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6/18/2013

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Carrera de Especialización en BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Instituto Nacional de Tecnología Industrial

BIOTECNOLOGIA DE LOSMICROORGANISMOS

Microorganismos Eucariontes

Docente: Dra. Isabel E. Cinto

[email protected] -2013-

REINO FUNGI (Los hongos)

¿Porqué estudiar a los hongos desde la biotecnología?

Industria papelera:Biopulpado de la maderaBioblanqueado de la pulpa de maderaBiodesentintado para reciclado de papel.

Industria textil:Maceración de tejidos para obtención de fibrasBiodecoloraciónBiopulido de telasLavandería.

Bioabsorción de metales pesados: En efluentes industriales y domiciliarios.



Degradación y detoxificación de contaminantes:En la industria papelera, textil, pesada, bélica, agroindustria.Contaminantes en medios sólidos, gaseosos o líquidos.

Hongos comestibles:Micoproteina quorn® (Fusarium graminearum)Hongos comestibles (Agaricus bisporus, Grifola frondosa,Lentinus edodes, etc.).

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Producción de bebidas:Vino (uvas).Cerveza (cereales).Sidra (manzana).Sake (arroz, SSF).Pulque (agave) Chicha (maíz).Hidromiel (miel) etc.



Alimentos fermentados:Pan, quesos (azul, camembert, brie),Fermentados tradicionales (Miso, Sufu, Tempeh, etc.).

Aditivos:Colorantes.Aromatizantes.Acidulantes.

Industria alimenticia:Extracción de jugos, aromas, aceites y pigmentos.Clarificación de jugos de frutas y vinos.Producción de jarabes de azúcar.Panadería.



Reciclado de materia orgánica:Bioconversión.Digestibilidad.Zacarificación.

Industria farmacéutica:Antibióticos (Penicilina, Cefalosporina, ác. fusídico).Antimicóticos (Griseofulvina).Inmunosupresores (Ciclosporina A).Antihipercolesterol (Mevinolina).Vasoconstrictores y contracción de músculo liso (alcaloides delergot). Medicina no tradicional.



Otras aplicaciones: Producción de vitaminas (riboflavina, vitamina A).Giberelina.Etanol.Glicerol.Biosurfactantes.Polisacáridos (b- glucanos, pululano).Biocontrol, Endofitos.Nanotecnología.

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Para mejorar estos procesos o para innovar en este campo, debemos

conocer la biología de los organismos implicados

¿Qué es un hongo?

Célula: eucarionte con pared celular formada por quitina Reproducción: se multiplican sexual y asexualmente por esporas

Nutrición: es heterótrofa, absortiva (saprobios y parásitos)

Fundamentalmente aerobios

Hábito: filamentoso o unicelular

Hábitat: variado

Nutrición:

Heterótrofos: se nutren a partir demateria orgánica, no puedensintetizarla a partir de CO2 y agua

Absortivos: incorporan solomoléculas pequeñas. Ladegradación de sustratos seproduce extracelularmente(enzimas extracelulares)

Hábito levuliforme

Unicelular (levaduras).

Saccharomyces cerevisiae

Gemación

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Hábito filamentoso

CenocíticoFilamentoso

Tabicado (septos)

Hifa

Micelio

Hifa: célula tubular de crecimiento apical

En Basidiomycota el poro es en forma de barril y se lo denomina “doliporo”. Presenta una especie de capuchón: “parentesoma”

En Ascomycota el septo es simple, con un poro y “cuerpos de Woronin”

Espora

Hifas

Micelio

Colonia

Cepa

Crecimiento radial

Anillos de bruja

Crecimiento radial

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Clasificación Clasificación

Chytridiomycetes (flagelados)

Zygomycetes

Ascomycetes esporas sexuales endógenasfase n+n corta

Basidiomycetes esporas sexuales exógenas fase n+n larga

Deuteromycetes (imperfectos)

Cenocíticos

TabicadosGeneranfructificaciones

Flagelos habitat habito Estructuras reproductivas

# especies conocidas septos

Chytridiomycetes siLa mayoría acuáticos

Unicelular o filamentoso esporangio ~1000 no

Zygomycetes noLa mayoría terrestre

filamentoso zygospora ~1000 no

Ascomycetes noLa mayoría terrestre

Filamentoso unicelular (levaduras)

Cuerpos fructíferos (ascomas) o esporas asexuales

~65,000 si

Basidiomycetes noLa mayoría terrestre

Filamentoso unicelular

Cuerpos fructíferos (basidiomas) o esporas asexuales

~30,000Si, con clamp connections

Chytridiomycota

Antes eran colocados en protistas, pero la evidencia apunta a que pertenecen al reino Fungi por pared celular, enzimas y rutas metabólicas.

Mantienen una etapa flagelada

Pueden ser descomponedores, parásitos o mutualistas

Presentan zoosporas: unicelulares, uninucleadas, con 1 flagelo en “látigo” posterior y se forman en un zoosporangio

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ChytridiomycotaCiclo de vida

Zygomycota

Talo bien desarrollado con hifas cenocíticas

Reproducción asexual:Esporangiosporas dentro de esporangios

Reproducción sexual:Fusión de gametangios (copulación gamentangial)Formación de zigosporangio conteniendo zigospora

ZygomycotaCiclo de vida

Zygomycota

Heterotálicos

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Ascomycota

Hongos con ascos (sacos) en ascocarposDesde unicelulares (levaduras) a multicelulares

Muchos forman asociaciones con algas (líquenes) y algunos micorrizas

Reproducción asexual:Conidios sobre conidióforosArtrosporas (espora resultante de la fragmentación de una hifa)Clamidospora (resistencia)

Reproducción sexual:Gametangios: ascogonios y anteridiosEstadio dicariótico (n+n) corto (hifas ascógenas)Ascosporas en ascos dentro del ascoma

AscomycotaCiclo de vida

Apotecio

Asco

Ascosporas (n)

Peritecio

Cleistotecio

Micelio (n)

Ascomycota Ascomycota

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Basidiomycota

Hifas están tabicadas con doliporo

Reproducción sexual es por somatogamia

Cariogamia muy retrasada respecto de la plasmogamia: micelio dicariótico (n+n)

Esporas de orígen sexual son exógenas: basidiosporas sobre basidios

BasidiomycotaCiclo de vida

Basidio Basidiospora (n)

Micelio (n+n)Basidiocarpo (n+n)

Basidiomycota Reproducción asexual

Zygomycetes

Deuteromycetes

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Pared celular

En todos los hongos basicamente la pared, mas allá de su composiciónquímica, está constituída por un andamiaje interno de fibras entrecruzadocon una matriz externa

En Ascomycota y Basidiomycota las fibras son microfibrillas de quitina quese sintetizan en la membrana. La pared se torna rígida una vez que lasmicrofibrillas se fijaron a la pared por entrecruzamientos con los β-glucanos.El tercer componente importante de la pared, son las proteínas, muchas deellas glicosiladas especialmente con manosa. Proteínas de la pareddeterminan propiedades como adhesión o reconocimiento.

Pared celular

Membrana plasmática

Proteínas (glicoproteínas)ATPasaTransporteActividades enzimáticasReceptores

LípidosÁcidos grasosEsteroides (ergosterol)

Sistemas de membranas

Vacuolas

Vesículas (100-400 nm)

Microvesículas (< 100 nm)

Golgi (poco desarrollado)

Cuerpo apical: Spitzenkörper

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Mitocondrias

Cuerpos de Woronin

Microcuerpos o microsomasPeroxisomasGlioxisomas

Hidrogenosomas

Sistemas de membranas

Levaduras de gemación

(Saccharomyces cerevisiae)

Crecimiento en hongosunicelulares

Brotación al azar polar axial(céls 2n) (céls n)

BUD 1,2,5 BUD 3,4

Levaduras de fisión

(Schizosaccharomyces pombe)

Crecimiento en hongosunicelulares

Crecimiento en hongosfilamentosos

Crecimiento polarizado

Síntesis de pared en un área restringida ApicalIndefinido

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Se acumulan vesículas en el ápice(Neurospora crassa: 80% del volumen celular en el 1er mm)

Centro de acumulación: Spitzenkörper

Citosqueleto: microtúbulos: mantienen polaridad

posición del Spitzenkörpermovimiento a larga distancia

microfilamentos: movilización vesículasCorrientes eléctricasCorrientes iónicasGradiente de pH

Spitzenkörper vesículas a la membrana

•Fusión con la membrana•Fuerza de empuje

Membrana de vesículas aumenta superficie de membrana plasmáticaContenido vesicular:

- enzimas S! pared membrana (Q-S, b-1,3 glucosinasa)pared (b-1,6 glucosintasa)

- enzimas hidrolíticas membrana paredliberadas al exterior

- enzimas degradación polímeros liberadas al exterior



Modelo matemático del crecimiento (Bartnicki García)

VSC: vesicular supply center (Spk)

y = x.cot V.xN

V: velocidad de desplazamiento del VSCN: nº de vesículas liberadas/ unid. de tiempo

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Sustrato

SustratoUnicelulares

Crecimiento en hongos

Filamentosos

Colonia

Colonia

O2

Difusión

Sistema en batch o por lotes (cerrado)

Sistema fed-batch o retroalimentado (semicerrado)

Sistema continuo (abierto)

Sistemas de cultivo

tiempo

biom

asa

trofofaseidiofase

Trofofase: crecimiento – metabolismo primario

Idiofase: metabolismo secundario

Sustrato + inóculo incubación cosecha

tiempo

biomasa

producto

sustratocosecha

Sistema en Batch

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Sustrato + inóculo incubación cosechaagregado de sustrato

tiempo

biomasa

producto

sustrato

cosecha

Mantiene sustrato limitanteSe evita represión catabólica

Sistema Fed-batch

(lote realimentado) Sustrato + inóculo agregado continuo cosecha continua

de sustrato

tiempo

biomasaproductosustrato

Cosecha continua

Sistema continuo

estado de equilibrio

(steady state)

Los Hongos (en la práctica)

Cepa de trabajo

(esporas, micelio)

Medio de cultivosólido

Medio de cultivolíquido

Sintético

Semisintético

Natural

Sintético

Semisintético

Fermentación enestado sólido (SSF)

Fermentaciónlíquida

Pellets, crec.difuso, colonias

Master culture

Stock culture

Partículasinertes

Natural(suspensión, ferm. semisólida)

Aislamiento

ReconocimientoMorfológico y potencialidades tecnológicas

Optimización

Escalado

Preservación cepas

Limitación de O2 (aceite mineral)

Baja temperatura – heladera (5ºC) freezer ( -20º)freezer ( - 70º)N2 líquido ( -196º)

Baja temperatura + deshidratación : liofilización

Criopreservantes(glicerol, trehalosa,DMSO)

Hongo mantenido en “pico de flauta” (medio malta, 5ºC)

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En el laboratorio

Crecimiento en hongosMedio semisintético agar-malta en caja(colonias)

Inóculo

Hifas maduras

Hifas jóvenes

Crecimiento en hongosMedio semisintético malta líquidocon agitación

Pellets

Corte transversalHifas

jóvenes

Hifasmaduras

Autólisis Micelio

Crecimiento en hongosMedio semisintético malta líquidoestático

Menor volumen de medio

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Crecimiento en hongosMedio natural. SSF

Salvado detrigo

Madera

Granos de avena

¿Cómo determinamos el crecimiento?

Peso frescoPeso secoRecuento de UFC (levaduras, esporas)EspectrofotométricoEvaluación de componentes hifalesDemanda de O2Producción de CO2Evaluación de metabolitosLuz infraroja

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