchamiento y solubilidad
Para evaluar el poder de hinchamiento del almidón de bambú se siguió la metodología
propuesta por Li and Yeh (2001), con ligeras modificaciones. Así, 100 mg de muestra (W1)
se depositaron en tubos falcon con capacidad de 50 mL previamente pesados, se adicionaron
10 mL de agua destilada y se sellaron herméticamente. La dispersión de cada tubo se sometió
a calentamiento en un baño de agua durante 1 h con agitación continua (250 rpm) a diferentes
temperaturas: 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C y 90 °C (IKA® C-Mag HS 7). Finalizado el tiempo,
la solución se dejó enfriar a temperatura ambiente y se centrifugó a 8000 rcf durante 20 min
(Thermo Scientific™ Heraeus™ Megafuge™ 16), el sobrenadante fue separado
cuidadosamente del sedimento por vertido y transferido a cajas de Petri previamente
pesadas, las que fueron ubicadas en un horno (IKA® Oven 125), a 100 °C, para evaporar el
agua hasta peso constante (Ohaus® PA214). El material residual obtenido luego del secado
Métodos y materiales 35
corresponde al almidón soluble (Ws). De igual forma, se determinó el peso del sedimento
húmedo (Wa) y después de ser sometido a secado bajo las mismas condiciones previamente
mencionadas (Wo). El poder de hinchamiento expresado en porcentaje (% PH), el porcentaje
de sólidos solubles (% SS) y el porcentaje de sólidos insolubles (% SI) se estimaron mediante
las Ecuaciones 3-5, 3-6 y 3-7. Se realizaron tres réplicas para cada medición.
% SS = Ws
W1
* 100 (3-5)
% SI = W0
W1
* 100 (3-6)
% PH = Wa
W1(100 - % SS) * 100 (3-7)
3.2 Resultados y discusión
De acuerdo con la información suministrada por el Herbario Nacional de Colombia, la
especie de bambú empleada en este estudio como fuente de partida de almidón, se identificó
como perteneciente a la familia Poaceae, con nombre científico Rhipidocladum cf.
Harmonicum (Parodi) Mcclure. Esta especie se distribuye principalmente en Colombia,
Ecuador, Perú, Bolivia y Costa Rica (Figura 3-4). En Colombia, los cultivos se ubican en
los departamentos de Boyacá, Putumayo, Santander y Cundinamarca (GBIF Backbone
Taxonomy, 2019).
36 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Figura 3-4. Registro de presencia de Rhipidocladum cf. Harmonicum (Parodi) Mcclure en América (adaptado
de GBIF Backbone Taxonomy, 2019).
Dentro de la descripción botánica del bambú empleado se destaca que, a diferencia de
parénquimas celulares caracterizados por sus células de tamaño casi uniforme como aquellos
presentes en el arroz, maíz y otras plantas, el bambú presenta células de parénquima cortas
y largas que están posicionadas verticalmente. Las células largas del parénquima se
caracterizan por sus paredes gruesas, polilameladas y lignificadas, y es allí donde se
almacena la energía en forma de gránulos de almidón. Por otro lado, las células del
parénquima cortas se encuentran dispersas entre las células largas y se caracterizan por sus
paredes delgadas, su citoplasma denso y la evidencia de la actividad enzimática de la
peroxidasa en sus paredes (He et al., 2002).
La Figura 3-5 muestra la ubicación de los gránulos de almidón en el bambú y como se
observa, las paredes del parénquima presentan pequeños orificios que juegan un papel
importante en el flujo de savia bruta desde la raíz hasta las hojas de la planta (Luo et al.,
2019).
Ecuador Colombia Perú Bolivia Costa Rica0
10
20
30
40
50
60
70
80
Reg
istr
o d
e pre
senci
a de
espec
ies
Resultados y discusión 37
Figura 3-5. Micrografías SEM del parénquima celular en fibras de bambú.
El rendimiento de extracción del almidón fue de 22.9% ± 1.0% en base seca, excluyendo la
humedad (5.5% ± 1.7%) y los porcentajes de lípidos (0.2% ± 0.1%), cenizas (0.1% ± 0.1%)
y fibra (9.7% ± 0.2%) presentes en el mismo. Este rendimiento se considera elevado
comparado con los valores reportados por otros investigadores para almidón extraído a partir
de diferentes especies de bambú. Por ejemplo, Felisberto et al. (2018) reportan porcentajes
de extracción de 11.6%, 15.2% y 14.6% correspondientes a la parte inferior, media y
superior, respectivamente, de un culmo de bambú (Dendrocalamus asper) de tres años de
edad. Por su parte, Toledo et al. (1987) reportan un porcentaje de extracción de 8.5% para
la especie de bambú Guadua flabellata. Estas diferencias en la cantidad de almidón extraído
podrían ser atribuidas al procedimiento utilizado para la extracción. Igualmente, la edad de
la planta puede tener influencia. En este sentido, se ha encontrado que culmos de bambú
Phyllostachys viridiglaucescens no contienen almidón durante la fase de crecimiento debido
a que todos los nutrientes de la planta deben utilizarse inmediatamente para sus procesos
metabólicos. Por otro lado, en culmos de mayor edad, el almidón está presente incluso hasta
los 12 años (Liese y Weiner, 1996). Asimismo, las diferencias botánicas y las condiciones
climáticas y geológicas propias de la región donde es cultivado el bambú podrían afectar de
forma importante el contenido de almidón en la planta (Asaoka et al., 1984, 1985, 1989).
El contenido aparente de amilosa presente en el almidón de bambú fue de 18.3% ± 1.2%,
que es característico de los almidones nativos y se encuentra en el rango entre 12% y 30%
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 1000x --- 9.3 mm Universidad Nacional de Colombia
HV Mag Sig WD 50.0µm
30.0 kV 2500x --- 9.1 mm Universidad Nacional de Colombia
38 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
reportado para otras especies de bambú (Ai et al., 2016; Felisberto et al., 2018; Toledo et
al., 1987).
Como se observa en la Figura 3-6A, los gránulos de almidón de bambú exhiben formas
irregulares, algunos de ellos con bordes poliédricos. Esta morfología es similar a la
observada para otras especies de bambú, tales como Dendrocalamus asper (Felisberto et al.,
2018), Guadua flabellata (Toledo et al., 1987) y para semillas de bambú Phyllostachys
heterocycla var. pubescens (Mazel) Ohwi (Ai et al., 2016). Igualmente, estas formas
irregulares del gránulo se han reportado para almidones extraídos a partir de maíz normal y
ceroso (Jane, 2009).
De otro lado, en el almidón de bambú se observa la presencia de gránulos compuestos los
que se forman mediante el ensamblaje de varios gránulos simples presentes en el
aminoplasto. La familia Poaceae, dentro de la cual se encuentran el bambú, el arroz, el maíz,
el sorgo, la cebada y el trigo, entre otros, se caracteriza por presentar este tipo de gránulos,
lo que podría estar relacionado con un recurso que utiliza la planta en la biosíntesis del
almidón, posiblemente para lograr un mayor almacenamiento en los aminoplastos
(Matsushima et al., 2015). Además, es evidente la presencia de algunas impurezas (Figuras
3-6B y 3-6C) atribuidas principalmente a fibras remanentes del proceso de extracción
(Anexo B), y que es consistente con el elevado contenido de fibra determinado en el análisis
químico (9.7% ± 0.2%).
Respecto a las observaciones de los gránulos mediante luz polarizada (Figura 3-6D), se
destaca la birrefringencia propia de las regiones semicristalinas presentes en los gránulos
confirmando así la integridad de la estructura macroscópica del almidón, es decir, el proceso
de extracción no causa alteraciones en este sentido.
Resultados y discusión 39
Figura 3-6. Micrografías de los gránulos del almidón de bambú, observado en: Microscopio electrónico de
barrido (A y B); microscopio óptico sin luz polarizada con una magnificación de 100x (C); microscopio óptico
de luz polarizada con una magnificación de 100x (D).
Para la determinación de la distribución del tamaño de partícula del almidón de bambú,
inicialmente se determinaron sus índices de refracción y de absorción utilizando para ello
un simulador para la optimización de las propiedades ópticas del material, incluido en el
software V3.62 y la gráfica de datos y ajuste. Como se observa en el Anexo C, Figura C-1
los datos obtenidos en la medición y los datos pronosticados por el modelo se superponen y
mediante el valor de los residuales se verifica su ajuste (Beekman et al., 2005).
Adicionalmente, se demostró la idoneidad de los índices de refracción y de absorción
estimados mediante la comparación de las concentraciones teórica y real del sistema de
partículas suspendidas en el dispersante a través del coeficiente de extinción medido por el
equipo según la teoría Mie de dispersión de luz y la teoría de Lambert Beer. En este caso, la
diferencia entre las dos concentraciones debe ser de máximo un 20%, el que como se reporta
C D
A
HV Mag Sig WD 20.0µm
30.0 kV 5000x SE 9.7 mm Universidad Nacional de Colombia
B
HV Mag Sig WD 100.0µm
30.0 kV 1000x SE 9.7 mm Universidad Nacional de Colombia
40 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
en el Anexo C, Tabla C-1 es muy superior al valor de 0.0003% obtenido en esta
investigación (Beekman et al., 2005).
El almidón de bambú se caracteriza por una distribución de tamaño de partícula bimodal
(Figura 3-7A), con tamaños pequeños en el rango entre 0.6 µm y 2.5 µm y tamaños grandes
entre 2.5 µm y 100 µm, datos que se pueden observar con mayor claridad en términos de
área superficial o de dos dimensiones (Figura 3-7B). Consistente con las observaciones por
microscopía electrónica de barrido (Figura 3-6 y Anexo B), tamaños de partícula menores a
1 µm se podrían atribuir a diminutos gránulos de almidón o a pequeños fragmentos de fibra
remanentes del proceso de obtención, dado que el análisis no puede discriminar entre
partículas de almidón y algunas impurezas irregulares que el modelo asume como esferas,
dentro del concepto de esferas equivalentes. Por su parte, los tamaños de partícula mayores
a 36 µm pueden corresponder a fibras presentes en el almidón o a agregados de gránulos;
por ello, es indispensable el proceso de sonicación y agitación durante la medición para
minimizar los factores que pueden afectar el análisis de los resultados. Sin embargo, como
se observa en la Figura 3-7A estas distribuciones de tamaño de partícula tienen porcentajes
de densidad en volumen por debajo del 1.5%, lo que indica que tan solo el 1.5% del volumen
total medido proviene de esos diámetros de partícula y el mayor aporte al volumen total
corresponde a los diámetros de partícula entre ~3.6 µm y ~36 µm.
De acuerdo con lo anterior, los datos que se consideraron más prácticos para representar el
rango de tamaños de partícula del almidón de bambú fueron el D10 y el D90, los que
corresponden a los diámetros a partir de los cuales el 10% y el 90% de la población de
partículas se encuentra por debajo, respectivamente. De acuerdo con esto, el almidón de
bambú presenta una distribución de tamaño en volumen en el rango de 3.1 µm ± 0.1 µm a
34.4 µm ± 2.1 µm.
Resultados y discusión 41
Figura 3-7. Distribución en densidad de volumen del tamaño de partícula del almidón de bambú (A);
distribución del tamaño de partícula del almidón de bambú en términos de área superficial (B).
Para efectos de comparación, es necesario representar el tamaño de partícula a través de
valores únicos tales como el diámetro medio de De Brouckere (D4,3), el valor medio de
Sauter (D3,2), la mediana (D50) y el span. No existe consenso sobre el valor apropiado y
representativo que debe reportarse para describir el tamaño de partícula de una distribución,
por tal motivo se reporta el valor estimado para todos los parámetros mencionados. Como
se observa, el almidón tiene un diámetro medio D4,3 de 15.0 µm ± 1.0 µm en términos de
volumen; cuando la distribución se analiza en términos de área superficial, el valor medio
D3,2, el cual es sensible a la presencia de partículas finas en la distribución de tamaño, es de
6.0 µm ± 0.1 µm. La mediana D50, que corresponde al valor medio a partir del cual reside
la mitad de la población tanto por encima como por debajo de dicho valor fue de 9.3 µm ±
0.4 µm. Finalmente, el span, que es una forma de representar mediante un único valor el
ancho de la distribución permitiendo evaluar la homogeneidad en el tamaño de las partículas,
fue de 3.4, un valor elevado que sugiere una distribución amplia, es decir, poca
homogeneidad de la muestra.
El coeficiente de variación correspondiente a los valores D10, D50, D90 (3%, 3%, y 4%,
respectivamente) son un indicativo de la reproducibilidad de las mediciones. Dicha
reproducibilidad se verificó mediante los límites de aceptación definidos por la norma ISO
13320-1 incluidos en el software del equipo (Mastersizer v3.62). Así, en términos generales,
1 10 1000
1
2
3
4
5
6
7
8
Den
sidad
en v
olu
men
(%
)
Diámetro de partícula (m)
0.1 1 10 100
0
1
2
3
4
5
6
7
Den
sidad
par
a el
are
a su
per
fici
al (
%)
Diámetro de partícula (m)
A B
42 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
todas las mediciones fueron reproducibles con una variabilidad dentro de los límites
establecidos por la norma ISO (D10 y D90 ≤ 5%, D50 ≤ 3%)
De otro lado, el almidón de bambú presenta elevada temperatura y baja entalpía de
gelatinización (Tabla 3-3, Figura 3-8A) comparado con almidones de otras fuentes botánicas
como el maíz y la papa, cuyas temperaturas y entalpías de gelatinización varían entre 62.5
°C y 71 °C, y entre 11.07 J g-1 y 19.8 J g-1, respectivamente (Srichuwong et al., 2005; Alvani
et al., 2011; Rocha et al., 2011; Jiang et al., 2020). Esto podría estar relacionado con las
características de las cadenas ramificadas de la amilopectina donde las cadenas de dobles
hélices estables podrían favorecer el empaquetamiento de las cadenas de amilopectina en
regiones cristalinas, confiriendo estabilidad térmica a estas estructuras, tal como lo propone
Felisberto et al. (2018) para el almidón de bambú Dendrocalamus asper y por Ai et al.
(2016) para el almidón de semillas de bambú (Phyllostachys heterocycla var. pubescens
(Mazel) Ohwi), donde los valores de temperatura y entalpía de gelatinización se encontraron
entre 73.4 °C y 84.7 °C y 4.2 J g-1 y 14.2 J g-1, respectivamente.
Tabla 3-3. Propiedades térmicas del almidón de bambú.
Gelatinización
Almidón Ti (°C) Tp (°C) Tf (°C) ΔH (J g-1)
Bambú 75.8 79.1 82.9 8.8
Temperatura de inicio (Ti); temperatura del pico (Tp); temperatura final (Tf);
entalpía de gelatinización (ΔH).
El espectro FTIR del almidón de bambú se muestra en la Figura 3-8B. Los picos
característicos para los grupos -OH de los residuos de glucosa y el agua presente en la
muestra aparecen en ~3280 cm-1 y en ~1648 cm-1, que se asignan a las vibraciones de
estiramiento y flexión, respectivamente. La vibración de estiramiento del enlace C-O
aparece en ~1150 cm-1, C-O-C en ~997 cm-1 y C-O-H en ~1078 cm-1. Por su parte la
vibración de estiramiento correspondiente al enlace C-H se observa en ~2930 cm-1.
El patrón de XRD del almidón de bambú investigado se muestra en la Figura 3-9. Como se
observa, este almidón se caracteriza por un patrón cristalino de tipo A con picos
característicos en ángulos de Bragg (2θ) de 15.3°, 17.2°, 18.1° y 23°, observaciones que son
Resultados y discusión 43
consistentes con lo reportado por Felisberto et al. (2018) que han caracterizado el almidón
de otra especie de bambú (15.1°, 16.8° y 22.3° en 2θ). De acuerdo con Tian et al. (2010) y
Ye et al. (2018), el pico de difracción en el ángulo 2θ de ~20° podría ser atribuido a la
presencia de una estructura cristalina endógena del tipo V-amilosa que se asocia a la
presencia de complejos amilosa - lípidos. El patrón de cristalinidad tipo A es característico
de los almidones de cereales tales como el arroz (Srichuwong et al., 2005; Bertoft et al.,
2008; Kong et al., 2015), maíz (Cheetham y Tao, 1998; Ngobese et al., 2018; Jiang et al.,
2020), centeno (Bertoft et al., 2008), trigo (Ao y Jane, 2007) y cebada (Ao y Jane, 2007;
Bertoft et al., 2008), entre otros. No obstante, es importante destacar que a pesar de que en
dichos cereales el almidón es extraído a partir de un gránulo y el de bambú de un culmo,
estos pertenecen a la misma familia Poaceae, lo que podría explicar la relación en el patrón
cristalográfico tipo A. Igualmente, el almidón extraído de géneros como Manioh, Ipomea,
Dioscórea, Colocasia y Coleus también presentan este tipo de cristalinidad (Gallant et al.,
1982).
Figura 3-8. Termograma obtenido para el almidón de bambú mediante HP-DSC (A); espectro infrarrojo
obtenido para el almidón de bambú (B).
El patrón cristalográfico obtenido para el almidón de bambú da indicios sobre la distribución
de sus cadenas ramificadas de amilopectina. En este sentido, es probable que la estructura
correspondiente al polimorfo A se caracterice por tener un DP ≥ 37, una baja proporción de
cadenas largas con un grado de polimerización (DP) de 25 – 36 y una elevada proporción
de cadenas cortas con DP 6 - 12 y DP 13 - 24 (Felisberto et al., 2018). Esto resulta de gran
30 40 50 60 70 80 90 100
F
lujo
de
calo
r en
doté
rmic
o
Temperatura (°C)
A
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Tra
nsm
itan
cia
(%)
Longitud de onda (cm-1)
B
44 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
importancia para esta investigación dado que influencia la capacidad de la amilopectina para
formar complejos de inclusión molecular. Como ha sido reportado por Godet et al. (1995),
la amilopectina forma este tipo de complejos siempre y cuando la longitud de las cadenas
ramificadas tengan un DP mayor a 20.
Figura 3-9. Patrón de difracción de rayos X del almidón de bambú.
Respecto al comportamiento de hinchamiento del almidón, éste se encuentra relacionado
con su gelatinización, es atribuido principalmente a la amilopectina y su valor varía en
función inversa al contenido de amilosa (Cozzolino et al., 2013). Como se observa en la
Figura 3-10A, el poder de hinchamiento del almidón de bambú aumenta con la temperatura
presentando un incremento pronunciado en la región de 70 °C a 90 °C. Un comportamiento
similar es observado para los sólidos solubles o índice de solubilidad (Figura 3-10B), el que
corresponde al porcentaje de materia seca presente en el sobrenadante, principalmente
amilosa.
Tabla 3-4. Cristalinidad relativa estimada para el almidón de bambú.
Almidón Patrón cristalográfico Cristalinidad (%)
Bambú Tipo A 21.7
La cantidad de sólidos solubles lixiviados aumenta significativamente en el rango entre 80
°C y 90 °C debido a que en estos valores se encuentra la temperatura de gelificación como
se evidencia en el análisis térmico (Figura 3-8A). En este punto, la estructura del almidón
10 15 20 25 30 35 40 45
Inte
nsi
dad
2 (°)
Resultados y discusión 45
sufre una transición orden - desorden que genera la ruptura del grano y la lixiviación
completa de sus componentes (Hoover, 2001). Respecto a los sólidos insolubles (Figura 3-
10B), que hace referencia al porcentaje de materia seca presente en el sedimento, como era
de esperarse disminuye en función de la temperatura debido a que parte de la amilosa del
gránulo ha lixiviado.
Figura 3-10. Poder de hinchamiento del almidón de bambú (A); porcentaje de sólidos solubles (%SS) e
insolubles (%SI) lixiviados en el almidón de bambú (B).
De acuerdo con los comportamientos obtenidos para el almidón de bambú respecto al
porcentaje de sólidos solubles y sólidos insolubles, para garantizar la formación del
complejo de inclusión molecular por el método de calentamiento sellado es necesaria una
temperatura superior a 80 °C debido a que la formación de dicho complejo ocurre
principalmente con la amilosa y es indispensable que ésta se encuentre disponible en el
medio de disolución para que interactúe con la molécula huésped.
50 60 70 80 904
6
8
10
12
14
16
18
20
Poder
de
hin
cham
iento
(%
)
Temperatura (°C)
50 60 70 80 90
5
10
15
20
25
% SS
% SI
Temperatura (°C)
% S
S
80
85
90
95
100
105
% S
I
A B
4 Preparación y caracterización de complejos de
inclusión molecular a base de almidón nativo
Los complejos de inclusión molecular ofrecen ventajas tales como el incremento de la
solubilidad, la mejora de la biodisponibilidad, el aumento de la estabilidad, la reducción de
la irritación generada en el tracto gastrointestinal y el enmascaramiento de olores y sabores
de moléculas activas (Sharma y Baldi, 2016). Con el propósito de explorar la posible
aplicación de estos sistemas específicamente en el diseño de productos con
biodisponibilidades que respondan a las necesidades terapéuticas, en esta investigación se
da un primer paso en el que se evalúa la capacidad del almidón de bambú para formar
complejos con ibuprofeno, un fármaco que fue seleccionado como molécula modelo dada
su baja solubilidad en agua (0.021 mg mL-1 a 20 °C) y sus dimensiones moleculares: ancho
4.265 Å y largo 9.7 Å (Yang et al., 2013). El ibuprofeno (Figura 4-1) es un ácido
monocarboxílico derivado de la sustitución del hidrógeno unido al carbono en la posición 2
del ácido propiónico por un grupo 4-isobutilfenil, es una molécula ópticamente activa con
dos isómeros S y R, donde el isómero S es el más activo biológicamente (Pubchem, 2016).
Figura 4-1. Representación de la estructura química de la mezcla racémica del ibuprofeno (ácido 2-(4-
isobutilfenil) propiónico).
Este fármaco se clasifica dentro de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) y actúa
inhibiendo la producción de prostaglandinas, mediadores que están relacionados con la
1
2
6
3
5
2 O
OH
CH3
1
2
CH3
CH3
R3
3
1
4
1
2
6
3
5
2 O
OH
CH3
1
2
CH3
CH3
3
3
1
4
S
y
Métodos y materiales 47
inflamación y el dolor. Igualmente, se utiliza como antipirético (Pereva et al., 2020) y en el
tratamiento de la artritis reumatoide aguda y crónica (Liu y Gao, 2012). Al administrar este
activo por la vía oral se generan ciertos efectos adversos en su paso por el tracto
gastrointestinal superior, tales como erosión gástrica, úlcera péptica y sangrado
(Marinopoulou et al., 2019). De esta forma los complejos de inclusión podrían ser una
alternativa interesante para la entrega dirigida al intestino mejorando su desempeño
terapéutico. Asimismo, teniendo en cuenta que los complejos de inclusión se forman
principalmente con amilosa, se utilizó un estándar de amilosa de papa (A0512 Sigma-
Aldrich) como control positivo. De otro lado, para lograr un análisis comparativo del
almidón de bambú como portador del activo de interés, también fueron preparados
complejos a partir de almidón nativo de maíz previamente caracterizado siguiendo las
metodologías descritas en el capítulo anterior (Tabla 4-1). Como se observa, los almidones
de bambú y de maíz presentan similitudes en sus características fisicoquímicas.
Tabla 4-1. Características fisicoquímicas obtenidas para el almidón de maíz.
Ensayo Resultados
Caracterización química
Humedada (%) 5.13 ± 0.74
Cenizasa (%) 0.17 ± 0.05
Fibra (%) ND
Lípidosa (%) 0.18 ± 0.02
Amilosaa (%) 16.30 ± 2.24
Difracción de rayos X Patrón cristalográfico Tipo A
Cristalinidad (%) 14.70
Propiedades térmicas Temperatura de gelificación (°C) 71.10
ΔH (J/g) 22.35 a Datos presentados como el promedio ± intervalo de confianza de 3 réplicas; no detectable
(ND); entalpía de gelatinización (ΔH).
4.1 Métodos y materiales
4.1.1 Preparación de los complejos de inclusión molecular
En la presente investigación, los complejos de inclusión molecular se prepararon bajo
diferentes condiciones de tiempo de complejación, concentración de almidón y método de
complejación (Tabla 4-2), con el fin de evidenciar la influencia de estos parámetros en las
48 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
características fisicoquímicas del complejo. En todos los casos donde se empleó almidón de
maíz o almidón de bambú se utilizó el activo en una relación almidón - ibuprofeno 50:1.
Cuando se trabajó con amilosa de papa, la relación amilosa - activo fue de 1:10. Esto
teniendo en cuenta que el estándar de amilosa es esencialmente libre de amilopectina. Se
utilizaron tres métodos de complejación: acidificación de una solución alcalina (ASA),
calentamiento - sellado (CS) y calentamiento sellado por rotaevaporación (RE).
Tabla 4-2. Condiciones de reacción empleadas para la preparación de complejos de inclusión molecular
basados en almidón.
Complejo Método
Cantidad
de agua
(mL)
Tiempo de
reacción
(h)
Cantidad
de almidón
(g)
Cantidad de
ibuprofeno
(mg)
AB-1%-ASA
Acidificación de
una solución
alcalina
300 3 3 60
AM-1%-ASA 300 3 3 60
AM-1%-ASA* 300 0.5 3 60
AB-1.5%-ASA 200 3 3 60
AM-1.5%-ASA 200 3 3 60
A-0.6%-ASA 200 3 1.2 120
AB-4%-CS
Calentamiento -
sellado
10 3 0.4 8
AB-4%-CSPG 10 3 0.4 8
AB-8%-CS 5 3 0.4 8
AM-8%-CS 5 3 0.4 8
AB-5%-RE
Calentamiento -
sellado por
Rotaevaporación
60 3 3 60
El rótulo correspondiente a cada almidón tiene la siguiente estructura XX-X%-XX; la primera abreviatura
hace referencia al tipo de almidón o en su defecto al estándar de amilosa, los caracteres numéricos
especifican el porcentaje (p/v) del almidón o en su defecto del estándar de amilosa y las últimas
abreviaturas indican el método de preparación de los complejos. Almidón de bambú (AB), almidón de
maíz (AM), amilosa (A), método acidificación de una solución alcalina (ASA), método calentamiento
sellado (CS), método calentamiento sellado utilizando rotaevaporación (RE), almidón pregelatinizado
(XPG), (X*) menor tiempo de complejación.
4.1.1.1 Método de acidificación de una solución alcalina
La complejación por el método de acidificación de una solución alcalina se realizó siguiendo
el procedimiento descrito por Marinopoulou et al. (2019), con ligeras modificaciones. Así,
inicialmente se preparó una dispersión de almidón (1%, 1.5%, o 0.6% según el ensayo) en
KOH 0.1 N a la que se adiciono ibuprofeno en una relación almidón-ibuprofeno 50:1.
Métodos y materiales 49
Posteriormente la solución se sometió a calentamiento (IKA® C-Mag HS 7) durante 3 h a
una temperatura de 90 °C con agitación constante (250 rpm); para evitar la excesiva pérdida
de agua por evaporación se improvisó una tapa de papel aluminio para cubrir el vaso de
precipitados (Figura 4-2). La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente con agitación
constante (180 rpm) y se ajustó a pH 4.5 utilizando HCl al 8% y al 1%, esta última para
facilitar el ajuste del pH deseado. La dispersión obtenida se mantuvo durante 24 h con
agitación constante (150 rpm) a temperatura ambiente, tiempo al cabo del cual las muestras
fueron centrifugadas a 3075 rcf durante 20 min (Hermle Z206 A). El sobrenadante fue
descartado cuidadosamente por vertido y el precipitado se lavó tres veces con una mezcla
etanol (Merck Millipore) - agua destilada 1:1 y por último, con etanol absoluto (Merck
Millipore) agitando en vortex durante 20 s (LB PRO MX-S). Los complejos se secaron
durante 12 h a una temperatura de 45 °C ± 2 °C hasta peso constante (Jouan IG 150). Las
muestras sólidas se trituraron con la ayuda de un mortero y se almacenaron en viales de
vidrio sellados herméticamente para su posterior caracterización.
Figura 4-2. Obtención de los complejos de inclusión molecular por el método de acidificación de una solución
alcalina.
50 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
4.1.1.2 Método de calentamiento - sellado
Los complejos de inclusión molecular por la técnica de calentamiento sellado se formaron
siguiendo la metodología descrita por Uchino et al. (2001), con algunas modificaciones
(Figura 4-3). Inicialmente, en un vial de vidrio sellado herméticamente se preparó una
dispersión de almidón (4% y 8% según el ensayo) en agua destilada, a la que se adicionó
ibuprofeno en una relación almidón - ibuprofeno 50:1. Posteriormente la solución se sometió
a calentamiento en un baño de aceite (IKA® C-Mag HS 7) a una temperatura de 90 °C ± 0.2
°C durante 3 h con agitación constante (250 rpm). Finalizado el tiempo de calentamiento, la
dispersión se dejó enfriar a temperatura ambiente y se siguieron los procedimientos de
centrifugación, lavado, secado, trituración y envase previamente descritos en el método de
acidificación de una solución alcalina (Sección 4.1.1.1).
Figura 4-3. Obtención de los complejos de inclusión molecular por el método de calentamiento - sellado.
4.1.1.3 Método de calentamiento - sellado por rotaevaporación
Para la formación de los complejos por el método de calentamiento - sellado por
rotaevaporación se empleó como fuente de calentamiento un rotaevaporador (Heidolph Hei-
VAP). Así, como se presenta en la Figura 4-4, 3 g de almidón se depositaron en un matraz
de evaporación junto con 60 mL de agua destilada y 60 mg de ibuprofeno. La mezcla se
sometió a calentamiento durante 3 h a una temperatura de 90 °C con una velocidad de
Métodos y materiales 51
rotación de 80 rpm y una presión de 751 mbar, fue necesaria la utilización de aceite industrial
en el baño termostático debido a la temperatura de trabajo. Cumplidas las 3 h de
calentamiento se disminuyó gradualmente la presión hasta alcanzar 90 mbar y una vez
evaporada toda el agua del sistema, el sólido obtenido se retiró del matraz de evaporación y
se realizaron los procedimientos de centrifugación, lavado, secado, trituración y envase
previamente descritos en el método de acidificación de una solución alcalina (Sección
4.1.1.1).
Figura 4-4. Obtención de los complejos de inclusión molecular por el método de calentamiento - sellado por
rotaevaporación.
Los rendimientos de los complejos obtenidos mediante las diferentes metodologías fueron
calculados empleando la Ecuación 4-1.
Rendimiento complejo (%) = Peso precipitado (g)
peso ibuprofeno (g) + almidón (g) * 100 (4-1)
4.1.1.4 Preparación de los controles y las mezclas físicas
Los controles correspondientes a los almidones de bambú y de maíz se prepararon
sometiendo éstos a un tratamiento de acidificación de una solución alcalina (Figura 4-2), en
ausencia de ibuprofeno. Por su parte, las mezclas físicas se prepararon mezclando una
52 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
cantidad determinada de los controles previamente obtenidos y una cantidad de ibuprofeno
disuelta en un pequeño volumen de etanol absoluto (Merck Millipore), de tal manera que la
concentración del activo en la mezcla física correspondiera al 0.05%. Posteriormente, el
etanol se evaporó a una temperatura de 45 °C ± 2 °C (Jouan IG 150) durante 1 h y finalmente
la mezcla sólida se trituró con la ayuda de un mortero.
4.1.2 Caracterización de los complejos de inclusión molecular
4.1.2.1 Determinación de la cantidad de ibuprofeno complejado
En viales de vidrio se prepararon 3 mL de una solución de pancreatina (40 unidades/mL)
(A3176 Sigma-Aldrich) en buffer fosfato pH 6.9. A dicha solución le fueron adicionados 30
mg de los complejos y la muestra se sometió a digestión enzimática en un baño de agua a
una temperatura de 37 °C ± 0.2 °C (IKA® C-Mag HS 7) durante 24 h con agitación constante
(150 rpm). Luego, se dejó enfriar a temperatura ambiente y la dispersión resultante se llevó
a un volumen total de 10 mL con etanol absoluto (Merck Millipore). La mezcla fue
centrifugada durante 5 min a 3428 rcf (Hermle Z216 M), filtrada (filtros Millipore Corp), y
analizada mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) utilizando una
metodología previamente validada (Anexo D). El contenido de ibuprofeno presente en los
complejos, así como la eficiencia de complejación se calcularon mediante las Ecuaciones 4-
2 y 4-3, respectivamente.
IBU complejado (%) = IBU en el complejo (g)
Peso complejo (g) * 100
(4-2)
Eficiencia de complejación (%) =IBU en el complejo (g)
IBU de partida (g) * 100 (4-3)
Métodos y materiales 53
4.1.2.2 Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Las micrografías electrónicas de barrido de los complejos fueron tomadas con un
microscopio electrónico de barrido (FEI Quanta 200), equipado con un filamento de
tungsteno convencional como fuente de electrones, detectores de electrones secundarios
(SE), de electrones retrodispersados (BSE) y de rayos X de dispersión de energía, además
de una cámara interna. Las muestras de los complejos fueron recubiertas con oro al 99.9%
de pureza, utilizando un revestidor de pulverización catódica con bomba rotativa (Q150R
ES), durante 30 s a una corriente de pulverización de 60 mA. El microscopio se operó
utilizando vacío a una presión de 5.3 x 10-5
Pa y una energía de aceleración del haz de
electrones de 30 kV.
4.1.2.3 Calorimetría diferencial de barrido de alta presión (HP-DSC)
La entalpía, así como la temperatura de disociación de los complejos, se determinó en un
calorímetro de alta presión (HP DSC 1 Mettler Toledo®) previamente calibrado con
estándares de indio y paladio. Se utilizaron crisoles estándar de aluminio con capacidad de
40 µL, se pesaron 6 mg de muestra en los crisoles y se les adicionaron 10 µL de agua
destilada. Posteriormente, los crisoles fueron sellados herméticamente y se les realizó una
pequeña perforación en la tapa. El equipo se operó bajo una atmósfera de nitrógeno a una
presión de 1 MPa con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min en un rango de
temperatura de 25 °C a 130 °C; como referencia se utilizó un crisol vacío. El tratamiento de
los datos se realizó utilizando el software (STARe), las gráficas y el tratamiento para la línea
base se realizaron con el software OriginPro® 9.
4.1.2.4 Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)
Los espectros vibracionales de los complejos se tomaron en un espectrofotómetro (IR-
Affinity-1S SHIMADZU) equipado con accesorio ATR. Las medidas se realizaron en un
rango de 3500 cm-1 a 400 cm-1 con una resolución de 4 cm-1; las gráficas y el tratamiento
para la línea base se realizaron con el software OriginPro® 9.
54 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
4.1.2.5 Difracción de rayos X (XRD)
Los patrones cristalográficos de los complejos se determinaron en un difractómetro de rayos
X PANalytical modelo X´PERT PRO MPD, configuración óptica de Bragg – Brentano,
equipado con un detector de estado sólido de alta velocidad (PIXcel) y un tubo generador
de rayos X con ánodo de cobre. Las condiciones de medida fueron: longitud de onda: 1.54
Å, filtro de níquel, voltaje: 45 kV y corriente: 40 mA, región de escaneo con ángulo dos
theta (2θ) de 7° a 100°, tamaño de paso: 0.0263°, tiempo de paso: 100 s. El tratamiento de
los datos y el ajuste de la curva se llevaron a cabo utilizando el software HighScore plus
(versión 3.0c). De igual manera la indexación de los datos en las diferentes celdas unitarias
se realizó empleando dicho software, el que permitió calcular los picos, así como los valores
de los índices de Miller (h, k y l) con los respectivos parámetros de red.
4.1.2.6 Evaluación del comportamiento de liberación
Los comportamientos de liberación in vitro del ibuprofeno a partir de los complejos
preparados se evaluaron por el método de diálisis (Figura 4-5) empleando medios que
simulan algunas condiciones gastrointestinales y que fueron preparados según las
indicaciones de la Farmacopea de los Estados Unidos (The United States Pharmacopeia,
2019). Así, para simular las condiciones gástricas se empleó solución buffer de ácido
clorhídrico pH 1.2; las condiciones simuladas del intestino delgado se lograron con solución
buffer fosfato pH 6.8, con solución buffer fosfato pH 6.8 conteniendo 35 unidades/mL de
pancreatina (A3176 Sigma-Aldrich) y con solución buffer fosfato pH 7.2 conteniendo 35
unidades/mL de pancreatina (A3176 Sigma-Aldrich). Inicialmente, los tubos de diálisis de
celulosa (D9777-100FT Sigma-Aldrich) se hidrataron en sus respectivos medios 12 h previo
a la realización del ensayo. Luego, 30 mg del complejo junto con 2 mL del medio de
liberación fueron depositados en las bolsas de diálisis para luego ser selladas y ubicadas en
20 mL del respectivo medio a una temperatura de 37 °C ± 0.2 °C (IKA® C-Mag HS 7) con
agitación continua (100 rpm). Se realizó el muestreo con remplazo de alícuotas de 500 µL
del compartimento externo en diferentes intervalos de tiempo (15, 30, 60, 90, 180 y 360
min), las muestras se filtraron (filtros Millipore Corp., tamaño de poro 0.45 µm) y se
analizaron mediante HPLC con una metodología previamente validada (Anexo D).
Métodos y materiales 55
4.1.2.7 Modelos cinéticos de liberación
Los datos de liberación del ibuprofeno se procesaron aplicando diferentes modelos
matemáticos (Tabla 4-3); para ello se empleó una herramienta libre de Excel (DDSolver)
desarrollada por Zhang et al. (2010). Para los modelos de Korsmeyer - Peppas y Weibull se
trabajaron los datos con una tasa de liberación menor al 60%.
Figura 4-5. Determinación del comportamiento de liberación de los complejos.
Por otro lado, con el fin de evidenciar diferencias en los perfiles de liberación de los
respectivos complejos se realizó la prueba del factor de similitud (f2), definida según la
Ecuación 4-4 como una transformación logarítmica de la raíz cuadrada media de la suma de
las distancias cuadradas en todos los puntos (Costa y Sousa Lobo, 2001). En efecto, valores
entre 50 y 100 indican similitud entre dos perfiles con una variación promedio ≤ 10%; por
el contrario, valores inferiores a 50 indican que no existe similitud entre los dos perfiles con
una variación promedio > 10% (Xie et al., 2015). Los cálculos se realizaron utilizando la
herramienta libre de Excel (DDSolver).
f2 = 50 * log {[1 + 1
n∑ (Rt - Tt)
2
n
t =1
]
-0.5
* 100} (4-4)
Tabla 4-3. Modelos matemáticos de liberación empleados para lograr una aproximación al mecanismo de
liberación del activo a partir de los complejos.
Modelo Ecuacióna Ecuación linealizadaa
56 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Orden ceroa [A] - [𝐴]0 = K0 t [A] = K0 t + [𝐴]0
Primer ordena [A] - [𝐴]0 = 100(1 - e - K1t) ln (1 - [A]
100) = - K1 t + ln [A]0
Higuchia [A] = KH √t log[A] = 0.5 log t + log KH
Korsmeyer - Peppasa [A] = KKP tn ln[A] = n ln t + ln KKP
Weibullb [A] = 100 (1 - e - atb) log [- ln (1 - [A]
100) ] = b log t - log a
Hixson - Crowella [A] = 100[1 - (1 - KKCt)3] 1 - (1 - [A]
100)
13
= KKC 𝑡
a [A] es el porcentaje acumulado liberado en el tiempo t; [A]0 es la cantidad inicial de activo en la solución
(la mayoría de las veces [A]0 = 0) Kp K0, K1, KH y KKC las constantes de velocidad de liberación para
cada modelo; n exponentes de liberación. b a es el parámetro de escala que define la escala del
tiempo del proceso, b es el parámetro de forma que caracteriza la curva.
4.2 Resultados y discusión
Como se ha mencionado, la presente investigación fue orientada hacia la evaluación del
almidón de bambú como una posible alternativa para el transporte de moléculas activas a
través de la formación de complejos entre éste y el ibuprofeno elegido como fármaco
modelo. Teniendo en cuenta que éste es el primer trabajo de investigación sobre la obtención
de complejos almidón - activo realizado en el grupo de investigación en Desarrollo y Calidad
de Productos Farmacéuticos y Cosméticos -GIDECA-, a medida que avanzaba la
investigación se fueron seleccionando los diferentes métodos para la preparación de los
complejos. Particularmente, se buscaban los mejores resultados en términos de eficiencia de
complejación. Por tal razón se emplearon dos técnicas reportadas en la literatura para éste
propósito (acidificación de una solución alcalina y calentamiento - sellado) y se propuso un
método basado en la evaporación del solvente mediante rotaevaporación. Como referencia
se emplearon el almidón de maíz y la amilosa de papa, lo que permitió un punto vista
comparativo respecto a la capacidad del almidón de bambú para formar este tipo de
complejos.
Como se representa en la Figura 4-6, cuando se emplea el método de acidificación de una
solución alcalina, inicialmente, debido a las condiciones básicas del medio el gránulo de
Resultados y discusión 57
almidón se hincha. Se ha propuesto que esto es causado por la desprotonación de los grupos
hidroxilo de las unidades de anhidro glucosa generando repulsión electrostática entre las
cadenas poliméricas. Esto ocasiona la disrupción de las regiones cristalinas de la estructura
del almidón, facilitando la lixiviación de sus componentes estructurales al medio de
disolución y la reorganización de las cadenas poliméricas de amilosa y amilopectina en una
estructura de bobina extendida (Banks y Greenwood, 1971); estos procesos son catalizados
por el suministro de energía al sistema en forma de calor. Cuando la molécula huésped es
adicionada a la solución y el pH del medio es disminuido lentamente, los grupos hidroxilo
ionizados se protonan de manera que las cadenas poliméricas adoptan nuevamente una
estructura helicoidal mediada por puentes de hidrógeno; la molécula huésped posiblemente
es incluida en las cavidades internas impulsada por el efecto hidrofóbico, dicho en otras
palabras, por la tendencia del activo y del hospedador a minimizar el contacto con el agua.
Finalmente, para completar la complejación y el plegamiento de las cadenas poliméricas se
requiere de agitación leve durante un periodo de tiempo prolongado dado que posiblemente,
éste no es un proceso instantáneo.
De acuerdo con lo anterior, parámetros como la velocidad a la que la solución es acidificada,
el tiempo de estabilización al final del proceso y la concentración del hidróxido de potasio,
el que está directamente relacionado con el tiempo necesario para garantizar la disolución
completa del almidón sin que se afecten las características estructurales de la amilosa y la
amilopectina, son parámetros que podrían jugar un rol importante en el proceso de
complejación. Igualmente, a partir de la hipótesis de que la principal fuerza impulsora para
que se dé la formación del complejo es el efecto hidrofóbico, resulta conveniente conocer la
influencia de la cantidad de agua garantizando en cualquier caso, que no se afecte la
disolución del almidón. Es importante tener en cuenta que la temperatura utilizada en la
preparación de los complejos está directamente relacionada con la plastificación de las
cadenas poliméricas y es un parámetro que influye en la estructura cristalina macro de los
complejos de inclusión molecular (Cai y Shi, 2013). En esta investigación la temperatura
fue un parámetro que se fijó en 90 °C considerando la temperatura de gelatinización del
almidón de bambú (79.1 °C).
58 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Figura 4-6. Mecanismo de reacción propuesto para la formación de complejos de inclusión molecular
mediante el método de acidificación de una solución alcalina. Dispersión de almidón en solución básica (A);
inicio de la lixiviación de los componentes estructurales del almidón como consecuencia de la ionización de
los grupos hidroxilo y el aumento de la temperatura (B); componentes estructurales en solución posterior a la
ruptura del gránulo de almidón (C); enfriamiento y protonación de los grupos hidroxilo de las cadenas
poliméricas que van adoptando una conformación helicoidal con el huésped incluido en la cavidad de la misma
(D).
Por su parte, mediante el método de calentamiento - sellado (Figura 4-7) los gránulos de
almidón son inicialmente sometidos a gelatinización y de acuerdo con la hipótesis propuesta
por Jenkins y Donald (1998) el proceso inicia con la entrada del agua en los anillos de
crecimiento amorfo generando cierto grado de hinchamiento, el estrés disruptivo es
transmitido a través de las moléculas de las regiones amorfas a las cristalinas y la amilosa
empieza a lixiviarse de los gránulos. De acuerdo con Banks y Greenwood (1971), a medida
que avanza el proceso las cadenas poliméricas van quedando en solución adoptando una
conformación de bobina aleatoria en la que coexisten segmentos completamente extendidos
y segmentos helicoidales donde inicialmente las moléculas del activo podrían ser alojadas.
Finalmente, cuando la solución es enfriada a temperatura ambiente y debido a una
disminución de la solubilidad del activo y a la reorganización de las cadenas poliméricas,
posiblemente se genera la asociación huésped - ibuprofeno, principalmente en los segmentos
extendidos de dichas cadenas.
A B C
D
Resultados y discusión 59
Figura 4-7. Mecanismo de reacción propuesto para la formación de complejos de inclusión molecular
mediante el método de calentamiento - sellado. Dispersión de almidón en agua destilada (A); inicio de la
lixiviación de los componentes estructurales del almidón como consecuencia del aumento de la temperatura
(B); componentes estructurales en solución posterior a la ruptura del gránulo de almidón (C); enfriamiento de
la solución y conformación helicoidal de las cadenas poliméricas con el huésped incluido en la cavidad interna
de la misma (D).
Debido a que las moléculas de amilosa y amilopectina en solución neutra no presentan una
conformación de bobina extendida, el almidón de bambú se pregelatinizó para evidenciar si
dicho proceso favorecía su dispersión y de esta manera la cantidad de ibuprofeno
complejado. De igual manera, teniendo en cuenta el efecto hidrofóbico, se modificó la
cantidad de agua empleada para corroborar si dicha variable favorecía la complejación. Se
considera que posiblemente las variables más importantes son aquellas que están
relacionadas con la completa gelatinización y disolución del almidón.
De acuerdo con los resultados de encapsulación del activo mediante las metodologías de
acidificación de una solución alcalina y de calentamiento - sellado, se propuso un método
no reportado en la literatura empleando un rotaevaporador a fin de lograr la evaporación del
solvente de forma gradual, generando un plegamiento inducido de las cadenas poliméricas
donde se espera que las moléculas de ibuprofeno quedan atrapadas (Figura 4-8).
Adicionalmente, la evaporación del agua de manera controlada podría aumentar el efecto
hidrofóbico del activo y del almidón favoreciendo posiblemente la complejación. Por otra
parte, la nucleación inducida por la evaporación del solvente podría generar tamaños de
A B C
D
60 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
cristal más pequeños permitiendo un mejor estudio de sus características cristalográficas,
dificultad que como se discutirá más adelante, fue evidenciada en la caracterización de los
complejos obtenidos por los otros dos métodos. De otro lado, mediante esta metodología la
variable que podría tener más influencia es la velocidad de evaporación gradual del agua y
una de las grandes ventajas es la posibilidad de emplear una mayor cantidad de la misma
favoreciendo la disolución del almidón.
Figura 4-8. Mecanismo de reacción propuesto para la formación de complejos de inclusión molecular
mediante el método de calentamiento - sellado. Dispersión de almidón en agua destilada (A); inicio de la
lixiviación de los componentes estructurales del almidón como consecuencia del aumento de la temperatura
(B); componentes estructurales en solución posterior a la ruptura del gránulo de almidón (C); evaporación del
solvente gradualmente, acompañado de la conformación helicoidal de las cadenas poliméricas con el huésped
incluido en la cavidad interna de las mismas (D y E).
4.2.1 Rendimiento, porcentaje de activo complejado y eficiencia de
complejación
Los complejos preparados según las metodologías descritas corresponden al precipitado
seco cuyos rendimientos, porcentajes de ibuprofeno complejado y eficiencia de
complejación son reportados en la Tabla 4-4. Para el caso del método de acidificación de
una solución alcalina, que fue el primero ensayado en esta tesis, se verificó que
efectivamente permitía la formación de los complejos empleando como control positivo
A B C
E D
Resultados y discusión 61
amilosa de papa, dado que no se encuentran reportes de la complejación de ibuprofeno con
almidones nativos.
Aunque se confirma la factibilidad de obtener este tipo de complejos, los resultados fueron
bajos comparados con los reportados en la literatura. Así, Zhang et al. (2016) lograron
porcentajes entre 7% y 14.1% usando amilosa de papa, que dependieron de la relación
amilosa - ibuprofeno; Yang et al. (2013) informan porcentajes de 12.8%, 18.4% y 4.3%
empleando amilosa de papa, almidón de maíz con alto contenido de amilosa (70%) y amilosa
- ibuprofeno mediante una síntesis in situ. Por otro lado, en cuanto a la complejación de
ibuprofeno con ciclodextrinas, Hussein et al. (2007) reportan porcentajes entre 2.8% y 5.4%
empleando β-ciclodextrina. Trabajando con otros activos, Cohen et al. (2008) reportaron
porcentajes de genisteina entre 1.4% y 11.3% en complejos empleando amilosa de papa, la
que depende de la relación amilosa - activo, asimismo, empleando almidón de maíz con alto
contenido de amilosa alcanzaron un porcentaje de genisteina de 9.3%. Al trabajar con
moléculas lineales como los ácidos grasos, Lalush et al. (2005) reportaron porcentajes entre
3.8% y 1.9% de ácido linoleico conjugado en complejos formados con amilosa y Ma et al.
(2011), empleando ésteres para la formación de complejos con almidón de maíz con alto
contenido de amilosa (Hylon® VII), reportaron la complejación de 6.3%, 1.4% y 0.7% de
palmitato de ascorbilo, palmitato de retinilo y ésteres de fitosterol, respectivamente. En
adición Arijaje y Wang (2016) empleando almidón normal de maíz y de papa sometidos
previamente a un tratamiento de desramificación enzimática, obtuvieron porcentajes entre
1.4% y 5.6 % de ácido esteárico complejado.
Cuando se preparan los complejos con los almidones de bambú y de maíz mediante la
metodología de acidificación de una solución alcalina, los rendimientos, cantidad de activo
complejado y eficiencia de complejación incrementan al emplear un menor porcentaje de
agua (ensayos AB-1%-ASA y AM-1%-ASA en los que se emplearon 300 mL de agua
comparados con los ensayos AB-1.5%-ASA y AM-1.5%-ASA utilizando 200 mL). Aunque
se desconoce el mecanismo por medio del cual se da la formación de los complejos con el
almidón o específicamente con la amilosa, se cree que la solubilidad de la molécula huésped
y su tendencia a evitar la interacción con el agua juegan un rol importante (Heinemann et
al., 2001; Conde-Petit et al., 2006). Seguramente al utilizar una menor cantidad de agua, el
62 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
efecto hidrofóbico impulsado por la entropía aumenta, es decir, se genera una estructuración
local del agua alrededor de las superficies hidrofóbicas de las moléculas de amilosa,
amilopectina e ibuprofeno y por lo tanto, más moléculas de activo buscarán un lugar en la
cavidad interna de las cadenas de amilosa y amilopectina, asociándose en segmentos
helicoidales cuya interacción es energéticamente más favorable que las interacciones de los
tipos huésped - agua u hospedador - agua. Como resultado, la complejación podría
favorecerse (Conde-Petit et al., 2006; Immel y Lichtenthaler, 2000).
Tabla 4-4. Porcentajes de rendimiento, porcentaje de ibuprofeno complejado y eficiencia de complejación
determinados para los diferentes complejos.
Complejo Rendimiento del
complejo (%)
IBU en el complejo
(%)
Eficiencia de
complejación (%)
AB-1%-ASA 35.90 0.05 ± 0.01 0.72 ± 0.02
AM-1%-ASA 30.30 0.11 ± 0.01 1.67 ± 0.01
AM-1%-ASA* 60.10 0.02 ± 0.01 0.60 ± 0.01
AB-1.5%-ASA 70.50 0.07 ± 0.02 2.11 ± 0.02
AM-1.5%-ASA 74.50 0.60 ± 0.02 22.35 ± 0.04
A-0.6%-ASA 24.70 0.48 ± 0.01 5.93 ± 0.02
AB-4%-CS 75.90 0.29 ± 0.02 9.11 ± 0.02
AB-4%-CSPG 89.60 0.27 ± 0.01 10.30 ± 0.02
AB-8%-CS 72.50 0.23 ± 0.01 6.89 ± 0.02
AM-8%-CS 66.30 0.53 ± 0.01 17.57 ± 0.01
AB-5%-RE 16.30 0.19 ± 0.01 1.30 ± 0.01
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método
acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS);
método calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).
Sin embargo, Le (2019) menciona que existe una concentración crítica de complejación para
cada molécula huésped y por tal motivo, el aumento de la concentración de la molécula
activa no garantiza una mayor asociación con el agente complejante. Por su parte, Conde-
Petit et al. (2006) indican que a altas concentraciones de agente complejante, la calidad
termodinámica del agua como disolvente podría verse afectada ocasionando la precipitación
de la amilosa no inducida por la formación del complejo.
Por otro lado, el tiempo de reacción parece influir en la cantidad de molécula huésped
complejada, como es evidente en el ensayo AM-1%-ASA* donde se obtuvo un porcentaje
Resultados y discusión 63
bajo de ibuprofeno complejado (0.02% ± 0.01%), debido posiblemente al comportamiento
de las cadenas de almidón en solución alcalina y al tiempo necesario para que se dé la
ionización completa de los grupos hidroxilo de la amilosa y la amilopectina y se logre la
conformación de bobina extendida generada por las repulsiones electrostáticas (Erlander y
Purvinas, 1968), la que es indispensable para garantizar la inclusión de la molécula huésped
dentro de la cavidad helicoidal (Yamashita, 1965). Esto podría resolverse aumentando la
concentración del KOH como lo demuestra Ragheb et al. (1995) al investigar el efecto de la
concentración de NaOH en la gelatinización del almidón de maíz. A temperatura ambiente
(25 °C) el almidón gelatiniza en un tiempo menor a 20 min cuando se emplean
concentraciones de NaOH entre 0.3 N y 2.5 N. En línea con lo anterior, al haber empleado
en esta investigación una solución de KOH 0.1 N y 30 min para la gelatinización del almidón
de maíz, es probable que dicho proceso ocurra de forma parcial.
En cuanto al método de calentamiento - sellado es evidente la influencia de la
pregelatinización del almidón de bambú (ensayo AB-4%-CSPG) favoreciendo el rendimiento
de complejación (89.60%) y por ende la eficiencia de complejación (10.30% ± 0.02%). Esto
contrasta con el almidón de bambú sin pregelatinizar (ensayo AB-4%-CS) donde se
alcanzaron valores de 75.90% y 9.11% ± 0.02% para el rendimiento de complejación y la
eficiencia de complejación, respectivamente. Por otra parte, cuando se utiliza una menor
cantidad de agua en la formación de los complejos preparados por este método CS (ensayo
AB-8%-CS), tanto el rendimiento del complejo (72.50%), el porcentaje de ibuprofeno en el
mismo (0.23% ± 0.01%) y la eficiencia de complejación (6.89% ± 0.02%) disminuyen
ligeramente en comparación con el complejo formado empleando una mayor cantidad de
agua (ensayo AB-4%-CS). Este comportamiento es consistente con lo hallado por Conde-
Petit et al. (2006) quienes indican que a menor cantidad de agua se requiere una mayor
temperatura para lograr la plastificación de la amilosa, es decir, la lixiviación completa de
la amilosa y un aumento en la flexibilidad de las cadenas en solución, necesaria para
garantizar la formación de los complejos.
De otro lado, resulta interesante que al emplear el método de acidificación de una solución
alcalina, la disminución de la cantidad de agua favorece la complejación del ibuprofeno con
los almidones. No obstante, cuando se utiliza el método de calentamiento - sellado la
64 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
disminución de la cantidad de agua, aunque podría favorecer el efecto hidrofóbico,
posiblemente influencia en mayor grado la gelatinización del almidón y la conformación de
las cadenas poliméricas en solución; por tal razón, el porcentaje de complejación del
ibuprofeno y la eficiencia de complejación disminuyen.
Independientemente del método, ASA o CS, los mayores porcentajes de ibuprofeno
complejado se obtuvieron utilizando como hospedador el almidón de maíz. Teniendo en
cuenta que el almidón de maíz presentó un menor porcentaje de amilosa aparente (16.30 ±
2.24%) en comparación con el almidón de bambú (18.30 ± 1.20%), lo que no puede
considerarse significativo, la mayor capacidad del almidón de maíz para complejar el activo
podría atribuirse a las características estructurales de sus componentes. Al respecto, Conde-
Petit et al. (2006), Gelders et al. (2004) y Godet et al. (1995) indican que la capacidad de
unión de una molécula huésped por la fracción lineal del almidón depende de la longitud de
la cadena de amilosa, siendo mayor a medida que la longitud de la cadena aumenta.
En términos generales, el método de calentamiento sellado parece ser la metodología que
permite mejores resultados empleando el almidón de bambú. En contraste, trabajando con
almidón de maíz, la técnica de acidificación de una solución alcalina resulta más
prometedora. A partir de los resultados obtenidos no es posible explicar este
comportamiento; la susceptibilidad por parte del almidón de bambú a un proceso de
degradación química acelerado por temperatura podría tener alguna influencia, dado que
durante el proceso de gelificación en condiciones básicas se observó un color amarillo como
posible indicador físico de dicho proceso.
Por lo que refiere a las ventajas y desventajas del método de acidificación de una solución
alcalina se destaca la posibilidad de no requerir temperaturas por encima de los 90 °C para
garantizar la formación de los complejos, como resultado de la utilización de una menor
cantidad de agua, como fue evidente en las cantidades empleadas en esta investigación (300
mL y 200 mL), por el contrario, el empleo de una base fuerte como el hidróxido de potasio
podría generar una degradación de las cadenas poliméricas de amilosa y amilopectina
repercutiendo en la capacidad de complejación de las mismas. Por otra parte, mediante el
método de calentamiento - sellado se requieren temperaturas por encima de los 90 °C cuando
Resultados y discusión 65
se emplean pequeñas cantidades de agua, esto para evitar que la plastificación de las cadenas
poliméricas se vea posiblemente afectada, asimismo, el aumento excesivo de la cantidad de
agua para favorecer dicho proceso, debido al incremento de la calidad termodinámica del
agua podría dificultar la formación y precipitación de los complejos de inclusión molecular.
De acuerdo con lo anterior y como un aporte en la búsqueda de una mejor estrategia para
preparar los complejos almidón - activo, en la presente investigación se propuso un método
basado en rotaevaporación. Como se discutió previamente en el mecanismo de formación
de los complejos, quizás la evaporación controlada del agua podría impulsar el efecto
hidrofóbico de la molécula huésped generando una mayor complejación del almidón y el
huésped. Los resultados obtenidos muestran que se logró un porcentaje de complejación de
ibuprofeno de 0.19% ± 0.01% y comparada con la metodología ASA utilizando almidón de
bambú fue superior en todos los casos (entre 0.04 y 0.06%). Por otro lado, en contraste con
el método CS, el rendimiento del complejo, el porcentaje de ibuprofeno en el complejo y la
eficiencia de complejación no permitieron ninguna ventaja de interés. Estos datos sugieren
la necesidad de investigar a fondo la influencia de la velocidad de evaporación del solvente
con el objetivo de evidenciar la posibilidad de obtener porcentajes mayores de ibuprofeno
en los complejos.
4.2.2 Caracterización de los complejos por SEM, DSC, FTIR, XRD
Como se observa en la Figura 4-9, los complejos obtenidos corresponden a estructuras
supramoleculares organizadas que difieren en su forma y tipo según la metodología y las
condiciones de preparación. Así, se observan estructuras ligeramente esféricas posiblemente
como consecuencia de la generación de esferulitas a nivel interno, que sugieren la
reorganización de las cadenas poliméricas de almidón en arquitecturas similares a las de los
gránulos de almidón nativo (Fanta et al., 2002) especialmente, en los complejos formados
mediante el método CS y RE (ensayos AB-4%-CS, AB-4%-CSPG, AM-8%-CS, AB-5%-
RE). Igualmente, se identifica la presencia de una cavidad central acorde con lo reportado
por otros investigadores (Nordmark y Ziegler, 2002; Lay Ma et al., 2011a).
Respecto a los complejos AB-1%-ASA, AM-1%-ASA, AM-1%-ASA*, AB-1.5%-ASA,
AM-1.5%-ASA, A-0.6%-ASA y AB-8%-CS se observan estructuras granulares compactas
66 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
y rígidas con formas poligonales. Observaciones similares fueron reportadas por
Marinopoulou et al. (2019) y Pereva et al. (2016) que trabajaron con complejos empleando
ibuprofeno como activo y amilosa y β-ciclodextrinas como agentes hospedantes. De igual
manera, estas estructuras han sido reportadas empleando como molécula huésped el ácido
ferúlico (Van Hung et al., 2013) y en presencia de lípidos (Fanta et al., 2002).
Figura 4-9. Micrografías SEM correspondientes a los complejos de inclusión molecular. Almidón de bambú
(AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA);
método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).
AB-1%-ASA AB-1%-ASA
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x SE 10.5 mm Universidad Nacional de Colombia
HV Mag Sig WD 10.0µm
30.0 kV 10000x SE 10.3 mm Universidad Nacional de Colombia
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x SE 10.3 mm Universidad Nacional de Colombia
AM-1%-ASA
HV Mag Sig WD 10.0µm
30.0 kV 10000x SE 10.2 mm Universidad Nacional de Colombia
AM-1%-ASA
AM-1%-ASA*
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x --- 9.7 mm Universidad Nacional de Colombia
AM-1%-ASA*
HV Mag Sig WD 10.0µm
30.0 kV 10000x SE 9.2 mm Universidad Nacional de Colombia
Resultados y discusión 67
Figura 4-9. Micrografías SEM correspondientes a los complejos de inclusión molecular (continuación).
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución
alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación
(RE)
AB-1.5%-ASA
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x SE 9.5 mm Universidad Nacional de Colombia
AB-1.5%-ASA
HV Mag Sig WD 10.0µm
30.0 kV 10000x SE 9.4 mm Universidad Nacional de Colombia
AM-1.5%-ASA
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x SE 10.0 mm Universidad Nacional de Colombia
AM-1.5%-ASA
HV Mag Sig WD 10.0µm
30.0 kV 10000x SE 10.1 mm Universidad Nacional de Colombia
A-0.6%-ASA A-0.6%-ASA
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x SE 10.3 mm Universidad Nacional de Colombia
HV Mag Sig WD 10.0µm
30.0 kV 10000x SE 10.3 mm Universidad Nacional de Colombia
AB-4%-CS
HV Mag Sig WD 10.0µm
30.0 kV 10000x BSE 9.8 mm Universidad Nacional de Colombia
AB-4%-CS
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x --- 9.9 mm Universidad Nacional de Colombia
68 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Figura 4-9. Micrografías SEM correspondientes a los complejos de inclusión molecular (continuación).
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución
alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación
(RE).
AB-4%-CSPG
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x --- 10.6 mm Universidad Nacional de Colombia
AB-4%-CSPG
HV Mag Sig WD 20.0µm
30.0 kV 4000x --- 10.6 mm Universidad Nacional de Colombia
AB-8%-CS
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x --- 9.3 mm Universidad Nacional de Colombia
AB-8%-CS
HV Mag Sig WD 10.0µm
30.0 kV 10000x BSE 9.1 mm Universidad Nacional de Colombia
AM-8%-CS
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x --- 9.7 mm Universidad Nacional de Colombia
AM-8%-CS
HV Mag Sig WD 10.0µm
30.0 kV 10000x --- 9.4 mm Universidad Nacional de Colombia
AB-5%-RE
HV Mag Sig WD 300.0µm
30.0 kV 500x --- 10.2 mm Universidad Nacional de Colombia
AB-5%-RE
HV Mag Sig WD 10.0µm
30.0 kV 10000x SE 10.4 mm Universidad Nacional de Colombia
Resultados y discusión 69
Las diferencias en las estructuras supramoleculares de los complejos se atribuyen a las
diferentes condiciones de reacción empleadas, tales como la cantidad de agua y el tiempo
de reorganización de las cadenas poliméricas. Adicionalmente, es importante tener en cuenta
que la velocidad de enfriamiento y la temperatura de cristalización podrían influenciar la
estructura del sólido obtenido (Cai y Shi, 2013). Igualmente, otras variables que podrían
tener alguna influencia incluyen la naturaleza del solvente, el grado de ramificación y la
concentración del almidón (Lourdin et al., 2015), la agitación durante el enfriamiento y el
pH de la dispersión (Bhosale y Ziegler, 2010).
Como lo reportan Ma et al. (2011), las estructuras supramoleculares de los complejos pueden
ser formadas bien por la cristalización inducida de complejos de inclusión molecular o por
el enfriamiento rápido de una dispersión de almidón calentada por encima de los 170 °C, el
cual no requiere la presencia de un agente complejante. De acuerdo con esto, y dado que
ninguno de los procedimientos de preparación de los complejos trabajados en esta
investigación requiere temperaturas superiores a 170 °C, es probable que las estructuras
supramoleculares obtenidas sean consecuencia de la formación de los complejos de
inclusión molecular.
El comportamiento térmico de los complejos, los controles y las correspondientes mezclas
físicas se presentan en la Figura 4-10. El ibuprofeno exhibe una señal en 71.7 °C
correspondiente al punto de fusión, con una entalpía de 110.86 J/g, resultados que son
consistentes con lo reportado en la literatura (Maxwell y Chickos, 2012). Los controles de
almidón de bambú y de maíz (CTAB, CTAM) muestran una señal endotérmica amplia en
96.20 °C y 92.30 °C, respectivamente, que estaría relacionada con la temperatura de
disociación de los complejos formados entre los componentes estructurales del almidón y
los lípidos endógenos. Por su parte, Kugimiya et al. (1980) en sus observaciones mediante
DSC acerca del comportamiento térmico de los complejos almidón - lípidos endógenos,
reportan un evento térmico en 93 °C y 99 °C para almidones de maíz y de trigo,
respectivamente, después de ser sometidos a gelatinización, lo que es atribuido a los
complejos de inclusión molecular. De otro lado, las entalpías de los eventos térmicos
exhibidos por los almidones de bambú y de maíz (Tabla 4-5) fueron relativamente bajas
sugiriendo la baja presencia de estructuras tipo V-amilosa.
70 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Figura 4-10. Termogramas correspondientes a los complejos de inclusión molecular, los controles y las
mezclas físicas de dichos materiales. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A);
método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método
calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF).
Las mezclas físicas de los almidones con el activo (MFAB, MFAM) exhiben una señal
adicional correspondiente a la temperatura de fusión del ibuprofeno. Para las mezclas con el
almidón de bambú dicha señal ocurre a 69.33 °C y para muestras almidón de maíz - activo
a 69.44 °C. Esta señal no fue detectada para los complejos almidón - activo, lo que sugiere
que no hay interacción netamente física entre los almidones y el ibuprofeno. Los complejos
preparados con los almidones y el ibuprofeno en el método ASA donde se emplea un tiempo
de 3 h en la etapa de gelatinización del almidón, exhiben dos eventos térmicos a temperaturas
entre 86.80 °C y 121.80 °C (Tabla 4-5). Este comportamiento podría estar relacionado con
la formación simultánea de dos tipos de estructuras cristalinas con seis y siete unidades de
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
IBU
CTAB
CTAM
IBU
IBU
MFAB
MFAM
AB-1%-ASA
AM-1%-ASA
AM-1%-ASA*
AB-1.5%-ASA
AM-1.5%-ASA
A-0.6%-ASA
Flu
jo d
e ca
lor
exo
térm
ico
AB-4%-CS
AB-4%-CSPG
AB-8%-CS
AM-8%-CS
Temperatura (°C)
AB-5%-RE
Resultados y discusión 71
glucosa por turno en la hélice (Kugimiya et al., 1980) o la ubicación del ibuprofeno intra e
interhelicoidal.
Igualmente, teniendo en cuenta que la molécula huésped juega un papel importante en el
diámetro interno de la hélice (Takeo et al., 1973) y que la asociación cooperativa positiva
entre las moléculas favorece la formación del complejo de inclusión, debido a que la unión
de un ligando aumenta la afinidad de unión de un segundo ligando (Conde-Petit et al., 2006),
no se descarta que los lípidos presentes en los almidones den lugar a estructuras helicoidales
mediante asociaciones lípido - lípido o lípido - ibuprofeno, dado que estos dos eventos
térmicos no fueron evidentes en el complejo donde se empleó un estándar de amilosa (A-
0.6%-ASA).
Tabla 4-5. Temperaturas y entalpías de disociación de los complejos de inclusión, de los controles y de las
mezclas físicas de dichos controles.
Endoterma (°C) ΔH (J g-1)
Muestra 1 2 1 2
IBU 71.70 110.86
CTAB 96.20 0.95
CTAM 92.30 0.86
MFAB 69.33 97.33
MFAM 69.44 92.70
AB-1%-ASA 99.70 113.70 1.73 1.22
AM-1%-ASA 96.20 121.80 1.65 2.14
AM-1%-ASA* ND ND
AB-1.5%-ASA 86.80 98.50 1.53 1.85
AM-1.5%-ASA 91.50 114.80 3.60 1.36
A-0.6%-ASA 118.30 3.42
AB-4%-CS 82.20 1.80
AB-4%-CSPG 81.00 1.52
AB-8%-CS 78.60 1.95
AM-8%-CS 92.70 2.92
AB-5%-RE 81.00
1.67
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa
(A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método
calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por
rotaevaporación (RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla
física (MF); entalpía de disociación (ΔH).
72 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
De otro lado, los análisis realizados por DSC confirman que el tiempo de gelificación es un
factor determinante para la formación de los complejos. Así, para el ensayo AM-1%-ASA*,
donde solo se permitieron 30 min de hinchamiento, no se observó ningún evento entálpico
debido posiblemente al bajo porcentaje de ibuprofeno complejado (Tabla 4-4) y al tiempo
de reacción, el que aunque es suficiente para garantizar la ruptura de la estructura interna de
los gránulos de almidón, no permite una eficiente complejación.
Respecto a los complejos formados mediante los métodos de calentamiento - sellado y
calentamiento sellado por rotaevaporación; los termogramas obtenidos evidencian un solo
evento térmico, lo que sugiere un cierto grado de homogeneidad en las estructuras cristalinas
que podría estar asociado a los procesos de precipitación que implican la formación de la
hélice, la nucleación y el crecimiento cristalino (Eliasson, 1988). Es importante destacar que
los complejos formados utilizando almidón de bambú presentan temperaturas de disociación
bajas (entre 78.60 °C y 82.20 °C) en comparación con el complejo formado empleando
almidón de maíz (AM-8%-CS), el que presentó una temperatura de disociación de 92.70 °C.
Quizás las diferencias en las características estructurales de los almidones, tales como las
longitudes de las cadenas de amilosa y amilopectina podría tener alguna influencia. Los
resultados obtenidos en esta investigación para los complejos preparados por los métodos
de acidificación de una solución alcalina y calentamiento - sellado, en especial lo
correspondiente a las bajas entalpías de disociación, se encuentran en línea con lo
previamente reportado en la literatura (Nuessli et al., 1997; Heinemann et al., 2001; Le Bail
et al., 2005; Marinopoulou et al., 2016b; Seo et al., 2016; Dries et al., 2017).
Por otra parte, los espectros FTIR de los controles, las mezclas físicas y los complejos de
inclusión se muestran en la Figura 4-11. El ibuprofeno exhibe una banda de absorción
característica en ~1711 cm-1 que se asigna a la vibración de estiramiento C=O y dos bandas
a ~778.9 cm-1 y ~667.7 cm-1 propias de la vibración de deformación de los enlaces C-H del
anillo aromático. Los controles correspondientes a los almidones de bambú y de maíz
(CTAB y CTAM) presentan tres bandas características en ~1150 cm-1, ~1078 cm-1 y ~998
cm-1 atribuidas a la vibración de estiramiento del anillo de anhídrido glucosa C-O, C-O-H y
C-O-C, respectivamente.
Resultados y discusión 73
Figura 4-11. Espectros FTIR correspondientes a los complejos de inclusión molecular, los controles y las
mezclas físicas de dichos controles. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A);
método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método
calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF).
En las mezclas físicas del activo con los almidones (MFAB y MFAM) se observan unas
bandas características del ibuprofeno en la región entre 1980 cm-1 y 1300 cm-1. No se detecta
claramente la banda característica del enlace C=O del ibuprofeno en ~1711 cm-1, debido
posiblemente a la cantidad de ibuprofeno en la mezcla y al número de osciladores presentes
en el almidón. Así, el espectro estaría dominado por las bandas vibracionales de las cadenas
poliméricas donde la banda amplia de los almidones alrededor de los 1655 cm-1 podría tener
influencia. Por otra parte, se observa una banda muy pronunciada en ~668 cm-1
correspondiente a la vibración de deformación de los enlaces C-H del anillo aromático del
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
IBU
CTAB
CTAM
MFAB
MFAM
AB-1%-ASA
AM-1%-ASA
AM-1%-ASA*
AB-1.5%-ASA
AM-1.5%-ASA
A-0.6%-ASA
AB-4%-CS
AB-4%-CSPG
AB-8%-CS
AM-8%-CS
Inte
nsi
dad
AB-5%-RE
Longitud de onda (cm-1
)
74 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
ibuprofeno. Respecto a los complejos, se evidencian las mismas bandas presentes en las
mezclas físicas, lo que confirma la presencia de ibuprofeno y es esperado dado que las
interacciones entre el huésped y el hospedador no son de tipo covalente. En este sentido, el
espectro infrarrojo del complejo de inclusión molecular no debería diferir apreciablemente
del espectro correspondiente a la mezcla física, tal como ha sido reportado por Braga et al.
(2003) al investigar el comportamiento de los complejos de inclusión molecular empleando
β-ciclodextrina e ibuprofeno.
De otro lado, como se muestra en la Figura 4-12, los análisis por XRD evidencian el patrón
cristalográfico altamente cristalino característico del ibuprofeno con picos en 2θ; 24.6°,
22.3°, 20.1°, 19.4°, 17.5°, 16.6°, 12.2° y un pico a 6.1° atribuido a la mezcla racémica (Byrn
et al., 1997). Los controles correspondientes a los almidones de bambú (CTAB) y de maíz
(CTAM) exhiben un patrón semicristalino con tres picos anchos en 2θ de 20.78°, 11.76°,
6.67° y 20.08°, 11.99°, 6.67°, respectivamente. Por su parte, la mezcla física entre los
controles y el ibuprofeno, en una concentración de 0.05%, muestra los picos característicos
del ibuprofeno en 2θ; 22.3°, 20.1°, 17.5°, 16.6°, 12.2° y 6.1°, con una intensidad
relativamente baja. Estos picos no son observados en los difractogramas obtenidos a partir
de los complejos, lo que sugiere que el patrón semicristalino observado para estas muestras
corresponde a los complejos almidón - activo formados. Aunque es posible que exista una
fracción de activo no complejado, ésta ocurre en un bajo porcentaje que no alcanza a ser
detectado por la resolución del equipo.
Los picos de los controles, al igual que los de los complejos almidón - ibuprofeno, son
anchos debido probablemente a la poca periodicidad de los átomos en los cristales o al
tamaño del cristal. Dado que la trayectoria del haz de rayos X dispersados por los primeros
dos planos de átomos difiere muy poco en el desfasamiento que se puede tolerar, el plano
de átomos que dispersa el haz de rayos X exactamente en desfase con respecto a los primeros
planos estaría ubicado en el interior del cristal. Cuando el cristal es tan pequeño, que este
plano de átomos no existe, no se cancelarán completamente todos los rayos X dispersos y
de esta manera, el haz sufrirá una pequeña divergencia angular debido al tamaño del cristal
en ángulos cercanos pero no iguales al ángulo perfecto de Bragg, haciendo que el pico no
sea agudo (Cullity y Stock, 2014).
Resultados y discusión 75
Figura 4-12. Difractogramas de rayos X correspondientes a los complejos de inclusión molecular, los
controles y las mezclas físicas. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método
acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento -
sellado por rotaevaporación (RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF).
Este comportamiento es evidente en la simulación computarizada mediante el software PDF-
4 desarrollado por Rodríguez-García et al. (2018) para evaluar la influencia del tamaño del
cristal de amilosa (20 nm - 2 nm) a partir de la forma de los picos de difracción de rayos X.
Los resultados evidencian picos de difracción amplios a medida que el tamaño del cristal
5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 40
IBU
Intensidad
AB
AM
CTAB
CTAM
MFAB
MFAM
AB-1%-ASA
AM-1%-ASA
AM-1%-ASA*
AB-1.5%-ASA
AM-1.5%-ASA
A-0.6%-ASA
AB-4%-CS
AB-4%-CSPG
AB-8%-CS
AM-8%-CS
AB-5%-RE
2 (°)
2 (°)
76 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
disminuye de 10 nm a 2 nm, y picos altamente definidos a media que el tamaño del cristal
aumenta desde 10 nm a 20 nm.
Teniendo en cuenta que en el metodo CS empleado para la obtención de los complejos se
induce su precipitación por enfriamiento, el tamaño de los cristales está fuertemente
influenciado por la velocidad y la temperatura de dicha etapa de enfriamiento. Al respecto
Marinopoulou et al. (2019) indican que cuanto mayor es la diferencia entre la temperatura
utilizada en la disolución del almidón y la posterior adición del activo respecto a la
temperatura a la que se enfrió el sistema, la formación de los cristales ocurre de forma más
rápida y menor es su tamaño.
Los patrones cristalográficos de los controles se catalogaron como tipo V6II (Zobel, 1988;
Putseys et al., 2010) y pueden ser indexados usando una celda ortorrómbica con dimensiones
a = 2.74 nm, b = 2.65 nm y c = 0.8 nm (Tabla 4-6) como ha sido reportado por Helbert y
Chanzy (1994). Esta estructura tipo V6II se caracteriza por presentar una hélice con seis
unidades de glucosa por turno, donde el ligando podría estar ubicado dentro y entre las
hélices; su espacio intersticial entre las hélices es mayor que el de la estructura Vh-amilosa.
Debido a que los almidones no fueron sometidos a desengrasado con el objetivo de dar uso
al almidón nativo sin ningún tratamiento previo, estas estructuras se pueden atribuir a la
presencia de lípidos en los almidones, los que al ser tratados con agua como plastificante,
forman complejos amilosa - lípido (Conde-Petit et al., 2006, Marinopoulou et al., 2019).
Como se ha mencionado, estos lípidos podrían favorecer la complejación de la molécula
huésped de interés; sin embargo, esto depende también de las características estructurales
de dicha molécula (Carbinatto et al., 2016).
De otro lado, los complejos AB-1%-ASA, AM-1%-ASA, AB-4%-CSPG y AB-5%-RE
exhiben tres picos característicos de los complejos de inclusión molecular tipo V6III (Tabla
4-6), indexados en una celda ortorrómbica con dimensiones a = 2.826 nm, b = 2.93 nm y c
= 0.801 nm, caracterizada por presentar seis unidades de glucosa por turno con el huésped
ubicado entre y dentro de las hélices y un mayor espacio intersticial que la estructura V6II,
debido posiblemente a las características estructurales del ibuprofeno. Esta estructura ha
Resultados y discusión 77
sido previamente reportada por Buléon et al. (1990) investigando los complejos de amilosa
con isopropanol y acetona.
Tabla 4-6. Indexación del d-espaciado observado en los respectivos complejos con ibuprofeno en las celdas
unitarias reportadas en la literatura.
Muestra 2θ Obs d Obs d Cal Δd h l k Estructura
CTAB
6.666 13.250 13.250a 0.000 0 2 0
V6II 11.762 7.518 7.520a 0.002 3 2 0
20.767 4.274 4.279a 0.005 5 2 1
CTAM
6.666 13.250 13.250a 0.000 0 2 0
V6II 11.991 7.375 7.376a 0.001 1 1 1
20.079 4.419 4.418a 0.001 0 5 1
AB-1%-ASA
6.953 12.703 12.727b 0.024 2 1 0
V6III 12.080 7.320 7.325b 0.005 0 4 0
20.694 4.289 4.293b 0.004 4 4 1
AM-1%-ASA
6.952 12.706 12.727b 0.021 2 1 0
V6III 12.074 7.324 7.325b 0.001 0 4 0
19.848 4.470 4.475b 0.005 5 4 0
AM-1%-ASA*
7.422 11.901 11.850c 0.051 0 2 0
12.955 6.828 6.825c 0.003 2 0 0 V6I
19.861 4.467 4.468c 0.001 3 1 0
AB-1.5%-ASA
6.901 12.799 12.798d 0.002 1 2 0
V7 11.788 7.501 7.500d 0.001 4 0 0
19.752 4.491 4.499d 0.008 2 6 0
AM-1.5%-ASA
6.901 12.799 12.798d 0.001 1 2 0
V7 11.789 7.501 7.500d 0.001 4 0 0
19.720 4.498 4.499d 0.001 2 6 0
A-0.6%-ASA
8.584 10.293 10.293d 0.000 2 2 0
V7 17.036 5.181 5.162d 0.019 1 4 1
22.728 3.909 3.909d 0.000 4 5 1
23.881 3.723 3.723d 0.000 7 1 1
AB-4%-CS
6.901 12.799 12.798d 0.001 1 2 0
V7
12.891 6.862 6.862d 0.000 3 3 0
18.002 4.926 4.924d 0.002 6 1 0
20.083 4.418 4.418d 0.000 6 3 0
21.566 4.117 4.117d 0.000 5 5 0
22.510 3.946 3.947d 0.001 5 4 1
AB-4%-CSPG
6.939 12.728 12.727b 0.001 2 1 0
V6III 12.583 7.029 7.028b 0.001 0 2 1
19.650 4.514 4.510b 0.004 4 5 0
AB-8%-CS
6.901 12.799 12.798d 0.001 1 2 0
V7 12.125 7.292 7.294d 0.002 1 1 1
22.246 3.993 3.993d 0.000 4 6 0
AM-8%-CS
6.901 12.800 12.798d 0.002 1 2 0
V7 12.464 7.096 7.075d 0.021 0 4 0
20.084 4.418 4.418d 0.000 6 3 0
22.474 3.953 3.947d 0.006 5 4 1
AB-5%-RE
8.720 10.133 10.170b 0.038 2 2 0
V6III 17.021 5.205 5.214b 0.009 4 1 1
22.257 3.991 3.999b 0.008 2 6 1 a d-espaciado calculado usando una celda unitaria reportada por Helbert and Chanzy (1994); b Buléon
et al. (1990); c Rappenecker and Zugenmaier (1981); d Yamashita et al. (1973). Observado (d Obs);
78 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
calculado (d Cal); diferencia del d-espaciado observado y el calculado (Δd); índices de Miller (h l k);
almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una
solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por
rotaevaporación (RE); control (CT); ibuprofeno (IBU); mezcla física (MF).
Cuando el tiempo de reacción en la formación de los complejos disminuye de 3 h a 0.5 h,
como en el caso del complejo AM-1%-ASA*, la indexación de los picos observados en 2θ;
19.86°, 12.95° y 7.42° (Tabla 4-6) usando una celda ortorrómbica con dimensiones a =
1.365 nm, b = 2.37 nm y c = 0.805 nm, podría corresponder a una estructura del tipo Vh -
amilosa o V6I. Considerando las características estructurales del ibuprofeno, esto explicaría
la baja presencia de moléculas de activo complejadas. Aunque en estas muestras se pierde
el patrón cristalográfico tipo A de los almidones nativos (Figura 4-12), los picos obtenidos
son escasamente resueltos. Probablemente, el tiempo de reacción es suficiente para
garantizar la ruptura de la estructura interna de los gránulos, pero no adecuado para lograr
la completa conformación de bobina extendida en la amilosa y amilopectina, que es
necesaria para que ocurra la complejación huésped - hospedador.
Por otra parte, en los difractogramas correspondientes a los complejos AB-1.5%-ASA, AM-
1.5%-ASA, A-0.6%-ASA, AB-4%-CS, AB-8%-CS, AM-8%-CS, se observan picos
característicos de una estructura V7 que pueden ser indexados en una celda ortorrómbica con
dimensiones a = 3.0 nm, b = 2.83 nm y c = 0.78 nm (Yamashita et al., 1973). La
conformación helicoidal en estas estructuras corresponde a siete unidades de anhidro
glucosa por turno con un diámetro interno de 0.63 nm, la que ha sido reportada para
alcoholes de cadena ramificada tales como el isopropílico, el isobutílico, el sec-butílico y el
tert-butílico (Takeo y Kuge, 1969; Yamashita et al., 1973; Nishiyama et al., 2010), para el
ácido propiónico (Takeo et al., 1973) y para cetonas alifáticas incluyendo acetona,
metiletilcetona, dietilcetona, acetonilacetona y metil-n-butilcetona (Takeo y Kuge, 1971).
El diámetro externo de la hélice en presencia de ligandos voluminosos, o en su defecto con
un anillo aromático como parte de su estructura, es de aproximadamente 1.47 nm con siete
u ocho unidades de glucosa por turno (Putseys et al., 2010), como fue evidente en algunas
estructuras obtenidas con el ibuprofeno como molécula huésped. En los casos en los que no
se logró este tipo de estructura, probablemente las diferencias procedimentales y las
condiciones empleadas según el método de preparación tuvieron alguna influencia, lo que
Resultados y discusión 79
se plantea como hipótesis dado que la literatura al respecto es escasa. En adición, la
presencia de los dos tipos de ligandos (ibuprofeno y lípidos) y los diferentes componentes
estructurales del almidón (amilosa y amilopectina) podrían jugar un papel importante en las
estructuras obtenidas. No obstante, la respuesta a dichos interrogantes se sale del alcance de
esta investigación.
En síntesis, teniendo en cuenta los resultados de caracterización de las diferentes
macroestructuras obtenidas en el presente trabajo, en particular, mediante el método
acidificación de una solución alcalina, se obtienen complejos de estructuras granulares con
formas poliédricas que se caracterizan por presentar dos eventos entálpicos. Por otro lado,
no es evidente una tendencia clara respecto a las estructuras cristalográficas obtenidas
mediante la indexación de los picos de difracción de rayos X. Mediante los métodos CS y
RE se obtienen en su mayoría macroestructuras ligeramente esféricas que, a diferencia de
las obtenidas mediante el método ASA, presentan una única señal endotérmica indicando
posiblemente la homogeneidad de dichas estructuras.
4.2.3 Liberación del activo
Teniendo en cuenta el interés de aprovechar los complejos almidón - activo como sistemas
de liberación de fármacos, los diferentes complejos obtenidos en esta investigación se
caracterizaron respecto a su comportamiento de liberación. Así, como se observa en la
Figura 4-13, en términos generales los complejos bajo estudio lograron porcentajes máximos
de liberación entre el 4.2% ± 0.5% y el 8.9% ± 0.8% al cabo de 360 min en condiciones
gástricas simuladas (Anexo E). Posiblemente, a estas condiciones de pH las estructuras
helicoidales impiden el acceso del medio de disolución a la cavidad interna como
consecuencia de una estructura más compacta.
Por su parte, también trabajando con un medio de liberación de pH 1.2, el complejo AM-
1%-ASA* presenta una liberación de ibuprofeno mayor al 13% al cabo de 90 min de iniciado
el estudio. Como se ha discutido previamente, quizás el ibuprofeno no se incluyó
completamente en la cavidad interna de la hélice dado que el tiempo de reacción en la etapa
de formación del complejo no fue suficiente (30 min). En adición, el tipo de estructura
80 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
cristalográfica (Vh) probable para este complejo no posee las dimensiones requeridas para
alojar dentro de la hélice a la molécula de ibuprofeno.
Al comparar los perfiles de liberación del activo a partir de los complejos obtenidos en esta
investigación, los factores de similitud se encuentran entre 50 y 100, indicando que no
existen diferencias en los comportamientos bajo estas condiciones (Anexo E). No obstante,
los valores de f2 correspondientes al complejo AM-1%-ASA* tienen los valores
marcadamente más bajos, entre 55 y 65, respecto al rango entre 73 y 99 en el que se ubican
los valores f2 para las demás comparaciones.
Figura 4-13. Perfiles de liberación de ibuprofeno a partir de los diferentes complejos investigados en
condiciones gástricas simuladas pH 1.2. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa
(A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método
calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).
En cuanto al mecanismo de liberación, la mayoría de los complejos se ajustaron
adecuadamente al modelo cinético de liberación propuesto por Higuchi (Tabla 4-7),
sugiriendo una liberación dirigida por procesos difusivos. Los complejos obtenidos en los
ensayos AM-1%-ASA*, AB-4%-CSPG, AB-8%-CS y AB-5%-RE presentaron un mejor
ajuste al modelo propuesto por Weibull, con un valor para el coeficiente b entre 0.406 y
0.636. En este modelo, valores del coeficiente b inferiores a 0.75 estarían relacionados con
la difusión Fickiana y valores entre 0.75 y 1 indican que la liberación ocurre tanto por
0 50 100 150 200 250 300 350 4000
2
4
6
8
10
12
14
16
Can
tid
ad l
iber
ada
acu
mu
lad
a (%
)
Tiempo (min)
AB-1%-ASA
AM-1%-ASA
AM-1%-ASA*
AB-1.5%-ASA
AM-1.5%-ASA
A-0.6%-ASA
AB-4%-CS
AB-4%-CSPG
AB-8%-CS
AM-8%-CS
AB-5%-RE
Resultados y discusión 81
difusión Fickiana como por transporte caso II (Carbinatto et al., 2014). A pesar de la
diferencia en el ajuste de los modelos para los diferentes complejos, los resultados en todos
los casos sugieren que el transporte está regido por la ley de Fick.
Tabla 4-7. Ajuste a los diferentes modelos cinéticos de los perfiles de liberación de los diferentes complejos
investigados en condiciones gástricas simuladas pH 1.2.
Modelo cinético de liberación
Complejo Orden cero Primer orden Higuchi r2 K0 r2 K1 r2 KH
AB-1%-ASA 0.665 0.029 0.688 0.000 0.990 0.471
AM-1%-ASA 0.480 0.031 0.514 0.000 0.957 0.525
AM-1%-ASA* 0.020 0.055 0.066 0.001 0.800 0.963
AB-1.5%-ASA 0.678 0.020 0.694 0.000 0.966 0.325
AM-1.5%-ASA 0.628 0.018 0.644 0.000 0.992 0.289
A-0.6%-ASA 0.727 0.028 0.749 0.000 0.988 0.460
AB-4%-CS 0.663 0.018 0.676 0.000 0.973 0.288
AB-4%-CSPG 0.815 0.013 0.823 0.000 0.988 0.212
AB-8%-CS 0.468 0.024 0.494 0.000 0.965 0.406
AM-8%-CS 0.579 0.015 0.594 0.000 0.986 0.253
AB-5%-RE 0.501 0.015 0.516 0.000 0.961 0.248
Korsmeyer - Peppas Weibull Hixson - Crowell
r2 nKP KKP r2 b r2 Ks
AB-1%-ASA 0.987 0.515 0.443 0.988 0.526 0.681 0.000
AM-1%-ASA 0.945 0.516 0.501 0.950 0.528 0.503 0.000
AM-1%-ASA* 0.902 0.387 1.784 0.908 0.406 0.039 0.000
AB-1.5%-ASA 0.854 0.618 0.142 0.859 0.727 0.689 0.000
AM-1.5%-ASA 0.990 0.474 0.320 0.988 0.526 0.639 0.000
A-0.6%-ASA 0.983 0.550 0.341 0.977 0.613 0.742 0.000
AB-4%-CS 0.971 0.518 0.266 0.971 0.525 0.672 0.000
AB-4%-CSPG 0.989 0.630 0.110 0.990 0.636 0.821 0.000
AB-8%-CS 0.967 0.487 0.447 0.969 0.496 0.486 0.000
AM-8%-CS 0.985 0.499 0.260 0.985 0.505 0.589 0.000
AB-5%-RE 0.970 0.466 0.302 0.971 0.471 0.511 0.000
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación
de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento
- sellado por rotaevaporación (RE).
De otro lado, los complejos investigados en condiciones simuladas del intestino a pH 6.8
(Figura 4-14) se caracterizan por una cantidad máxima de liberación entre 49.93% ± 2.54%
y 57.20 ± 0.5% al cabo de 6 h. Al igual que lo obtenido en condiciones gástricas simuladas,
el complejo AM-1%-ASA* presentó un mayor porcentaje de liberación del activo (>50%)
al cabo de 90 min de iniciado el estudio. Como se discutió previamente este comportamiento
puede ser atribuido a las condiciones de proceso y a la ubicación del ibuprofeno dentro de
la estructura cristalina donde no es incluido completamente en el interior de las hélices de
82 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
amilosa. De hecho, este complejo se caracteriza por los menores valores de carga de activo
y eficiencia de complejación de todas las opciones investigadas.
Figura 4-14. Perfiles de liberación de ibuprofeno a partir de los diferentes complejos investigados en
condiciones simuladas del intestino pH 6.8. Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa
(A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método
calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).
En la Tabla 4-8 se presentan los resultados del ajuste de los datos a los respectivos modelos
cinéticos de liberación. En general los complejos AB-1%-ASA, AM-1%-ASA, AB.1.5%-
ASA, AM-1.5%-ASA, A-0.6%-ASA, AB-4%-CSPG y AB-5%-RE presentan un ajuste
adecuado al modelo propuesto por Weibull con valores para el coeficiente b inferiores a
0.75, lo que sugiere que la liberación en estas muestras estuvo regida por un mecanismo de
difusión Fickiana. Por su parte, los complejos AB-4%-CS, AB-8%-CS y AM-8%-CS tienen
un mejor ajuste al modelo de Higuchi indicando de igual manera que los procesos difusivos
gobiernan el mecanismo de liberación. El complejo AM-1%-ASA* se ajustó mejor al
modelo de Korsmeyer - Peppas con un valor de 0.582 para el exponente n, que
correspondería a un transporte anómalo donde la liberación se da por procesos difusivos y
de hinchamiento.
De otro lado, según el factor de similitud el complejo AM-1%-ASA* difiere en el
comportamiento de liberación del activo respecto a los demás complejos, con valores de f2
0 50 100 150 200 250 300 350 4000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Can
tid
ad l
iber
ada
acu
mu
lad
a (%
)
Tiempo (min)
AB-1%-ASA
AM-1%-ASA
AM-1%-ASA*
AB-1.5%-ASA
AM-1.5%-ASA
A-0.6%-ASA
AB-4%-CS
AB-4%-CSPG
AB-8%-CS
AM-8%-CS
AB-5%-RE
Resultados y discusión 83
inferiores a 50 (Anexo E). Asimismo, el complejo AB-1%-ASA presenta diferencias en el
comportamiento de liberación respecto al complejo AM-8%-CS con un valor de f2 de 49. El
complejo AM-8%-CS se caracteriza por presentar una estructura tipo V7 donde el porcentaje
de liberación máximo fue menor en contraste con la estructura tipo V6III del complejo AB-
1%-ASA, es decir, la estructura V7 podría favorecer la ubicación del ibuprofeno dentro de
la hélice confiriendo posiblemente una mayor interacción entre el huésped y hospedador.
Tabla 4-8. Ajuste a los diferentes modelos cinéticos de los perfiles de liberación de los diferentes complejos
investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8.
Modelo cinético de liberación
Complejo Orden cero Primer orden Higuchi r2 K0 r2 K1 r2 KH
AB-1%-ASA 0.086 0.210 0.448 0.004 0.787 3.660
AM-1%-ASA 0.123 0.212 0.589 0.005 0.840 3.661
AM-1%-ASA* 0.372 0.277 0.898 0.007 0.931 4.658
AB-1.5%-ASA 0.036 0.192 0.451 0.004 0.798 3.327
AM-1.5%-ASA 0.463 0.197 0.738 0.004 0.914 3.292
A-0.6%-ASA 0.325 0.201 0.678 0.004 0.889 3.413
AB-4%-CS 0.501 0.208 0.780 0.004 0.893 3.467
AB-4%-CSPG 0.279 0.199 0.623 0.004 0.891 3.377
AB-8%-CS 0.291 0.205 0.654 0.004 0.832 3.489
AM-8%-CS 0.669 0.187 0.835 0.003 0.956 3.042
AB-5%-RE 0.021 0.192 0.415 0.004 0.776 3.341
Korsmeyer - Peppas Weibull Hixson - Crowell
r2 nKP KKP r2 b r2 Ks
AB-1%-ASA 0.901 0.387 6.835 0.941 0.482 0.266 0.001
AM-1%-ASA 0.887 0.421 5.885 0.918 0.588 0.432 0.001
AM-1%-ASA* 0.992 0.582 3.813 0.988 0.724 0.816 0.002
AB-1.5%-ASA 0.857 0.414 5.586 0.884 0.563 0.277 0.001
AM-1.5%-ASA 0.821 0.622 1.867 0.915 0.733 0.633 0.001
A-0.6%-ASA 0.871 0.516 3.296 0.928 0.623 0.537 0.001
AB-4%-CS 0.731 0.706 1.279 0.879 0.832 0.672 0.001
AB-4%-CSPG 0.911 0.458 4.360 0.925 0.625 0.475 0.001
AB-8%-CS 0.727 0.632 1.682 0.780 0.837 0.521 0.001
AM-8%-CS 0.848 0.717 1.050 0.940 0.827 0.790 0.001
AB-5%-RE 0.853 0.384 6.628 0.888 0.527 0.236 0.001
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación
de una solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento
- sellado por rotaevaporación (RE).
El aumento en la cantidad máxima liberada de ibuprofeno para todos los complejos a pH 6.8
en comparación con la obtenida en condiciones gástricas simuladas pH 1.2, podría atribuirse
a la sinergia entre el pH del medio y la temperatura empleada. Como lo indican Hayashi y
84 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Miyake (1981) a partir de sus trabajos con amilosa en solución neutra a temperaturas entre
35 °C y 60 °C, el aumento de la temperatura podría favorecer la formación de puentes de
hidrógeno entre el agua y las cadenas poliméricas de amilosa acelerando el proceso de
hinchamiento de la estructura del complejo, que se espera sea mayor a pH basico. De igual
manera, el incremento en la liberación podría deberse a un porcentaje de ibuprofeno ubicado
en regiones amorfas de la estructura del complejo, es decir, dentro de cadenas poliméricas
no agrupadas en empaquetamientos cristalinos que bajo estas condiciones facilitan su salida
hacia el medio de liberación.
Cuando se evalúa el comportamiento de liberación a pH 6.8 en presencia de pancreatina
(Figura 4-15), los porcentajes de activo liberado al cabo de 360 min (entre 81.7% ± 4.1% y
97.2% ± 0.6%) aumentan entre un 19% y un 44% en comparación con la liberación en
ausencia de la misma (Figura 4-14 y Anexo E), siendo evidente la influencia de la actividad
enzimática de la amilasa. Como se observa en la Tabla 4-9, los comportamientos de
liberación obtenidos para los diferentes complejos se ajustaron al modelo de primer orden,
es decir, el porcentaje de liberación es directamente proporcional a la concentración del
activo incorporado en la estructura del almidón. Esto podría estar relacionado con la
degradación enzimática en masa que ocasiona un aumento en la cantidad del activo liberado
como consecuencia de la escisión de los enlaces α(1→4) en cualquier punto de las cadenas
poliméricas. Resultados similares fueron reportados por Carbinatto et al. (2016) estudiando
los complejos entre el almidón de maíz con alto contenido de amilosa (Hylon® VII) y dos
moléculas farmacológicamente activas (praziquantel y nimesulida), en presencia de ácido
palmítico. De otro lado, es importante aclarar que los datos correspondientes al
comportamiento de liberación en condiciones simuladas del intestino a pH 6.8 en presencia
de pancreatina no fueron ajustados a los modelos propuestos por Korsmeyer - Peppas y
Weibull debido a que estos modelos se aplican principalmente cuando se tienen porcentajes
de liberación menores al 60% (Costa y Sousa, 2001; Lao et al., 2011; Carbinatto et al.,
2014).
Respecto a la comparación de los comportamientos de liberación de activo a partir de los
complejos investigados a pH 6.8 en presencia de pancreatina, según los factores de similitud,
el complejo AM-1%-ASA* presenta diferencias en el perfil de liberación con valores de f2
Resultados y discusión 85
inferiores a 50 respecto a los complejos AB-1.5%-ASA, A-0.6%-ASA y AM-8%-CS, los
que se caracterizan por presentar una estructura tipo V7 reiterando nuevamente la estabilidad
de dicha estructura, en este caso posiblemente expresada en términos de resistencia a la
degradación enzimática, con lo cual el porcentaje de activo liberado fue menor que para el
complejo AM-1%-ASA*.
Figura 4-15. Perfiles de liberación de ibuprofeno a partir de los diferentes complejos investigados en
condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en presencia de pancreatina. Almidón de bambú (AB); almidón de
maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento
- sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).
Finalmente, los comportamientos de liberación del ibuprofeno a partir de los diferentes
complejos empleando condiciones simuladas del intestino a pH 7.2 en presencia de
pancreatina, al igual que para el medio de pH 6.8/pancreatina, se ajustan a una cinética de
primer orden (Tabla 4-10), con una cantidad máxima de activo liberado entre el 83.8% ±
3.2% y el 99.0% ± 1.8 % (Figura 4-16). Al parecer, el aumento del pH del medio no
influencia en gran medida la liberación comparado con lo obtenido en condiciones
simuladas del estómago pH 6.8 en presencia de pancreatina (Figura 4-15), dado que este
cambio leve del pH podría no alterar en gran medida la actividad enzimática de la α-amilasa
y el hinchamiento de la estructura del complejo.
0 50 100 150 200 250 300 350 4000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
AB-1%-ASA
AM-1%-ASA
AM-1%-ASA*
AB-1.5%-ASA
AM-1.5%-ASA
A-0.6%-ASA
AB-4%-CS
AB-4%-CSPG
AB-8%-CS
AM-8%-CS
AB-5%-RE
Can
tid
ad l
iber
ada
acu
mu
lad
a (%
)
Tiempo (min)
86 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Por otra parte, el complejo AM-1%-ASA* presenta diferencias en el perfil de liberación
respecto a los obtenidos para los complejos AB-1.5%-ASA, A-0.6%-ASA y AM-8%-CS,
comportamiento que es similar al observado en condiciones simuladas del intestino a pH 6.8
en presencia de pancreatina. Además, el complejo AB-1%-ASA presenta diferencias en el
comportamiento de liberación respecto al complejo AM-8%-CS; este último complejo se
caracteriza por presentar una estructura tipo V7 donde la tasa de liberación fue menor en
contraste con la estructura tipo V6III del complejo AB-1%-ASA. Probablemente, la
estructura V7 presenta cierto grado de resistencia a la degradación enzimática en contraste
con las estructuras V6III atribuida al complejo AB-1%-ASA.
Tabla 4-9. Ajuste a los diferentes modelos cinéticos de los perfiles de liberación de los diferentes complejos
investigados en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en presencia de pancreatina.
Modelo cinético de liberación
Complejo Orden cero Primer orden Higuchi Hixson - Crowell r2 K0 r2 K1 r2 KH r2 KHC
AB-1%-ASA 0.033 0.346 0.974 0.016 0.829 5.986 0.849 0.003
AM-1%-ASA 0.091 0.340 0.881 0.012 0.806 5.909 0.760 0.003
AM-1%-ASA* 0.134 0.360 0.942 0.024 0.781 6.278 0.800 0.003
AB-1.5%-ASA 0.333 0.321 0.970 0.012 0.895 5.440 0.939 0.003
AM-1.5%-ASA 0.007 0.341 0.949 0.019 0.811 5.928 0.821 0.003
A-0.6%-ASA 0.332 0.326 0.976 0.012 0.906 5.518 0.946 0.004
AB-4%-CS 0.144 0.339 0.966 0.016 0.871 5.812 0.925 0.004
AB-4%-CSPG 0.024 0.350 0.974 0.017 0.835 6.060 0.856 0.003
AB-8%-CS 0.148 0.342 0.973 0.016 0.864 5.871 0.935 0.004
AM-8%-CS 0.125 0.306 0.879 0.009 0.863 5.260 0.783 0.002
AB-5%-RE 0.009 0.351 0.961 0.018 0.822 6.086 0.828 0.003
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una
solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por
rotaevaporación (RE).
De acuerdo con todo lo anterior, a través de caracterizaciones por SEM, DSC, FTIR y XRD
se corrobora la formación de los complejos por las diferentes metodologías ensayadas y sus
comportamientos de liberación indican que las condiciones del medio (pH y presencia de
enzima) son determinantes para facilitar el hinchamiento del complejo y la escisión de las
cadenas poliméricas modulando la entrega del fármaco. Al parecer, de las propiedades
investigadas a los complejos, la estructura cristalina y la facilidad para plastificar las cadenas
poliméricas o por la cantidad de activo complejado, son la que influencian en mayor grado
la entrega del activo al medio de liberación. Igualmente, si el activo se logra incorporar
Resultados y discusión 87
completamente en la hélice de amilosa o amilopectina, así como la fuerza de interacción
huésped - hospedador podrían facilitar o no la liberación de la molécula complejada. Esto,
a la vez que evidencia la necesidad de trabajos de investigación adicionales para entender la
estructura de los complejos y optimizar el proceso de incorporación de activos en ellos,
plantea expectativas interesantes respecto a su posible aplicación en el transporte de
moléculas activas, especialmente cuando se pretende una liberación en el tracto
gastrointestinal a nivel de intestino.
Figura 4-16. Perfiles de liberación de ibuprofeno a partir de los diferentes complejos investigados en
condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en presencia de pancreatina. Almidón de bambú (AB); almidón de
maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una solución alcalina (ASA); método calentamiento
- sellado (CS); método calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE).
Tabla 4-10. Ajuste a los diferentes modelos cinéticos de los perfiles de liberación de los diferentes complejos
investigados en condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en presencia de pancreatina.
Modelo cinético de liberación
Complejo Orden cero Primer orden Higuchi Hixson - Crowell r2 K0 r2 K1 r2 KH r2 KHC
AB-1%-ASA 0.053 0.353 0.960 0.022 0.793 6.159 0.832 0.003
AM-1%-ASA 0.106 0.350 0.955 0.021 0.788 6.119 0.803 0.003
AM-1%-ASA* 0.089 0.376 0.965 0.021 0.793 6.539 0.869 0.004
AB-1.5%-ASA 0.374 0.323 0.976 0.010 0.899 5.461 0.950 0.003
AM-1.5%-ASA 0.026 0.337 0.944 0.019 0.817 5.849 0.821 0.003
A-0.6%-ASA 0.086 0.353 0.983 0.018 0.835 6.100 0.922 0.004
AB-4%-CS 0.198 0.346 0.986 0.015 0.879 5.926 0.937 0.004
AB-4%-CSPG 0.104 0.343 0.971 0.016 0.858 5.908 0.923 0.004
0 50 100 150 200 250 300 350 4000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Can
tid
ad l
iber
ada
acu
mu
lad
a (%
)
Tiempo (min)
AB-1%-ASA
AM-1%-ASA
AM-1%-ASA*
AB-1.5%-ASA
AM-1.5%-ASA
A-0.6%-ASA
AB-4%-CS
AB-4%-CSPG
AB-8%-CS
AM-8%-CS
AB-5%-RE
88 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
AB-8%-CS 0.102 0.341 0.971 0.016 0.855 5.873 0.867 0.003
AM-8%-CS 0.021 0.323 0.867 0.010 0.801 5.625 0.762 0.003
AB-5%-RE 0.053 0.328 0.863 0.010 0.790 5.716 0.753 0.003
Almidón de bambú (AB); almidón de maíz (AM); amilosa de papa (A); método acidificación de una
solución alcalina (ASA); método calentamiento - sellado (CS); método calentamiento - sellado por
rotaevaporación (RE).
5 Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
El trabajo de investigación desarrollado en la presente tesis ofrece un aporte en la generación
de valor agregado a los recursos naturales disponibles en Colombia, en este caso, las fuentes
nativas no convencionales de almidón y su posibilidad de ser empleadas en el desarrollo de
sistemas transportadores de activos. De acuerdo con los resultados obtenidos, el bambú
(Rhipidocladum cf. harmonicum (Parodi) Mcclure) podría ser una fuente alternativa
importante de almidón teniendo en cuenta el porcentaje de extracción (22.9% ± 1.0%), su
hábito de crecimiento (36 m en 6 meses) y su alta producción de biomasa por unidad de
área, que ha sido poco aprovechada en nuestro medio.
De otro lado, los complejos de inclusión molecular entre los almidones de bambú y de maíz,
y el ibuprofeno como molécula activa, fueron preparados exitosamente empleando tres
metodologías diferentes; acidificación de una solución alcalina (ASA), calentamiento -
sellado (CS) y calentamiento - sellado por rotaevaporación (RE), demostrando la posibilidad
de emplear almidones nativos con este propósito. Se obtuvieron los porcentajes más altos
de ibuprofeno complejado empleando almidón de maíz y el método ASA; por el contrario,
al utilizar almidón de bambú, la metodología CS presentó mejores resultados. La
disminución de la cantidad de agua empleada durante la preparación de los complejos
favorece el porcentaje de molécula activa incorporada mediante el método ASA; sin
embargo, esta variable no es determinante cuando se trabaja con el método CS. Por otra
parte, mediante el método RE, propuesto en esta investigación, cuando se empleó almidón
de bambú se lograron porcentajes de incorporación de ibuprofeno superiores a los obtenidos
con el método ASA pero menores que con la técnica CS. No obstante, podría resultar
prometedor debido a que facilita un mayor control del proceso, formando los precipitados
almidón - activo en menor tiempo con estructuras cristalinas mas definidas. Asimismo, se
90 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
destaca la posibilidad de emplear una mayor cantidad de agua para favorecer la
plastificación de las cadenas poliméricas.
Los análisis de los diferentes complejos mediante DSC, FTIR y XRD y liberación de activo
evidenciaron la interacción entre el ibuprofeno y los respectivos almidones generando
diferentes tipos de estructuras cristalinas de las cuales, al parecer, la estructura V7 presenta
una mayor estabilidad en contraste con las estructuras V6I y V6III. Todos los complejos
presentaron poca liberación de fármaco bajo condiciones gástricas simuladas pH 1.2, donde
la liberación se rige principalmente por un transporte de difusión Fickiana. De otro lado, con
el aumento del pH se evidencia un aumento en la cantidad de activo liberado, asimismo, los
complejos fueron sensibles a la degradación enzimática por parte de la pancreatina
permitiendo un aumento en la cantidad máxima liberada del ibuprofeno siguiendo una
cinética especialmente de primer orden. Por consiguiente, este tipo de sistemas de
encapsulación podrían ser potencialmente interesantes para la entrega dirigida de moléculas
activas al intestino.
5.2 Recomendaciones
Esta investigación corresponde a una primera aproximación respecto al empleo de
almidones nativos como sistemas transportadores de moléculas activas. Los resultados de
complejación de ibuprofeno y los comportamientos de liberación obtenidos resultan
prometedores, por lo que es importante que a partir de ellos se optimicen las condiciones de
trabajo con el propósito de obtener porcentajes mucho más elevados de complejación de la
molécula huésped, por ejemplo, aumentando la cantidad inicial de ligando, lo que
adicionalmente podría favorecer la complejación con la amilopectina tal como lo sugieren
Conde-Petit et al. (2006). Por otra parte, como lo demuestra Arijaje y Wang (2016)
sometiendo los almidones a un proceso de desramificación empleando isoamilasa y β-
amilasa, se pueden generar cadenas de amilosa y amilopectina con una mayor capacidad de
complejación. Igualmente, se hace necesario evidenciar la influencia positiva o negativa de
los lípidos presentes en los almidones, debido a que muchos de estos pueden estar asociados
a complejos tipo V-amilosa endógenos deben implementarse procesos de desengrasado que
permitan disponer de una calidad adecuada. Es necesario profundizar en el entendimiento
Recomendaciones 91
del proceso de formación de los complejos y de sus características estructurales empleando
técnicas instrumentales que complementen las ya empleadas en este trabajo, tales como la
resonancia magnética nuclear en estado sólido (NMR) (Morrison et al., 1993; Kawada y
Marchessault, 2004; Le Bail et al., 2005; Tozuka et al., 2006; Zabar et al., 2009, 2010;
Gidley, 2014; Zhu, 2017c; Feng et al., 2018), la microscopía electrónica de transmisión
(TEM) (Buléon et al., 1990; Cardoso et al., 2007; Nishiyama et al., 2010; Nuessli et al.,
2003; Putaux et al., 2008), la espectroscopía Raman (Cael et al., 1975; Yang et al., 2013;
Marinopoulou et al., 2019), la microscopía de fuerza atómica (Tian et al., 2010; Yang et al.,
2013; Zabar et al., 2010), la distribución de las cadenas ramificadas de amilopectina (Ao y
Jane, 2007; Zhang y Hamaker, 2012; Felisberto et al., 2018) y el peso molecular de las
cadenas poliméricas (Yoo y Jane, 2002; Chen y Bergman, 2007; Harding et al., 2016). Esto
ampliará las posibilidades de trabajo con otras moléculas activas, facilitará la optimización
de los métodos de complejación y se podrá lograr una alternativa de bajo costo para el diseño
de sistemas de liberación de moléculas activas basada en almidones nativos, considerando
la poca disponibilidad comercial de amilosa y de almidones con un elevado contenido de
amilosa. De otro lado, durante la extracción del almidón a partir de bambú, fue evidente el
elevado contenido de fibra que posee esta planta. Sobre esta base, podrían desarrollarse
investigaciones que aprovechen este subproducto y que generen valor agregado a esta planta.
A. Anexo: Determinación del contenido de
amilosa aparente
• Determinación de la cantidad de yodo y longitud de máxima
absorbancia
Como se observa en la Figura A-1, a partir de 80 µL de la solución de yodo/yoduro de
potasio no se evidencia un cambio en el valor de la absorbancia, la longitud de onda de
absorbancia máxima es de 620 nm y fue la seleccionada para realizar la lectura de las
muestras.
Figura A-1. Espectros de absorción obtenidos en la determinación de la cantidad de yodo necesaria para la
cuantificación de amilosa.
• Curva de calibración
La curva de calibración preparada para la determinación del contenido de amilosa aparente
presentó un coeficiente de determinación (R2) de 0.9988 (Figura A-2). Es importante resaltar
300 400 500 600 700 800 9000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Ab
sorb
anci
a
Longitud de onda (nm)
40 L I2/KI
60 L I2/KI
80 L I2/KI
100 L I2/KI
94 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
que el nivel 1 de la curva de calibración que contiene una proporción del estándar de
amilopectina del 100%, presenta una absorbancia de 0.144 (Figura A-3). Esto estaría
relacionado con el complejo de amilopectina - yodo, debido posiblemente a las longitudes
de las cadenas ramificadas de la misma.
Figura A-2. Curva de calibración para la determinación del contenido aparente de amilosa.
Figura A-3. Espectros de absorción correspondientes a la curva de calibración en la determinación del
contenido aparente de amilosa.
0 20 40 60 80 1000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Amilosa (%)
Ab
sorb
anci
a Ecuación y = 0.0091x - 0.13
R 0.9994
R^2 0.9988
Valor Error estándar
Intercepto 0.13 0.0042
Pendiente 0.0091 7.564E-05
300 400 500 600 700 800 900
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Ab
sorb
anci
a
Longitud de onda (nm)
0%
10%
25%
50%
75%
100%
B. Anexo: Observaciones de impurezas por
microscopía óptica y SEM
Micrografías de los sólidos insolubles en la determinación de fibra, después de someter el
almidón a una digestión básica donde se observa la fibra remanente del proceso de
extracción (A). Su presencia se confirma por los pequeños orificios observados en las
micrografías tomadas al parénquima celular (Figura 3-5). De otro lado, la micrografía óptica
normal con una magnificación de 100x confirma la presencia de pequeñas partículas de
fibras (B).
Figura B-1. Micrografía SEM de los sólidos insolubles presentes en el almidón (A); micrografía óptica del
almidón con una magnificación de 100x (B).
A B
C. Anexo: Distribución del tamaño de
partícula
Figura C-1. Comportamiento de los datos y los ajustes en la determinación del tamaño de partícula.
Tabla C-1. Residuales de la curva de datos, ajuste e índices de refracción y absorción utilizados en la
determinación del tamaño de partícula.
Índice de refracción de la partícula 1.52
Índice de absorción de la partícula 0.18
Índice de refracción del dispersante 1.33
Residual 0.34%
Residual ponderado 0.66%
Concentración teórica 0.004%
Concentración real 0.0043%
5 10 15 20 25 30 35 40 450
5
10
15
20
25
30
35
En
erg
ía d
e la
lu
z
Número de detector
Datos
Ajuste
D. Anexo: Validación de la metodología
analítica por HPLC
D.1 Condiciones cromatográficas de partida
Se realizaron análisis preliminares para ajustar las condiciones cromatográficas
(Cromatógrafo Agilent 1260 Infinity Quaternary LC) partiendo de las recomendaciones de
la Farmacopea de los Estados Unidos (The United States Pharmacopeia, 2019). Se
seleccionó como longitud de onda de lectura 220 nm según el espectro de absorción obtenido
(Figura D-1) y se trabajó con un volumen de inyección de 100 µL con el objetivo de obtener
una respuesta significativa que permitiera cuantificar pequeñas cantidades de analito. De
igual manera, en los ensayos preliminares se empleó una columna cromatográfica marca
Luna® C18(2) con longitud y diámetro interno de 150 x 4.6 mm y tamaño de partícula de 5
µm. Los análisis se llevaron a cabo en condiciones isocráticas a una temperatura de 30 °C,
la fase móvil consistió en una mezcla de agua (pH 2.5 empleando ácido ortofosfórico) y
acetonitrilo (1:1) a un flujo de 1.5 mL/min.
D.2 Preparación de las muestras
• Preparación del estándar de ibuprofeno
Para desarrollar la validación de la metodología analítica se preparó una solución madre de
ibuprofeno (SMI) a una concentración de 200 µg/mL:
SMI =10 mg Ibuprofeno
50 mL (agua pH 2.5 - acetonitrilo (1:1)) =
0.2 mg
mL =
200 μg
mL
100 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Figura D-1. Espectro de absorción del ibuprofeno obtenido mediante HPLC.
• Preparación de las muestras correspondientes a los complejos de
inclusión
Las muestras se sometieron a una degradación enzimática como se describe en la
Sección 4.1.2.1.
• Idoneidad del sistema
Previo al desarrollo de la validación de la metodología analítica, se evaluó la idoneidad del
sistema. Con este propósito se inyectó una muestra del estándar de ibuprofeno a una
concentración de 5 µg/mL, leída seis veces para determinar los siguientes parámetros
cromatográficos: tiempo de retención, factor de capacidad, resolución, factor de asimetría y
factor de selectividad.
D.3 Validación de la metodología analítica
La validación del método se realizó tomando como referencia los lineamientos establecidos
por la Conferencia Internacional de Armonizacion ICH (2005). Teniendo en cuenta que se
trata de un método que se empleará para cuantificar el activo, los parámetros evaluados
incluyeron: especificidad, linealidad y rango, exactitud, repetibilidad, precisión intermedia,
límite de cuantificación y límite de detección.
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
0
20
40
60
80
100
Inte
nsi
dad
(m
AU
)
Longitud de onda (nm)
D. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC 101
• Especificidad
Con el fin de determinar la especificidad del sistema se analizaron los componentes de la
fase móvil, de la matriz de almidón de bambú y de maíz después de ser sometidos a un
tratamiento de degradación enzimática (Sección 4.1.2.1), y de estas últimas enriquecidas
con el analito. Como criterios de aceptación se tuvieron en cuenta el tiempo de retención
(Tr) y la pureza del pico dado por el software del equipo (Agilent ChemStation 3.2).
• Linealidad
La evaluación de la linealidad del sistema se llevó a cabo mediante la preparación de una
curva de calibración en el rango entre 0.05 ppm y 20 ppm utilizando soluciones
correspondientes a ocho niveles de concentración del estándar de ibuprofeno (Tabla D-1),
que fueron preparadas por triplicado a partir de la SMI, y cada una leída por triplicado para
un total de 72 mediciones. Como criterios de aceptación se tuvieron en cuenta el coeficiente
de determinación (R2) después del ajuste de los datos mediante un modelo lineal, que debe
cumplir con el valor de aceptación R2 > 0.998, el análisis de varianza (ANOVA) para
comprobar estadísticamente la relación lineal entre las dos variables con un intervalo de
confianza del 95% y pruebas de hipótesis estadísticas t de Student de dos colas para el
intercepto y la pendiente, con un intervalo de confianza del 95%.
Tabla D-1. Niveles de concentración seleccionados para evaluar la linealidad del sistema en la validación de
la metodología analítica mediante HPLC.
Nivel 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentración (µg/mL) 0.05 0.08 0.1 0.5 1 3 10 20
• Precisión
La precisión del sistema se determinó mediante la evaluación de la repetibilidad utilizando
tres niveles de concentración (0.05, 5 y 20 µg/mL). Se realizaron tres réplicas para cada
medición. La precisión intermedia se determinó con tres niveles de concentración (0.05, 5 y
20 µg/mL) utilizando el mismo equipo. De igual manera, se realizaron tres réplicas para
102 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
cada medición. Las lecturas se llevaron a cabo intra-día e inter-día, cada nivel por triplicado.
Como criterio de aceptación se tuvo en cuenta el coeficiente de variación promedio
ponderado obtenido mediante la prueba C de Cochran con un valor de aceptación de %RSD
≤ 2%.
• Exactitud
La exactitud del sistema se determinó utilizando la matriz de bambú enriquecida con una
solución del estándar de ibuprofeno en tres niveles de concentración (0.05, 5 y 20 µg/mL).
Como criterio de aceptación se consideraron el porcentaje de recuperación (%R) con valores
de aceptación entre el 90% - 110% y una prueba de hipótesis estadística t de Student de dos
colas, con un intervalo de confianza del 95%, para verificar si existían diferencias
significativas entre el porcentaje medio de recuperación experimental y el 100%
(Quattrocchi et al., 1992). El valor de t calculado se determinó mediante la Ecuación D-1.
tcal = (% R ̅- 100) √n
CV (D-1)
Dónde: %R̅ es el porcentaje de recuperación medio; CV el coeficiente de variación y n el
número de medidas.
• Límites de detección y cuantificación
Los límites de detección (LD) y de cuantificación (LC) del sistema se estimaron a partir de
los datos obtenidos en la curva de calibración realizada en la evaluación de la linealidad
(Quattrocchi et al., 1992), utilizando las Ecuaciones D-2 y D-3, respectivamente.
LD = a + 3Sa
b *√ n (D-2)
LC = a + 10Sa
b *√ n (D-3)
Dónde: Sa es el error estándar del intercepto; a el intercepto; b la pendiente y n el número
de medidas.
D. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC 103
D.4 Resultados y discusión
La Figura D-2 muestra el cromatograma obtenido para el ibuprofeno con las condiciones de
trabajo mencionadas previamente. El tiempo de retención del analito fue de 6.06 min ± 0.10
min (Tabla D-2) el que corresponde al tiempo transcurrido desde la inyección del soluto
hasta la elución del mismo obteniendo una máxima señal de respuesta (Quattrocchi et al.,
1992).
Figura D-2. Cromatograma correspondiente al estándar de ibuprofeno (5 µg/mL) obtenido mediante HPLC.
Como se observa en la Tabla D-2, el factor de capacidad, que está relacionado con la
distribución del analito en ambas fases, cumple con los valores de aceptación dado que su
valor se encuentra en el rango de 2 a 10, que es el recomendado para mezclas de pocos
componentes (Quattrocchi et al., 1992). La eficiencia y el poder de separación de una
columna se mide en función de sus platos teóricos de acuerdo con el modelo propuesto por
Martin y Singer en 1941 (Quattrocchi et al., 1992) y que explica el equilibrio del analito
entre la fase móvil y la fase estacionaria en el proceso de separación. Aunque no existe un
consenso universal sobre un valor definido que indique las cualidades de una columna
debido a los múltiples factores que influyen en la misma, se espera que a mayor número de
platos teóricos, su eficiencia y poder de separación aumenten. Según los resultados
obtenidos en los diferentes parámetros (Tabla D-2), los que estuvieron dentro de los valores
de aceptación, se considera que el sistema cromatográfico es idóneo para llevar a cabo la
0 1 2 3 4 5 6 7
0
10
20
30
40
50
60
70
Inte
nsi
dad
(m
AU
)
Tiempo (min)Ib
up
rofe
no
104 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
validación de la metodología analítica y la posterior cuantificación del ibuprofeno presente
en los complejos.
Tabla D-2. Datos de idoneidad del sistema obtenidos mediante HPLC.
Parámetros Abreviatura Ecuación
Valor
experimental
Valor de
aceptación
Tiempo de retención (min) tR 6.06 ± 0.10
Tiempo muerto (min) tM 0.59 ± 0.20
Número de platos teóricos N N = 16 * (tR
W𝑏)
2
24055 ± 993
Altura de plato teórico (µm) H H = L
N 6.00
Factor de capacidad k' k
'=
tR - tM
tM 9.20 ± 0.50 k
' > 2
Factor de asimetría As As =b
a 1.05 As ≤ 2
Para evaluar la selectividad de la metodología analítica se analizó el comportamiento
cromatográfico de: (i) la matriz del almidón de bambú y de maíz sin presencia del analito,
(ii) la fase móvil y (iii) la matriz de almidón de bambú enriquecida con ibuprofeno. Todas
las muestras se sometieron al mismo tratamiento de degradación enzimática con el fin de
evidenciar la influencia de éste en la selectividad del método. Como se observa en la Figura
D-3, ninguno de los componentes de las matrices o de la fase móvil presenta señales de
interferencia y se tiene un tiempo de retención de 6.06 min ± 0.10 min correspondiente al
ibuprofeno.
D. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC 105
Figura D-3. Cromatogramas obtenidos para la evaluación de la selectividad mediante HPLC: matriz de
almidón de bambú enriquecido con ibuprofeno 5 µg/mL (A); matriz de almidón de bambú (B); matriz de
almidón de maíz (C); fase móvil (D).
De otro lado, la matriz de almidón de bambú, que fue seleccionada por su complejidad, no
presenta un efecto de matriz significativo cuando se analizan muestras enriquecidas con un
estándar de ibuprofeno a una concentración de 5 ppm. En adición, la Figura D-4 muestra
que el estándar de ibuprofeno adicionado a la matriz de almidón se encuentra dentro de los
límites de pureza procesados con el software del equipo (Agilent ChemStation) con un factor
de pureza de 999.926 (61 de 61 espectros están dentro del límite del umbral (990)). De
acuerdo con los criterios previamente mencionados, se concluye que el método es selectivo.
Figura D-4. Determinación de la pureza del pico correspondiente al ibuprofeno, datos procesados con el
software Agilent ChemStation con un límite de umbral de 990.
0 1 2 3 4 5 6 7
2 3 4 5 6
D
C
B
Inte
nsi
dad
Tiempo (min)
A
A
A
C
Tiempo (min)
B
106 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
La Figura D-5 muestra los datos ajustados a un modelo de regresión lineal simple para
evidenciar la relación entre la media de la variable dependiente (área) y la variable
independiente (concentración). El valor del coeficiente de determinación (R2) de 0.99968
indica que el 99.97 % de la variación en las áreas de los picos se debe a la concentración de
las muestras analizadas (Ross, 2010).
Figura D-5. Curva de calibración del sistema obtenida mediante HPLC, datos ajustados a un modelo de
regresión lineal simple.
Debido a que el modelo de regresión lineal simple es capaz de explicar la mayor parte de la
variación en los datos de respuesta y cumple con el criterio de aceptación R2 > 0.998, se
concluye que los datos (Tabla D-3) se ajustan adecuadamente al modelo. En adición, los
resultados de las pruebas de hipótesis estadística t de Student de dos colas para el intercepto
y la pendiente, con un intervalo de confianza del 95% (Tabla D-4) rechazan la hipótesis nula
(Ho) indicando que la pendiente es significativamente diferente de cero, es decir, existe una
relación positiva entre las dos variables que no puede ser atribuida al azar.
Respecto al intercepto (α), el tcal fue inferior al ttab, por consiguiente, se acepta la hipótesis
nula indicando que el intercepto, valor en el cual la línea de regresión cruza el eje y, no es
significativamente diferente de cero.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Are
a (m
AU
)
Concentración (g/mL)
Ecuación y = 144.12x - 0.39
R 0.99984
R^2 0.99968
Valor Error estándar
Intercepto -0.39 2.45
Pendiente 144.12 0.31
D. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC 107
Tabla D-3. Datos primarios para la evaluación de la linealidad del sistema en la validación de la metodología
analítica mediante HPLC.
Nivel Concentración (µg/mL) Áreas
1 0.05
8.30 8.72 7.00
8.94 8.33 7.23
10.65 8.48 7.59
2 0.08
17.38 14.78 13.12
17.75 13.96 13.19
17.95 14.21 13.30
3 0.1
16.47 15.77 17.41
16.41 15.92 19.04
16.29 16.28 18.46
4 0.5
77.57 62.31 68.62
76.25 64.01 68.03
76.36 63.31 68.39
5 1
138.16 145.08 139.89
138.08 145.52 139.50
138.16 145.31 139.54
6 3
407.54 425.38 419.87
408.23 424.71 419.72
408.11 425.07 419.33
7 10
1455.88 1464.96 1459.41
1447.76 1464.90 1458.56
1448.28 1465.14 1458.99
8 20
2918.91 2889.70 2823.84
2915.46 2889.15 2819.04
2916.59 2889.05 2818.73
Por su parte, el análisis de varianza (ANOVA) utiliza la varianza de los datos para
determinar si es posible aplicar el modelo de regresión lineal. Como se observa en la Tabla
D-5, el valor del F calculado (Fcal) fue mayor que el F tabulado (Ftab), por consiguiente, se
rechaza la hipótesis nula indicando que la variabilidad en el modelo de regresión lineal no
es significativa y se concluye que el sistema tiene un comportamiento lineal en el rango de
concentración estudiado.
108 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Tabla D-4. Prueba t de Student para el intercepto y la pendiente empleada para la evaluación de la linealidad
del sistema en la validación de la metodología analítica mediante HPLC.
Coeficiente H0 Condición tcal ttab
Pendiente β = 0 tcal > ttab se rechaza la hipótesis nula. 469.23 1.99
Intercepto α = 0 tcal < ttab se acepta la hipótesis nula. -0.16 1.99
Se determinó la precisión evaluando la repetibilidad a tres niveles de concentración (0.05, 5
y 20 µg/mL), estudiados bajo las mismas condiciones de operación en un mismo día (Tabla
D-6)
Tabla D-5. ANOVA para la evaluación del modelo de regresión lineal empleado en la validación de la
metodología analítica mediante HPLC.
GL SC CM H0 Condición Fcal Ftab
Regresión 1 67201700 67201700
La variabilidad
del modelo de
regresión es
estadísticamente
significativa.
Fcal > Ftab
se rechaza
la
hipótesis
nula.
220175.12 3.98
Error 70 21365.34 305.22
Total 71 67223000
SC: suma de los cuadrados, CM: cuadrados medios, GL: grados de libertad.
La desviación estándar y el coeficiente de variación correspondiente a las diferentes
concentraciones indican el grado de dispersión de las tres mediciones respecto a su media,
lo que es un indicativo de precisión de una medida (’t Lam, 2010). Como se presenta en la
Tabla D-7, los porcentajes del coeficiente de variación (CV) para cada una de las
concentraciones investigadas estuvieron por debajo del criterio de aceptación del 2%, por lo
tanto, no se identifican variaciones atípicas en los resultados de las mediciones.
En adición, con el fin de determinar si las variaciones en las medidas con respecto a las
diferentes concentraciones son homogéneas (Tabla D-7), se realizó la prueba unilateral C de
Cochran con una probabilidad del 95%. El valor calculado G (Gcal) fue menor que el valor
crítico tabulado de Cochran (Gtab), por tal motivo se acepta la hipótesis nula indicando que
no hay diferencias significativas en las varianzas, en otras palabras, existe homogeneidad en
D. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC 109
las variaciones. Lo anterior permite concluir que el método cumple con los criterios
establecidos de precisión.
Tabla D-6. Datos primarios para la evaluación de la repetibilidad de la metodología analítica mediante HPLC.
Nivel Concentración (µg/mL) Área
1 0.05
7.38
7.22
7.19
2 5
721.65
728.72
729.51
3 20
2806.42
2814.15
2817.60
La precisión intermedia se evaluó utilizando tres niveles de concentración (0.05, 5 y 20
µg/mL), con dos analistas bajo las mismas condiciones de operación, en tres días diferentes
(Tabla D-8). Se utilizó ANOVA para determinar si las variaciones respecto al analista, a los
días y a las réplicas, eran estadísticamente significativas (Tabla D-9).
Tabla D-7. Evaluación de la repetibilidad y prueba de hipótesis estadística C de Cochran empleados en la
validación de la metodología analítica mediante HPLC.
Concentración
(µg/mL) Promedio S CV H0 Condición Gcal Gtab
0.05 7.26 0.10 1.44 No hay
diferencias
significativas
en las varianzas
Gcal > Gtab se
rechaza la
hipótesis
nula
0.64 0.87 5 721.65 4.33 0.60
20 2812.72 5.72 0.20
El F calculado (Fcal) fue menor que el F tabulado (Ftab) en los análisis de las varianzas
respecto al cambio de analista, réplicas y días, por tal motivo no se rechaza la hipótesis nula
y se interpreta que las variabilidades en los resultados no son estadísticamente significativas.
Con el cumplimiento de los parámetros establecidos previamente para la repetibilidad y la
precisión intermedia se concluye que el método es preciso.
110 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Tabla D-8. Datos primarios para la evaluación de la precisión intermedia de la metodología analítica mediante
HPLC.
Analista 1 Analista 2
Concentración (µg/mL) Concentración (µg/mL)
0.05 5 20 0.05 5 20
Área
Día 1
7.50 721.65 2826.42 7.48 758.71 2839.75
7.22 728.72 2814.15 7.12 771.62 2840.01
7.49 739.51 2817.60 7.09 749.52 2856.86
Día 2
7.71 720.42 2815.21 7.48 724.86 2834.27
7.45 720.99 2814.11 7.35 724.57 2830.49
7.78 721.80 2815.83 7.53 734.18 2833.43
Día 3
7.38 736.70 2831.47 7.73 741.39 2863.99
7.68 737.37 2859.12 7.51 731.82 2865.05
7.49 736.26 2858.51 7.45 741.45 2858.51
La exactitud de la metodología analítica fue evaluada utilizando la matriz de almidón de
bambú enriquecida con una solución estándar de ibuprofeno en tres niveles de concentración
(0.05, 5 y 20 µg/mL), sometidas al mismo tratamiento de degradación enzimática utilizado
para las muestras de los complejos (Sección 4.2.1.1), con el fin de evidenciar que dicho
proceso no tiene incidencia en las mediciones. Como se observa en la Tabla D-10, los
porcentajes de recuperación se encuentran dentro del rango establecido (90% – 110%), lo
que sugiere que el ibuprofeno fue estable durante los tratamientos a los que fue sometido y
que las desviaciones estándar relativas (CV) observadas pueden ser atribuidas a errores
sistemáticos y aleatorios.
Tabla D-9. ANOVA para la evaluación de la precisión intermedia de la metodología analítica mediante HPLC.
Origen de las
variaciones GL SC CM H0 Condición Fcal Ftab
Analistas 1 1490.24 1490.24 Las variabilidades
en los datos no son
estadísticamente
significativas.
Fcal > Ftab se
rechaza la
hipótesis
nula.
9.97E-04 4.04
Días 2 2098.00 1049.00 6.88E-04 3.19
Réplicas 2 64.49 32.25 2.12E-05 3.19
Error 48 7.77E+07 1.62E+06
Total 53 7.78E+07
Suma de los cuadrados (SC); Cuadrados medios (CM); Grados de libertad (GL).
D. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC 111
El valor de t calculado fue inferior al t tabulado, por tal motivo se acepta la hipótesis nula
que establece que no existen diferencias significativas entre el porcentaje de recuperación
medio obtenido y el 100%. Debido a la concordancia entre el valor medido y el valor de
referencia, se concluye que la exactitud es apropiada.
Tabla D-10. Evaluación de la exactitud y prueba t de Student realizadas en la validación de la metodología
analítica mediante HPLC.
CT
(µg/mL) Áreas
CE
(µg/mL) %R H0 Condición tcal ttab
0.05
7.00 0.0513 102.52
No existen
diferencias
significativas
entre el
porcentaje de
recuperación
medio y el 100%
tcal > ttab se
rechaza la
hipótesis
nula
0.43 2.04
7.23 0.0529 105.74
7.19 0.0525 105.10
5
699.33 4.85 97.10
718.05 4.98 99.70
723.24 5.00 100.42
20
2823.84 19.60 97.98
2819.04 19.56 97.82
2818.73 19.56 97.80
Promedio 100.46
CV 3.26
Concentración teórica (CT); concentración experimental (CE); porcentaje de recuperación (%R);
coeficiente de variación (CV).
El límite de detección corresponde a la menor concentración de analito que puede detectarse,
pero no necesariamente cuantificarse. Por otro lado, el límite de cuantificación se refiere a
la menor concentración que puede determinarse con precisión y exactitud (The United States
Pharmacopeia, 2019). Teniendo en cuenta las bajas concentraciones utilizadas en la curva
de calibración, los límites de detección y de cuantificación fueron determinados a partir de
los datos obtenidos en el modelo de regresión lineal.
Tabla D-11. Límite de detección y límite de cuantificación obtenidos con datos de la curva de calibración
correspondiente a la metodología analítica mediante HPLC.
Error estándar
Intercepto -0.39 2.45
Pendiente 144.12
LD (µg/mL) 0.0057
LQ (µg/mL) 0.0197
E. Anexo: Datos de liberación en condiciones
simuladas del tracto gastrointestinal
Tabla E-1. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones gástricas simuladas pH 1.2.
Complejo Cantidad acumulada liberada de ibuprofeno (%)
15 min 30 min 60 min 90 min 180 min 360 min
AB-1%-ASA 1.62 ± 0.27 2.64 ± 0.19 3.98 ± 0.11 4.91 ± 0.29 5.87 ± 0.42 8.94 ± 1.99
AM-1%-ASA 1.80 ± 0.58 2.78 ± 0.10 4.93 ± 2.00 5.72 ± 1.27 7.55 ± 1.11 8.96 ± 0.79
AM-1%-ASA* 4.37 ± 2.13 6.69 ± 0.96 9.31 ± 0.70 13.18 ± 1.97 13.26 ± 0.89 14.70 ± 1.32
AB-1.5%-ASA 0.51 ± 0.12 1.61 ± 0.17 3.01 ± 0.21 3.27 ± 0.28 4.51 ± 0.21 5.96 ± 1.01
AM-1.5%-ASA 1.01 ± 0.03 1.58 ± 0.48 2.45 ± 0.89 2.85 ± 0.43 4.06 ± 0.54 5.24 ± 0.76
A-0.6%-ASA 1.32 ± 0.06 2.07 ± 1.25 3.64 ± 0.63 4.51 ± 0.47 6.60 ± 0.41 8.54 ± 0.15
AB-4%-CS 0.85 ± 0.54 2.14 ± 1.35 2.19 ± 0.75 2.87 ± 0.73 3.53 ± 0.29 5.55 ± 0.26
AB-4%-CSPG 0.55 ± 0.01 0.98 ± 0.23 1.51 ± 0.45 2.03 ± 0.60 2.87 ± 0.10 4.16 ± 0.55
AB-8%-CS 1.48 ± 0.43 2.41 ± 0.39 3.62 ± 0.48 4.45 ± 0.12 5.72 ± 0.25 6.96 ± 0.33
AM-8%-CS 0.95 ± 0.75 1.39 ± 0.55 2.19 ± 0.88 2.57 ± 0.46 3.56 ± 0.46 4.51 ± 0.32
AB-5%-RE 0.87 ± 0.94 1.94 ± 3.01 1.88 ± 0.51 2.67 ± 1.64 3.31 ± 0.64 4.44 ± 0.44
Tabla E-2. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones simuladas del intestino pH 6.8.
Complejo Cantidad acumulada liberada de ibuprofeno (%)
15 min 30 min 60 min 90 min 180 min 360 min
AB-1%-ASA 15.50 ± 1.45 27.49 ± 2.24 39.89 ± 3.36 45.20 ± 1.75 52.31 ± 1.42 54.81 ± 2.47
AM-1%-ASA 11.23 ± 4.99 25.99 ± 2.08 37.80 ± 1.80 45.20 ± 5.89 53.53 ± 0.44 56.16 ± 0.57
AM-1%-ASA* 19.69 ± 1.82 24.67 ± 0.71 41.56 ± 3.34 54.24 ± 1.90 69.02 ± 1.31 76.42 ± 3.03
AB-1.5%-ASA 10.12 ± 1.57 24.52 ± 2.06 34.21 ± 1.84 43.86 ± 1.62 47.95 ± 3.23 49.93 ± 2.54
AM-1.5%-ASA 7.27 ± 0.30 17.86 ± 1.03 28.43 ± 5.04 37.84 ± 2.38 52.10 ± 1.41 53.52 ± 0.73
A-0.6%-ASA 11.59 ± 2.47 17.87 ± 0.28 30.59 ± 1.52 42.29 ± 2.47 52.85 ± 0.38 53.68 ± 0.43
AB-4%-CS 6.45 ± 3.36 13.68 ± 0.25 29.72 ± 2.10 44.85 ± 1.96 52.71 ± 2.30 57.20 ± 1.86
AB-4%-CSPG 9.27 ± 2.58 22.14 ± 2.62 35.02 ± 0.24 40.10 ± 0.08 47.49 ± 0.08 54.60 ± 0.16
AB-8%-CS 4.52 ± 1.13 19.52 ± 0.77 36.72 ± 3.41 44.83 ± 2.24 52.99 ± 0.05 53.71 ± 6.72
AM-8%-CS 5.39 ± 2.21 13.46 ± 2.99 23.55 ± 1.47 33.86 ± 2.26 45.50 ± 2.66 54.14 ± 5.04
AB-5%-RE 12.54 ± 1.62 20.83 ± 0.64 38.38 ± 1.28 42.97 ± 0.34 48.68 ± 2.26 49.28 ± 4.48
114 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Tabla E-3. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en
presencia de pancreatina.
Complejo Cantidad acumulada liberada de ibuprofeno (%)
15 min 30 min 60 min 90 min 180 min 360 min
AB-1%-ASA 27.64 ± 3.81 37.92 ± 0.89 61.77 ± 3.98 75.32 ± 2.82 86.59 ± 1.87 97.19 ± 0.64
AM-1%-ASA 28.17 ± 0.34 49.17 ± 0.38 59.54 ± 0.81 71.06 ± 0.76 82.23 ± 2.85 91.00 ± 5.59
AM-1%-ASA* 29.27 ± 1.78 50.76 ± 1.16 64.30 ± 1.57 80.00 ± 1.67 86.24 ± 0.73 95.34 ± 1.66
AB-1.5%-ASA 15.39 ± 1.45 29.86 ± 0.31 54.60 ± 1.16 64.33 ± 2.60 81.71 ± 0.94 86.75 ± 0.86
AM-1.5%-ASA 23.84 ± 2.01 40.15 ± 0.18 63.08 ± 0.15 75.35 ± 2.01 85.36 ± 1.92 89.39 ± 3.45
A-0.6%-ASA 17.25 ± 0.42 32.68 ± 0.20 51.90 ± 1.29 64.76 ± 6.56 83.53 ± 2.36 88.17 ± 3.91
AB-4%-CS 24.17 ± 1.67 38.05 ± 0.13 58.00 ± 1.51 70.22 ± 0.23 84.14 ± 4.33 90.93 ± 1.13
AB-4%-CSPG 27.99 ± 0.58 40.81 ± 2.51 63.41 ± 1.00 73.47 ± 3.08 87.30 ± 1.76 92.91 ± 0.59
AB-8%-CS 22.94 ± 3.08 38.20 ± 4.41 59.26 ± 3.54 69.89 ± 5.86 87.55 ± 6.52 90.69 ± 5.63
AM-8%-CS 21.29 ± 0.86 35.18 ± 2.72 53.15 ± 2.28 63.34 ± 1.58 76.63 ± 0.26 81.69 ± 4.08
AB-5%-RE 24.84 ± 0.64 48.66 ± 4.04 64.94 ± 3.62 70.92 ± 2.72 86.24 ± 5.22 93.77 ± 2.56
Tabla E-4. Datos del porcentaje de liberación acumulado en condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en
presencia de pancreatina.
Complejo Cantidad acumulada liberada de ibuprofeno (%)
15 min 30 min 60 min 90 min 180 min 360 min
AB-1%-ASA 25.07 ± 5.28 44.98 ± 2.05 65.25 ± 6.00 77.00 ± 0.99 90.43 ± 0.01 91.40 ± 7.95
AM-1%-ASA 29.42 ± 1.87 43.96 ± 3.45 65.10 ± 2.63 75.57 ± 3.63 89.01 ± 1.73 91.03 ± 1.97
AM-1%-ASA* 28.89 ± 5.65 57.90 ± 3.56 61.86 ± 7.01 78.89 ± 3.19 94.74 ± 2.66 99.01 ± 1.82
AB-1.5%-ASA 15.02 ± 2.94 29.04 ± 4.01 49.56 ± 1.40 67.81 ± 1.85 82.72 ± 5.00 87.46 ± 4.38
AM-1.5%-ASA 22.63 ± 4.79 40.19 ± 5.05 62.03 ± 3.50 73.02 ± 2.46 85.33 ± 1.02 88.19 ± 2.07
A-0.6%-ASA 22.31 ± 2.47 40.80 ± 2.38 64.84 ± 4.81 74.07 ± 1.79 90.06 ± 4.03 92.77 ± 3.78
AB-4%-CS 22.10 ± 1.04 37.90 ± 3.48 58.80 ± 6.13 71.14 ± 8.16 87.12 ± 2.72 92.94 ± 7.46
AB-4%-CSPG 24.70 ± 4.94 39.53 ± 1.95 60.16 ± 0.92 71.18 ± 0.85 85.95 ± 1.52 91.50 ± 1.44
AB-8%-CS 23.82 ± 0.39 39.90 ± 3.92 59.78 ± 2.97 70.66 ± 3.20 85.87 ± 4.82 90.66 ± 7.99
AM-8%-CS 21.94 ± 4.29 40.39 ± 0.63 59.61 ± 4.83 70.38 ± 2.99 82.58 ± 2.40 83.84 ± 3.17
AB-5%-RE 22.67 ± 1.17 41.53 ± 3.35 61.81 ± 3.43 72.28 ± 6.83 82.19 ± 7.63 85.32 ± 9.77
E. Anexo: Validación de la metodología analítica por HPLC 115
Tabla E-5. Factor de similitud (f2) correspondiente a los perfiles de liberación obtenidos para los complejos
de inclusión molecular en condiciones gástricas simuladas pH 1.2.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 95 63 87 83 98 83 77 95 80 80
2 65 82 79 94 78 73 90 76 76
3 58 57 62 57 55 61 56 56
4 98 88 97 90 93 95 94
5 85 99 94 90 99 98
6 84 78 96 81 81
7 94 89 98 98
8 82 98 97
9 86 86
10 99
AB-1%-ASA (1); AM-1%-ASA (2); AM-1%-ASA* (3); AB-1.5%-ASA (4); AM-
1.5%-ASA (5); A-0.6%-ASA (6); AB-4%-CS (7); AB-4%-CSPG (8); AB-8%-CS (9);
AM-8%-CS (10); AB-5%-RE (11).
Tabla E-6. Factor de similitud (f2) correspondiente a los perfiles de liberación obtenidos para los complejos
de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 6.8.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 82 48 69 57 63 56 67 63 49 70
2 48 72 62 67 61 71 71 52 70
3 42 42 45 44 43 45 38 43
4 66 70 62 79 70 56 80
5 79 72 71 68 70 64
6 75 73 71 62 70
7 65 70 62 61
8 72 60 75
9 56 69
10 55
AB-1%-ASA (1); AM-1%-ASA (2); AM-1%-ASA* (3); AB-1.5%-ASA (4); AM-
1.5%-ASA (5); A-0.6%-ASA (6); AB-4%-CS (7); AB-4%-CSPG (8); AB-8%-CS (9);
AM-8%-CS (10); AB-5%-RE (11).
116 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Tabla E-7. Factor de similitud (f2) correspondiente a los perfiles de liberación obtenidos para los complejos
de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 6.8 en presencia de pancreatina.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 65 63 55 83 57 76 86 76 55 65
2 67 51 67 54 66 69 64 54 74
3 45 63 47 57 66 57 46 69
4 56 84 63 53 62 69 51
5 58 75 80 76 56 69
6 66 55 65 69 52
7 73 88 62 65
8 74 53 72
9 59 66
10 51
AB-1%-ASA (1); AM-1%-ASA (2); AM-1%-ASA* (3); AB-1.5%-ASA (4); AM-
1.5%-ASA (5); A-0.6%-ASA (6); AB-4%-CS (7); AB-4%-CSPG (8); AB-8%-CS (9);
AM-8%-CS (10); AB-5%-RE (11).
Tabla E-8. Factor de similitud (f2) correspondiente a los perfiles de liberación obtenidos para los complejos
de inclusión molecular en condiciones simuladas del intestino pH 7.2 en presencia de pancreatina.
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 65 71 50 75 52 64 77 67 49 73
2 67 51 67 54 66 69 64 54 74
3 45 63 47 57 66 57 46 69
4 56 84 63 53 62 69 51
5 58 75 80 76 56 69
6 66 55 65 69 52
7 73 88 62 65
8 74 53 72
9 59 66
10 51
AB-1%-ASA (1); AM-1%-ASA (2); AM-1%-ASA* (3); AB-1.5%-ASA (4); AM-
1.5%-ASA (5); A-0.6%-ASA (6); AB-4%-CS (7); AB-4%-CSPG (8); AB-8%-CS (9);
AM-8%-CS (10); AB-5%-RE (11).
6 Bibliografía
’t Lam, R.U.E. (2010) «Scrutiny of variance results for outliers: Cochran’s test optimized»,
Analytica Chimica Acta, 659(1-2), pp. 68-84. doi: 10.1016/j.aca.2009.11.032
Ai, Y., Gong, L., Reed, M., Huang, J., Zhang, Y. y Jane, J. (2016) «Characterization of
starch from bamboo seeds», Starch, 68(1-2), pp. 131-139. doi: 10.1002/star.201500206
Albert, C., Beladjine, M., Tsapis, N., Fattal, E., Agnely, F. y Huang, N. (2019) «Pickering
emulsions: Preparation processes, key parameters governing their properties and
potential for pharmaceutical applications», Journal of Controlled Release, 309, pp.
302-332. doi: 10.1016/j.jconrel.2019.07.003
Alvani, K., Qi, X., Tester, R.F. y Snape, C.E. (2011) «Physicochemical properties of potato
starches», Food Chemistry, 125(3), pp. 958-965. doi: 10.1016/j.foodchem.2010.09.088
Ao, Z. y Jane, J. (2007) «Characterization and modeling of the A and B granule starches of
wheat, triticale, and barley», Carbohydrate Polymers, 67(1), pp. 46-55. doi:
10.1016/j.carbpol.2006.04.013
Arijaje, E.O. y Wang, Y.J. (2016) «Effects of enzymatic modifications and botanical source
on starch-stearic acid complex formation», Starch, 68(7-8), pp. 700-708. doi:
10.1002/star.201500249
Asaoka, M., Okuno, K., Hara, K., Oba, M. y Fuwa, H. (1989) «Effects of environmental
temperature at the early developmental stage of seeds on the characteristics of
endosperm starches of rice (Oryza sativa L.)», Journal of the Japanese Society of
Starch Science, 36(1), pp. 1-8. doi: 10.5458/jag1972.36.1
Asaoka, M., Okuno, K. y Fuwa, H. (1985) «Effect of environmental temperature at the milky
stage on amylose content and fine structure of amylopectin of waxy and nonwaxy
endosperm starches of rice (Oryza sativa L.)», Agricultural and Biological Chemistry,
49(2), pp. 373-379. doi: 10.1080/00021369.1985.10866741
Asaoka, M., Okuno, K., Sugimoto, Y., Kawakami, J. y Fuwa, H. (1984) «Effect of
environmental temperature during development of rice plants on some properties of
endosperm starch», Starch, 36(6), pp. 189-193. doi: 10.1002/star.19840360602
AOAC. (2003) Official methods of analysis, (17th ed). Association of Official Analytical
Chemists. Gaithersburg, MD, USA
Auda, S.H. (2014) «Nimesulide/methyl β-cyclodextrin inclusion complexes:
Physicochemical characterization, solubility, dissolution, and biological studies», Drug
118 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Development Research, 75(2), pp. 68-75. doi: 10.1002/ddr.21156
Baker, A.A., Miles, M.J. y Helbert, W. (2001) «Internal structure of the starch granule
revealed by AFM», Carbohydrate Research, 330(2), pp. 249-256. doi: 10.1016/S0008-
6215(00)00275-5
Banks, W. y Greenwood, C.T. (1971) «The conformation of amylose in dilute solution»,
Starch, 23(9), pp. 300-314. doi: 10.1002/star.19710230903
Banks, W. y Greenwood, C.T. (1967) «The fractionation of labortory-isolated cereal
starches using dimethyl sulphoxide», Starch, 19(12), pp. 394-398. doi:
10.1002/star.19670191202
Banks, W., Greenwood, C.T. y Thomson, J. (1959) «The properties of amylose as related to
the fractionation and subfractionation of starch», Die Makromolekulare. doi:
10.1002/macp.1959.020310113
Beekman, A., Shan, D., Ali, A., Dai, W., Ward-Smith, S. y Goldenberg, M. (2005)
«Micrometer-scale particle sizing by laser diffraction: Critical impact of the imaginary
component of refractive index», Pharmaceutical Research, 22(4), pp. 518-522. doi:
10.1007/s11095-005-2494-x
Bertoft, E. (2017) «Understanding Starch Structure: Recent Progress», Agronomy, 7(3), p.
56. doi: 10.3390/agronomy7030056
Bertoft, E. (2015) «Fine Structure of Amylopectin», en Nakamura, Y. (ed.) Starch. Tokyo:
Springer Japan, pp. 3-40. doi: 10.1007/978-4-431-55495-0_1
Bertoft, E., Piyachomkwan, K., Chatakanonda, P. y Sriroth, K. (2008) «Internal unit chain
composition in amylopectins», Carbohydrate Polymers, 74(3), pp. 527-543. doi:
10.1016/j.carbpol.2008.04.011
Bertoft, E. (2004) «On the nature of categories of chains in amylopectin and their connection
to the super helix model», Carbohydrate Polymers, 57(2), pp. 211-224. doi:
10.1016/j.carbpol.2004.04.015
Bhosale, R.G. y Ziegler, G.R. (2010) «Preparation of spherulites from amylose-palmitic acid
complexes», Carbohydrate Polymers, 80(1), pp. 53-64. doi:
10.1016/j.carbpol.2009.10.069
Biais, B., Le Bail, P., Robert, P., Pontoire, B. y Buléon, A. (2006) «Structural and
stoichiometric studies of complexes between aroma compounds and amylose.
Polymorphic transitions and quantification in amorphous and crystalline areas»,
Carbohydrate Polymers, 66(3), pp. 306-315. doi: 10.1016/j.carbpol.2006.03.019
Blazek, J. y Gilbert, E.P. (2011) «Application of small-angle X-ray and neutron scattering
techniques to the characterisation of starch structure: A review», Carbohydrate
Polymers, pp. 281-293. doi: 10.1016/j.carbpol.2011.02.041
Bourne, E.J., Donnison, G.H., Haworth, N. y Peat, S. (1948) «Thymol and cyclohexanol as
fractionating agents for starch», Journal of the Chemical Society (Resumed), p. 1687.
doi: 10.1039/jr9480001687
Bibliografía 119
Braga, S.S., Gonçalves, I.S., Herdtweck, E. y Teixeira-Dias, J.J.C. (2003) «Solid state
inclusion compound of S-ibuprofen in β-cyclodextrin: Structure and characterisation»,
New Journal of Chemistry, 27(3), pp. 597-601. doi: 10.1039/b207272f
Buléon, A., Véronèse, G. y Putaux, J.-L. (2007) «Self-association and crystallization of
amylose», Australian Journal of Chemistry, 60(10), pp. 706-718. doi:
10.1071/ch07168
Buléon, A., Colonna, P., Planchot, V. y Ball, S. (1998) «Starch granules: Structure and
biosynthesis», International Journal of Biological Macromolecules, 23(2), pp. 85-112.
doi: 10.1016/s0141-8130(98)00040-3
Buléon, A., Delage, M.M., Brisson, J. y Chanzy, H. (1990) «Single crystals of V-amylose
complexed with isopropanol and acetone», International Journal of Biological
Macromolecules, 12(1), pp. 25-33. doi: 10.1016/0141-8130(90)90078-o
Byrn, S.R., Stahly, G.P., McKenzie, A.T., Andres, M.C., Russell, C.A. y Johnson, P. (1997)
«Determination of the optical purity of ibuprofen using X-ray powder diffraction»,
Journal of Pharmaceutical Sciences, 86(8), pp. 970-971. doi: 10.1021/js9700715
Cael, J.J., Koenig, J.L. y Blackwell, J. (1975) «Infrared and Raman spectroscopy of
carbohydrates. Part VI: Normal coordinate analysis of V‐amylose», Biopolymers,
14(9), pp. 1885-1903. doi: 10.1002/bip.1975.360140909
Cai, L. y Shi, Y.-C. (2013) «Self-assembly of short linear chains to A and B type starch
spherulites and their enzymatic Digestibility», Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 61(45), pp. 10787-10797. doi: 10.1021/jf402570e
Cailliau, J., Vézina, G., Fortin, F. y Batigne, S. (2007) The visual guide to understanding
plants & the vegetable kingdom. Editado por I. QA. Eslovaquia: Jacques Fortin
Carbinatto, F.M., Ribeiro, T.S., Colnago, L.A., Evangelista, R.C. y Cury, B.S.F. (2016)
«Preparation and characterization of amylose inclusion complexes for drug delivery
applications», Journal of Pharmaceutical Sciences, 105(1), pp. 231-241. doi:
10.1002/jps.24702
Carbinatto, F.M., de Castro, A.D., Evangelista, R.C. y Cury, B.S.F. (2014) «Insights into
the swelling process and drug release mechanisms from cross-linked pectin/high
amylose starch matrices», Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 9(1), pp. 27-34.
doi: 10.1016/j.ajps.2013.12.002
Cardoso, M.B., Putaux, J.-L., Nishiyama, Y., Helbert, W., Hÿtch, M., Silveira, N.P. y
Chanzy, H. (2007) «Single crystals of V-amylose complexed with α-naphthol»,
Biomacromolecules, 8(4), pp. 1319-1326. doi: 10.1021/bm0611174
Cheetham, N.W.H. y Tao, L. (1998) «Variation in crystalline type with amylose content in
maize starch granules: An X-ray powder diffraction study», Carbohydrate Polymers,
36(4), pp. 277-284. doi: 10.1016/s0144-8617(98)00007-1
Chen, M., Ye, L., Li, H., Wang, G., Chen, Q., Fang, C., Dai, C. y Fei, B. (2020) «Flexural
strength and ductility of moso bamboo», Construction and Building Materials, 246, p.
118418. doi: 10.1016/j.conbuildmat.2020.118418
120 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Chen, B., Zeng, S., Zeng, H., Guo, Z., Zhang, Y. y Zheng, B. (2017) «Properties of lotus
seed starch-glycerin monostearin complexes formed by high pressure
homogenization», Food Chemistry, 226, pp. 119-127. doi:
10.1016/j.foodchem.2017.01.018
Chen, M.H. y Bergman, C.J. (2007) «Method for determining the amylose content,
molecular weights, and weight and molar based distributions of degree of
polymerization of amylose and fine structure of amylopectin», Carbohydrate
Polymers, 69(3), pp. 562-578. doi: 10.1016/j.carbpol.2007.01.018
Cheng, L., Feng, T., Zhang, B., Zhu, X., Hamaker, B., Zhang, H. y Campanella, O. (2018)
«A molecular dynamics simulation study on the conformational stability of amylose-
linoleic acid complex in water», Carbohydrate Polymers, 196, pp. 56-65. doi:
10.1016/j.carbpol.2018.04.102
Choudhury, S. y Nelson, K.F. (1992) «Improvement of oral bioavailability of
carbamazepine by inclusion in 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin», International
Journal of Pharmaceutics, 85(1-3), pp. 175-180. doi: 10.1016/0378-5173(92)90146-s
Chung, H.J. y Liu, Q. (2009) «Impact of molecular structure of amylopectin and amylose
on amylose chain association during cooling», Carbohydrate Polymers, 77(4), pp. 807-
815. doi: 10.1016/j.carbpol.2009.03.004
Cohen, R., Schwartz, B., Peri, I. y Shimoni, E. (2011) «Improving bioavailability and
stability of genistein by complexation with high amylose corn starch», Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 59(14), pp. 7932-7938. doi: 10.1021/jf2013277
Cohen, R., Orlova, Y., Kovalev, M., Ungar, Y. y Shimoni, E. (2008) «Structural and
functional properties of amylose complexes with genistein», Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 56(11), pp. 4212-4218. doi: 10.1021/jf800255c
Conde-Petit, B., Escher, F. y Nuessli, J. (2006) «Structural features of starch-flavor
complexation in food model systems», Trends in Food Science & Technology, 17(5),
pp. 227-235. doi: 10.1016/j.tifs.2005.11.007
Copeland, L., Blazek, J., Salman, H. y Tang, M.C. (2009) «Form and functionality of
starch», Food Hydrocolloids, 23(6), pp. 1527-1534. doi:
10.1016/j.foodhyd.2008.09.016
Costa, P. y Sousa, J.M. (2001) «Modeling and comparison of dissolution profiles»,
European Journal of Pharmaceutical Sciences, 13(2), pp. 123-133. doi:
10.1016/s0928-0987(01)00095-1
Cozzolino, D. y Degner, S. (2016) «An overview on the role of lipids and fatty acids in
barley grain and their products during beer brewing», Food Research International, 81,
pp. 114-121. doi: 10.1016/j.foodres.2016.01.003
Cozzolino, D., Roumeliotis, S. y Eglinton, J. (2013) «Relationships between swelling
power, water solubility and near infrared spectra in whole grain barley: A feasibility
study», Food and Bioprocess Technology, 6(10), pp. 2732-2738. doi: 10.1007/s11947-
012-0948-9
Bibliografía 121
Crowe, T.C., Seligman, S.A. y Copeland, L. (2000) «Inhibition of enzymic digestion of
amylose by free fatty acids in vitro contributes to resistant starch formation», The
Journal of Nutrition, 130(8), pp. 2006-2008. doi: 10.1093/jn/130.8.2006
Cui, R. y Oates, C.G. (1999) «The effect of amylose-lipid complex formation on enzyme
susceptibility of sago starch», Food Chemistry, 65(4), pp. 417-425. doi:
10.1016/s0308-8146(97)00174-x
Cullity, B.D. y Stock, S.R. (2014) Elements of X-Ray Diffraction. 3.a ed. United States of
America: Pearson Education Limited
Doblado-Maldonado, A.F., Gomand, S.V., Goderis, B. y Delcour, J.A. (2017)
«Methodologies for producing amylose: A review», Critical Reviews in Food Science
and Nutrition, 57(2), pp. 407-417. doi: 10.1080/10408398.2014.954030
Dries, D.M., Gomand, S.V., Pycarelle, S.C., Smet, M., Goderis, B. y Delcour, J.A. (2017)
«Development of an infusion method for encapsulating ascorbyl palmitate in V-type
granular cold water swelling starch», Carbohydrate Polymers, 165, pp. 229-237. doi:
10.1016/j.carbpol.2017.02.054
Eliasson, A.-C. (1988) «On the thermal transitions of the amylose-cetyltrimethylammonium
bromide complex», Carbohydrate Research, 172(1), pp. 83-95. doi: 10.1016/s0008-
6215(00)90844-9
Erlander, S.R. y Purvinas, R.M. (1968) «The polyelectrolyte behavior of amylose and its
helix‐to‐coil transition in aqueous alkaline solutions», Starch, 20(2), pp. 37-45. doi:
10.1002/star.19680200203
Fanta, G.F., Felker, F.C. y Shogren, R.L. (2002) «Formation of crystalline aggregates in
slowly-cooled starch solutions prepared by steam jet cooking», Carbohydrate
Polymers, 48(2), pp. 161-170. doi: 10.1016/s0144-8617(01)00230-2
Fanta, G., Shogren, R.L. y Salch, J.H. (1999) «Steam jet cooking of high-amylose starch-
fatty acid mixtures. An investigation of complex formation», Carbohydrate Polymers,
38(1), pp. 1-6. doi: 10.1016/s0144-8617(98)00104-0
Felisberto, M.H.F., Beraldo, A.L., Costa, M.S., Boas, F.V., Franco, C.M.L. y Clerici,
M.T.P.S. (2018) «Characterization of young bamboo culm starch from Dendrocalamus
asper», Food Research International, (2017). doi: 10.1016/j.foodres.2018.03.074
Felisberto, M.H.F., Beraldo, A.L. y Clerici, M.T.P.S. (2017a) «Young bamboo culm flour
of Dendrocalamus asper: Technological properties for food applications», LWT - Food
Science and Technology, 76, pp. 230-235. doi: 10.1016/j.lwt.2016.06.015
Felisberto, M.H.F., Miyake, P.S.E., Beraldo, A.L. y Clerici, M.T.P.S. (2017b) «Young
bamboo culm: Potential food as source of fiber and starch», Food Research
International, 101, pp. 96-102. doi: 10.1016/j.foodres.2017.08.058
Feng, T., Wang, H., Wang, K., Liu, Y., Rong, Z., Ye, R., Zhuang, H., Xu, Z. y Sun, M.
(2018) «Preparation and structural characterization of different amylose-flavor
molecular inclusion complexes», Starch, 70(1-2), pp. 1700101-1700111. doi:
10.1002/star.201700101
122 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Fiedler, J.O., Carmona, Ó.G., Carmona, C.G., José Lis, M., Plath, A.M.S., Samulewski, R.B.
y Bezerra, F.M. (2020) «Application of Aloe vera microcapsules in cotton nonwovens
to obtain biofunctional textiles», The Journal of the Textile Institute, 111(1), pp. 68-74.
doi: 10.1080/00405000.2019.1625607
Gallant, D.J., Bouchet, B. y Baldwin, P.M. (1997) «Microscopy of starch: Evidence of a
new level of granule organization», Carbohydrate Polymers, 32(3-4), pp. 177-191. doi:
10.1016/s0144-8617(97)00008-8
Gallant, D.J., Bewa, H., Buy, Q.H., Bouchet, B., Szylit, O. y Sealy, L. (1982) «On
ultrastructural and nutritional aspects of some tropical tuber starches», Starch, 34(8),
pp. 255-262. doi: 10.1002/star.19820340803
GBIF Backbone Taxonomy. (2019) Rhipidocladum harmonicum (Parodi) McClure.
Disponible en: https://www.gbif.org/es/species/4143058 (Accedido: 1 de abril de
2020)
Gelders, G.G., Vanderstukken, T.C., Goesaert, H. y Delcour, J.A. (2004) «Amylose-lipid
complexation: A new fractionation method», Carbohydrate Polymers, 56(4), pp. 447-
458. doi: 10.1016/j.carbpol.2004.03.012
Gidley, M.J. (2014) «Starch NMR», en Halley, P.J. y Averóus, L. (eds.) Starch Polymers.
Elsevier, pp. 243-253. doi: 10.1016/b978-0-444-53730-0.00029-4
Gidley, M.J., Hanashiro, I., Hani, N.M., Hill, S.E., Huber, A., Jane, J.L., Liu, Q., Morris,
G.A., Rolland-Sabaté, A., Striegel, A.M. y Gilbert, R.G. (2010) «Reliable
measurements of the size distributions of starch molecules in solution: Current
dilemmas and recommendations», Carbohydrate Polymers, 79(2), pp. 255-261. doi:
10.1016/j.carbpol.2009.07.056
Godet, M.C., Bizot, H. y Buléon, A. (1995) «Crystallization of amylose-fatty acid
complexes prepared with different amylose chain lengths», Carbohydrate Polymers,
27(1), pp. 47-52. doi: 10.1016/0144-8617(95)00034-5
Gouin, S. (2004) «Microencapsulation: Industrial appraisal of existing technologies and
trends», Trends in Food Science & Technology, 15(7-8), pp. 330-347. doi:
10.1016/j.tifs.2003.10.005
Greenwood, C.T. y Thomson, J. (1962) «Physicochemical studies on starches. Part XXIV.
The fractionation and characterization of starches of various plant origins», Journal of
the Chemical Society (Resumed), 2(0), pp. 222-229. doi: 10.1039/jr9620000222
Han, S., Choi, S.-H., Kim, W., Kim, B.-Y. y Baik, M.-Y. (2015) «Infusion of catechin into
native corn starch granules for drug and nutrient delivery systems», Food Science and
Biotechnology, 24(6), pp. 2035-2040. doi: 10.1007/s10068-015-0270-1
Hanashiro, I. (2015) «Fine structure of amylose», en Nakamura, Y. (ed.) Starch. Tokyo:
Springer Japan, pp. 41-60. doi: 10.1007/978-4-431-55495-0_2
Hanashiro, I., Abe, J. y Hizukuri, S. (1996) «A periodic distribution of the chain length of
amylopectin as revealed by high-performance anion-exchange chromatography»,
Bibliografía 123
Carbohydrate Research, 283, pp. 151-159. doi: 10.1016/0008-6215(95)00408-4
Hancock, R.D. y Tarbet, B.J. (2000) «The other double helix-the fascinating chemistry of
starch», Journal of Chemical Education, 77(8), pp. 988-992. doi: 10.1021/ed077p988
Harding, S.E., Adams, G.G. y Gillis, R.B. (2016) «Molecular weight analysis of starches:
Which technique?», Starch, 68(9-10), pp. 846-853. doi: 10.1002/star.201600042
Hassanzadeh, A.M., Khiabani, M.S., Sadrnia, M., Divband, B., Rahmanpour, O., Jabbari,
V., Gholizadeh, P. y Kafil, H.S. (2017) «Immobilization and microencapsulation of
Lactobacillus caseii and Lactobacillus plantarum using zeolite base and evaluating
their viability in gastroesophageal-intestine simulated condition», Ars Pharmaceutica,
58(4), pp. 163-170. doi: 10.4321/s2340-98942017000400003
Hayashi, A., Kinoshita, K. y Miyake, Y. (1981) «The conformation of amylose in solution.
I.», Polymer Journal, 13(6), pp. 537-541. doi: 10.1295/polymj.13.537
He, X.-Q., Suzuki, K., Kitamura, S., Lin, J.-X., Cui, K.-M. y Itoh, T. (2002) «Toward
understanding the different function of two types of parenchyma cells in bamboo
culms», Plant and Cell Physiology, 43(2), pp. 186-195. doi: 10.1093/pcp/pcf027
Heinemann, C., Conde-Petit, B., Nuessli, J. y Escher, F. (2001) «Evidence of starch
inclusion complexation with lactones», Journal of Agricultural and Food Chemistry,
49(3), pp. 1370-1376. doi: 10.1021/jf001079u
Helbert, W. y Chanzy, H. (1994) «Single crystals of V amylose complexed with n-butanol
or n-pentanol: Structural features and properties», International Journal of Biological
Macromolecules, 16(4), pp. 207-213. doi: 10.1016/0141-8130(94)90052-3
Hizukuri, S. (1991) «Properties of hot-water-extractable amylose», Carbohydrate Research,
217, pp. 251-253. doi: 10.1016/0008-6215(91)84136-3
Hong, C., Li, H., Xiong, Z., Lorenzo, R., Corbi, I., Corbi, O., Wei, D., Yuan, C., Yang, D.
y Zhang, H. (2020) «Review of connections for engineered bamboo structures»,
Journal of Building Engineering, 30, p. 101324. doi: 10.1016/j.jobe.2020.101324
Hoover, R. (2001) «Composition, molecular structure, and physicochemical properties of
tuber and root starches: A review», Carbohydrate Polymers, 45(3), pp. 253-267. doi:
10.1016/s0144-8617(00)00260-5
Hu, L., Zhang, H., Song, W., Gu, D. y Hu, Q. (2012) «Investigation of inclusion complex
of cilnidipine with hydroxypropyl-β-cyclodextrin», Carbohydrate Polymers, 90(4), pp.
1719-1724. doi: 10.1016/j.carbpol.2012.07.057
Hussein, K., Türk, M. y Wahl, M.A. (2007) «Comparative evaluation of ibuprofen/β-
cyclodextrin complexes obtained by supercritical carbon dioxide and other
conventional methods», Pharmaceutical Research, 24(3), pp. 585-592. doi:
10.1007/s11095-006-9177-0
ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005) «Validation of Analytical Procedures: Text
and methodology, Q2 (R1)», International Conference on Harmonization. Disponible
en: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality
124 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
/Q2_R1/Step4/Q2_R1_Guideline.pdf (Accedido: 8 de marzo de 2020)
Imberty, A., Buléon, A., Tran, V. y Péerez, S. (1991) «Recent advances in knowledge of
starch structure», Starch, 43(10), pp. 375-384. doi: 10.1002/star.19910431002
Immel, S. y Lichtenthaler, F.W. (2000) «The hydrophobic topographies of amylose and its
blue iodine complex», Starch, 52(1), pp. 1-8. doi: 10.1002/(sici)1521-
379x(200001)52:1<1::aid-star1>3.0.co;2-h
Jacob, S. y Nair, A.B. (2018) «Cyclodextrin complexes: Perspective from drug delivery and
formulation», Drug Development Research, 79(5), pp. 201-217. doi:
10.1002/ddr.21452
Jane, J. (2009) «Structural features of starch granules II», en James, B. y Whistler, R. (eds.)
Starch. 3.a ed. Academic Press, pp. 193-236. doi: 10.1016/b978-0-12-746275-2.00006-
9
Jenkins, P.J. y Donald, A.M. (1998) «Gelatinisation of starch: A combined
SAXS/WAXS/DSC and SANS study», Carbohydrate Research, 308(1-2), pp. 133-
147. doi: 10.1016/s0008-6215(98)00079-2
Jiang, F., Du, C., Guo, Y., Fu, J., Jiang, W. y Du, S. (2020) «Physicochemical and structural
properties of starches isolated from quinoa varieties», Food Hydrocolloids, 101, p.
105515. doi: 10.1016/j.foodhyd.2019.105515
Kaneko, Y. y Kadokawa, J. (2005) «Vine-twining polymerization: A new preparation
method for well-defined supramolecules composed of amylose and synthetic
polymers», The Chemical Record, 5(1), pp. 36-46. doi: 10.1002/tcr.20031
Karve, M.S., Bhide, S.V. y Kale, N.R. (1981) «Separation of starch components by affinity
chromatography», en Solution properties of polysaccharides, pp. 559-570. doi:
10.1021/bk-1981-0150.ch037
Kawada, J. y Marchessault, R.H. (2004) «Solid state NMR and X-ray studies on amylose
complexes with small organic molecules», Starch, 56(1), pp. 13-19. doi:
10.1002/star.200300222
Kenar, J.A., Compton, D.L., Little, J.A. y Peterson, S.C. (2016) «Formation of inclusion
complexes between high amylose starch and octadecyl ferulate via steam jet cooking»,
Carbohydrate Polymers, 140, pp. 246-252. doi: 10.1016/j.carbpol.2015.12.048
Kennedy, J.F., Rivera, Z.S., Lloyd, L.L. y Warner, F.P. (1992) «Fractionation of starch
amylopectin and amylose by high performance gel filtration chromatography», Starch,
44(2), pp. 53-55. doi: 10.1002/star.19920440205
Kim, H.I., Kim, H.R., Choi, S.J., Park, C.-S. y Moon, T.W. (2017) «Preparation and
characterization of the inclusion complexes between amylosucrase-treated waxy starch
and palmitic acid», Food Science and Biotechnology, 26(2), pp. 323-329. doi:
10.1007/s10068-017-0044-z
Klucinec, J.D. y Thompson, D.B. (1998) «Fractionation of high-amylose maize starches by
differential alcohol precipitation and chromatography of the fractions», Cereal
Bibliografía 125
Chemistry Journal, 75(6), pp. 887-896. doi: 10.1094/cchem.1998.75.6.887
Kobayashi, S., Schwartz, S.J. y Lineback, D.R. (1985) «Rapid analysis of starch, amylose
and amylopectin by high-performance size-exclusion chromatography», Journal of
Chromatography A, 319, pp. 205-214. doi: 10.1016/S0021-9673(01)90555-2
Kong, X., Zhu, P., Sui, Z. y Bao, J. (2015) «Physicochemical properties of starches from
diverse rice cultivars varying in apparent amylose content and gelatinisation
temperature combinations», Food Chemistry, 172, pp. 433-440. doi:
10.1016/j.foodchem.2014.09.085
Kong, L. y Ziegler, G.R. (2014a) «Formation of starch-guest inclusion complexes in
electrospun starch fibers», Food Hydrocolloids, 38, pp. 211-219. doi:
10.1016/j.foodhyd.2013.12.018
Kong, L. y Ziegler, G.R. (2014b) «Molecular encapsulation of ascorbyl palmitate in
preformed V-type starch and amylose», Carbohydrate Polymers, 111, pp. 256-263.
doi: 10.1016/j.carbpol.2014.04.033
Kong, L., Lee, C., Kim, S.H. y Ziegler, G.R. (2014c) «Characterization of starch
polymorphic structures using vibrational sum frequency generation spectroscopy»,
Journal of Physical Chemistry B, 118(7), pp. 1775-1783. doi: 10.1021/jp411130n
Kuge, T. y Takeo, K. (1968) «Complexes of starchy materials with organic compounds»,
Agricultural and Biological Chemistry, 32(10), pp. 1232-1238. doi:
10.1080/00021369.1968.10859210
Kugimiya, M., Donovan, J.W. y Wong, R.Y. (1980) «Phase transitions of amylose‐lipid
complexes in starches: A calorimetric study», Starch, 32(8), pp. 265-270. doi:
10.1002/star.19800320805
Kumar, K. y Loos, K. (2019) «Deciphering structures of inclusion complexes of amylose
with natural phenolic amphiphiles», ACS Omega, 4(18), pp. 17807-17813. doi:
10.1021/acsomega.9b02388
Lalush, I., Bar, H., Zakaria, I., Eichler, S. y Shimoni, E. (2005) «Utilization of amylose-lipid
complexes as molecular nanocapsules for conjugated linoleic acid»,
Biomacromolecules, 6(1), pp. 121-130. doi: 10.1021/bm049644f
Lao, L.L., Peppas, N.A., Boey, F.Y.C. y Venkatraman, S.S. (2011) «Modeling of drug
release from bulk-degrading polymers», International Journal of Pharmaceutics,
418(1), pp. 28-41. doi: 10.1016/j.ijpharm.2010.12.020
Lawton (Retired), J.W. (2016) «Starch: Uses of native starch», en Wrigley, C., Corke, H.,
Seetharaman, K., y Jon, F. (eds.) Encyclopedia of Food Grains. 2.a ed. Academic Press,
pp. 274-281. doi: 10.1016/b978-0-12-394437-5.00146-7
Lay Ma, U.V., Floros, J.D. y Ziegler, G.R. (2011a) «Effect of starch fractions on spherulite
formation and microstructure», Carbohydrate Polymers, 83(4), pp. 1757-1765. doi:
10.1016/j.carbpol.2010.10.041
Lay Ma, U.V., Floros, J.D. y Ziegler, G.R. (2011b) «Formation of inclusion complexes of
126 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
starch with fatty acid esters of bioactive compounds», Carbohydrate Polymers, 83(4),
pp. 1869-1878. doi: 10.1016/j.carbpol.2010.10.055
Le Bail, P., Rondeau, C. y Buléon, A. (2005) «Structural investigation of amylose
complexes with small ligands: helical conformation, crystalline structure and
thermostability», International Journal of Biological Macromolecules, 35(1-2), pp. 1-
7. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2004.09.001
Le, C.A.K. (2019) Inclusion complexes of amylose : morphogenesis , crystal structure and
release of bioactive molecules (Doctoral Dissertation). Université Grenoble Alpes.
Disponible en: https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-02018878/document
Lee, B.-J. y Lee, J.-R. (1995) «Enhancement of solubility and dissolution rate of poorly
water-soluble naproxen by complexation with 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin»,
Archives of Pharmacal Research, 18(1), pp. 22-26. doi: 10.1007/bf02976502
Li, X., Wu, M., Xiao, M., Lu, S., Wang, Z., Yao, J. y Yang, L. (2019) «Microencapsulated
β-carotene preparation using different drying treatments», Journal of Zhejiang
University-SCIENCE B, 20(11), pp. 901-909. doi: 10.1631/jzus.b1900157
Li, J.-Y. y Yeh, A.-I. (2001) «Relationships between thermal, rheological characteristics and
swelling power for various starches», Journal of Food Engineering, 50(3), pp. 141-
148. doi: 10.1016/s0260-8774(00)00236-3
Liese, W. y Weiner, G. (1996) «Ageing of bamboo culms. A review», Wood Science and
Technology, 30(2), pp. 77-89. doi: 10.1007/bf00224958
Lima, B.Dos S., Shanmugam, S., Quintans, J.De S., Quintans-Júnior, L.J. y Araújo, A.A.De
S. (2019a) «Inclusion complex with cyclodextrins enhances the bioavailability of
flavonoid compounds: a systematic review», Phytochemistry Reviews, 18(5), pp. 1337-
1359. doi: 10.1007/s11101-019-09650-y
Lima, B.Dos S., Campos, C.De A., Santos, A.C.R.Da S., Santos, V.C., Trindade, G.Das G.,
Shanmugam, S., Pereira, E.W., Marreto, R.N., Duarte, M.C., Almeida, J.R.G.Da S.,
Quintans, J. de S., Quintans-Júnior, L.J. y Araújo, A.A. de S. (2019b) «Development
of morin/hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex: Enhancement of
bioavailability, antihyperalgesic and anti-inflammatory effects», Food and Chemical
Toxicology, 126(February), pp. 15-24. doi: 10.1016/j.fct.2019.01.038
Liu, L. y Gao, H. (2012) «Molecular structure and vibrational spectra of ibuprofen using
density function theory calculations», Spectrochimica Acta Part A: Molecular and
Biomolecular Spectroscopy, 89, pp. 201-209. doi: 10.1016/j.saa.2011.12.068
Loh, G.O.K., Tan, Y.T.F. y Peh, K.-K. (2016) «Enhancement of norfloxacin solubility via
inclusion complexation with β-cyclodextrin and its derivative hydroxypropyl-β-
cyclodextrin», Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 11(4), pp. 536-546. doi:
10.1016/j.ajps.2016.02.009
Lopez-Rubio, A., Flanagan, B.M., Gilbert, E.P. y Gidley, M.J. (2008) «A novel approach
for calculating starch crystallinity and its correlation with double helix content: A
combined XRD and NMR study», Biopolymers, 89(9), pp. 761-768. doi:
Bibliografía 127
10.1002/bip.21005
Lourdin, D., Putaux, J.-L., Potocki-Véronèse, G., Chevigny, C., Rolland-Sabaté, A. y
Buléon, A. (2015) «Crystalline structure in starch», en Nakamura, Y. (ed.) Starch.
Tokyo: Springer Japan, pp. 61-90. doi: 10.1007/978-4-431-55495-0_3
Luo, J., Lian, C., Liu, R., Zhang, S., Yang, F. y Fei, B. (2019) «Comparison of metaxylem
vessels and pits in four sympodial bamboo species», Scientific Reports, 9(1), p. 10876.
doi: 10.1038/s41598-019-47419-7
Manners, D.J. (1989) «Recent developments in our understanding of amylopectin structure:
A review», Carbohydrate Polymers, 11(2), pp. 87-112. doi: 10.1016/0144-
8617(89)90018-0
Marinopoulou, A., Christofilos, D., Arvanitidis, J. y Raphaelides, S.N. (2019a) «Study of
molecular inclusion complex formation of amylose with indomethacin», Starch, 71(7-
8), p. 1800295. doi: 10.1002/star.201800295
Marinopoulou, A., Papastergiadis, E. y Raphaelides, S.N. (2019b) «Inclusion complexes of
non-granular maize starch with fatty acids and ibuprofen. A comparative study of their
morphology and structure», Starch, 71(1-2), p. 1800100. doi: 10.1002/star.201800100
Marinopoulou, A., Papastergiadis, E. y Raphaelides, S.N. (2016a) «An investigation into
the structure, morphology and thermal properties of amylomaize starch-fatty acid
complexes prepared at different temperatures», Food Research International, 90, pp.
111-120. doi: 10.1016/j.foodres.2016.10.035
Marinopoulou, A., Papastergiadis, E., Raphaelides, S.N. y Kontominas, M.G. (2016b)
«Structural characterization and thermal properties of amylose-fatty acid complexes
prepared at different temperatures», Food Hydrocolloids, 58, pp. 224-234. doi:
10.1016/j.foodhyd.2016.02.034
Marinopoulou, A., Papastergiadis, E., Raphaelides, S.N. y Kontominas, M.G. (2016c)
«Morphological characteristics, oxidative stability and enzymic hydrolysis of amylose-
fatty acid complexes», Carbohydrate Polymers, 141, pp. 106-115. doi:
10.1016/j.carbpol.2015.12.062
Marques, H.M. (2010) «A review on cyclodextrin encapsulation of essential oils and
volatiles», Flavour and Fragrance Journal, 25(5), pp. 313-326. doi: 10.1002/ffj.2019
Matheson, N.K. (1996) «The chemical structure of amylose and amylopectin fractions of
starch from tobacco leaves during development and diurnally-nocturnally»,
Carbohydrate Research, 282(2), pp. 247-262. doi: 10.1016/0008-6215(95)00381-9
Matheson, N.K. y Welsh, L.A. (1988) «Estimation and fractionation of the essentially
unbranched (amylose) and branched (amylopectin) components of starches with
concanavalin A», Carbohydrate Research, 180(2), pp. 301-313. doi: 10.1016/0008-
6215(88)80087-9
Matsushima, R., Maekawa, M. y Sakamoto, W. (2015) «Geometrical formation of
compound starch grains in rice implements Voronoi diagram», Plant and Cell
Physiology, 56(11), pp. 2150-2157. doi: 10.1093/pcp/pcv123
128 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Maxwell, R. y Chickos, J. (2012) «An examination of the thermodynamics of fusion,
vaporization, and sublimation of ibuprofen and naproxen by correlation gas
chromatography», Journal of Pharmaceutical Sciences, 101(2), pp. 805-814. doi:
10.1002/jps.22803
McGrance, S.J., Cornell, H.J. y Rix, C.J. (1998) «A simple and rapid colorimetric method
for the determination of amylose in starch products», Starch, 50(4), pp. 158-163. doi:
10.1002/(sici)1521-379x(199804)50:4<158::aid-star158>3.0.co;2-7
McNaught, A.D. y Wilkinson, A. (2009) IUPAC compendium of chemical terminology (the
«Gold Book»). 2.a ed. Editado por M. Nič, J. Jirát, B. Košata, A. Jenkins, y A.
McNaught. Research Triagle Park, NC: IUPAC. doi: 10.1351/goldbook
Meng, S., Ma, Y., Cui, J. y Sun, D.-W. (2014a) «Preparation of corn starch-fatty acid
complexes by high-pressure homogenization», Starch, 66(9-10), pp. 809-817. doi:
10.1002/star.201400022
Meng, S., Ma, Y., Sun, D.-W., Wang, L. y Liu, T. (2014b) «Properties of starch-palmitic
acid complexes prepared by high pressure homogenization», Journal of Cereal
Science, 59(1), pp. 25-32. doi: 10.1016/j.jcs.2013.10.012
Meyer, K.H., Bernfeld, P. y Wolf, E. (1940) «Recherches sur l’amidon III. Fractionnement
et purification de l’amylose de maïs naturel», Helvetica Chimica Acta, 23(1), pp. 854-
864. doi: 10.1002/hlca.194002301110
Moriwaki, C., Costa, G.L., Ferracini, C.N., Moraes, F.F. de, Zanin, G.M., Pineda, E.A.G. y
Matioli, G. (2008) «Enhancement of solubility of albendazole by complexation with β-
cyclodextrin», Brazilian Journal of Chemical Engineering, 25(2), pp. 255-267. doi:
10.1590/s0104-66322008000200005
Morrison, W.R., Law, R.V. y Snape, C.E. (1993) «Evidence for inclusion complexes of
lipids with V-amylose in maize, rice and oat starches», Journal of Cereal Science,
18(2), pp. 107-109. doi: 10.1006/jcrs.1993.1039
Muankaew, C. y Loftsson, T. (2018) «Cyclodextrin-based formulations: A non-invasive
platform for targeted drug delivery», Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology,
122(1), pp. 46-55. doi: 10.1111/bcpt.12917
Nair, A.B., Attimarad, M., Al-Dhubiab, B.E., Wadhwa, J., Harsha, S. y Ahmed, M. (2014)
«Enhanced oral bioavailability of acyclovir by inclusion complex using
hydroxypropyl-β-cyclodextrin», Drug Delivery, 21(7), pp. 540-547. doi:
10.3109/10717544.2013.853213
Ngobese, N.Z., Wokadala, O.C., Plessis, B.Du., Da Silva, L.S., Hall, A., Lepule, S.P.,
Penter, M., Ngcobo, M.E.K. y Swart, H.C. (2018) «Physicochemical and
morphological properties of a small granule legume starch with atypical properties
from wild mango (Cordyla africana L .) seeds: A comparison to maize, pea, and kidney
bean starch», Starch, 70(11-12), p. 1700345. doi: 10.1002/star.201700345
Nishiyama, Y., Mazeau, K., Morin, M., Cardoso, M.B., Chanzy, H. y Putaux, J.-L. (2010)
«Molecular and crystal structure of 7-fold V-amylose complexed with 2-propanol»,
Bibliografía 129
Macromolecules, 43(20), pp. 8628-8636. doi: 10.1021/ma101794w
Nordmark, T.S. y Ziegler, G.R. (2002) «Structural features of non-granular spherulitic maize
starch», Carbohydrate Research, 337(16), pp. 1467-1475. doi: 10.1016/S0008-
6215(02)00192-1
Nuessli, J., Putaux, J.L., Le Bail, P. y Buléon, A. (2003) «Crystal structure of amylose
complexes with small ligands», International Journal of Biological Macromolecules,
33(4-5), pp. 227-234. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2003.08.009
Nuessli, J., Sigg, B., Conde-Petit, B. y Escher, F. (1997) «Characterization of amylose-
flavour complexes by DSC and X-ray diffraction», Food Hydrocolloids, 11(1), pp. 27-
34. doi: 10.1016/s0268-005x(97)80007-0
Obiro, W.C., Ray, S.S. y Emmambux, M.N. (2012) «V-amylose structural characteristics,
methods of preparation, significance, and potential applications», Food Reviews
International, 28(4), pp. 412-438. doi: 10.1080/87559129.2012.660718
Ocampo‐Salinas, I.O., Gómez‐Aldapa, C.A., Castro‐Rosas, J., Vargas‐León, E.A., Guzmán‐
Ortiz, F.A., Calcáneo‐Martínez, N. y Falfán‐Cortés, R.N. (2020) «Development of wall
material for the microencapsulation of natural vanilla extract by spray drying», Cereal
Chemistry, 97(3), pp. 555-565. doi: 10.1002/cche.10269
Oguchi, T., Yamasato, H., Limmatvapirat, S., Yonemochi, E. y Keiji Yamamoto, A. (1998)
«Structural change and complexation of strictly linear amylose induced by sealed-
heating with salicylic acid», Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions,
94(7), pp. 923-927. doi: 10.1039/a707848j
Ohdan, K., Fujii, K., Yanase, M., Takaha, T. y Kuriki, T. (2006) «Enzymatic synthesis of
amylose», Biocatalysis and Biotransformation, 24(1-2), pp. 77-81. doi:
10.1080/10242420600598152
Pacheco, P.A., Rodrigues, L.N.C., Ferreira, J.F.S., Gomes, A.C.P., Veríssimo, C.J.,
Louvandini, H., Costa, R.L.D. y Katiki, L.M. (2018) «Inclusion complex and
nanoclusters of cyclodextrin to increase the solubility and efficacy of albendazole»,
Parasitology Research, 117(3), pp. 705-712. doi: 10.1007/s00436-017-5740-3
Panyoo, A.E. y Emmambux, M.N. (2017) «Amylose-lipid complex production and potential
health benefits: A mini-review», Starch, 69(7-8), p. 1600203. doi:
10.1002/star.201600203
Pereva, S., Nikolova, V., Sarafska, T., Angelova, S., Spassov, T. y Dudev, T. (2020)
«Inclusion complexes of ibuprofen and β-cyclodextrin: Supramolecular structure and
stability», Journal of Molecular Structure, 1205, p. 127575. doi:
10.1016/j.molstruc.2019.127575
Pérez, S. y Bertoft, E. (2010) «The molecular structures of starch components and their
contribution to the architecture of starch granules: A comprehensive review», Starch,
62(8), pp. 389-420. doi: 10.1002/star.201000013
Pérez, S., Baldwin, P.M. y Gallant, D.J. (2009) «Structural features of starch granules I», en
BeMiller, J. y Roy, W. (eds.) Starch. 3.a ed. San Diego: Academic Press, pp. 149-192.
130 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
doi: 10.1016/b978-0-12-746275-2.00005-7
Preiss, J. (2018) «Plant starch synthesis», en Sjöö, M. y Nilsson, L. (eds.) Starch in Food.
2.a ed. Woodhead Publishing, pp. 3-95. doi: 10.1016/b978-0-08-100868-3.00001-9
Pubchem (2016) ibuprofen_C13H18O2 - PubChem, The Pubchem Project. Disponible en:
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Ibuprofen#section=Computed-
Properties (Accedido: 5 de mayo de 2020)
Putaux, J.-L., Cardoso, M.B., Dupeyre, D., Morin, M., Nulac, A. y Hu, Y. (2008) «Single
crystals of V-amylose inclusion complexes», Macromolecular Symposia, 273(1), pp.
1-8. doi: 10.1002/masy.200851301
Putseys, J.A., Lamberts, L. y Delcour, J.A. (2010) «Amylose-inclusion complexes:
Formation, identity and physico-chemical properties», Journal of Cereal Science,
51(3), pp. 238-247. doi: 10.1016/j.jcs.2010.01.011
Qi, X. y Tester, R.F. (2019) «Starch granules as active guest molecules or microorganism
delivery systems», Food Chemistry, 271, pp. 182-186. doi:
10.1016/j.foodchem.2018.07.177
Quattrocchi, O., Andrizzi, S. y Laba, R. (1992) Introducción a la HPLC, aplicación y
práctica. 1.a ed. Buenos Aires: Artes Graficas Farro
Ragheb, A.A., Abdel-Thalouth, I. y Tawfik, S. (1995) «Gelatinization of starch in aqueous
alkaline solutions», Starch, 47(9), pp. 338-345. doi: 10.1002/star.19950470904
Rajbanshi, B., Dutta, A., Mahato, B., Roy, D., Maiti, D.K., Bhattacharyya, S. y Roy, M.N.
(2020) «Study to explore host guest inclusion complexes of vitamin B1 with CD
molecules for enhancing stability and innovative application in biological system»,
Journal of Molecular Liquids, 298, p. 111952. doi: 10.1016/j.molliq.2019.111952
Raphaelides, S.N., Dimitreli, G., Exarhopoulos, S., Ilia, E. y Koutsomihali, P. (2015) «A
process designed for the continuous production of starch inclusion complexes on an
industrial scale», Food and Bioproducts Processing, 96, pp. 245-255. doi:
10.1016/j.fbp.2015.09.001
Rappenecker, G. y Zugenmaier, P. (1981) «Detailed refinement of the crystal structure of
Vh-amylose», Carbohydrate Research, 89(1), pp. 11-19. doi: 10.1016/s0008-
6215(00)85225-8
Reddy, C.K., Choi, S.M., Lee, D.J. y Lim, S.T. (2018) «Complex formation between starch
and stearic acid: Effect of enzymatic debranching for starch», Food Chemistry, 244,
pp. 136-142. doi: 10.1016/j.foodchem.2017.10.040
Ridout, M.J., Parker, M.L., Hedley, C.L., Bogracheva, T.Y. y Morris, V.J. (2006) «Atomic
force microscopy of pea starch: Granule architecture of the rug3-a, rug4-b, rug5-a and
lam-c mutants», Carbohydrate Polymers, 65(1), pp. 64-74. doi:
10.1016/j.carbpol.2005.12.016
Ridout, M.J., Parker, M.L., Hedley, C.L., Bogracheva, T.Y. y Morris, V.J. (2003) «Atomic
force microscopy of pea starch granules: granule architecture of wild-type parent, r and
Bibliografía 131
rb single mutants, and the rrb double mutant», Carbohydrate Research, 338(20), pp.
2135-2147. doi: 10.1016/s0008-6215(03)00309-4
Rocha, G.A., Fávaro-Trindade, C.S. y Grosso, C.R.F. (2012) «Microencapsulation of
lycopene by spray drying: Characterization, stability and application of
microcapsules», Food and Bioproducts Processing, 90(1), pp. 37-42. doi:
10.1016/j.fbp.2011.01.001
Rocha, T.S., Cunha, V.A.G., Jane, J. y Franco, C.M.L. (2011) «Structural characterization
of peruvian carrot (Arracacia xanthorrhiza) starch and the effect of annealing on its
semicrystalline structure», Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(8), pp.
4208-4216. doi: 10.1021/jf104923m
Rodríguez-García, M.E., Londoño-Restrepo, S.M., Ramirez-Gutierrez, C.F. y Millan-Malo,
B.M. (2018) «Effect of the crystal size on the X-ray diffraction patterns of isolated
starches». Preprint. Corpus ID: 119495259
Ross, S.M. (2010) «Linear regression», en Introductory Statistics. 3.a ed. Boston: Academic
Press, pp. 537-604. doi: 10.1016/b978-0-12-374388-6.00012-0
Saifullah, M., Shishir, M.R.I., Ferdowsi, R., Tanver Rahman, M.R. y Van Vuong, Q. (2019)
«Micro and nano encapsulation, retention and controlled release of flavor and aroma
compounds: A critical review», Trends in Food Science & Technology, 86, pp. 230-
251. doi: 10.1016/j.tifs.2019.02.030
Schoch, T.J. (1945) «The fractionation of starch», en Pigman, W.W. y Wolfrom, M.L. (eds.).
Academic Press, pp. 247-277. doi: 10.1016/s0096-5332(08)60411-7
Schoch, T.J. (1942) «Fractionation of starch by selective precipitation with butanol»,
Journal of the American Chemical Society, 64(12), pp. 2957-2961. doi:
10.1021/ja01264a065
Seo, T.-R., Kim, H.-Y. y Lim, S.-T. (2016) «Preparation and characterization of aqueous
dispersions of high amylose starch and conjugated linoleic acid complex», Food
Chemistry, 211, pp. 530-537. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.05.078
Sharma, N. y Baldi, A. (2016) «Exploring versatile applications of cyclodextrins: An
overview», Drug Delivery, 23(3), pp. 729-747. doi: 10.3109/10717544.2014.938839
Srichuwong, S., Sunarti, T., Mishima, T., Isono, N. y Hisamatsu, M. (2005) «Starches from
different botanical sources I: Contribution of amylopectin fine structure to thermal
properties and enzyme digestibility», Carbohydrate Polymers, 60(4), pp. 529-538. doi:
10.1016/j.carbpol.2005.03.004
Takeda, Y., Hizukuri, S., Takeda, C. y Suzuki, A. (1987) «Structures of branched molecules
of amyloses of various origins, and molar fractions of branched and unbranched
molecules», Carbohydrate Research, 165(1), pp. 139-145. doi: 10.1016/0008-
6215(87)80089-7
Takeo, K., Tokumura, A. y Kuge, T. (1973) «Complexes of starch and its related materials
with organic compounds. Part. X. X-ray diffraction of amylose-fatty acid complexes»,
Starch, 25(11), pp. 357-362. doi: 10.1002/star.19730251102
132 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
Takeo, K. y Kuge, T. (1971) «Complexes of starchy materials with organic compounds»,
Agricultural and Biological Chemistry, 35(4), pp. 537-542. doi:
10.1080/00021369.1971.10859944
Takeo, K. y Kuge, T. (1969) «Complexes of starchy materials with organic compounds»,
Agricultural and Biological Chemistry, 33(8), pp. 1174-1180. doi:
10.1080/00021369.1969.10859434
Tang, H., Mitsunaga, T. y Kawamura, Y. (2006) «Molecular arrangement in blocklets and
starch granule architecture», Carbohydrate Polymers, 63(4), pp. 555-560. doi:
10.1016/j.carbpol.2005.10.016
Tester, R.F., Karkalas, J. y Qi, X. (2004) «Starch composition, fine structure and
architecture», Journal of Cereal Science, 39(2), pp. 151-165. doi:
10.1016/j.jcs.2003.12.001
The United States Pharmacopeia (2019) The National Formulary. Vol 3. (USP 43-NF 37).
USP43-NF38 ed. Rockville, Md : United States, Pharmacopeial Convention
Tian, Y., Yang, N., Li, Y., Xu, X., Zhan, J. y Jin, Z. (2010) «Potential interaction between
β-cyclodextrin and amylose-lipid complex in retrograded rice starch», Carbohydrate
Polymers, 80(2), pp. 581-584. doi: 10.1016/j.carbpol.2009.12.010
Toledo, M.C.F., Azzini, A. y Reyes, F.G.R. (1987) «Isolation and characterization of starch
from bamboo culm (Guadua flabellata)», Starch, 39(5), pp. 158-160. doi:
10.1002/star.19870390504
Tomasik, P. y Schilling, C.H. (1998a) «Complexes of starch with organic guests», en
Horton, D. (ed.). Academic Press, pp. 345-426. doi: 10.1016/s0065-2318(08)60047-5
Tomasik, P. y Schilling, C.H. (1998b) «Complexes of starch with inorganic guests», en
Horton, D. (ed.). Academic Press, pp. 263-343. doi: 10.1016/s0065-2318(08)60046-3
Tozuka, Y., Takeshita, A., Nagae, A., Wongmekiat, A., Moribe, K., Oguchi, T. y
Yamamoto, K. (2006) «Specific inclusion mode of guest compounds in the amylose
complex analyzed by solid state NMR spectroscopy», Chemical and Pharmaceutical
Bulletin, 54(8), pp. 1097-1101. doi: 10.1248/cpb.54.1097
Tufvesson, F., Wahlgren, M. y Eliasson, A.-C. (2003) «Formation of amylose-lipid
complexes and effects of temperature treatment. Part 1. Monoglycerides», Starch,
55(2), pp. 61-71. doi: 10.1002/star.200390018
Uchino, T., Tozuka, Y., Oguchi, T. y Yamamoto, K. (2001) «The change of the structure of
amylose during the inclusion of 2-naphthol in sealed-heating process», Journal of
Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 39(1-2), pp. 145-149. doi:
10.1023/a:1008145407085
Vamadevan, V. y Bertoft, E. (2015) «Structure function relationships of starch
components», Starch, 67(1-2), pp. 55-68. doi: 10.1002/star.201400188
Van Hung, P., Phat, N.H. y Phi, N.T.L. (2013) «Physicochemical properties and antioxidant
capacity of debranched starch-ferulic acid complexes», Starch, 65(5-6), pp. 382-389.
Bibliografía 133
doi: 10.1002/star.201200168
Wang, M., Wichienchot, S., He, X., Fu, X., Huang, Q. y Zhang, B. (2019) «In vitro colonic
fermentation of dietary fibers: Fermentation rate, short-chain fatty acid production and
changes in microbiota», Trends in Food Science & Technology, 88, pp. 1-9. doi:
10.1016/j.tifs.2019.03.005
Wang, S., Zhan, J., Jin, Z. y Tian, Y. (2017) «Enhanced fluorescence of starch-fluorescence
guest complexes enables evaluation of the encapsulation properties of maize starches»,
Food Hydrocolloids, 63, pp. 286-292. doi: 10.1016/j.foodhyd.2016.09.007
Wang, S. y Copeland, L. (2013) «Molecular disassembly of starch granules during
gelatinization and its effect on starch digestibility: A review», Food & Function, 4(11),
p. 1564. doi: 10.1039/c3fo60258c
Wongprayoon, S., Tran, T., Gibert, O., Dubreucq, E., Piyachomkwan, K. y Sriroth, K.
(2018) «Pullulanase debranching of various starches upgrades the crystalline structure
and thermostability of starch-lauric acid complexes», Starch, 70(7-8), p. 1700351. doi:
10.1002/star.201700351
Wulff, G., Avgenaki, G. y Guzmann, M.S.P. (2005) «Molecular encapsulation of flavours
as helical inclusion complexes of amylose», Journal of Cereal Science, 41(3), pp. 239-
249. doi: 10.1016/j.jcs.2004.06.002
Xie, Y.L., Jiang, W., Li, F., Zhang, Y., Liang, X.Y., Wang, M., Zhou, X., Wu, S.Y. y Zhang,
C.H. (2020) «Controlled release of spirotetramat using starch-chitosan-alginate-
encapsulation», Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 104(1), pp.
149-155. doi: 10.1007/s00128-019-02752-5
Xie, F., Ji, S. y Cheng, Z. (2015) «In vitro dissolution similarity factor (f2) and in vivo
bioequivalence criteria, how and when do they match? Using a BCS class II drug as a
simulation example», European Journal of Pharmaceutical Sciences, 66, pp. 163-172.
doi: 10.1016/j.ejps.2014.10.002
Yamada, T. y Taki, M. (1976) «Fractionation of maize starch by gel-chromatography»,
Starch, 28(11), pp. 374-377. doi: 10.1002/star.19760281103
Yamashita, Y.H., Ryugo, J. y Monobe, K. (1973) «An electron microscopic study on crystals
of V-amylose complexes», Journal of Electron Microscopy, 22(1), pp. 19-26. doi:
10.1093/oxfordjournals.jmicro.a049858
Yamashita, Y. (1965) «Single crystals of amylose V complexes», Journal of Polymer
Science Part A: General Papers, 3(9), pp. 3251-3260. doi:
10.1002/pol.1965.100030919
Yanase, M., Takata, H., Fujii, K., Takaha, T. y Kuriki, T. (2005) «Cumulative effect of
amino acid replacements results in enhanced thermostability of potato type L α-glucan
phosphorylase», Applied and Environmental Microbiology, 71(9), pp. 5433-5439. doi:
10.1128/aem.71.9.5433-5439.2005
Yang, L., Zhang, B., Yi, J., Liang, J., Liu, Y. y Zhang, L.-M. (2013) «Preparation,
characterization, and properties of amylose-ibuprofen inclusion complexes», Starch,
134 Desarrollo de un complejo de inclusión molecular de fármacos a partir de almidón nativo
65(7-8), pp. 593-602. doi: 10.1002/star.201200161
Ye, J., Hu, X., Luo, S., McClements, D.J., Liang, L. y Liu, C. (2018) «Effect of endogenous
proteins and lipids on starch digestibility in rice flour», Food Research International,
106, pp. 404-409. doi: 10.1016/j.foodres.2018.01.008
Yildiz, Z.I., Celebioglu, A., Kilic, M.E., Durgun, E. y Uyar, T. (2018a) «Fast-dissolving
carvacrol/cyclodextrin inclusion complex electrospun fibers with enhanced thermal
stability, water solubility, and antioxidant activity», Journal of Materials Science,
53(23), pp. 15837-15849. doi: 10.1007/s10853-018-2750-1
Yildiz, Z.I., Celebioglu, A., Kilic, M.E., Durgun, E. y Uyar, T. (2018b)
«Menthol/cyclodextrin inclusion complex nanofibers: Enhanced water-solubility and
high-temperature stability of menthol», Journal of Food Engineering, 224, pp. 27-36.
doi: 10.1016/j.jfoodeng.2017.12.020
Yoo, S.H. y Jane, J.L. (2002) «Molecular weights and gyration radio of amylopectins
determined by high-performance size-exclusion chromatography equipped with multi-
angle laser-light scattering and refractive index detectors», Carbohydrate Polymers,
49(3), pp. 307-314. doi: 10.1016/s0144-8617(01)00339-3
Yun, S.-H. y Matheson, N.K. (1990) «Estimation of amylose content of starches after
precipitation of amylopectin by concanavalin-A», Starch, 42(8), pp. 302-305. doi:
10.1002/star.19900420805
Zabar, S., Lesmes, U., Katz, I., Shimoni, E. y Bianco-Peled, H. (2010) «Structural
characterization of amylose-long chain fatty acid complexes produced via the
acidification method», Food Hydrocolloids, 24(4), pp. 347-357. doi:
10.1016/j.foodhyd.2009.10.015
Zabar, S., Lesmes, U., Katz, I., Shimoni, E. y Bianco-Peled, H. (2009) «Studying different
dimensions of amylose-long chain fatty acid complexes: Molecular, nano and micro
level characteristics», Food Hydrocolloids, 23(7), pp. 1918-1925. doi:
10.1016/j.foodhyd.2009.02.004
Zaki Rizkalla, C.M., latif Aziz, R. y Ibrahim Soliman, I. (2013) «Microencapsulation of
hydroxyzine HCl by thermal phase separation: in vitro release enhancement and in vivo
pharmacodynamic evaluation», Pharmaceutical Development and Technology, 18(1),
pp. 196-209. doi: 10.3109/10837450.2012.693506
Zhang, L., Cheng, H., Zheng, C., Dong, F., Man, S., Dai, Y. y Yu, P. (2016) «Structural and
release properties of amylose inclusion complexes with ibuprofen», Journal of Drug
Delivery Science and Technology, 31, pp. 101-107. doi: 10.1016/j.jddst.2015.12.006
Zhang, P. y Hamaker, B.R. (2012) «Banana starch structure and digestibility»,
Carbohydrate Polymers, 87(2), pp. 1552-1558. doi: 10.1016/j.carbpol.2011.09.053
Zhang, L., Yang, X., Li, S. y Gao, W. (2011) «Preparation, physicochemical characterization
and in vitro digestibility on solid complex of maize starches with quercetin», LWT -
Food Science and Technology, 44(3), pp. 787-792. doi: 10.1016/j.lwt.2010.09.001
Bibliografía 135
Zhang, Y., Huo, M., Zhou, J., Zou, A., Li, W., Yao, C. y Xie, S. (2010) «DDSolver: An add-
in program for modeling and comparison of drug dissolution profiles», The AAPS
Journal, 12(3), pp. 263-271. doi: 10.1208/s12248-010-9185-1
Zhao, Y., Sun, C., Shi, F., Firempong, C.K., Yu, J., Xu, X. y Zhang, W. (2016) «Preparation,
characterization, and pharmacokinetics study of capsaicin via hydroxypropyl-beta-
cyclodextrin encapsulation», Pharmaceutical Biology, 54(1), pp. 130-138. doi:
10.3109/13880209.2015.1021816
Zhu, F. (2017a) «Atomic force microscopy of starch systems», Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 57(14), pp. 3127-3144. doi: 10.1080/10408398.2015.1094650
Zhu, F. (2017b) «NMR spectroscopy of starch systems», Food Hydrocolloids, 63, pp. 611-
624. doi: 10.1016/j.foodhyd.2016.10.015
Zobel, H.F. (1988) «Starch crystal transformations and their industrial importance», Starch,
40(1), pp. 1-7. doi: 10.1002/star.19880400102